Fehérje transzport biológia BSc - Molekuláris biológia előadások - Putnoky 10-1

Átírás

1 Fehérje transzport 10-1

2 Fehérje transzportmechanizmusok az eukarióta sejtben: 1) transzmembrán transzport kitekert formában, egyedi fehérjék transzportja célzottan - citoszol ER, citoszol MT (kék nyilak) 2) póruson keresztüli transzport (gated transport) nukleusz, nukleáris pórus, aktív térszerkezet megmarad, komplexek ellenőrzött transzportja 3) vezikuláris transzport egyik kompartmentből a másikba, membránba zárva, lefűződés és fúzió a másik kompartmenttel: ER Golgi transzfert irányító szignálok a fehérjéken Jellegzetes, durva felszínű endoplazmatikus retikulum és sejtmag egy erőteljes fehérjeszintézist és kiválasztást végző sejtben. Jól látható a nukleólusz a fokozott riboszóma összeszerelés miatt. 10-2

3 FEHÉRJE TRANSZPORT Egy átlagos emlős sejt , egy élesztősejt féle fehérjét tartalmaz. Ezek fele a citoszólban marad, DE fele átkerül egy másik kompartmentbe. Ehhez precízen írányított transzport folyamatok szükségesek. Protein targeting vagy protein sorting. Szignál szekvenciák biztosítják, hogy mely transzport apparátus irányítja majd a fehérje útját. Minden sejtorganellumnak speciális receptor-készlete van, amely a felismerést biztosítja. 1) mi a szignál-szekvencia? 2) mi a receptor? 3) hogyan működik a transzport? 4) milyen energia működteti? A kiválasztandó fehérjék (secretory proteins) szintézisük után azonnal az endoplazmatikus retikulumban (ER, mikroszóma frakció) jelennek meg. (rádioaktív aminosavak alkalmazása) 10-3

4 A kiválasztott fehérjék szintézise és transzportja együttesen folyik. A szignál-szekvencia általában nem képes az utólagos irányításra. Szabad riboszómán indul a szintézis AS N-terminális szignál irányítja a riboszómát az ER felszínéhez 6-15 hidrofób aminosav (Ala, Val, Leu, Ile, Phe) után egy-két pozitív töltésű fontos a transzportban, változtatás funkcióvesztés, nincs transzport szignál szekvencia fúziója citoszolikus fehérjéhez transzport (β-laktamáz szignál -α-globin) fehérjeszintézis és párhuzamos transzlokáció (kísérlet: sejtmentes közegben, mikroszóma egyidejű jelenléte szükséges) kotranszlációs transzport vagy transzlokáció 10-4

5 Az irányítás a signal recognition particle (SRP) kapcsolódásával kezdődik. Szignálfelismerő részecske SRP: ribonukleoprotein (RNP) komplex 300 nukleotid RNS váz, 7 SL RNS + 6 fehérje alegység szignálszekvencia felismerés, kapcsolódás, elongáció felfüggesztése az egyes fehérje alegységeknek ismert funkciói: - szignálszekvencia kötés (P54), - riboszóma nagy alegység kötés, - transzlokáció (receptor kötés) 10-5

6 SRP-receptor: transzmembrán (β) és perifériális (α) alegység transzlokációs csatorna - translocon GTP-hidrolízis, leválás, GTP-kötés szignál felismerés (ciklus) SRP-P54 és SRP-receptor α- alegység is GTP-kötő szignálpeptidáz hasítás harmadlagos szerkezet (folding) ADP-chaperonok 10-6

7 A transzlokációs csatorna alaphelyzetben zárt. Az N-terminális signál peptidet tartalmazó kb 30 AS bejutásával nyílik. Sec61 komplex (3 alegység, α, β, γ) - translocon Kotranszlációs transzlokáció vagy transzport 10-7

8 Transzmembrán fehérjék, TOPOLÓGIA transzmembrán domének (TMD): hidrofób AS,α-helix szerkezet, membránt keresztező részek Az ER, Golgi, lizoszóma és sejtmembrán fehérjék mind az endoplazmatikus retikulumba kerülnek és onnan vezikuláris transzport révén, a vezikulák membránjába épülve jutnak tovább (lásd később). I.: típus: exoplazmikus N-terminális, eltávolítandó szignál, 1 TMD II.: nincs szignálpeptid, N-terminális citoszól felé, 1 TMD III.: típus: nincs szignálpeptid, 1 TMD, N-terminális exoplazmikus (ER lumen) IV.: nincs szignálpeptid, sok TMD, integrális membránfehérjék 10-8

9 I-es típus: N-terminális szignál szekvencia és középső transzfer-stop szekvencia (stop-transfer anchor sequence - STA) Mesterséges HGH (human growth hormon) receptor változatok transzfere emlős sejtkultúrában, megváltoztatott TMD (+töltések) vagy nincs TMD teljes transzlokáció és szekréció (nem épül be a membránba!) 10-9

10 II-es típus: nincs N-terminális szignál szekvencia, egyszerre szignál szekvencia és anchor szekvencia, a transzláció ennél áll meg, ez kerül be a transzlokációs csatornába, az N-terminális rész a citoszólban marad és a C-terminális rész kerül a lumenbe. (signal anchor sequence - SA) III-as típus: TMD az N-terminális részhez közel. Transzport eleje hasonló az I-es típushoz, de utána a TMD transzlokációs stop-szignálként működik. C-terminális marad a citoszólban. Pozitív töltésű aminosavak halmozódása a TMD egyik oldalán meghatározza az orientációt (+) a citoszól felé Lys (K), Arg (R) aminosavak sorozata 10-10

11 a (+) töltések elhelyezkedése orientál! 10-11

12 A membránfehérjék az aminosav-sorrend számítógépes elemzésével észrevehetők. Számítógépes szekvencia elemzés (predikció) hidropatikus profil (hydropathy profile): a hidrofób aminosavak (+) értéket kapnak (hidropatikus index, Phe, Met) 20 AS egy feltételezhető transzmembrán domént alkot pozitív töltésű aminosavak halmozódása feltételezhető citoplazmikus domén Kikövetkeztethető topológia, amit kísérletes eszközökkel bizonyítani kell

13 Néhány fehérjét nem transzmembrán domén (TMD), hanem egy foszfolipid horgony rögzít a membránhoz. GPI: glikozil foszfatidil inozitol horgony néhány sejtfelszíni fehérje esetén (zsírsav és oligoszacharid lánc, amfifíl) inozitol, glükózamin, mannóz, foszfo-etanol-amin végződés A prekurzor fehérjén N-terminális szignál és TMD (STA) is van, DE érés során a szignál és a C- terminális rész is eltávolítódik. A STA szekvencia N- terminális oldalán (lumen) történő hasítás után a fehérjelánc a GPI -horgonyra helyeződik át. GPI-transzamidáz vesz részt a C-terminális GPIhorgonyt hordozó fehérjék érésében. Más fehérjék a citoszól felé orientáltak, ezeknél más a lipid horgony (pl. Ras) 10-13

14 FEHÉRJE MÓDOSÍTÁS és FOLDING A transzláció (és transzfer) után a szekretálandó fehérjék sokféle módosításon eshetnek keresztük, az ER vagy a Golgi lumenben, mielőtt végső helyükre kerülnek. 1) glikoziláció (ER, Golgi) 2) diszulfid hidak (ER) 3) folding (aktív térszerkezet ), alegységek kapcsolódása (ER) 4) proteolitikus módosítások (ER, Golgi, szekréciós vezikulák) GLIKOZILÁCIÓ Az ER-be kerülő legtöbb fehérje glikozilálódik, egy vagy több oligoszacharid oldalláncot kap. Ezeket nevezzük glikoproteineknek. O-glikoziláció, OH csoport, Ser, Thr O-kapcsolt oligoszacharidok N-glikoziláció, -NH 2, Asn N-kapcsolt oligoszacharidok O-gliozidos vagy N-glikozidos kötés Az O-kapcsolt a ritkább és az egyszerűbb módosítás (1-4 cukor alegység). Az N-kapcsolt módosítás a gyakoribb és a bonyolultabb. 14 cukormolekula polimere a prekurzor, elágazó, glükóz (Glc), mannóz (Man), N-acetil-glükózamin (GlcNAc) cukrokból áll (ábra). Ez a prekurzor azonos egysejtűek, növények és állatok esetében is. 5 konzerválódott cukor alegység az alap, ami az érés során marad: GlcNAc 2 -Man

15 tunicamycin gátolja AZ OLIGOSZACHARID DEKORÁCIÓ SZINTÉZISE dolichol foszfát (poli-izoprenoid lipid) hordozó (karrier) Glc 3 Man 9 GlcNAc 2 pirofoszfáton keresztül kapcsolódik a 14 cukor dolichol-pirofoszforil-oligoszacharid Aktivált cukrok, nukleotid-cukrok, UDP- vagy GDPszármazékok szükségesek a szintézishez. A szintézis a külső felszínen (citoszól) kezdődik és az ER lumenben fejeződik be. N-glikozilációnál a célfehérjén egy Asn módosul, ha utána Ser vagy Thr van (egy AS kihagyással) célszekvencia: -Asn-X-(Ser,Thr)- oligoszacharil-transzferáz enzim végzi a reakciót 10-15

16 A glikozilálás szerepe: Glc 3 Man 9 GlcNAc 2 a 3 Glc jelzi, hogy kész a prekurzor a 3 Glc és 1 Man a fehérjére való ráhelyezés után azonnal eltávolítódik (3 enzim) Man 8 GlcNAc 2 rész marad 1) transzport, helyes térszerkezet (folding), kísérlet: a hemaglutinin prekurzor esete. Ha tunicamycin gátolja a glikozilációt (10-15 old 1. lépés) vagy a módosítandó Asn mutáció miatt nincs jelen nincs módosítás rossz folding a fehérje ER lumenben marad 2) Jó a transzport, de gyorsabb a fehérje degradációja az oldalláncok hiányában 3) Sejt adhézió, felismerés (ABO vércsoport) 10-16

17 DISZULFID HIDAK KIALAKÍTÁSA PDI protein-diszulfid-izomeráz: két közeli Cys az aktív centrumban (szulfhidril v. thiol (-SH) csoportok) elektrontranszfer, thiol-diszulfid transzfer ismétlődő reakciók, amíg kialakul a legstabilabb konformáció minőség ellenőrzés pl.: proinzulin 1-4, 2-6 és 3-5 SHközöti kötés A fehérje két ciszteinjének SH csoportja között jön létre diszulfid híd. A reakció a megfelelő oxidáns és enzim jelenlétében CSAK az ER-ban játszódik le! Citoszólikus fehérjéknél nincs diszulfid kötés. Más kölcsönhatások stabilizálnak. Ezért lehet probléma egy eukarióta fehérje termeltetése baktériumokban: nincs glikozilálás és diszulfid-híd kialakítás (ER), rossz konformáció, nem funkcióképes a fehérje. Eukarióta expressziós rendszerek alkalmazása

18 Poszttranszlációs transzlokáció vagy transzport, élesztőnél gyakori (mt, cp) Sec63 komplex FOLDING feltekeredés v. folding a helyes térszerkezet kialakítása Nagyon nagy, 200 mg/ml fehérje koncentráció sok kölcsönhatás zavarja a foldingot, irányítani kell. ADP-chaperonok gátolják a zavaró kölcsönhatásokat és az idő előtti feltekeredést. BiP fehérje vagy binding protein (Hsp70 család) A teljes transzlokáció megtörténte után következik a folding, BiP-ADP BiP-ATP átalakulás és leválás az átjutott fehérjéről

19 Poszt-transzlációs transzport: mitokondrium, kloroplaszt, peroxiszóma A fehérjeszintézis a citoszolban történik, befejeződése után szignálok irányítják a transzportot a különböző membránokon keresztül. Bonyolultabb belső terek, összetettebb transzport Mitokondrium, kloroplaszt: saját DNS, saját fehérje szintézis is, DE a fehérjék többsége a sejtmag által kódolt és transzláció után transzportálódik a sejtorganellumba. poszt-transzlációs transzport chaperoninok: citoplazmikus és kloroplaszt/ mitokondrium chaperonok (bakteriális chaperonokra is ezt az elnevezést használják) szignál szekvenciák ER 6-12 hidrofób AS, elötte bázikus, (+) AS (Lys, Arg) mt (matrix) AS amfipatikus hélix, (+)Lys, (+)Arg és hidrofób AS-ak (matrix-targeting) cp Ser, Thr és kis hidrofób AS-ak peroxiszóma C-terminális helyzet! Ser-Lys-Leu 10-19

20 A mitokondriális fehérjék transzportja A transzport vizsgálata in vitro rendszerben: ha a mitokondriális fehérjék szintézise után mitokondriumokat adunk a rendszerhez, akkor a tripszines kezelés nem képes degradáli a fehérjéket. Tehát bekerültek a mitokondrium belsejébe, ahol védve vannak. A fehérjék a citoszolban szintetizálódnak, a transzferhez szignál szekvencia szükséges, ami transzfer után lehasad. A mitokondrium felveszi a kész fehérjéket. Nem kell riboszóma és párhuzamos fehérje szintézis, mint az ER esetében

21 TOM és TIM - mt fehérje import kiterített (unfolded) fehérjék transzportja citoszolikus chaperonin Hsc70 mt szignál szekvencia (mátrix): amfipatikus, egyik oldalon Arg és Lys (+ töltések), a másik oldalon hidrofób AS-ak import receptor (Tom20/22) általános import pórus (general import pore) (Tom40 protein) TOM: translocon of the outer membrane of mitochondria TIM: translocon of the inner membrane of mitochondria (Tim23 komplex) mátrix proteáz: szignál eltávolítás matrix Hsc70 chaperonin transzlokáció, térszerkezet 10-21

22 Mitokondrium belső membrán fehérje és intermembrán tér transzport útvonalak Sokféle transzfer útvonal, négy célállomás 1) mátrix fehérjék 2) belső membrán fehérjék, 3) intermembrán tér fehérjéi, 4) külső membrán fehérjék Egy célállomáshoz többféle út is lehet többféle receptor és transzlokon csatorna is van. Hasonlóan az ER-transzporthoz a transzmembrán domének a matrix targeting szignállal együtt határozzák meg a célállomást és térszerkezetet. (STA stop transzfer anchor) pl. N-mátrix szignál-belső membrán szignál- kettős belső membrán (2) (3) ha van még egy proteáz szignál a membrán fehérjén, hasítás után bekerül az intermembrán térbe A külső membránba más speciális szignál irányít

23 TOC és TIC - cp fehérje transzport translocon of the outer membrane of chloroplasts translocon of the inner membrane of chloroplasts Kloroplaszt sztróma fehérjék transzportja hasonló az mt mátrixfehérjék transzportjához (Calvin-ciklus enzimek). RUBISCO (ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase) nagy (L) alegység a cp genomban kódolt. Kis (S) alegység és a többi enzim N-terminális sztroma-import szekvenciát hordoz (tranzit szekvencia) hasonlóság: mitokondrium transzport 6 különböző célállomás: külső membrán, belső membrán, intermembrán tér, sztróma, tilakoid, tilakoid lumen transzlocon fehérjék funkcionálisan analógok, de nem homológok az mt rendszer elemeivel, külön evolúció 10-23

24 Tilakoid lumen transzport A bakteriális belső membrán útvonalakhoz hasonlóan két lehetőség: A) lineáris végig sztróma import szekvencia Toc-Tic komplex lineáris fehérje chaperoninok tilakoid import szekvencia kloroplaszt SRP/SRP-receptor (bakteriális rendszerhez hasonló translocon) lineáris fehérje transzport (plasztocianin) B) lineáris és globuláris a sztrómába szignál és lineáris transzport, de ott kialakul a végső térszerkezet (folding) és ph-grádiens által hajtott transzport, speciális tilakoid memránfehérjék alkotják a transzlokont RR- tartalmú szignál (2xArg) metalloproteinek 10-24

25 Peroxiszóma fehérje transzport Egyszerű membrán, oxidatív folyamatok, oxidációs enzimek, zsírsav oxidálás, acetil-csoportok keletkeznek (acetyl-coa), nincs ATP termelés kb. 50 féle enzim, méregtelenítés oxidálással szabad gyökök: szuperoxid, hidroxil szuperoxid diszmutáz H 2 O 2 generálás kataláz H 2 O és oxidáció nincs saját DNS, mégis prokarióta eredet? csökevényes sejtorganellum? a légköri oxigén megnövekedésekor az első organellum mitokondriumok kialakulása előtt? szignál szekvencia a C-terminálison, nem hasad le PTS1 (peroxisomal targeting sequence) SKF (Ser-Lys-Phe), mesterséges SKF jelenléte elég a célba juttatáshoz sejtmentes rendszerben is tanulmányozható Pex5 szolubilis receptor Pex14 membránreceptor multimer transzlokációs csatorna nagyobb méretű, több alegységes, nem lineáris fehérjék transzportja is, ATP szükséges hasonlít némileg a nukleáris transzportra PTS2 kevés enzimnél eltérő N-terminális szignál 10-25

26 VEZIKULÁRIS TRANSZPORT Az ER lumenből a fehérjék a Golgi-készülékbe jutnak. Ciszternák és vezikulumok rendszere. Cisz-, mediális-és transz kompartmentek További fehérje módosítások, glikozilálás befejezése Osztályozás, irányítás transzport vezikulumok lizoszóma sejtmembránba szekretálódó granulumokba konstitutív szekréció: gyors és folyamatos szabályozott szekréció: A transzport során a membránok aszimmetriája megőrződik. A lefűződés és fúzió tükörképei egymásnak. A beltér sejten kívüli térnek tekintendő! A belső tartalom mindig megörződik, nem kerül érintkezésbe a citoszóllal

27 Glükoproteinek érése Az N-kapcsolt oligoszacharid oldallánc további, specifikus módosítása a Golgi-rendszerben specifikus glukozidáz és transzferáz enzimek hasítják le, vagy adják egyesével a cukor alegységeket cukor-nukleotid prekurzorok (UDP-, GDP-, CMP-) aktivált cukrok A további módosítások a célállomást határozzák meg

28 (nem jó a Bálint könyvből) A transzport vezikulák burok kialakulás és lefűződés burokfehérjék (coat proteins) COPs - COPI, COPII GTP-kötő fehérjék SNARE receptorok mindkét oldalon A SNARE név eredete (elrettentés képpen) (=SNAP REceptors /SNAP=Soluble NSF Attachment Protein / NSF = N-ethylmaleimide-sensitive factor) v-snare a vezikula (donor) oldalon t-snare a célmembrán (target) oldalon a szállított fehérjék membránhoz kötöttek! lehetnek: - cargo protein (szolubilis) és cargo protein receptor (membránprotein) - cargo membránprotein a szállítandó anyagok a kialakuló vezikula membránjához kötődnek sorting signals (lásd a későbbi táblázatot) (aminosav szekvencia vagy specifikus glikoziláció) meghatározza, milyen burkolatú vezikulába kerül A fehérjeburok meghatározza a célállomást COPI, COPII burok leválás (GTP-hidrolízis) után a SNARE receptorok irányítják a kapcsolódást és a fúziót a céloldalon (Rab-fehérjék) 10-28

29 In vitro előállított lefűződő vezikulák. A tisztított COPII fehérjeburok kialakulása liposzómákon. Izolált Golgi-membránból COPI coat fehérje és GTP jelenlétében vezikulák keletkeznek. Nem hidrolizáló GTP-analóg jelenlétében a vezikulák felhalmozódnak, nem történik meg a burok leválása

30 burok szétesés, lefűződés után Sar1-GTP hidrolízis Sar1-GDP konformáció változás burok szétesése COPII vezikula kialakulás: Monomer G-protein Sar1-GDP kapcsolódik a Sec12 ER mebránfehérjéhez GDP/GTP csere Sar1-GTP N-terminálisa a memránba épül (Sar = secretion associated and RAS-related protein) burokfehérjék kapcsolódása (Sec23/Sec24) hordozó (cargo-receptor) transzmembrán fehérjék kapcsolódnak a Sec-komplexhez (sorting signal, citoszólikus régió) Sec13/Sec31 burok kialakul (nincs a rajzon) 10-30

31 VEZIKULA IRÁNYÍTÁS VEZIKULA típus COAT PROTEINEK GTP-KÖTŐ fehérje IRÁNY COPII Sec23/Sec24 és Sec13/Sec31 Sar1 ER cis-golgi COPI 7 eltérő COP alegység ARF* trans-golgi vissza cis-golgy ER CLATHRIN clathrin és AP adapto proteinek ARF* trans-golgi endosome *ARF: ADP-ribozilációs faktor, szintén GTP kötő fehérje A coat proteinek 1) segítik a vezikula kialakulását és 2) kiszelektálják a cargo fehérjéket. A cargo proteineken célállomást meghatározó sorting signal-ok találhatók: membrán fehérjéken a citoszólikus (coat proteinekkel érintkező) oldalon specifikus szekvenciák. A solubilis (lumen) proteinek specifikus cargo receptor membrán fehérjékhez kötődnek

32 VEZIKULA FELTÖLTÉS - SORTING SIGNAL SORTING SIGNAL PROTEINEK receptor vezikula 2x savas AS pl.: Asp-X-Glu cargo membránfehérjék ER Sec23/Sec24 COPII Lys-Asp-Glu-Leu KDEL ER-rezidens lumen prot. KDEL-receptor cis-golgi COPI mannóz-6-(p) M6P szolubilis lizoszóma enzimek (cis-golgi) M6P-receptor trans-golgi clathrin/ AP1 M6P lizoszóma szignál nincs 6P (megfelelő foszfotranszferáz hiánya), I-sejt betegség, (mukolipidózis) az enzimek kiválasztódnak és nem a lizoszómába kerülnek nem működik megfelelően a lizoszóma szortírozás 10-32

33 anterograde transport ER cis-golgi COPII vezikula kialakulása COPII coat proteinek polimerizációja a burokfehérjékkel kölcsönható (sorting signal) cargo membránproteinek vagy cargo protein receptorork (+ solubilis cargo) burok diszociáció (GTP hasítás) v-snare t-snare kölcsönhatás és FÚZIÓ a Golgi membránnal Rab G-fehérjék segítik a fúziót retrograd transport Golgi ER transport v-snare és ER-rezidens fehérjék visszajuttatása COPI burok KDEL signál receptorok kötése révén jutnak vissza az ER lumenbe A kötések specifitásában a vezikulák ph-jának van jelentős szerepe ER: ph:7,0 - Golgi ph:5,0 - a KDEL szekvenciát hordozó fehérjék 10x erősebben kötődnek a receptorhoz bekerülnek a COPI vezikulába és visszajutnak az ERlumenbe