A víztartalom szerepe a tejsav enzimkatalitikus észterezése során The effect of water content on the enzymatic esterification of lactic acid Major Brigitta, Kelemenné Horváth Ilona, Bélafiné Bakó Katalin, Gubicza László Pannon Egyetem, Műszaki Kémiai Kutató Intézet 8200 Veszprém, Egyetem u. 10 Summary 2-hydroxypropionic acid or lactic acid is the smallest chiral hydroxycarboxilic acid, which is produced by the fermentation of various renewable resources. Among the lactic acid derivatives lactates are really valuable products since they are applied by the food, pharmaceutical and cosmetic industry. While usually the enzymatic esterification of lactic acid with sort chain alcohols was tested in different organic solvents (hexane, toluene), researchers of the Institute of Chemical and Process Engineering use ionic liquid media exploiting its benefits like negligible vapour pressure, enzyme stabilizing effect, chemical and thermal stability. Esterification of lactic acid is an equilibrium reaction therefore the maximal yield can be influenced using an excess of one of the substrates (usually the alcohol) or removing the product ester or the side-product water. In the case of enzymatic lactate synthesis the water content has other roles as well: i) The enzyme needs a monomolecular water layer to maintain its active conformation. ii) Lactic acid undergoes self esterification producing dimers (lactoyllactic acid) or other oligomers as a result of water removal that may decrease the obtained yield. In the case of ethyl acetate and isoamyl acetate, where the acid does not produce dimers, water removal resulted in near 100% yield therefore our aim was to determine the complex effect of water content in the lactate production. Several phosphonium type ionic liquids were tested as the media of the enzymatic ethyl lactate production and Cyphos 104 was found the best because it maintained a proper environment for the enzyme but did not catalysed the reaction itself. The ethyl lactate production was optimized and the highest yield was achieved using the following parameters: 0.8 mmol ionic liquid, a lactic acid solution containing 2 mmol monomer acid, 7 times ethanol excess, 3 w/w% initial water content, 25 mg immobilised Candida antarctica lipase B enzyme, 40 C reaction temperature. An integrated system was developed for the production of ethyl lactate and separation of water. The reaction was carried out in a thermostated, stirred (500 rpm) bioreactor (volume: 50 cm 3 ) on 40 C, 13 h reaction time. Flat sheet hydrophilic pervaporation membrane was applied for water removal. Permeate was collected in a cold trap using vacuum. Starting the reaction from the same initial concentration the obtained yield was lower (32%) using pervaporation than without it (54%). After increasing the amount of the removed water by changing to zeolite adsorption the ester yield was even smaller (30%). These results proved our theory that water content influences the monomer lactic acid concentration. The explanation of the observed effect can be concluded as follows: removing the side-product water hinders the hydrolysis of lactoyllactic acid, furthermore the decreasing water content results in the dimerisation of the lactic acid decreasing the available substrate amount. Bevezetés A 2-hidroxi-propánsav (tejsav) a legkisebb aszimmetrikus szénatomot tartalmazó hidroxikarbonsav. Kiváló alapanyag, hiszen több megújuló forrásból könnyen előállítható, rendelkezik karboxil- és hidroxil-csoporttal is, aminek következtében számos különböző reakció lejátszatható vele [1]. A tejsavnak különösen értékes származékai az észterek. Zsírsavakkal alkotott vegyületeit emulgeálószerként használják. Rövid szénláncú alkoholokkal alkotott észterei úgynevezett zöld oldószerek. Optikai aktivitásukat is ki lehet használni királis szintéziseknél. A tejsav-etil-észter ezen kívül a természetben is előforduló aromaanyag, ezért szívesen alkalmazzák az élelmiszer-, a kozmetikai-, és gyógyszeriparban [1].
A tejsav kis molekulatömegű alkoholokkal történő enzimes észterezésére több példa is található az irodalomban. From és munkatársai [2] hexán oldószerben immobilizált Candida antarctica lipáz B-t használtak, míg Parida és munkatársa [3] toluolban Candida cylindracea enzimmel értek el jó eredményeket. A Műszaki Kémiai Kutató Intézetben ionos folyadékban vizsgáljuk a reakciót, kihasználva ezen új közeg pozitív tulajdonságait, úgymint enzimstabilizáló hatás, elhanyagolható gőznyomás, nagy kémiai és termikus stabilitás [4]. Mivel a tejsav észterezése egyensúlyra vezető folyamat, az elérhető maximális hozam befolyásolható valamelyik szubsztrát általában az alkohol feleslegben való alkalmazásával. Nagy enzimdezaktiváló hatásuk miatt savakat ritkán használnak feleslegben [5]. A másik, a reakció szempontjából kulcsfontosságú befolyásoló paraméter a víztartalom. Ennek három oka is van. i) A víz az észterezés mellékterméke, így mennyiségének szabályozásával az egyensúly eltolható. ii) Az enzim aktív konformációjának megőrzéséhez szüksége van egy monomolekuláris vízrétegre. iii) A tejsav azon tulajdonsága, hogy vízelvonás hatására dimereket (pl. laktilsav), illetve egyéb oligomereket alkot [6, 7]. Ebből is látható, hogy a víztartalomnak összetett hatása van a tejsavetil-észter szintézisére. Intézetünkben korábban már folytak kísérletek, melyekben a vízelvétel észterezési reakciókra gyakorolt hatását vizsgáltuk. Etil-acetát [8] és i- amil-acetát [9] szintézisénél azt tapasztaltuk, hogy a melléktermék víz elvonása 100% közelébe növelte a hozamot. Lényeges különbség volt azonban, hogy az ecetsav nem hajlamos dimerizálódásra. A tejsav ezen hajlama feltételezésünk szerint megakadályozhatja az észter hozam vízelvétellel történő növelését, ezért ennek vizsgálatát tűztük ki célul. Anyagok és módszerek Enzim: Novozym 435 (immobilizált Candida antarctica lipáz B, triacilglicerol hidroláz, E.C. 3.1.1.3.) Novo Nordisk (Basvaerd, Dánia). (1U=11900 μmol propil-laurát/g, 15 min, 1 atm, víztartalom: 1-2%). Ionos folyadék: trihexil-tetradecil-foszfóniumbis (2,4,4-trimetil-pentil)-foszfinát (Cyphos 104), (IoLiTec GmbH, Németország) Egyéb felhasznált vegyszerek: (L)-tejsav 90 %- os (Reanal, Magyarország), etanol abszolút (Spektrum 3D, Magyarország), acetonitril, hexán, aceton (Scharlau, Spanyolország) Rázatás, inkubálás: GFL 3031 rázó inkubátorral. Membrán: Hidrofil pervaporációs lapmembrán STANDARD, (Beroplan GmbH, Németország) Zeolit: aktivált 4A molekulaszűrő (Zeolyst International, USA) Reakció rázatott lombikban: A különböző összetételű reakcóelegyeket (össztérfogat 1,5 cm 3 ) 40 C hőmérsékleten, 150 min -1 rázatási intenzitás mellett reagáltattuk 13 órán keresztül. Reakció pervaporációs vízelvétellel: A reakcióelegyet (össztérfogat: 50 cm 3 ) mágneskeverővel (fordulatszám: 500 min -1 ), termosztáttal, illetve visszacsepegő hűtővel ellátott bioreaktorban reagáltattuk 40 C-on 13 órán keresztül folyamatos vízelvétel mellett. Az elegy mozgatását a membránmodul és a bioreaktor között perisztaltikus szivattyú végezte (áramlási sebesség: 30 cm 3 /min). A permeátumot vákuum (nyomás: 1 kpa) segítségével, acetonos szárazjéggel hűtött csapdában gyűjtöttük. Reakció zeolitos vízelvétellel: A pervaporációhoz használt bioreaktort és körülményeket használtuk, csupán a víz elvétele zeolittal (40 g) töltött oszlopon történt. Elemzések: Az elemzések elvégzéséhez gázkromatográfot illetve folyadékkromatográfot használtuk: HP 5890 A gázkromatográf, FID detektor, HP-FFAP kolonna (Macherey-Nagel), fejnyomás: 80 kpa, N 2 áramlási sebesség: 20 cm 3 /min. MERCK típusú folyadékkromatográf, Zorbax SB-Aq 76 kolonna, L-7450 detektor, detektálás hullámhossza: 215 nm. Minta előkészítés: A tejsav-etil-észter gázkromatográfiás elemzéséhez az egyfázisú
reakcióelegyből szabályos időközönként 50 μl mintát vettünk, amiből az észter tartalmat hexánnal extraháltuk. HPLC méréshez a reakcióelegyből vett mintából 20 mg/ml tejsav tartalmú vizes oldatot készítettünk Az oldószer 6% acetonitril tartalmú foszfát puffer volt (ph: 2,3). Víztartalom mérése: automata Mettler Toledo DL 35 Karl-Fisher titrátorral. Eredmények és értékelésük A tejsav-etil-észter előállításának lehetőségét megvizsgáltuk több foszfónium típusú ionos folyadékban, melyek közül a Cyphos 104 kiváló környezetet biztosított az enzim számára, de a reakciót nem katalizálta. Ebben az ionos folyadékban meghatároztuk a hozam szempontjából optimális Reakcióelegy reakciókörülményeket rázatott lombikos kísérletekben és a következő eredményt kaptuk: 0,8 mmol ionos folyadék, 2 mmol tejsav tartalmú elegy (ami a monomer tejsavon kívül annak dimereit, illetve vizet is tartalmazott), hétszeres etil-alkohol mólfelesleg, 3 m/m% kezdeti víztartalom. Az enzim mennyisége: 25 mg. Az elért maximális hozam 13 h reakcióidő után 54% volt. A további kísérleteket az optimálisnak ítélt összetételű reakcióeleggyel hajtottuk végre. Összeállítottunk egy integrált rendszert, mely alkalmas volt a reakcióelegy víztartalmának szabályozására. A vízelvétel módjának a pervaporációt választottuk, mivel előzetes tapasztalatok [8], illetve irodalmi adatok [10] alapján ez a membrános művelet kiválóan alkalmas a feladat elvégzésére. A felépített rendszert szemlélteti a 1. ábra. P Pervaporációs membrán modul Csapda a permeátum gyűjtésére Bitzonsági csapdák Bioreaktor 1. ábra: A pervaporációs víztartalom szabályozás folyamatábrája Többféle hidrofil membránt teszteltünk, amik közül a Beroplan által gyártott bizonyult a legmegfelelőbbnek. A víztartalom 7 óra reakcióidő után 3,4 m/m%-on stabilizálódott. A keletkező észter mennyiségének nyomon követéséből viszont azt tapasztaltuk, hogy az elérhető hozam elmaradt az azonos kiindulási összetételű rázatott lombikos kísérletek mögött (2. ábra). Hogy a feltevésünket igazoljuk, az elvont víz mennyiségének változtatására volt szükség. Mivel a használható membrán mérete behatárolt volt (12 cm 2 ), ezért a vízelvétel növeléséhez másik módszert kellett használni. Egyszerű kivitelezhetősége és a kezdetekben tapasztalható nagy vízelvonó képessége miatt a zeolitos adszorpciót választottuk. Az összeállított berendezés a pervaporációnál használt bioreaktorból és egy termosztált, zeolittal töltött oszlopból állt. A mérési eredmények alapján, azonos kiindulási összetételt alkalmazva a tejsav-etil-észter hozam a
pervaporációnál tapasztaltaknál is alacsonyabb lett (2. ábra). hozam (%) 100 80 60 40 20 rázatott lombik pervaporáció zeolit 0 0 2 4 6 8 10 12 14 idő (h) 2. ábra: Tejsav-etil-észter hozam változása különböző víztartalom szabályozások mellett Megvizsgáltuk a reakció során a tejsav és a laktilsav (nyíltláncú dimer) arányának változását zeolitos vízelvétel mellett, HPLC segítségével (3. ábra). tejsav és származékai megoszlása (m/m%) 100% 80% 60% 40% 20% 0% tejsav laktilsav egyéb 0 3 7 11 13 reakcióidő (h) 3. ábra: Tejsav és származékai megoszlása a reakcióelegyben zeolitos vízelvétel során Azt tapasztaltuk, hogy a reakcióidő első 3 órájában a tejsav aránya 61%-ról 47%-ra csökkent (összesen 14%), bár a 10%-os észter hozam csak 6,1% növekedésre ad okot (a 61% monomer tejsav tartalom 10%-a). Tehát a tejsavat nem csak az észterezési reakció fogyasztotta. Ez alátámasztotta azt az elméletünket, miszerint a vízelvonás befolyásolta a reakcióelegy monomer tejsav tartalmát, ezzel hatva a képződő észter mennyiségére. Megállapítottuk, hogy vízelvétel nélkül a reakcióban keletkező víz elősegíti a laktilsav tejsavvá bomlását, ezzel növelve az elérhető észter hozamot. Ezt a vízmennyiséget elvéve megakadályozzuk ezt a folyamatot, ezért csökken a termék kihozatalt. Megvizsgáltuk, mi a hozam szempontjából optimális kezdeti víztartalom pervaporációs vízelvételt alkalmazása mellett, és azt tapasztaltuk, hogy 5%-os kiindulási víztartalomnál már elérhető a rázatott lombikban kapott 58%-os hozam. Összefoglalás Összefoglalásként elmondható, hogy tejsav-etilészter előállítását megvalósítottuk rázatott lombikban víztartalom szabályozás nélkül, illetve bioreaktorban pervaporációs és zeolitos vízelvétel mellett. A mérési eredmények alapján megállapítottuk, hogy azonos kiindulási paraméterek mellett a legnagyobb termékkoncentrációt vízelvétel nélkül lehet elérni, mivel a keletkező víz hatására a laktilsav hidrolízise részben végbemegy, ezzel növelve a szubsztrát tejsav mennyiségét. Az optimális kezdeti víztartalom pervaporáció alkalmazása mellett 5%- nak adódott. Irodalomjegyzék [1] Datta, R., Henry, M., J Chem Technol Biot, 81 1119-1129 (2006) [2] From, M., Adlercreutz, P., Mattisson, B., Biotechnol Lett, 19 315-317 (1997) [3] Parida, S., Dordick, J. S., Am Chem Soc, 133 2253-2259 (1991) [4] Yang, Z., Pan, W., Enzyme Microb Technol, 37 19 28 (2005) [5] Hollmann F., Grzebyk P., Heinrichs V., Doderer K., Thum O., J Mol Catal B-Enzym, 57 257-261 (2009) [6] Vu, D. T., Kolah, A. K., Asthana, N. S., Peereboom, L., Lira, C. T., Miller, D. J., Fluid Phase Equilibr, 236 125-135 (2005) [7] Gubicza L., Bodnár J. MKL, 46 (1) 2-6 (1991) [8] Gubicza, L. Bélafi-Bakó, K., Fehér, E., Fráter, T., Green Chem., 10 1284-1287 (2008) [9] Fehér E., Major B., Bélafi-Bakó K., Gubicza L., Desalination, 241 8-13 (2009) [10] Delgado P., Sanz M. T., Beltrán S., Sep Purif Techn, 64 78-87 (2008)