A SEJTMAG (nucleus) Az eukarióta sejt dupla membránnal körülvett része. A külső membrán összefügg az endoplazmatikus retikulummal (ER).

Átírás

1 A SEJTMAG (nucleus) Az eukarióta sejt dupla membránnal körülvett része. A külső membrán összefügg az endoplazmatikus retikulummal (ER). nukleoplazma kromatin nukleáris genom nukleolusz riboszóma összeszerelés nukleáris membrán a genetikai anyag mechanikai védelme elkülönítés (transzkripció, transzláció) speciális funkciók nukleáris pórus magi transzport 8-1

2 eukromatin Nukleusz (N) N nukleoplazma kromatin: fehérje és DNS (RNS) 1:1 elkülönülnek benne: n nukleolusz (n) membrán nélküli elektrondenz rész, intenzív RNS szintézis (rrns) heterokromatin elektrondenz, sötétebb, erősen kondenzált, csomagolt DNS heterokromatin eukromatin lazább szerkezet az interfázisos sejtmagban, a működő gének főleg itt 8-2

3 A kromatin Egy átlagos humán kromoszóma 130 Mb, ami kiterítve 44,2 mm (3,4 Å/bp) (teljes genom (2n) 2 méter!) Az átlagos metafázisos kromoszóma 4,5 µm (a sejtmag µm átmérőjű) 44 mm = 4x 10 4 µm x es tömörítés szükséges, hogy a kromatin elférjen a sejtmagban! (A teljes humán genom 3 Gb, több mint 1 m hosszú!) prokarióták: E. coli kromoszóma 1 mm, a sejt 1 µm hossszú 10 Å = 1nm / 1000 nm = 1 µm / 1000 µm = 1 mm Egy kromoszóma DNS állományának egy része kiterítve. Fehérjementesített preparátum EM képe. Egyetlen kígyózó DNS-fonál alkotja. A kép alsó részén a fehérjékből álló vázszerkezet maradványa, a scaffold látható. 8-3

4 A kromoszóma metafázisban citogenetikailag jellegzetes szerkezet, protein-dns komplex. Fele-fele arányban a két alkotó. A kromatin fehérjék hiszton és nonhiszton fehérjékre oszthatók. (nonhiszton fehérjék?) Legnagyobb mennyiségben, minden eukarióta sejtmagban, a hiszton fehérjék vannak. A hisztonok kis méretű, bázikus fehérjék. Öt fő típus: H1, H2a, H2b, H3, H4 mindegyik gazdag pozitív töltésű, bázikus aminosavakban (Arg=R, Lys=K, His=H), amelyek szoros kölcsönhatásba lépnek a negatívan töltött DNS-sel (foszfát csoportok). Erősen konzerválódott aminosavsorrend: tengerisün H3 1 AS eltérés szarvasmarha H3 4 AS eltérés borsó H3 8-4

5 H4 hiszton szekvenciák illesztése - egymilliárd éve alig változtak (bázikus aminosav: ) Zm Zea mays At Arabidopsis thaliana Ps Pisum sativum Ce Caenorhabditis elegans Dm Drosophila melanogaster Bt Bos taurus Hs Homo sapiens 8-5

6 A nukleoszóma Alacsony sókoncentrációnál és Mg ++ hiányában a kromatin 10 nm vastag fonalként izolálható, amelyen gyöngyszerű képletek, nukleoszómák vannak. Ezekre tekeredik fel a DNS (2 fordulat, 160 bp). Két nukleoszóma között szabadon lévő kapcsló v. linker DNS található (20-60 bp). Egy nukleoszóma 2-2 molekula H2a, H2b, H3 és H4 hisztont tartalmaz, amelyek egyenként kb. 100 AS hosszúak. N-terminális AS hosszú szabad rész, Lys aminosavak amino csoportjai kölcsönhatásban a két nukleoszóma közötti linker DNSsel. A 10 és a 30 nm vastag szál EM képe. 160 bp 2x hurok Acetiláció (+) töltés megszűnik, csomagolás lazul Metiláció (+) töltés stabilizálódik, mert gátolja az acetilációt, kompakt szerkezet marad. Az Arg aminosavak szintén metilálódhatnak A Ser, Thr pedig foszforilálódhat (P), ezzel negatív töltések keletkeznek a hisztonokon, így a kromatin struktúra fellazul. A hisztonok és a DNS között létrejövő, nem szekvencia-specifikus H- híd kötések tovább stabilizálják a kapcsolatot. 40 bp kapcsoló, linker DNS 8-6

7 A nukleoszómákra feltekeredett kromatin szerkezetet nemcsak a H2-H4 hisztonok N-terminális része, hanem a H1 hiszton is segít egymáshoz rögzíteni. Ez kb. 200 AS hosszú, és egy molekula kapcsolódik minden nukleoszómához. Szolenoid v. 30 nm-es szál alakul ki, melyben 6 nukleoszóma van egy csavarulatban. A nem expresszálódó DNS-szakaszok ebben a formában találhatók, míg a működő gének a 10 nm-es kitekeredett állapotban vannak. A 30 nm vastag szál egy fehérje vázhoz (szkaffold) kapcsolódik, további hurkokba rendeződve. A váz természete még kevéssé ismert: nonhistone scaffold proteinek topoizomeráz II kb hosszúságú hurkok 8-7

8 A hurkokba rendezett szál 300 nm vastag és tovább tömörödik egy kb 700 nm vastagságú tekercsben. A metafázisos kromoszómát két, erősen feltekercselt DNS kettős spirál alkotja (testvérkromatidák), melyek osztódáskor a két utódsejtbe kerülnek. 8-8

9 A SEJTMAGVACSKA - NUCLEOLUS Erőteljes rrns szintézis és egyidejűleg sok riboszómális fehérje megjelenése (sejtmagi transzport) teszi láthatóvá a nukleóluszt a sejmagon belül. A nukleólusz egy riboszóma összeszerelő üzem. Dense fibrillar - rrns átírás, granular - riboszóma szerelés 8-9

10 Riboszómális RNS gének Prokariótáknál a traszkripciót egy RNS-polimeráz végzi, míg eukariótáknál három RNS polimeráz van: RNS pol I - 45S rrns (18S, 5,8S, 28S) RNS pol II - mrns, snrns RNS pol III - 5S rrns, trns A génexpresszió hatásfoka: egy abundáns fehérje esetében elég egy erősen átíródó gén, a transzláció sokszorozza a hatást 1 mrns-ről akár fehérje is képződhet riboszómális RNS gének erős promóter, de ez kevés lenne sokszorozás csak a kópiaszám növelésével lehetséges tandem ismétlődés E. coli - 7 gén ember rrns gén, 5 különböző kromoszómán (1n) X. laevis gén egy csoportban! A humán 45S rrns gén 45S rrns prekurzor - 18S, 5,8S, 28S rrns 5S rrns gén máshol spacer DNS promóterek pre-rrns érés 18S nt - riboszóma kis alegység 5,8S nt 28S nt rrns 5S rrns nt rrns 8-10

11 A nukleoláris állomány a nukleusz többi részétől elkülönítve izolálható. A nukleóluszt alkotó kromoszóma szakaszok egy területre rendeződnek. Nukleolar organizer - nukleólusz szervező - szakaszok a 45S rrns géncsoportok. A riboszómák felépítésében, összeszerelésében több mint 80 fehérje vesz részt. A nucleolin fehérje - burkolja a képződő 45S rrns-t. További RNS kötő fehérjék és az U3 snrnp is segíti az összeszerelést (mrns érés: U1, U2, U5, U4/U6) snorns-ek (kb 150 small nucleolar RNS) vesznek részt az érési folyamatokban (45S RNS vágás, metilációval a pszeudouridin bázisok kialakítása). snornp ribonukleoprotein komplexek Az 5S rrns nem a nukleóluszban keletkezik. Fehérjék egyenkénti importja és a félig kész riboszómák exportja (lásd a jobb oldali ábrát). 8-11

12 Sejtmaghártya és transzport 8-12

13 Fehérje transzportmechanizmusok az eukariota sejtben: 1) transzmembrán transzport kitekert formában, egyedi fehérjék transzportja célzottan - citoszol ER, citoszol MT 2) póruson keresztüli transzport (gated transport) nukleusz, nukleáris pórus, aktív térszerkezet megmarad, komplexek ellenőrzött transzportja 3) vezikuláris transzport egyik kompartmentből a másikba, membránba zárva, lefűződés és fúzió a másik kompartmenttel: ER Golgi transzfert irányító szignálok a fehérjéken 8-13

14 Az eukarióta sejt dupla membránnal körülvett része. A külső membrán egybefügg az endoplazmatikus retikulummal (ER). nukleoplazma kromatin nukleáris genom nukleolusz riboszóma összeszerelés nukleáris membrán a genetikai anyag mechanikai védelme elkülönítés (transzkripció, transzláció) speciális funkciók nukleáris pórus magi transzport 8-14

15 NUKLEÁRIS LAMINA lamin A, C és B fehérjék intermedier filamentumok, membránok erősítése, laminok, nukleáris membrán, nukleáris mátrix lamin A és C egy gén által kódolt, alternatív splicing! lamin A 133 AS-val hosszabb a C-terminális részén, lamin B és lamina fehérje poszttranszlációs módosítása hidrofób izoprenil csoport, belső nukleáris membránba rögzítés dimerek, α-helix pálca, globuláris fej, fej-fej ill. farok-farok polimerizáció az interfázisos sejtmagban lamin dimer lamin tetramer farok-farok polimerizáció sejtosztódás előtt depolimerizáció Ser-P foszforiláció laminb-(p) nukleáris membránhoz kötött marad, a többi a citoszólban 8-15

16 A nukleáris pórus komplex (nuclear pore complex NPC) nyolcszögletü kosár kd nagyságú fehérje komplex 30x nagyobb mint egy riboszóma citoplazmikus filamentumok nukleoplazmikus kosár gyűrűk (citoplazmikus, központi és nukleoplazmikus) vizes csatorna, ionok, kisebb molekulák, 60 kd nagyságú globuláris fehérjéig diffúzióval átjárható A nukleáris pórus képe (a) citoplazmikus és a (b) nukleoplazmikus felszínen nukleoporin fehérjék alkotják: 50 féle fehérje élesztőnél, 100 körül gerinceseknél 8-16

17 Nukleáris transzport makromolekulák, ribonukleoprotein (RNP) komplexek irányított transzportja (export és import) Minden fehérje a citoplazmában szintetizálódik és a nukleáris póruson keresztül jut be ill. utána ki - sok esetben körforgalom (hisztonok, transzkripciós alap és regulátor fehérjék, mrns érés, replikáció, rekombináció, repair (javító) fehérjék, riboszómális fehérjék... stb)! 10 6 hiszton fehérje / 3 min. - S fázisban transzportin fehéjék végzik a szállítást (importinok, exportinok) nukleáris lokalizációs szignál (NLS) van a magi fehérjéken Első bizonyítékok: SV40 vírus nagy T-antigén fehérje génben mutánsok, a hibás fehérje nem transzportálódik a sejtmagba -x-x- Pro-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val -x-xbázikus motívumot kódoló régión belül találhatók a mutációk Pro-Pro-Pro-Lys-Thr-Lys- Arg-Lys-Val - nem működik Kísérletek hibrid fehérjékkel: NLS szignál: bárhol lehet, 4-8 AS, két blokkban (2-4 AS) GFP fúziók, különböző hullámhosszon világító GFP fehérjékkel többes nyomkövetést is lehetséges Ha egy citoszólikus hibrid fehérje tartalmazza az NLS motívumot, bekerül a sejtmagba. Nyomkövetés ellenanyaggal vagy GFP fúziós fehérje alkalmazása. (a): normál fehérje lokalizáció, (b): NLS motívumot tartalmazó hibrid fehérje helyzete 8-17

18 Nukleáris import (be) 3 komponens Ran monomer G-protein GTP, GDP kötés nukleáris import receptor: importin α NLS felismerő domén importin β FG-nukleoporin felismerés FG-nukleoporin megtalálható a citoplazmikus filamentumokban, a csatorna belsejében és a kosárban, fenilalanin (F) és glicin (G) gazdag hidrofób régió, ezeket felismerve és ezekkel kölcsönhatva jut be az importin komplex (cargo complex) közvetlen energia felhasználás (ATP) nincs. Vannak más típusú NLS szignálok, amelyeket különböző importin β homológ fehérjék ismernek fel, nem szükséges az α alegység A cargo komplex kialakulása: a) szabad importin az NLS-hez kötődik import b) Ran-GDP import A cargo komplex szétesése transzport után: a nukleoplazmában a Ran-GDP Ran-GTP átalakulást a GEF protein (guanine nucleotide-exchange factor) segíti. A Ran-GTP kötődik az importinhoz és ez a komplex exportálódik, majd a GAP (GTPase accelerating protein, citoplazmikus filamentumon) hatására Ran-GDP keletkezik a komplex szétesik 8-18

19 A Ran fehérje monomerikus GTP-kötő fehérje, a Ras családba tartozik. Ezek a fehérjék transzport folyamatokban, jeltovábbításban vesznek részt. Általános kapcsolási mechanizmus egy fehérje aktív és inaktív formája között a GTP-kötés, hidrolízis, GDPkötés, vagy a foszforiláltság állapotának a változtatása. Az aktív (bekapcsolt) állapot általában a foszforilált állapot vagy a GTP-kötött állapot, de előfordul ennek az ellenkezője is

20 Nukleáris export (ki) proteinek, trns, riboszóma alegységek exportja (importinek exportja) hasonló mechanizmussal exportinok nukleáris export receptor, exportin 1 NES (nuclear export signal) Leu gazdag, ill más, még nem ismert szignálok NES (Leu) található pl. a HIV Rev fehérjén Ran-GTP/exportin1/NES-protein komplex ki Általános ciklus: Ran-GTP keletkezik a nukleuszban (GEF) ez jut ki komplexben vagy 1) az üres importinnal, vagy 2) az exportin-cargo komplexszel együtt Ran-GDP keletkezik kívül, a citoplazmikus filamentumokon lévő GAP fehérje által Ran-GDP- NTF2 import, visza a sejtmagba A transzport szabályozása Számos fehérje folyamatosan ingázik a citoplazma és a sejtmag között mrns export fehérjék, mind NLS mind NES szakaszokat tartalmaznak Számos trasnzkripciós faktor csak bizonyos szignálok meglétekor transzportálódik -foszforiláció megléte vagy hiánya módosítja az NLS felismerhetőségét - maszkírozás: citoplazmikus fehérje kapcsolódása elfedheti az NLS szekvenciát, így a fehérje a citoplazmában marad a maszkírozó fehérje leválása (jel) után történhet meg a transzport 8-20

21 Egy példa a nukleáris receptorra: a glükokortikoid receptor a szteroid hormonok zsíroldékonyak, membránon keresztül diffúzóval jutnak a sejtbe, nem kell sejtfelszíni receptor 1) A receptor a hsp90 hősokk fehérjével komplexet alkot, ha nincs hormon az NLS rész rejtve, a fehérje a citoplazmában marad (DBD DNS-kötő és LBD ligand kötő domén) 2) Ha hormon kötődik a receptorhoz konformáció változás, hsp90 leválik, NLS szabad nukleáris transzport megtörténik 3) A nukleáris transzport után a DNS-kötő domén segítségével transzkripció aktiválás a hormon által szabályozott gének bekapcsolva, génexpresszió. kortizon 8-21

22 The domain structure of steroid receptor superfamily. Its ligand binding domain binds to the steroid and the DNA binding domain interacts with DNA to regulate gene transcription. Respons elem Transzkripciós faktor konszenzus szekvencia ERE Estrogen receptor AGGTCANNNTGACCT GRE Glucocorticoid receptor AGAACANNNTGTTCT 8-22