IPARI ENZIMEK 2 Proteázok A proteázok az ipari enzimek egyik legfontosabb csoportja (6200 t tiszta E/év) Peptid kötéseket bont (létrehoz) (hidrolízis, szintézis) Fehérje lebontás: élelmiszer, tejalvadás, mosóenzimek, infúzió, vérrögoldás (fibrin oldás) Fehérje szintézis: aszpartám előállítása Csoportosítás: termelő szervezetek alapján (baktérium, gomba) ph optimum alapján (alkalikus, neutrális, savas) kulcs-aminosav szerint (Ser, Cys, Asp proteázok) 2 Alkalikus proteázok Termelő mikroorganizmusok: Streptomyces nemzetség, Aspergillus nemzetség, B. amyloliquefaciens (szubtilizint termel szerin-proteáz, reverzibilis acilezésre képes) A mosószer proteázoknál feltétel a kompatibilitás: detergensekkel lúgokkal kelátképzőkkel perborátokkal Hőstabilitás 3 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 1
Törzsek Screening ph = 10-es fehérje agaron szélesztéssel Törzsjavítás (génmanipuláció, protein engineering) Célja: az adott törzs több enzimet termeljen 1.) erős promótert teszünk az adott gén elé 2.) multikópiás plazmid: az adott gén több példányban legyen jelen. 3.) protein engineering: a stabilitás érdekében a 222 Met-t (mely instabil) Ser-re cserélték - jobb aktivitást tapasztaltak, de a stabilitás nem lett jobb. 4 Fed batch fermentáció Az NH 4 és aminosav koncentrációt alacsonyan kell tartani nagy O 2 bevitel kell 48-72 h Fermentációs technológia 1971-ben allergia miatt termék-krízis: a por állagú enzim a levegőben szállt és allergiát okozott. Megoldás: mikrokapszulázás, extruderes granulátum sima felületű szemcsék, nem porzik. 5 Neutrális proteázok Termelő mikroorganizmusok: Bacillus subtilis, S. griseus, Aspergillus orizae Érzékeny: - hőre - stabilizátorokra (CaCl 2,NaCl) - alkalikus proteáz gyorsan lebontja Felhasználás: Élelmiszeripar (kenyér, keksz gyártás) Bőripar (szőrtelenítés, húsmaradék lemésztése. Irányított folyamat) 6 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 2
Savas proteázok Cys proteázok Pepszinhez hasonló enzimek (ph opt = 2-4) pl. : papain, bromelin Felhasználás: - emésztést elősegítő enzimek - szója szósz előállítása - glutén hidrolízise (sütőipar) 7 Oltóenzim, rennin, rennet, chymosin, gasztriktin Savas proteáz A sajtgyártás legfontosabb enzime, alvasztó enzim, Asp van az aktív centrumban (= aszparaginsav proteáz) 3-4 hetes borjú gyomrában található pre-pro-chymozin formában Két izoenzime van: - chymozin A: Asp (~40%, nagyobb az aktivitás) - chymozin B: Gly (~60%) Genetikailag meghatározott, a borjú gyomrában vagy A, vagy B van jelen. 8 Chymosin-B 9 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 3
Rennin Megnövekedett igény, nincs elég borjú gyomor. A hiányzó mennyiség pótlására: 1. állati (pl. csirke) pepszinek (Izrael, Csehország) 2. savas penész proteázok - Mucor mihei, Mucor pusillus, Endothia parasitica E. parasitica enzim: kereskedelmi készítmény, 1967, Supraren (USA, Franciaország) - (ph = 4-5,5) - hőstabilitása (viszonylag) nagy (nem jó tulajdonság) - extracelluláris enzim, kicsapódhat Protein engineering-gel próbálják javítani. 10 3. Rekombináns DNS technika E. coli - 1980 elején az állati chymozin gént klónozták, REN- NET R néven szabadalmaztatták és engedélyeztették - az enzim oldhatatlan, zárványtest (inclusion body) formában van - az összfehérje 15-20%-a rennin Az E. coli élelmiszeripari gyártásban nem alkalmazható mikroba, mert néha patogén, és toxint termelhet. Ezért más törzsek: B. subtilis: ártalmatlan mikroba, de ez is intracelluláris Saccharomyces cerevisiae: gyenge termékképzés 11 Kluyveromyces lactis: élelmiszeripari mikroba (SCP savón), 1950-60 savóból izolálták A tejiparban használatos β-galaktozidázt ezzel termelte a Gist-Brocades. Extracelluláris enzimtermelés: az élesztő α-faktor leadert, mint szignál szekvenciát beépítették ezáltal a prochymosint extracellulárisan termeli. (1988 F, NL) A törzs kevés extracelluláris fehérjét termel, ezért könnyű a rennint izolálni Prochymosin chymosin (MAXIREN R ) Scale up könnyű, mert ezzel az törzzsel termelték a β-galaktozidázt is (bár az intracelluláris enzim volt). 12 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 4
A K. lactis-ba bevitt plazmid Expressziós vektor - laktóz promóter régió - szignál peptid rész - pro-chymosin DNS - laktóz terminátor régió - transzpozon 13 A termék nem tartalmazhat élő sejtet, ezért benzoesavval alacsony ph-án elölik, és szűrik (ultraszűrés után sterilszűrés, élelmiszer enzim (DNS-t nem tartalmazhat) Közben a prochymosin chymosin átalakulás végbemegy A termék tartósítását benzoesavval v. NaCl-dal végzik. Régebben plazmidos rekombináns élesztővel termeltették a prochymosint, ma már a prochymosin gént a kromoszómába építették be. 14 Az aktív RENNIN kialakulása 15 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 5
MAXIREN R - tisztább, mint a borjú rennin, nincs kísérő enzim (pepszin + egyéb) - a renninnel kémiailag és biológiailag teljesen azonos - ez a kereskedelmi termék az egész világon. - termelése olcsó - állandó tisztaságú, mentes állati szervmaradványoktól (pl. nincs BSE veszély) - mennyisége korlátlan 16 MAXIREN R - 1988-tól ipari termelés Seclinben (Fr.o.), ez az üzem ISO 9002 minősítéssel rendelkezik rekombináns élesztő tenyésztésére, Kóser engedély (vegetáriánus termék) - engedélyeztetése nehéz volt DNS stabilitás, patogenitás, mutagenitás, toxikusság, etetési teszt, allergia, sajtgyártási teszt, organoleptikus vizsgálatok - EC, EU előírásait betartani (termelésre és termékre egyaránt) 17 A RENNIN hatása A sajtgyártás kulcslépése a tejfehérje megalvasztása. Sajt: ez az első termék, melynél enzimet és mikrobát is használnak évezredek óta Évente 25*10 6 liter rennetet forgalmaznak, 140 M USD értékben, olcsó enzim 18 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 6
Fehérjék % Foszfát csoportok molekulánként Kazein α s1-kazein 32 8 Hőstabil P miatt, α s2-kazein 8 10-13 Ca kötő micella β-kazein 32 5 képz. κ-kazein 8 1-2 Savó fehérje 80 β-laktoglobulin 12 0 β-laktalbumin 4 0 Immunglobulin 3 0 Szérum albumin 1 0 20 Ezek ultraszűréssel eltávolíthatók 19 0,1% Ca jelenlétében a kazein micellát képez 20 A rennin hatása 21 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 7
A rennin hatása 1. fázis: A rennin fenilalanin-metionin között végez hasítást, és ez a vágás destabilizálja a micella szerkezetét. 2. fázis: koaguláció, mely a magasabb hőmérsékleten és Ca 2+ ionok hatására fokozódik Szétválasztás: túró (fehérje: a 8%-ból 7, zsír, Ca, foszfát) + savó (tejcukor ~7,5% és ~1% fehérje, ásványi sók) 22 Sajtérlelés Bizonyos sajtokat érlelnek (4 hét-2 év), az idővel a víztartalom csökken. Közben: kémiai, biokémiai, mikrobiológiai változások zajlanak le. - ha tejcukor maradt a sajtban és ezen a mikrobák elszaporodnak kellemetlen íz - sok szabad zsírsav keserű (szappanszerű) ízt ad - a fehérje bomlás folyamatos, aminosavak, biogén aminok, ammónia 23 Fémproteázok Zn proteáz, termolizin az aszpartángyártás fontos enzime Az aszpartám egy mesterséges, kis kalóriájú édesítőszer. Felhasználása élelmiszereknél: tej, jam, italok, cukorkák A fenilalanin metil észterének és aszparaginsavnak az összekapcsolásával keletkezik: 24 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 8
Termolizin Forrása: Bacillus proteoliticus Japán hőforrásból izolálták jó a hőstabilitása A kofaktora Zn 2+ ion, a stabilitását 4 Ca 2+ biztosítja. Optimális körülmények: ph = 7-7,5 T = 50 C Izolált enzimként, oldott formában alkalmazzák. Szakaszos eljárás, keverős reaktorban Enantiomer tisztaság: 99,99 % 25 Az enzimes eljárás előnyei Nem keletkezik β-aszpartám (keserű) Sztereoszelektív a reakció, csak L-aszpartám keletkezik, alapanyagként DL-Phe (racém) is használható. Nincs racemizáció a szintézis alatt A reakció vizes közegben, enyhe körülmények között végrehajtható. 26 Aszpartám gyártás Ahhoz, hogy csak a fenilalanin aminocsoportja reagáljon a az aszparaginsav α-karboxil csoportjával, a rajtuk lévő egyéb funkciós csoportokat blokkolni kell, egyébként random dipeptidek és oligopeptidek képződnek. A Phe metilésztere a karbonsavat blokkolja, az Asp aminocsoportját pedig egy benzoil-oxi-karbonil (BOC) csoporttal védik (ez hidrogénezéssel eltávolítható) 27 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 9
Aszpartám gyártás Szubsztrátok: L-aszparaginsav + DL-fenilalanin-OMe (racém, olcsóbb) A keletkező védett aszpartám adduktot képez a feleslegben lévő D-PheOMe-rel, ami kicsapódik. Szűrés Sósavval visszaoldják. A BOC csoportot lehidrogénezik, a D-PheOMe-t racemizálják és visszaviszik a folyamat elejére. 28 29 Aszpartám gyártás 30 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 10
Lipázok Alapreakció: a zsírok észterkötéseit hidrolizálják, termékek: szabad zsírsavak, mono- és digliceridek, glicerin. Egyensúlyi reakció, visszafelé is megy. 31 Lipázok Vannak régióspecifikusak, amelyek csak a szélső zsírsavakat hidrolizálják, a középsőt nem, de vannak erre érzéketlenek is. A szénlánc hossza csak a sebességet befolyásolja. Szerves oldószerekben is jól működnek, igen kis víztartalom mellett. Sőt a hőállóságuk is jobb ebben a közegben 70 C. Adszorpcióval könnyen immobilizálhatók szerves és szervetlen hordozók felületén (hidrofil-hidrofób jelleg a használt oldószer szerint). 32 Termelő mikroorganizmusok: Aspergillus nemzetség, Mucor nemzetség, Rhyzopus nemzetség, Candida nemzetség Általában sejthez kötött enzimek, de Mg 2+ ionok hatására leválnak Induktor: olaj, zsírok (szubsztrát), Represszor: glicerin (mint termék), glükóz (katabolit represszió) 33 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 11
Lipázok felhasználása 1. Emésztést elősegíti (pankreász lipáz pótlása) 2. Sajtérlelésben ízjavító (tejzsír irányított bontása) 3. Szappan ipar, kíméletes elszappanosítás (Candida lipáz) 4. Átészterezés, észterképzés dinamikus egyensúly a karbonsav csoportok folyamatosan cserélődnek 34 1. Trigliceridek között Zsírok átészterezése 2. Triglicerid és zsírsav között 35 Zsírok átészterezése Élelmiszeripar: pálmamag-olaj átészterezése kakaóvaj-szerű zsiradékká (csokoládé gyártás) 36 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 12
Penicillin aciláz/amidáz A félszintetikus penicillinek előállítása a fermentált G- penicillin oldalláncának lecserélésével történik. 1. Hidrolízis 2. Új oldallánc (karbonsav) rákötése G penicillin 6-amino-penicillánsav (6-APA) + fenilecetsav 37 Penicillin aciláz/amidáz Karbonsav származék + 6-APA félszintetikus penicillin Ugyanazzal az enzimmel meg lehet csinálni a két ellentétes reakciót, de itt sav-származékot kell adni (ph, ionizálás!) 38 Penicillin aciláz/amidáz Termelő törzsek: Type I: penész típusú, ph ~10, t ~50 C, inkább V, mint G Type II: baktérium típusú, ph ~8, t ~40 C. Sokféle van, de az iparban főleg E. coli mutánsok és manipulált törzsek. Fermentáció: Indukció fenil-ecetsav adagolással (5X titer-növekedés) Glükóz: katabolit represszió miatt kis koncentrációban O 2 : aerob, de nem túl erős levegőztetés Feldolgozás: - nyugvósejtes tenyészet, - immobilizált enzim 39 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 13