A nukleáris genom felépítése

A nukleáris genom felépítése 1000 bp = 1 kbp (10 3 ) egy prokariota gén mérete, 1000 kb = 1 Mbp (10 6 ), 1000 Mb = 1 Gbp (10 9 ) 0,6x10 6 bp 600 gén? Mycoplasma genitalium 4,7x10 6 bp 4 700 gén? 4300 gén Escherichia coli 1,3x10 7 bp 13 000 gén? Saccharomyces cerevisiae SV40 rhesus polyomavirus 5243 bp - 8 gén lambda fág (E. coli) 48 kb 90 gén T4 fág (E. coli) 168 kb - 288 gén 9,7x10 7 bp 97 000 gén? Caenorhabditis elegans 1,2x10 8 bp 120 000 gén? Arabidopsis thaliana 3,3x10 9 bp 3 300 000 gén? Homo sapiens 1-1

A bakteriális genomok mérete és a gének száma 1-2

A C-érték paradoxon A C-érték a totál DNS tartalma egy haploid genomnak. A nukleáris DNS mennyisége és az organizmus fejlettsége, filogenetikai pozíciója között nem egyértelmű az összefüggés. Egy rendszertani kategóriában a minimális genomméret általában tükrözi a fejlettséget, DE: A minimális* haploid genomméret növekedése a törzsfejlődés során. (*egy renszertani kategóriában az ismert legkisebb genom nagysága bázispárokban) 1-3

1) azonos fejlettségű fajok között 10x -100x-os méretbeli különbségek lehetnek (legnagyobbak a különbségek az ízeltlábúak, kétéltűek és a virágos növények esetében) 2) a fejlettebb élőlények genommérete sokkal nagyobb mértékben nő, mint azt génjeik feltételezett száma indokolná pl.: a humán gének becsült száma 30-50 000, ami durván 10x több mint az E. coli génjeinek száma, DE a genomok mérete között sokkal nagyobb a különbség: 3300 Mb és 4,7 Mb (kb. 1000x nagyobb a humán genom) Mi okozza az ellentmondást? A haploid genomméret (bp) különböző rendszertani kategóriákban 1-4

DNS renaturációs kísérletek szolgáltatták az első választ. (a) A hiperkróm effektus Tm (melting temperature) az a hőmérséklet, ahol a DNS fele denaturált (egyszálú) formában van. (b) Egy adott DNS-szakasz illetve egy teljes genom Tm értéke annak GC tartalmától függ. Nagyobb G:C tartalom, magasabb Tm értéket eredményez. 1-5

A renaturáció vagy reasszociáció kinetikája Egyszerűbb szervezetek DNS oldatának reasszociációja látható az ábrán. A görbék a reasszociált DNS %-ának alakulását mutatják az idő függvényében. (pontosabban a Co x t függvényében, ahol Co a kiindulási DNS koncentráció, mert a reasszociáció gyorsasága nem csak az időtől, hanem a DNS-oldat koncentrációjátóltól is függ). Kontroll a szintetikus, monoton poliu-polia kettős szál. Komplexitása 1 bp. A komplexitás a gének (egyedi szekvenciák) számával emelkedik. Azonos koncentrációk mellett a reasszociáció ideje a genom komplexitásával nő. Egy ismeretlen genom komplexitása (az egyedi szekvenciák nagysága) a Cot 1/2 érték megmérésével becsülhető. 1-6

Fejlettebb szervezeteknél a renaturációs görbe három részre tagolt: gyorsan, közepesen és lassan renaturálódó DNS. A DNS komplexitása a genomon belül eltérő! 1) gyorsan renaturálódó - kisebb komplexitású, azaz sok ismétlődő szekvencia- erősen repetitív szekvenciák 25%, mintha egy 340 bp hosszú szekvencia 500 000 példányban fordulna elő 2) lassabban renaturálódó - közepesen komplex - közepesen repetitív szekvenciák 30%, 6x10 5 bp 350 példányban 3) lassan renaturálódó - nagy komplexitású - egyedi szekvenciák 45%, 3x10 8 bp 1 példányban Egy magasabban fejlett eukarióta DNS-ének reasszociációja. Reasszociált DNS % az idő (Co x t érték) függvényében. 1-7

A magasabban fejlett eukarióták genomjában a közepesen és nagy fokban repetitív szekvenciák meghatározó mennyiségben vannak jelen. Összességükben kitehetik akár a genom 70%-át is. A genom méretek közötti eltérés, tehát a közel rokon fajok esetében, de a távolabbi rendszertani kategóriákba eső eukarióta fajok esetében is elsősorban a repetitív ( töltelék ) DNS mennyiségétől függ. Nem a gének számának erőteljes változását jelzi! Prokarióták és alacsonyabb fejlettségű eukarióták esetében a genom mérete elsősorban az egyedi szekvenciák (kódoló régiók), azaz a gének számának növekedését tükrözi. (Lásd a következő oldalt.) 1-8

A genomprojektek előrehaladásával lett egyre tisztább a kép. A fejlettséggel együtt nő a gének száma, de ezzel párhuzamosan sokkal nagyobb mértékben 1) csökken az egy adott DNS-szakaszon lévő gének száma (géndenzitás) 2) nő az intronok száma és átlagos hosszúsága (lásd később: cdns, mrns érés) 3) nő a repetitív DNS-szekvenciák aránya. Mindezek kövezkeztében pl. a humán genomban csak 1% a kódoló szekvenciák aránya! Egy prokarióta esetében ez közel 100%. GÉNDENZITÁS: Egy 65 kb DNS-régió szerkezeti jellemzői (exon, intron, repetitív szekvenciák aránya...) négy, különböző fejlettségű fajnál. Középpontjában az RNS polimeráz lagnagyobb alegységének kódoló szakasza áll. Ez a gén az intronok számának és hosszának növekedésével egyre nagyobb helyet foglal el, az ismétlődő szekvenciák aránya is nő, a géndenzitás csökken 1-9

Az átlagos humán génnek csak 5% exon (fehérje kódoló) szekvencia. Az mrns jellegzetes részei még az 5 UTR és a 3 UTR régiók UTR = (untranslated region, nem transzlálódó, fehérjévé nem átíródó régió) Az átlagos exon hossza csak 145 bp, míg egy átlagos intron 3365 bp! 1-10

Molekuláris biológiai értelemben a gén az a DNS-szakasz, ami a funkcionális géntermék (RNS, fehérje) szabályozott elkészítéséhez szükséges. Tehát nem csak az adott RNS (trns, rrns ) vagy fehérje kódoló régióját jelenti, hanem a génátírást irányító promóter és szabályozó elemek, valamint a transzkripció végét jelző szignálok összességét is. A génekhez tartozó szekvenciák között szerepelnek a pszeudogének, nem működő gének is. Ezek létrejöhetnek reverz transzkriptáz enzimaktivitások következményeként, amikor is promóter nélküli (tehát nem expresszálódó) kódoló szekvenciák keletkeznek. Az mrns-ről a reverz transzkiptáz (retrovírusok, retrotranszpozonok, lásd később) DNS másolatot készít, ami véletlenszerűen beépülhet a genomba. Mivel az átíródást (transzkripció) biztosító szabályozó elemek hiányoznak, ez a génszerű szekvencia nem funkcióképes. 1-11

A nem kódoló szekvenciák arányát mutatja a két ábra. intronok, transzpozonok és hasonló szekvenciák, nagy duplikációk, egyszerű ismétlődések, egyéb 1-12

Repetitív, ismétlődő szekvenciák simple sequence DNA vagy szatellit DNS-szekvenciák rövid azonos v. nagyon hasonló DNS szakaszok ismétlődnek kimutatás először CsCl egyensúlyi ultracentrifugálás A centrifugálás hatására CsCl sűrűséggrádiens jön létre a csőben. Ebben az oldatban a DNS a neki megfelelő (bázisösszetételtől függő) sűrűségű régióban állapodik meg ( úszik ). Egy kisebb frakció sűrűsége eltér a genom más részének sűrűségétől, ezért elkülönitve jelenik meg. Ez a szatellit DNS. Mint kiderült, különleges szekvenciákat tartalmaz. mikroszatellit DNS 1-13 bázis ismétlődik néhány 100 bp-on keresztül, replikációs hiba (elcsúszás) következtében gyorsan változhatnak, kromoszómára jellemző lehet (ábra) miniszatellit DNS 15-100 bp szekvencia ismétlődik 1-5 kb hosszan szatellit DNS 20-100 kb hosszú A nukleáris DNS fragmentek megoszlása a különböző sűrűségű CsCl frakciókban (a grádiens denzitása balról jobbra csökken) A szatellit DNS nagy része a centromer és a telomerek közelében található. 1-13

Egy adott repetitív szekvencia jelenléte jellemző lehet egy kromoszómára. FISH (fluorescence in situ hybridization) technika segítségével ez kimutatható. A fluoreszcens vegyülettel jelölt repetitív DNS szakaszt ( próba ) hozzáadják a kromoszóma preparátumhoz. Megfelelő körülmények között a próba specifikusan kötődik (hibridizál) a vele komplementer DNS szakaszhoz, és csak ahhoz. DNS-DNS hibridizáció A denaturált DNS mintához adják a denatuált, jelölt (izotóp, fluoreszcens festék) próba DNS-t. Olyan körülményeket teremtenek, ahol a komplementer szálak ismét összekapcsolódhatnak. A jelölés segítségével láthatóvá válik a keresett DNS-szakasz helyzete a preparátumon, DNS gélen... stb (lásd később). 1-14

Egér szatellit DNS szekvenciája. A hosszabb szakasz nagyon hasonló bázissorrendű, kisebb egységekből áll. A szakasz két felét illetve negyed részeit egymás alá rendezve a hasonlóság kimutatható. 1-15

Az ismétlődések végső alapja a repeat nyolcad részeinek illesztése után a leggyakrabban előfordló betűket összegző ún. konszenzus szekvencia. Feltételezik, hogy az evolúció során az ábra alján jelzett szekvenciából (ancestral?) fejlődött ki a hosszabb ismétlődés duplikációk és pontmutációk együttes hatására. 1-16

Az ismétlődések tagszáma rekombináció révén is változhat és a változás öröklődhet, ha a meiózis során a kromoszómapár két tagja között jön létre átrendeződés. Az ismétlődések tagszáma replikációs hiba (elcsúszott bázispárosodás) miatt is változhat, nőhet vagy csökkenhet. Az ismétlődésekben bekövetkező változásoknak az egyed életképességére általában nincs hatása, mert nem kódoló régiókat érintenek. Ezért minden változás öröklődik. Az az ismétlődések tagszáma akár egyedi szintű azonosításra is lehetőséget ad. Lásd később: DNS-polimorfizmus, DNS fingerprint, DNS technikák alkalmazása a genetikai térképezésben, a bűnüldözésben, apasági perekben... stb. 1-17

MOBIL DNS Kukoricában írt le először Barbara McClintock mozgó géneket (1940-es évek, Ac és Ds elemek). Felfedezéséért jóval később, 1983-ban kapott Nobeldíjat. A mozgó genetikai elemek szerkezetét prokarióta rendszeren ismerték meg először (lásd inszerciós szekvenciák (IS), transzpozonok). Emlősök esetében a genom 25-50 %-át alkotják. A humán genom 45%-a ún. mobil DNS szakaszokból vagy azok mozgásképtelen származékaiból áll (a teljes genom szekvencia megismerése adott pontos képet róluk). Különböző ugráló gének vagy transzpozábilis elemek a prokarióta és az eukarióta gemomban egyaránt találhatók. A transzpozíció segítségével az elem önálló életet él, mozoghat a genomon belül, mutációkat okozhat, befolyásolja a teljes genom evolúcióját. 1-18

MOBIL DNS Két forma, amely az áthelyeződés mechanizmusában, és így a folyamathoz szükséges génekben (enzimekben) tér el: a) inszerciós szekvencia v. IS elem és transzpozon DNS alapú b) retrotranszpozonok és származékaik RNS intermedier 1-19

a) inszerciós szekvencia v. IS elem és transzpozon Meghatározott DNS szakasz mozog. Áthelyeződésüket egy speciális enzim, a transzpozáz segíti, amelynek génje a mozgó DNS-szakaszon található. Egy bakteriális IS elem felépítése. Jellegzetessége a fordítottan ismétlődő, két rövid határoló szekvencia (piros téglalapok). A beépülés helyén néhány bázispár direkt ismétődés figylhető meg (fekete téglalapok). Középen a transzpozáz gén. A humán genomban 300 000 hasonló, teljes hosszúságú vagy csonka rokon szekvencia található (3%). 1-20

Retrotranszpozon szekvenciák Tartalmazhatják a retrovíusokra jellemző kódoló szekvenciákat, kivéve az envelop fehérjékét. RNS intermedier (RNS-polimeráz) Reverz transzkriptáz RNS DNS átírás és integráz DNS szakasz beékelődése a genomba 1) Viral vagy LTR retrotranszpozonok long terminal repeat (LTR), hosszú ismétlődő végek. Elterjedtek élesztőtől a muslicán át a humán genomig. A humán genomban 8%. 2) Nonviral vagy non-ltr retrotrasnzpozonok: nincs LTR szekvencia, Emlősökben a legelterjedtebb (abundáns) retrotranszpozon szekvenciák. Közepesen repetitív szekvenciacsalád, két típussal. A retrovírusok RNS vírusok, melyek burka fertőzéskor fúzionál a sejthártyával. A vírus genomnak tekinthető RNS a burokban lévő reverz transzkriptáz fehérjével együtt bekerül a citoplazmába. Itt az RNS-ről a reverz transzkriptáz egy kettős szálú DNS-másolatot készít (kivétel a centrális dogma alól), aminek mindkét végén LTR-szekvencia található. Az elkészült DNS-szakasz bekerül a sejtmagba és random integrálódik a genomba (provírus). A provírusról egyrészt mrns molekulák képződnek, melyek a vírus összeszereléséhez szükséges fehérjék és a reverz transzkriptáz elkészülését irányítják, másrészt átíródik a vírus genomot jelentő teljes hosszúságú RNS is, amely bekerül a sejtből kiszabaduló virionba. 1-21

Az ORF1 RNS kötő fehérjét, az ORF2 egy reverz transzkriptáz és DNS-endonukleáz aktivitással rendelkező fehérjét kódol. 2a) A hosszú LINE (long interspersed elements) -6 kb körüli méretűek, és a leggyakoribb humán közepesen repetitív szekvenciák. A humán genomban 900 000 helyen és 21% arányban vannak jelen. 2b) A rövid SINE - (short interspersed elements) 100-400 bp hosszúak. A/T gazdag szakasz van az elejükön (5 vég), ami a LINE szekvenciákra is jellemző. Alu elemeknek is nevezik őket, mert általában egy AluI nevü, specifikus endonukleáz hasítóhely van rajtuk. A humán genomban 1,3 millió helyen, 13 %-ban vannak jelen. 1-22

Az eukarióta genom összetevői és részarányuk a humán genomban TÍPUS HOSSZ KÓPIA ARÁNY GÉNEK Fehérjekódoló gének egyedi gének duplikációk, géncsaládok Tandem ismétlődő gének (rrns, trns, snrna, hiszton) változó 1 2 1000 20-300 15* (0,8) % 15* (0,8) % 0,3 % ISMÉTLŐDŐ DNS Simple sequence repeat (szatellit DNS) 1-500 bp változó 3 % Transzpozonok DNS transzpozonok Retrotranszpozonok LTR (long terminal repeat), vírus-szerű retrotranszpozonok Non-LTR (nonviral) retrotranszpozonok LINE SINE 2-3 kb 6-11 kb 6-8 kb 100-300 bp 300 000 440 000 860 000 1 600 000 3 % 8 % 21 % 13 % 45 % Pszeudogének változó 1-100 0,4 % Egyéb DNS változó - 25 % *intronokkal (csak exonok), a humán gének számát 30-35 ezerre becsülik jelenleg. 1-23

Evolúciós jelentőség Génduplikáció, új exon kombinációk. A mobil illetve ismétlődő szekvenciák jelentősen befolyásolhatták az egyes gének illetve a genom fejlődését az evolúció során. Rekombináció, transzpozíció nyomán különböző eredetű exonok kerülhettek egymás mellé. Ha ezek egy fehérjedomént határoztak meg, új doménkombinációval rendelkező fehérjék jöhettek létre és próbáltattak ki. Ez az exon shuffling, az exonok megkeverése. Rekombináció Alu szekvenciák közreműködésével. A kicserélődés homológ rekombináción alapul, bár a két Alu szekvencia között nem azonos a kromoszómák szekvenciája. 1-24

Gén vagy exon áthelyeződés lehetséges speciális rekombinációs folyamatok révén, transzpozon vagy retrotranszpozon elemek segítségével. Az eredeti kópia maradhat a helyén. 1-25

Géncsaládok A legtöbb gén egy példányban van jelen egy haploid genomban, de előfordulnak géncsaládok is, ahol hasonló szekvenciák egymáshoz közel vagy elszórtan helyezkednek el. Sorozatos génduplikációval alakulhattak ki. A több példány megléte lehetőséget biztosít a specializációra, a módosult funkció kialakulására. A géncsaládok által kódolt fehérjék fehérjecsaládokba sorolható - akár sokszáz tagjuk is lehet. Az L1 a régióban jelen lévő LINE szekvencia előfordulását jelzi, amely a géncsalád kifejlődésében szerepet játszhatott. Jelelgzetes fehérjecsaládokat alkotnak a protein kinázok, transzkripciós faktorok, immunglobulinok, citoszkeleton fehérjék, miozin nehézláncok, globinok. A β-globinok: β, δ, ε, Aγ, Gγ gének által kódolt variációk specializálódott formák. Pl. az Aγ, Gγ gének a magzati élet alatt expresszálódnak. Erősebb oxigénkötés. 1-26

A bakteriális genomok mérete és a gének száma Az eukarióta genomok mérete és a gének száma 1-27

A nukleáris genom felépítése 1000 bp = 1 kbp (10 3 ) egy prokariota gén mérete, 1000 kb = 1 Mbp (10 6 ), 1000 Mb = 1 Gbp (10 9 ) 0,6x10 6 bp (600 kb) Mycoplasma genitalium 4,7x10 6 bp (4,7 Mb) 4300 gén Escherichia coli 1,3x10 7 bp (13 Mb) Saccharomyces cerevisiae SV40 rhesus polyomavirus 5243 bp - 8 gén lambda fág (E. coli) 48 kb 90 gén T4 fág (E. coli) 168 kb - 288 gén 9,7x10 7 bp (97 Mb) Caenorhabditis elegans 1,2x10 8 bp (120 Mb) Arabidopsis thaliana 3,3x10 9 bp (3,3 Gb) Homo sapiens 1-28

A GÉNEXPRESSZIÓ VIZSGÁLATA A DNS nemcsak tárolja az információt, hanem lehetővé teszi annak szabályozott érvényre jutását, kifejeződését. A génexpresszió során a génekről RNS-molekulák keletkeznek (transzkripció), melyek mint speciális RNS-ek (trns, rrns, snrns ) funkcionálnak, vagy mint mrns-ek a gének által kódolt fehérjék elkészülését (transzláció) irányítják. Az információ áramlás iránya: DNS RNS fehérje. Ez a centrális dogma, amely a reverz transzkriptázok felfedezésével részben módosult. A génkifejeződést a gén által kódolt RNS illetve fehérje megjelenésének detektálása segítségével vizsgálhatjuk. RNS kimutatás hibridizációval Northern-blott, differenciál hibridizáció, DNS-chip, microarray in situ hibridizáció Fehérjék kimutatása Western-blott ellenanyagokkal in situ detektálás ellenanyagokkal fehérje chip foszforiláltság vizsgálata enzimaktivitás detektálása riporter gének, transzgenikus élőlények 1-29

Különböző szövetekből vagy kezelésekből vett minták RNS tisztítás elválasztás: denaturáló agaróz vagy poliakrilamid gélelektroforézis Northern-blottolás (RNS-filter) jelölt génszakasz hibridizáció előhívás 1-30

1-31

cdns géntár, differenciál hibridizáció csirke oviduktusz példányszám / sejt 100.000 4.000 5 mrns-féle 1 mrns - ovalbumin 7 féle mrns 12.500 féle mrns genomikus géntár: a teljes genomból, - milliós klónszám, - minden szekvencia közel azonos arányban cdns klóntár: a működő gének lenyomata, érett mrns szekvenciákról - tíz-százezres klónszám, - erősen eltérő arányban a szekvenciák (0-100.000) - többféle mrns minta / többféle géntár - alkalmas a különböző expressziós mintázatú gének azonosítására - nincs: intron, viszonylag rövid szekvenciák (1-5 kb) DE pl. a disztrofin gén 2.000 kb ( majd fél E. coli genom!) hosszúságú és a róla keletkező érett mrns is 14 kb - 3685 AS hoszú fehérje). - nincs promoter és más szabályozó elemek, ezek azonosításához genomikus géntár kell 1-32

eukarióta mrns tisztítás oligo-dt oszlop reverz transzkriptáz cdns-szintézis terminális transzferáz védelem: metilálás 1-33

védelem: metilálás EcoRI linker ligálás EcoRI hasítás és vektorba klónozás (in vitro pakolás, lambda fág vektor) 1-34

Dot-blott 1-35

DNS-chip.microarray 1-36

DNS-chip.microarray 1-37

Riporter gének, génfúziók 1-38

Riporter gének: fontosabb rendszerek és felhasználásuk kódolt fehérje eredet detektálás főbb alklamazások β -galactosidase E. coli lacz, lac operon Xgal kék szín In vivo génexpresszió követés baktériumokban In situ génexpresszió elemzés, transzgenikus állatokban, növényekben (ONPG) GUS β-glükuronidáz E. coli gus operon uida gén X-glu kék In vivo génexpresszió követés élesztőben és transzgenikus növényekben in situ protein targeting és transzport CAT chloramphenicol acetyl transferase E. coli, transzpozon Tn9 [ 3 H]- vagy [ 14 C] chloramphenicol Ac-CoA vagy ellenanyaggal In vitro génexpresszió elemzés vékonyréteg kromatográfia, autoradiográfia immuncitokémia, in situ enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) Luciferase szentjánosbogár lux gén Photinus pyralis Luciferin + ATP + O2 fény oxyluciferin érzékeny CCD kamera biolumineszcencia hatékonyság több mint 90% In vivo génexpresszió követés transzgenikus élőlényekben GFP Green fluorescent protein medúza Aequorea victoria 395 nm gerjesztés 509 nm, zöld fluoreszkálás In vivo génexpresszió követés transzgenikus élőlényekben, sejten belüli likalizáció, több folyamat egyidejű követése (különböző színek) 1-39

1-40

Transzgenikus élőlények 1-41

1-42

vektor új génkonstrukció neo R SZELEKCIÓ és ELLENŐRZÉS neomicin jelenlétében csak a konstrukciót tartalmazó sejtek nőnek A blasztocisztából embrionális őssejteket (embrionális sztemsejt, ES) izolálnak, amelyek petricsészében tenyészthetők. A génkonstrukció bejuttatása után ki lehet válogatni (neo) a transzgenikus (transzfektált) sejteket. Ellenőrizni lehet (PCR, hibridizáció) a DNS-beépülést (példányszám, pozíció). A transzgenikus ES sejteket bejuttatják blasztocisztába (eltérő szőrszín) álvemhes anya Hátrány: kiméra keletkezik Keresztezés szükséges a valódi trasnzgenikus egyed létrehozásához. 1-43

Génkiütés: a knock out technika Szelekció a konstrukció beépülésére (kanamicin, neo) Ellenszelekció a véletlenszerűen beépült DNS-t tartalmazó sejtek elpusztítására. A tk (timidin kináz) gén érzékenyít a ganciklovir vegyületre (bázisanalóg). A homológ rekombinációval a célgénbe beépült DNS-szakasz nem tartalmazza a tk gént. Ritka esemény, de kiválogatható: kanr, ganr sejtek. 1-44

1-45

1-46

Transzgenikus növények Agrobacterium fertőzés paradicsom növényen 1-47

RB Auxin produkció Citokinin produkció Opin szintézis LB Rhizobiaceae család, Gram negatív talajbaktériumok Agrobacterium tumefaciens - Agrobacterium rhizogenes törzsek kétszikü növényeken - gyökérgolyva vagy crown gall tumor hormonmentes táptalajon lehet a tumorszövetet fenntartani - auxin és citokinin termelés bakteriális DNS a tumorszövet sejtmagjában! -természetes transzformáció (genetikai gyarmatosítás) 1-48

1-49

1-50

Prokarióta génszabályozás a transzkripció szintjén - külön fájlban Eukarióta génszabályozás a transzkripció szintjén- külön fájlban 1-51

1-52

Fehérje transzportmechanizmusok az eukariota sejtben: 1) transzmembrán transzport kitekert formában, egyedi fehérjék transzportja célzottan - citoszol ER, citoszol MT 2) póruson keresztüli transzport (gated transport) nukleusz, nukleáris pórus, aktív térszerkezet megmarad, komplexek ellenőrzött transzportja 3) vezikuláris transzport egyik kompartmentből a másikba, membránba zárva, lefűződés és fúzió a másik kompartmenttel: ER Golgi transzfert irányító szignálok a fehérjéken 1-53

A SEJTMAG (nucleus) Az eukarióta sejt dupla membránnal körülvett része. A külső membrán egybefügg az endoplazmatikus retikulummal (ER). nukleáris membrán a genetikai anyag mechanikai védelme elkülönítés (transzkripció, transzláció) speciális funkciók nukleáris lamina - erősítés nukleáris pórus magi transzport nukleoplazma kromatin nukleáris genom nukleolusz riboszóma összeszerelés 1-54

Nukleusz nukleoplazma kromatin, fehérje és DNS elkülönülnek benne: nukleolusz membrán nélküli elektrondenz rész, intenzív RNS szintézis (rrns) heterokromatin elektrondenz, sötétebb, erősen kondenzált, csomagolt DNS eukromatin lazább szerkezet az interfázisos sejtmagban, a működő gének főleg itt 1-55

NUKLEÁRIS LAMINA lamin fehérjék intermedier filamentumok, membránok erősítése, laminok, nukleáris membrán, nukleáris mátrix lamin A, C és B fehérjék lamin A és C egy gén által kódolt, alternatív splicing lamin A 133 AS-val hosszabb a C-terminális részén lamin B fehérje poszttranszlációs módosítás hidrofób izoprenil (zsírsav) csoport, belső nukleáris membránba rögzítés dimerek, α-helix pálca, globuláris fej, fej-fej ill. farok-farok polimerizáció az interfázisos sejtmagban lamin dimer lamin tetramer farok-farok polimerizáció sejtosztódás előtt depolimerizáció Ser-P foszforiláció laminb-(p) nukleáris membránhoz kötött marad, a többi az oldatban 1-56

A nukleáris pórus complex (NPC) nyolcszögletü kosár 125 000 kd nagyságú fehérje komlplex 30x nagyobb mint egy riboszóma citoplazmikus filamentumok nukleoplazmikus kosár gyűrűk (citoplazmikus, központi és nukleoplazmikus) 60 kd nagyságú globuláris fehérjéig átjárható (vizes csatorna, ionok, kisebb molekulák - diffúzióval) nukleoporin fehérjék alkotják: 50 féle fehérje élesztőnél, 100 körül gerinceseknél A nukleáris póris képe a citoplazmikus (a) és a nukleoplazmikus (b) felszínen 1-57

Nukleáris transzport makromolekulák, ribonukleoprotein (RNP) komplexek irányított transzport (export és import) Minden fehérje a citoplazmában szintetizálódik és a nukleáris póruson keresztül jut be ill. utána ki - sok esetben körforgalom (hisztonok, transzkripciós alap és regulátor fehérjék, mrns érés, replikáció, rekombináció, repair (javító) fehérjék, riboszómális fehérjék! 10 6 hiszton fehérje / 3 min. - S fázisban transzportin fehéjék végzik a szállítást (importinok, exportinok) nukleáris likalizációs szignál (NLS) van a magi fehérjéken Első bizonyítékok: SV40 vírus nagy T-antigén fehérje génben mutánsok, a hibás fehérje nem transzportálódik a sejtmagba -x-x- Pro-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val -x-xbázikus motívumot kódoló régión belül találhatók a mutációk Pro-Pro-Pro-Lys-Thr-Lys- Arg-Lys-Val - nem működik Kísérletek hibrid fehérjékkel: NLS szignál: bárhol lehet, 4-8 AS, két blokkban (2-4 AS) Ha egy citoszolikus hibrid fehérje tartalmazza a motívumot, bekerül a sejtmagba. Nyomkövetés ellenanyaggal. (a): normál fehérje lokalizáció, (b): NLS motívumot tartalmazó hibrid fehérje helyzete 1-58

Nukleáris import négy komponens Ran monomer G-protein GTP, GDP kötés NTF2 - nukleáris transzport faktor 2 (Ran-GDP import) nukleáris import receptor: importin α NLS felismerő domén importin β - FG-nukleoporin felismerés FG-nukleoporin megtalálható a citoplazmikus filamentumokban, a csatorna belsejében és a kosárban, fenilalanin (F) és glicin (G) gazdag hidrofób régió, ezeket felismerve és ezekkel kölcsönhatva jut be az importin komplex (cargo complex) közvetlen energia felhasználás (ATP) nincs. Vannak más típusú NLS szignálok, amelyeket különböző importin β homológ fehérjék ismernek fel, nem szükséges az α alegység A cargo komplex kialakulása: a) szabad importin az NLS-hez kötődik import b) Ran-GDP-NTF2 komplex import A cargo komplex szétesése transzport után: a nukleoplazmában a Ran-GDP Ran-GTP átalakulást a GEF protein (guanine nucleotideexchange factor) segíti. A Ran-GTP kötődik az importinhoz és ez a komplex exportálódik, majd a GAP (GTPase accelerating protein, citoplazmikus filamentumon) hatására Ran-GDP keletkezik a komplex szétesik 1-59

Nukleáris export proteinek, trns, riboszóma alegységek exportja hasonló mechanizmus exportinok nukleáris export receptor, exportin 1 NES (nuclear export signal) Leu gazdag, ill más, még nem ismert szignálok NES (Leu) található pl. a HIV Rev fehérjén Ran-GTP/exportin1/NES-protein komplex ki Általános ciklus: Ran-GTP keletkezik a nukleuszban (GEF) ez jut ki komplexben vagy 1) az üres importinnal, vagy 2) az exportin-cargo komplexszel együtt Ran-GDP keletkezik kívül, a citoplazmikus filamentumokon lévő GAP fehérje által Ran-GDP- NTF2 import, visza a sejtmagba 1-60

A transzport szabályozása Számos fehérje folyamatosan ingázik a citoplazma és a sejtmag között mrns export fehérjék, mind NLS mind NES szakaszokat tartalmaz a fehérje Számos génreguláló fehérje csak bizonyos szignálok meglétekor transzportálódik -foszforiláció megléte vagy hiánya módosítja az NLS felismerhetőségét - maszkírozás: citoplazmikus fehérje kapcsolódása elfedheti az NLS szekvenciát, így a fehérje a citoplazmában marad a maszkírozó fehérje leválása (jel) után történhet meg a transzport 1-61

Egy példa: a glükokortikoid receptor 1) A receptor a hsp90 hősokk fehérjével komplexet alkot, ha nincs hormon az NLS rész rejtve 2) Ha hormon kötődik a receptorhoz konformáció változás, hsp90 leválik, NLS szabad 3) A nukleáris transzport után a DNS-kötő domén segítségével transzkripció aktiválás a hormon által szabályozott gének bekapcsolva, génexpresszió. 1-62

A kromatin egy átlagos humán kromoszóma 280 Mb a haploid humán genom 3 Gb (3x10 9 bp), aminek a hossza 1 m (a sejtmag 10-15 µm) (prokarióták: E. coli kromoszóma 1 mm, a sejt 1µm hossszú) 100 000 x es tömörítés szükséges, hogy a kromatin elféjen a sejtmagban Egy kromoszóma DNS állományának egy része. Fehérjementesített preparátum EM képe. Egyetlen kígyózó DNS-fonál alkotja. A kép alsó részén a fehérjékből álló vázszerkezet maradványa a scaffold látható. 1-63

A kromoszóma metafázisban citogenetikailag jellegzetes szerkezet, protein-dns komplexek fele-fele arányban a két alkotó A kromatin fehérjék hiszton és nonhiszton fehérjékre oszthatók. Legnagyobb mennyiségben minden eukarióta sejtmagban a hiszton fehérjék vannak. A hisztonok kis méretű, bázikus fehérjék. Öt fő típusuk van: H1, H2a, H2b, H3, H4 mindegyik gazdag pozitív töltésű, bázikus aminosavakban (Arg=R, Lys=K, His=H), melyek szoros kölcsönhatásba lépnek a negatívan töltött DNS-sel (foszfát csoport). Erősen konzerválódott aminosavsorrend: tengerisün H3 1 AS eltérés szarvasmarha H3 4 AS eltérés borsó H3 1-64

A nukleoszóma Alacsony sókoncentrációnál és Mg ++ hiányában a kromatin 10 nm vastag fonalként izolálható, amelyen gyöngyszerű képletek, nukleoszómák vannak. Ezekre tekeredik fel a DNS (2 fordulat, 146 bp). Két nukleoszóma között szabadon lévő kapcsló v. linker DNS található (20-60 bp). A 10 és a 30 nm vastag szál EM képe. Egy nukleoszóma 2-2 molekula H2a, H2b, H3 és H4 hisztont tartalmaz, amelyek egyenként kb. 100 AS hosszúak. N-terminális szabad farok, Lys aminosavak amino csoportjai kölcsönhatásban a két nukleoszóma közötti linker DNS-sel. Acetiláció (+) töltés megszűnik, csomagolás lazul Metiláció (+) töltés stabilizálódik, mert gátolja az acetilációt, kompakt szerkezet marad. Az Arg aminosavak szintén metilálódhatnak A Ser, Thr pedig foszforilálódhat (P), ezzel negatív töltések keletkeznek a hisztonokon, így a kromatin struktúra fellazul. A hisztonok és a DNS között létrejövő, nem szekvencia-specifikus H-híd kötések tovább stabilizálják a kapcsolatot. 1-65

A nukleoszómákra feltekeredett kromatin szerkezetet nemcsak a H2-H4 hisztonok N-terminális része, hanem a H1 hiszton is segít egymáshoz rögzíteni. Ez kb. 200 AS hosszú, és egy molekula kapcsolódik minden nukleoszómához. A 30 nm vastag szál egy fehérje vázhoz (szkaffold) kapcsolódik, további hurkokba rendeződve. A szkaffold természete még kevéssé ismert. A hurkokba rendezett szál 300 nm vastag és tovább tömörödik egy kb 700 nm vastagságú tekercsben. A metafázisos kromoszómát két, erősen feltekercselt DNS kettős spirál alkotja, amelyek osztódáskor a két utódsejtbe kerülnek. A hisztonfehérjék N-terminális farok részének módoításai szabják meg a kromatin állapotát. Specifikus fehérjék kötődhetnek ezekhez a részekhez, amelyek a bromo domén vagy kromo domén segítségével ismerik fel az egyes szakaszokat. Bromo domén: acetilált hiszton farok felismerése, kapcsolat hiszton acetil-transzferázokkal és deacetiláz enzimekkel Kromo domén: metilált hiszton farok felismerése hiszton metil-transzferázok és demetilázok A bromo ill kromo domén megjelenik transzkripciót szabályozó ill. kromatin szerkezetet befolyásoló más fehérjéken is. 1-66

A SEJTMAGVACSKA - NUCLEOLUS Erőteljes rrns szintézis és egyidejűleg sok riboszómális fehérje megjelenése (sejtmagi transzport) teszi láthatóvá a nukleóluszt a sejmagon belül. A nukleólusz egy riboszóma összeszerelő üzem. Dense fibrillar - rrns átírás, granular - riboszóma szerelés 1-67

Riboszómális RNS gének Prokariótáknál a traszkripciót egy RNS-polimeráz végzi, míg eukariótáknál három RNS polimeráz van: RNS pol I - 45S rrns (18S, 5,8S, 28S) RNS pol II - mrns, snrns RNS pol III - 5S rrns, trns A génexpresszió hatásfoka: egy abundáns fehérje esetében elég egy erősen átíródó gén, a transzláció sokszorozza a hatást 1 mrns-ről akár - 10 000 fehérje is képződhet riboszómális RNS gének erős promóter, de ez kevés lenne sokszorozás csak a kópiaszám növelésével tandem ismétlődés E. coli - 7 gén ember - 200 rrns gén, 5 különböző kromoszómán (1n) X. laevis - 600 gén egy csoportban! A humán 45S rrns gén 45S rrns prekurzor - 18S, 5,8S, 28S rrns 5S rrns gén máshol spacer DNS promóterek pre-rrns érés 18S - 2000 nt - riboszóma kis alegység 5,8S - 160 nt 28S - 5000 nt rrns Emberben 200 5S rrns gén az 1. kromoszómán 5S rrns - 120 nt rrns 1-68

A nukleoláris állomány a nukleusz többi részétől elkülönítve izolálható. A nukleóluszt alkotó kromoszóma szakaszok egy területre rendeződnek. Nukleolar organizer - nukleólusz szervező - szakaszok a 45S rrns géncsoportok. A riboszómák felépítésében, összeszerelésében több mint 80 fehérje vesz részt. A nucleolin fehérje - burkolja a képződő 45S rrns-t. További RNS kötő fehérjék és az U3 snrnp is segíti az összeszerelést snorns-ek (kb 150 small nucleolar RNS) vesznek részt az érési folyamatokban (45S RNS vágás, és metilációval a pszeudouridin bázisok kialakítása). snornp ribonukleoprotein komplexek Az 5S rrns nem a nukleóluszban keletkezik. Fehérjék egyenkénti importja és a félig kész riboszómák exportja (lásd a jobb oldali ábrát). 1-69