A dinamin szerepe az AT 1 -angiotenzinreceptor internalizációjában

Celluláris és Molekuláris Élettan Doktori Program A dinamin szerepe az AT 1 -angiotenzinreceptor internalizációjában Doktori (Ph.D.) értekezés Szaszák Márta Témavezető: Dr. Hunyady László egyetemi docens Semmelweis Egyetem Élettani Intézet Budapest 2003

ÖSSZEFOGLALÁS A renin-angiotenzin rendszer elégtelen működése számos kardiovaszkuláris betegség kialakulásában szerepet játszik. Az AT 1 -angiotenzinreceptort szelektíven gátló gyógyszereknek fontos szerepe van a népbetegségnek számító magasvérnyomás kezelésében. Az AT 1 -receptor a G-fehérjéhez kapcsolt, hét transzmembrán domén szerkezetű receptorok családjába tartozik. A receptor molekuláris szabályozási mechanizmusának tanulmányozása a receptorantagonista és -agonista vegyületek alkalmazásának szempontjából, valamint az endocitózis általános folyamatának megértése céljából alapvető fontosságú. Az angiotenzinreceptor endocitózisa befolyásolja a receptor jelátvitelét, illetve szerepet játszik a receptorérzékenység, valamint a receptorszám hosszútávú szabályozásában. Kísérleteinkben arra kerestük a választ, hogyan szabályozzák az angiotenzinreceptor klatrin-mediált internalizációjat az emlős sejtekben ubikviteren előforduló dinamin2, GTP-áz fehérje által létrehozott fehérje-lipid, illetve fehérje-fehérje kölcsönhatások. A dinamin2 foszfolipdeket kötő, PH doménjében létrehozott pontmutáció, valamint az SH3 domént tartalmazó fehérjékhez kapcsolódni képes, prolingazdag doménjének az eltávolítása, gátolták a receptor internalizációját. Ezen felül azonban, amint azt funkcionális és konfokális mikroszkópos vizsgálatokkal megállapítottuk, a prolingazdag domén deléciója megszűntette a dinamin2 plazmamembrán-lokalizációját is. A dinamin lokalizációját hasonló módon megakadályozta, amikor az amfifizin és endofilin SH3 doménjét expresszáltuk a receptorral. Ezen SH3 domének a receptorinternalizációt is gátolták, amely gátlást a dinamin expresszálása felfüggesztett, ami arra utal, hogy az amfifizin és endofilin fehérjéknek a dinaminon keresztüli kapcsolódása szerepet játszik az AT 1 -receptor endocitózisában. A kísérleti eredményeink arra utalnak, hogy a dinamin, amfifizin és endofilin nem neuronális formája a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok dinamin-függő endocitózisa során hasonló szerepet játszik, mint ahogyan azt ezen fehérjék neuronális formái esetében leírták a szinaptikus vezikulák újrafelvétele során. Megállapítottuk, hogy e folyamat során a dinamin prolingazdag doménje a fehérje lokalizációjában, míg PH doménje valószínűleg inkább a molekula működésének szabályozásában játszik szerepet. 1

SUMMARY The renin-angiotensin system has a role in the pathogenesis of several cardiovascular diseases. Drugs that selectively block the AT1 receptor have important roles in the treatment of hypertension. AT1 receptor belongs to the superfamily of G- protein-coupled receptors, which contain seven transmembrane regions. Elucidation of the molecular mechanisms that control the receptor function has a high importance in regard to the use of receptor antagonist and agonist compounds and for the understanding of the mechanism of endocytosis. Endocytosis of the angiotensin II receptor influences the signal transduction, causes resensitization of the receptor after its desensitisation and has a role in the long-term regulation of the number of receptors. The aim of our study was to examine the role of dynamin2 in the clathrin-mediated internalization of the AT1 receptor. Dynamin2 is a GTP-ase protein that is ubiquitously expressed in mammalian cells and can interact with lipids and several proteins. The internalization of the AT1 receptor was inhibitied by generating a pointmutation in the PH domain of dynamin, which can bind to phospholipids and by deletion of the proline-rich region that can interact with SH3 domain containing proteins. In addition the deletion of the proline-rich region has inhibited the plasmamembrane localization of dynamin as it was confirmed by confocal microscopic studies. Coexpression of the SH3 domain of amphiphysin and endophilin impeded the localization of dynamin in a similar way. These SH3 domains also inhibited the internalization of the receptor, which was overcome by the coexpression of dynamin suggesting that the specific interaction of dynamin with these SH3 domain containing proteins has a role in the endocytosis of the AT1 receptor. Our experiments show that the non-neuronal isoform of dynamin, amphipiysin and endophilin has a similar role during receptor endocytosis as it was described by their neuronal isoforms in the recycling of the synaptic vesicles. In addition, we concluded that the proline-rich domain of dynamin has a role in its localization, whereas the PH domain most probably regulates its function. 2

TARTALOMJEGYZÉK ÖSSZEFOGLALÁS... 1 SUMMARY... 2 TARTALOMJEGYZÉK... 3 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE... 5 CÉLKITŰZÉSEK... 7 IRODALMI HÁTTÉR...9 Az endocitózis molekuláris mechanizmusa... 9 A klatrin-mediált endocitózis útvonala...11 A β-arresztin...12 A klatrinhoz, illetve az AP-hoz kapcsolódó fehérjék...13 A dinamin...17 A dinamin felépítése...18 A dinamin funkciójára vonatkozó modellek...20 A dinamin család fehérjéi...23 A dinamin endocitózison kívül betöltött szerepe...25 A foszfoinozitidkötő és prolingazdag domének altalános jellemzése, szerepük az endocitózisban...25 A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok deszenzitizációjának és internalizációjának általános mechanizmusa... 29 A receptor útvonala a sejten belül...30 Az endocitózis és a jelátvitel kapcsolata...32 Az angiotenzin II receptorok... 34 Az angiotenzin szerepe...34 Az ACE-gátlók és AT 1 -receptor antagonisták...35 Az angiotenzinreceptorok...36 Az AT 1 -receptor...37 Az AT 1 -receptor jelátviteli útvonalai...38 Az AT 2 -receptor...39 Az AT 1 -receptor internalizációja...40 A β-arresztin és a dinamin szerepe az AT 1 -receptor endocitózisában...41 A Rab fehérjék szerepe az AT 1 -receptor endocitózisában...42 MÓDSZEREK... 44 EREDMÉNYEK... 47 A dinamin2 PH doménjének szerepe az AT 1 -receptor internalizációjában... 47 A dinamin2 prolingazdag régiójának szerepe az AT 1 -receptor internalizációjában... 47 A PH domén és a prolingazdag domén szerepének vizsgálata a dinamin lokalizációjában kettős mutánsok segítségével... 48 A különböző mutáns dinamin fehérjék sejten belüli lokalizációja... 51 A dinamin mutánsok kolokalizációja β2-adaptinnal a klatrinburkos gödröcskékben.. 53 Az amfifizin és az endofilin SH3 doménjének hatása az AT 1 -receptor internalizációjára... 54 A dinamin2 lokalizációja az amfifizin, illetve az endofilin SH3 doménjét tartalmazó sejtekben... 57 3

MEGBESZÉLÉS... 59 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS... 66 IRODALOMJEGYZÉK... 67 SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE... 82 Az értekezés alapjául szolgáló közlemények... 82 Egyéb közlemények... 82 4

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ACE AP AT 1 -receptor AT 2 -receptor AT 1A -receptor AT 1B -receptor AT 3 -receptor AT 4 -receptor CHO C-terminális EGF EH ENTH ERK EVH1 GAP GED GEF G-fehérje GFP GRK GST HA-epitóp HIV LDL MAPK mtsai NMR N-terminális PH angiotenzin-konvertáló enzim adaptor fehérje komplex egyes típusú angiotenzin II receptor kettes típusú angiotenzin II receptor patkány 1A típusú angiotenzin II receptor patkány 1B típusú angiotenzin II receptor angiotenzin III receptor angiotenzin IV receptor kínai aranyhörcsög petefészek eredetű sejtvonal karboxil-terminális epidermális növekedési faktor eps15-homológia epszin N-terminális homológia extracelluláris jelre regulálódó protein-kináz Enabled/VASP homológia1 GTP-ázt aktiváló protein GTP-áz effektor domén guanin nukletoid kicserélő faktor heterotrimer GTP-kötő fehérje zöld fluoreszcens fehérje G-fehérjéhez kapcsolt receptor-kináz glutation S-transzferáz influenza hemagglutinin antigénjének epitópja humán immundeficiencia vírus low density lipoprotein mitogén aktivált protein-kináz munkatársai nukleáris mágneses rezonancia amino-terminális pleksztrin-homológia 5

PIP2 foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfát PI(3,4)P2 foszfatidilinozitol-3,4-biszfoszfát PI(4,5)P2 foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfát PI(3,4,5)P3 foszfatidilinozitol-3,4,5-triszfoszfát PI3K foszfatidilinozitol-3-kináz PI3P foszfatidilinozitol-3-foszfát PI4P foszfatidilinozitol-4-foszfát PKA protein-kináz A PKB protein-kináz B PKC protein-kináz C PLC foszfolipáz C PX phox-homológia SH3 Src-homológia 3 7TM receptor hét transzmembrán domén szerkezetű receptor 6

CÉLKITŰZÉSEK A klatrin-mediált endocitózis egy több lépéses folyamat, amely számos fehérje finoman összehangolt interakcióját követeli meg. GTP-ázok, kinázok, foszfatázok, ubikvitinkonjugáló enzimek, lipidmódosító enzimek, és az aktin citoszkeleton egyaránt kellenek a klatrinburok és a vezikula kialakulásához. A folyamatban nagyon sok fehérje szerepét felvetették, amelyek különböző fehérje-lipid és fehérje-fehérje kölcsönhatásokra képesek, de a vezikula létrejöttének finoman szabályozott lépéseinek pontos mechanizmusa a mai napig ismeretlen. Az egyik legtöbbet vizsgált és kulcsfontosságú szerepet játszó fehérje, a dinamin GTP-áz, amelynek a lefűződött vezikula levágódásában tulajdonítanak szerepet. Munkacsoportunk vizsgálatai igazolták, hogy az AT 1 -receptor internalizációja alacsony angiotenzin koncentrációnál β-arresztin és dinamin-függő módon történik, klatrinburkos vezikulákban. Kísérleteink megkezdésekor azonban ellentmondó adatok voltak az irodalomban azzal kapcsolatban, hogy a dinamin foszfolipidet kötő PH, vagy a más fehérjék SH3 doménjéhez kapcsolódni képes prolingazdag doménje játszik szerepet a dinamin plazmamembránhoz történő kapcsolódásában az AT 1 -receptor endocitózisa során. Nem volt arra sem adat, hogy a szinaptikus vezikula újrafelvételében szerepet jatszó adapter fehérjék, mint amilyen az endofilin és az amfifizin, egy G-fehérjéhez kapcsolt receptor, az AT 1 -receptor internalizációja során is hasonló szerepet tölthetnek-e be nem neuronális szövetekben. Kísérleteinkben összefoglalva a következő kérdésekre kerestük a választ: 1. Szerepet játszik-e a dinamin PH doménjének foszfolipid kötése az AT 1 -receptor endocitózisában? 2. A dinamin prolingazdag doménje által kialakított fehérje-fehérje interakciók szerepelnek-e az AT 1 -receptor internalizációjában? 3. A dinamin PH doménjének lipidkötése, vagy a prolingazdag domén által kialakított fehérje-fehérje kölcsönhatások játszanak szerepet a dinamin klatrinburkos struktúrákhoz történő kapcsolódásában az internalizáció során? 7

4. A szinaptikus vezikulák endocitózisában bizonyítottan szerepet játszó endofilin és amfifizin szerepet játszhat-e az AT 1 -receptor internalizációjában is, nem neuronális szövetben? 5. Hogyan befolyásolja az endofilin és az amfifizin SH3 doménje a dinamin lokalizációját az AT 1 -receptor internalizációja során? 8

IRODALMI HÁTTÉR Az endocitózis molekuláris mechanizmusa Az extracelluláris anyagok intracelluláris felvétele membránnal határolt vezikulákba, vagy más néven endocitózis, egészen a múlt század elejétől kezdve intenzív kutatási terület. Az endocitózis számos biológiai folyamatban szerepet játszik, mint például amilyen az antigén prezentáció, a tápanyagok felvétele, az apoptotikus sejtek eltakarítása, a különböző patogének sejtbe jutása, a szinaptikus vezikulák újrafelvétele és a sejtfelszíni receptorszám szabályozása [1]. Az endocitózist két csoportra lehet elkülöníteni. Az egyik a fagocitózis, ami speciális sejttípusok általi nagyobb partikulumok bekebelezését jelenti. Ide tartozik a makrofágok, neutrofilek, monociták általi nagy patogének, baktériumok, élesztő, apoptotikus sejtek, stb... eltakarítása, amelynek során specifikus sejtmembránreceptorok jelátviteli kaszkádot indítanak meg, és a folyamatot a Rho GTP-ázok szabályozzák. A másik csoportot a pinocitózis alkotja, amelybe legalább az alábbi négy mechanizmus tartozik: a makropinocitózis, a klatrin-mediált endocitózis, a kaveolamediált endocitózis, és a klatrin- és kaveola-független endocitózis. A receptorok esetében az endocitózis lehet ligand-indukált, melynek során a ligand receptor kötése indítja el az endocitózis folyamatát, míg a konstitutív endocitózis során a ligand megkötése nem stimulálja az endocitózist. Konstitutív endocitózissal történik például a transzferrin és az LDL sejtbe bekerülése [2]. A makropinocitózis során nagy, 0,5-2 µm es nagyságú, hetrogén vezikulák, a makropinoszómák jönnek létre. Szerepét leírták a növekedési hormonok és mitogének által indukált membránfodrozódás utáni membrán körforgásban, ezen kívül az antigén prezentációs útvonalban, illetve különböző baktériumok és vírusok, mint például a Legionella és a HIV sejtbe bejutásában [3,4,5,6]. A folyamat szabályozásában többek között a spektrin kötő fehérje 1-nek (Hssh3bp1), és az ARF6 kis GTP-áz fehérjének tulajdonítanak lényeges funkciót [7,8]. A másik ismert, klatrin-független, fő útvonal a kaveolák segítségével történő internalizáció. A kaveolák jellegzetes morfológiájú, palack alakú sejtmembrán- 9

lefűződések, amelyekből különösen sok található az endoteliális sejteken. Speciális lipid összetételű membrán doménekből alakulnak ki, amelyekre jellemző, hogy glikoszfingolipidekben és koleszterinben gazdagok, valamint a koleszterint kötő kaveolin nevű fehérjét tartalmazzák [3]. Több tucat membránreceptor, jelátvitelben szereplő molekula, glikozil-foszfatidil-inozitol (GPI)-kihorgonyzott fehérje, és membrántranszporter lokalizációját kimutatták a kaveolákban, amely ahhoz a feltételezéshez vezetett, hogy a jelátvitel egyik központjaként szerepelhet a sejtben. [9] [10]. A nem klatrin-mediált útvonal jellemzőjeként elsősorban a koleratoxin B és egyébb bakteriális toxinok endocitózisát használják, azonban ezekkel kapcsolatban van adat a klatrin-mediált útvonal szerepére is [11,12]. A klatrin- és kaveola-független endocitózis során lipid raftok segítségével történik az endocitózis. Ezek a 40-50 nm átmérőjű lipidraftok szabadon diffundálnak a sejtmembránban és bármely endocitotikus vezikulával internalizációra kerülhetnek. Ennek a mechanizmusnak a szabályozásával kapcsolatban még igen kevés adat áll rendelkezésre az irodalomban [13]. Fagocitózis Makropinocitózis ( >1 µm) Klatrin-mediált endocitózis ( ~120 nm) Kaveola-mediált endocitózis ( ~60 nm) Klatrin- és kaveolafüggetlen endocitózis ( ~90 nm) 1.ábra Az endocitózis útvonalai emlős sejtben. Az egyes endocitózisútvonalak különbözhetnek a kialakuló vezikula nagyságában, a vezikulába rakományaként bekerülő fehérjékben és lipidekben, valamint a vezikula kialakulásának mechanizmusában. Az ábrán az emlős sejtekben működő alapvető endocitózis mechanizmusok kerültek sematikusan ábrázolásra (Conner SD alapján [13]). 10

A klatrin-mediált endocitózis útvonala A klatrin-mediált endocitózis szerepe jól ismert a tápanyag-receptorok és a növekedési faktorok receptorainak endocitózisában, valamint a szinaptikus vezikulák újrafelvételében. A 7TM receptorok endocitózisának is ez a fő útvonala, néhány esetben azonban felvetették a kaveolák és a nem burkos vezikulák szerepét is. A klatrin-mediált útvonal fő markereként a transzferrinreceptor és az LDL-receptor endocitózisát használják. [14]. A klatrin-mediált útvonal volt az, amit elsőként felefedeztek és a legalaposabban tanulmányoztak. Roth és Porter ismerte fel először 1964-ben a klatrinburkos vezikulák jelenlétét a sejtben [3]. A klatrint 1976-ban fedezte fel Barbara Pearse mint a burkos vezikulákban legnagyobb mennyiségben előforduló fehérjét, amely a vezikulák burkát alkotja, és amelyekben a különböző számú klatrin alegységek hexagonokba és pentagonokba rendeződnek [15,16]. A klatrinburok elektromikroszkópikusan, morfológiailag jól elkülöníthető a nem burkolt vezikuláktól. A klatrinburok a plazmamembrán citoplazmatikus oldalán gyűlik össze, először burkos gödröcskéket alkotva, amelyek utána lefűződnek és levágodnak a membránról. A klatrinburok egy poligonális kalitka, melyet a 190kDa-os klatrin nehéz lánc és a 25 kda-os klatrin könnyű lánc által képzett triszkelionok alkotnak. A klatrin kalitka 8 hexagonból és 12 pentagonból épül fel. In vitro, a klatrin önmagában is képes a burkos vezikulákhoz hasonló nagyságú ketreceket formálni [17,18,19]. Mivel ez azonban messze van a fiziológiás körülményektől az élő sejtben valószínűsítették, hogy egyéb faktorok is szerepelnek a burok kialakulásában [20]. A későbbiekben valóban kiderült, hogy a klatrin kapcsoló fehérjeként is szerepel, nem csak a burok vázát alkotja, illetve a burkot oly módon deformálja, hogy vezikulák jöjjenek létre, hanem emellett, fehérje-fehérje interakciók révén képes felismerni és kiszelektálni azon fehérjéket is, melyek a burok rakományaként szerepelnek. Nem sokkal a klatrin felfedezése után 1979-ben fedezték fel Keen és munkatársai azt a heterotetramer fehérje komplexet, az AP, adaptor fehérje komplexet, amely a klatrinburokban található és kötődik a klatrinhoz, valamint in vitro elősegíti a klatrinburok összeállását [21]. A klatrin triszkelionok disztális, amino terminális vége áll kapcsolatban az adaptor komplexszel, amely a burkon belül található. Az AP jelent 11

kapcsolatot a klatrin és a membrán között, mivel olyan membrán fehérjékkel képes kapcsolatba lépni, amelyek a klatrinburkos vezikula kialakulásáért felelős szignált tartalmaznak. Minden AP t 4 polipeptid alkot: kettő 100KDa-os α vagy γ és egy β lánc, egy 50 kda-os µ lánc es egy 25-kDa-os σ lánc, melyeket adaptin alegységeknek neveznek. A sejtben különböző helyen funkcionáló klatrinburokhoz különböző adaptor komplex kapcsolódik. Az AP1 komplex a transz-golgi hálózat és az endoszóma közötti transzportban működik közre, és γ,β1,µ1,σ1 alegységekből áll. Az AP2 komplex a plazmamembránról lefűződő endocitotikus vezikulákon van jelen és α,β2,µ2,σ2 alegységekből épül fel. Az AP3 és az AP4 az endoszómális és lizoszómális organellumokon valamint a transz-golgi hálózat vezikuláin található meg, de szerepük kevésbé ismert. Az AP felfedezésével kiderült, hogy inkább ez, mint a klatrin felelős a rakomány fehérjék kiválasztásáért [22,23]. Az AP kölcsönhatásba lép a vezikulák rakományaiként szereplő transzmembrán fehérjék citoplazmatikus részével, amelyek egy úgynevezett endocitotikus szignált tartalmaznak. Ezek olyan szignál szekvenciák a fehérjék citoplazmatikus doménjeiben, amelyek a fehérjet a klatrin-burkos gödröcskékbe irányítják. 4 féle endocitotikus szignált azonosítottak eddig, az első a tirozin (Y)-alapú szignál : FxNPxY, illetve YxxO (ahol O nagy hidrofób csoport) [24,25]. A második a dileucint (LL) tartalmazó szignál [26]. A harmadik a foszforilált szerint tartalmazó domén, amely számos G-fehérjéhez kapcsolt receptor C-terminális részén megtalálható [27]. A negyedik pedig a ligand indukált szerinfoszforiláció és ubikvitináció, mely elsősorban élesztőben működik [28,29,30,31]. A β-arresztin A másik csoportja a fehérjéknek, amelyek szintén adapter funkciót látnak el, a nemvizuális arresztinek, a β-arresztinek, amelyek a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok internalizációjában játszanak fontos szerepet [32,33]. Az arresztin fehérjéket először a retina pálcikákban írták le, mint a rodopszin deszenzititációjában szerepet játszó fehérjét [34]. A 4 arresztin gén közül kettő a retinában expresszálódik, míg a másik kettő a β-arresztin 1 és 2, vagy más néven arresztin 2 és 3 ubikviteren expresszálódnak [32]. A β-arresztinnek szerepe van a deszenzitizációban, a szignalizációban és az 12

internalizációban. Az arresztinek a foszforilált receptorhoz kapcsolódva sztérikusan gátolják a receptor további kapcsolatát a G-fehérjével, ami a receptor jelátviteli útjának megszakadásához, a receptor deszenzitizációjához vezet [35]. Emellet azonban mint kapcsoló fehérjék is részt vesznek az endocitózisban. Az arresztin az N-terminális részén keresztül képes az aktivált receptorhoz kötődni, C-terminális részén keresztül pedig a klatrinhoz, illetve az AP2-höz, ezáltal az aktivált receptort a klatrinburkos gödröcskék területére irányítja [36,37,38]. A β-arresztin ezenkívül, egyéb enzimek számára is kapcsolódási helyet jelent, melyek a MAPK/ERK útvonalát aktiválják [39,40]. A klatrinhoz, illetve az AP-hoz kapcsolódó fehérjék A klatrinburok kialakításában egyéb fehérjék is szerepet játszanak, melyek vagy a klatrinhoz vagy az AP-hez kötődnek, de általában nem lehet sztöchiometrikus arányban kitisztítani őket a klatrinos vezikulából, ezért feltételezik, hogy szabályozó szerepet töltenek be az endocitózis folyamatában. Ezek a fehérjék számos fehérje-lipid, illetve fehérje-fehérje kölcsönhatás kialakításáért felelős domént tartalmaznak, mint amilyen például a PH domén, SH3 domén, prolingazdag domén, EH domén, és közülük számos enzim aktivitással is rendelkezik. Ezek a járulékos fehérjék valószínűleg csak átmenetileg lépnek kölcsönhatásba a burokkal. Legtöbbjük szerepét először a szinaptikus vezikula újrefelvételében írták le, de a neuronális izoformájuk mellet nem neuronális izoformáik is léteznek, amelyek szerepe kevésbé ismert. Az amfifizin a BAR (Bin-amfifizin-Rvsp) család elsőként felfedezett tagja, amelyet a csirke agyban, mint egy szinaptikus vezikulához kötődő, 128 KDa-os fehérjét fedeztek fel 1992-ben [41]. Az amfifizin autoantigénként szerepel egy autoimmun neurológiai betegségben, a Stiff-man szindrómában, amely a mellrákkal társul [42]. A BAR család minden tagja tartalmaz egy erősen konzervált N-terminális BAR domént, amely az amfifizin dimerizációjához, illetve membránhoz töténő kapcsolódásához szükséges. Ezen kívül tartalmaz egy C-terminális SH3 domént, ami a gerincesekben a dinamin PSRPNR szekvenciájához, és a szinaptojaninhoz tud kötődni, élesztőben pedig az aktinhoz [43]. A centrális régió egy prolingazdag részt tartalmaz, amely az endofilinhez képes kötődni és van egy klatrint és AP2-t kötő doménje is [44,45]. Az 13

amfifizin II két klatrinkötő helyet is tartalmaz a PWDLW, és az LLDLDFDP aminosav szekvenciákat, amely utóbbihoz hasonló található a β-arresztinben is (LIEFE). Az amfifizin I, a dinamin és a szinaptojanin az idegvégződésekben kolokalizál [46,47,48]. Az amfifizin I az idegvégződésekben heterodimert alkot az amfifizin II-vel [49]. A komplexet foszforiláció szabályozza. Az idegvégződés depolarizációja következtében létrejövő kalcium beáramlás aktiválja a kalcium függő kalcineurin nevű foszfatázt, amely defoszforilálja a dinamint, amfifizint és szinaptojanint. A defoszforiláció fokozza a dinamin és a szinaptojanin amfifizinhez kapcsolódását, illetve az amfifizin kötődését a klatrinhoz és az AP2-höz [50]. Az AP180 az idegvégződésekben feldúsulva, specifikusan az agyban található fehérje, de homológjai az emlős sejtekben ubikviteren előfordulnak. Kapcsolatba lép a klatrinnal és fokozza a klatrin vezikulába való összeállását. Két doménje van, az aminoterminális lipidkötő ENTH domén és a C-terminális klatrinkötő domén [51]. Az AP180 peptid injektálása szinaptikus idegvégződésbe a szinaptikus vezikula újrafelvételének gátlását okozta és a membrán morfológiai megváltozásához is vezetett [52]. Az endofilin (előző nevén SH3p4) az agy preszinaptikus idegvégződéseiben található, SH3 domént tartalmazó fehérje, amely az N-terminális részén keresztül dimerizálni képes, és a klatrinburkos vezikula képződés különböző pontjaiban kimutatták lehetséges szerepét, a membrán lefüződésétől kezdve a szinaptikus vezikula kicsomagolásáig [53,54]. Mind a C-terminális SH3 doménje, mind az N-terminális doménje szükséges az endocitózishoz [55]. Az SH3 doménjén keresztül számos endocitózisban szereplő fehérje prolingazdag doménjéhez képes kötődni, például a dinaminhoz és a szinaptojaninhoz [56]. Az N-terminális részének lizofoszfatidsav-aciltranszferáz aktivitása van, amelynek szerepet tulajdonítanak az endocitózis során a membrán görbület kialakításában, mivel közvetlenül képes a lipidekhez kötődni és azokat módosítani. A fordított kúp formájú lizofoszfatidsavat, kúp formájú foszfatidsavvá alakítja, amely alapján azt a hipotézist állították fel, hogy ez a membrán görbületét pozitívból negatív irányúvá alakítja, és felvetették, hogy ez a folyamat szerepet játszik az endocitotikus vezikula kialakulásában [57]. Ezen felül az endofilin képes komplexet képezni a jelátvitelben szereplő molekulákkal, köztük sejtmembránreceptorokkal, és metalloproteázokkal, amely lehetséges összekötő szerepére utal a 14

vezikula kialakulása és az a sejten belüli jelátviteli kaszkád között [58,59]. Két izoformája, az endofilin 1 és 2 heterodimerizációra képesek [60]. Eps15 az EGF receptor kináz szubsztrátja, és egy olyan fehérje-fehérje interakcióban szereplő domént, az EH domént tartalmaz, amely más fehérjék, például a szinaptojanin, NPF (aszparagin-prolin-fenilalanin) motívumaival képes kapcsolatba lépni [61,62]. Konstitutívan kapcsolódik a plazmamembrán AP2 komplexéhez [63]. Az epszin a klatrinhoz, eps15-höz és az AP2-höz kötődő fehérje. N-terminálisan egy ENTH (epszin N-terminális homológia) domént tartalmaz, amely specifikusan képes a PIP2-höz kötődni [64]. Egy új elmélet szerint, ez a PIP2 kötés a membrán olyan módosításához vezet, amelynek a membrángörbület kialkításában van szerepe az endocitózis során [65]. Az interszektin két EH domént és öt SH3 domént tartalmaz [66]. Ez alapján nagyon sok endocitotikus fehérjével kimutatták a kapcsolatát, többek között kötődik a dinaminhoz és a szinaptojaninhoz, az N-WASP-hoz (a neuronális Wiskott-Aldrich szindróma protein), valamint kötődik a Ras kicserélő faktor SOS-hez ezért az endocitózison kívül a MAPK kaszkád aktiválásában is szerepet játszik [67,68,69]. A szinaptojaninnak egy 170kDa-os neuronális és egy 145kDa-os nem-neuronális izoformája van [70]. A dinaminhoz hasonlóan prolingazdag domént tartalmaz és az endofilinhez, az amfifizinhez, a klatrinhoz, AP2-höz, eps15-höz képes kapcsolódni [71,72]. Valamint inozitol-5-foszfatáz aktivitása révén, az endocitózis során a foszfoinozitid szintet szabályozza [73]. A szindapin I (szinaptikus dinaminhoz asszociált protein I ) a C-terminális SH3 doménjén keresztül kötődik a dinaminhoz, szinaptojaninhoz és szinapszin I hez. Ezen kívül kapcsolódik még a N-WASP-hoz is, amely az aktint depolimerizálja és aktin citoszkeletont regulálja. Ezáltal az aktin citoszkeleton és az endocitózis közötti egyik lehetséges kapcsoló elem [74,75,76]. A szinaptotagmin egy N-terminális transzmembrán domént és egy citoplazmatikus domént tartalmaz, amely utóbbit két Ca 2+ és foszfolipidkötő domén alkot. A második C2 domén (C2B) olyan lizin motívumokat tartalmaz, melyek az AP2 kötésben szerepelhetnek. Mind a szinaptikus vezikulák endocitózisában, mind az exocitózisban leírták a szerepét. Az AP2 α és µ alegységéhez egyaránt képes kötődni, ezért az egyik lehetséges faktor az AP2 membránhoz történő kapcsolódásában [77,78]. A kötődést a 15

szinaptotagmin oligomerizációja fokozza [79]. Az internalizációra kerülő receptor fokozza az AP2-szinaptotagmin komplex kialakulását, az AP2-ben létrehozott konformációs változás révén [80]. 2. ábra A klatrin-mediált endocitózis kezdeti lépései és az ebben szereplő fő komponensek. A klatrin-mediált endocitózis során az egyes résztvevő molekulák pontos funkciója és a különböző fehérje-lipid, fehérje-fehérje kapcsolatok hierarchiája a mai napig nem teljesen tisztázott. A képen számos résztvevő fehérje domén szerkezete, és a klatrinburok formálódásának lépései, a burokba történő fehérjék kiválasztása, a burkos gödröcske plazmamembránról történő lefűződése, és a lefűződő vezikula kialakulása került ábrázolásra. Az ábra A részén a mechanizmusban feltüntetett fehérjék, míg a B részén az ábrába nem rajzolt, de az endocitózisban szerepet kapó fehérjék szerepelnek. A rövidítések a következők: ENTH: epszin amino-terminális homológia domén, C2: protein-kináz C-homológia domén, GED: GTP-áz effektor domén, PH: pleksztrinhomológia domén, PRD: prolingazdag domén, SH3: Src-homológia 3 domén, EH: eps15-homológia domén, NPF: Asp-Pro-Phe, DPW: Asp-Pro-Trp, Sac1: aktin szupresszor1 (Takei és mtsai alapján [77]). 16

A dinamin A dinamint 1987-ben fedezte fel Paschal, mint a mikrotubulosokhoz kötődő fehérjét, habár in vivo nincs bizonyíték arra nézve, hogy valóban kötődne a mikrotubulosokhoz [81,82]. 1990-ben Obal és munkatársai klónozták a dinamint, és definiálták a dinamin GTP-áz fehérjék családját [83]. Más munkacsoportok mint a PKC szubsztrátját azonosították neuronális szövetekben, és a defoszfin nevet adták neki [84]. A dinamin endocitózisban betöltött szerepét először akkor fedezték fel, amikor a Drosophila shibire génjének termékéről megállapították, hogy az a dinamin homológja [85]. A hőmérsékletre érzékeny shibire muslicák a nem megfelelő hőmérsékleten gyors és reverzibilis paralízist szenvednek, amely az endocitózis blokkjának a következménye [86,87]. Ezután emlős sejtekben is kimutatták, hogy egy olyan dinamin mutánst expresszálva, amelyben a GTP kötést egy mutációval elrontották, az valóban gátolta az endocitózist [88]. Ezt a dinamin K44A mutánst azóta is általánosan alkalmazzák annak meghatározására, hogy egy adott molekula dinamin-függően internalizálódik-e. Emlősökben 3 izoformát azonosítottak, a neuronális dinamin1-et, a dinamin2-őt, amely minden sejtben megtalálható és a dinamin3-at, ami elsősorban a testisben, tüdőben, és neuronokban fordul elő [89]. A különböző izoformák és splice variánsaik a sejtben különböző helyre lokalizálódnak, és a plazmamembránról történő endocitózison kívül a Golgiból történő transzportban is szerepet játszanak [90]. A dinamin szerepét nem csak a klatrin-mediált endocitózisban, hanem a kaveola mediált endocitózisban is leírták [91]. A dinamin a GTP-ázok között számos egyedülálló tulajdonsággal rendelkezik, és a nagy molekulatömegű GTP-ázokon belül egy önálló családot alkot. A GTP-ázok definíció szerint GTP-t kötnek és hidrolizálnak, és ennek alapján három féle állapotban lehetnek: GTP-kötött, GDP-kötött, illetve nukleotidot nem kötő állapotban. A klasszikus GTP-ázok mint például a Ras esetében mind a GTP hidrolízis mind a GDP elengedésének a sebessége lassú. A dinamin amellett, hogy nagy a molekulatömege, 100 kda, a GTP affinitása kicsiny (K m = 10-25 µm) a bazális GTP hídrolízis sebessége nagy (K cat =8-30*10-3 sec -1 ) és a stimulált GTP hidrolízis sebessége pedig extrém mértékben nagy (K cat =1-5 sec -1 ). Ezenkívül a nukleotidcsere sebessége nagyon magas, vagyis a sebességmeghatározó lépés az a GTP hidrolízis sebessége [92]. 17

A dinaminról kimutatták, hogy a citoplazmában tetramerként van jelen, amely képes gyűrű, illetve spirál alakú struktúrákba tovább oligomerizálódni [93]. Ezek a struktúrák nagyon hasonlítanak a shibire mutánsban található burkos vezikulák nyaka körüli gyűrűkre [94]. Ez, a magasabb rendezettségű struktúrákba való oligomerizáció, a dinamin GTP-áz aktivitását 50-100-szorosra növeli [93,95]. A dinamin oligomerizációja bekövetkezik alacsony sókoncentrációnál, illetve fiziológiás sókoncentráció mellett, GTPγS, illetve GTPAlF 4 jelenlétében, valamint oligomerizálódik mikrotubulusokon, illetve liposzómákon is [96,97,98,99]. A dinamin felépítése A dinamin egy multidomén szerkezetű fehérje, melyben a legkonzerváltabb rész a GTP-áz és a GED domén. A GTP-áz domén (1-299) három konszenzus GTP kötő szekvenciát tartalmaz: GXXXXGKS, DXXG, és TKXD [100]. A dinamin családon belül ez a legkonzerváltabb régió. A kristálystruktúráját meghatározták mind a GDP kötött, mind nukletidot nem kötött állapotban [101]. A globuláris GTP-áz domén a klasszikus G- fehérjékhez hasonló váz motívumot tartalmaz, mint amilyen például a Rasban van. A különbség a Rashoz képest, hogy nem 6 hanem 8 szálú β-lemezt, 55 aminosavval többet tartalmaz mint a Ras, es eggyel több amino-terminális hélix van benne [102]. Azt találták, hogy a GDP-t kötött és a nukleotidot nem kötött konformáció közt nincs különbség, ami arra utal, hogy a konformáció változás a dinaminban nem a GDP elengedésekor, hanem a GTP megkötésekor vagy a foszfát lehidrolizálásakor történik. A GTP-áz doménben létrehozott mutációk nukleotidot nem kötő, illetve csökkent GTPáz aktivitású állapotot hoznak létre a dinaminban, amely gátolja a receptor-mediált endocitózist in vivo [88]. A középső domén (300-520): Ennek a doménnek egyik ismert doménnel sincs szekvenciahomológiája. Alternatív splicing helyek a 3 dinamin izoforma számára, ennek a doménnek a C-terminális részében vannak [90]. Az N-terminális részének a dinamin molekulák közötti interakcióban van szerepe [103,104]. 18

A pleksztrin-homológia domén (521-622): A dinamin PH doménje a PIP2-höz mutatja a legnagyobb affinitást, amely kötés a GTP-áz aktivitását is stimulálja [105]. A lipidkötést a dinamin oligomerizációja fokozza [106]. A monomer dinamin PH doménhez képest kimutatták, hogy a dimer már olyan erősséggel köti a PIP2-őt, amely elegendő lehet a PH domén általi foszfoinozitid kötéshez a sejtmembránon, figyelembe véve, hogy a teljes hosszúságú dinamin tetramerként van jelen a sejtben [107,108]. A PH domén 3 dimenziós kristálystruktúráját meghatározták mind röntgendiffrakciós analízissel, mind NMR-el [109,110]. Ami a PH domének esetében tipikusnak tekinthető, a dinamin esetében is, a PH domén minimális szekvencia homológiát mutat a többi fehérje PH doménjével, de a harmadlagos stuktúra jól konzervált és 7 β-lemezt 3 variábilis hurkot és C-terminálisan egy α-hélixet tartalmaz. Struktúrális és pontmutációs vizsgálatok igazolták, hogy a 3 variábilis hurok a β redők között tartalmaz olyan bázikus aminosavakat,amelyek felelősek az anionos lipidekhez, elsősorban a PIP2-höz és a PI4P-hoz való kötődésért [105]. Ezt alátámasztja az is, hogy 535-ös lizin pontmutációja megakadályozta a lipid által stimulált GTP-áz aktivitást és gátolta a transzferrinreceptor endocitózisát [111,112]. A dinamin PH doménje ezenkívül még a G-fehérjék βγ alegységéhez is képes kötődni, amely a lipidkötéssel ellentétben gátolja a dinamin GTP-áz aktivitását [113,114]. A GTP-áz effektor domén (623-745): Ez a domén 2 olyan régiót tartalmaz amely fehérje-fehérje, illetve domén-domén interakciókban játszik fontos szerepet [115]. A GED domén az α-hélixek által képzett hidrofób árokban kölcsönhatásba tud lépni a GTP-áz doménnel. Ez az interakció fokozza a GTP hidrolízis sebességét, ami arra utal, hogy a GED domén intramolekuláris GTP-áz aktiváló proteinként (GAP) funkcionál a dinaminon belül [93]. A GED domén másik GED doménnel is kölcsönhatásba lép, amelynek a dinamin dimerek, illetve tetramerek kialakulásában lehet szerepe. Pontmutációs analízis a 694-es lizinnek, a 725-ös és a 730-as argininnek tulajdonított szerepet a GTP-áz aktivitás stimulálásában. Az 725-ös arginin a katalitikus aktivitásban játszik fontos szerepet, míg a 694-es lizin a dinamin oligomerizációjában. És habár ezek a mutációk in vitro csökkentik a dinamin GTP-áz aktivitását, in vivo mégis stimulálják a receptor mediált endocitózist [95]. 19

A prolingazdag domén (746-684): Az utolsó kb. 100 aminosava a dinaminnak gazdag prolinokban és bázikus aminosavakban. Az izoelektromos pontja: pi=kb.12 [82]. A dinamin prolingazdag doménjében 3 olyan rész van, amely különböző specificitással köti az SH3 doméneket. Ez az interakció fokozza a dinamin GTP-áz aktivitását. In vitro a dinamin prolingazdag részéhez képes kötődni többek között a Grb2, a PI3K, a PLCγ SH3 doménje, valamint az amfifizin, endofilin, interszektin SH3 doménje [116,117,118]. 3. ábra A dinamin doménszekezete. A dinamin 5 funkcionális doménből épül fel. N-terminálisan egy GTP-áz domént tartalmaz, amelyben 3 GTP kötő szekvencia található. Mellete a középső domén van, majd a PH domén, melynek a kristálystruktúrája van alatta feltüntetve, és a PIP2 koordinálásában szerepet játszó 535-ös lizin aminosav. Ezt követi a GED domén, amelyben a két fehérje-fehérje kölcsönhatásra alkalmas rész van kiemelve. A prolingazdag doménben (PRD) a Grb2 és az amfifizin SH3 doménjét kötő szekvenciarészletek kerültek külön kiemelésre (Hinshaw és mtsai alapján [119]). A dinamin funkciójára vonatkozó modellek A dinamin endocitózisban betöltött szerepének pontos mechanizmusa a mai napig nem ismert. Először azt hitték, hogy egy klasszikus mechanokémiai enzim, amely a vezikulák plazmamembránról tőrténő lehasítását végzi, de az utóbbi időben egyre több adat mutat inkább annak irányában, hogy a klasszikus regulátor fehérjékhez hasonlóan, GTP kötött formában effektor molekulák hozzákapcsolódását segíti elő a vezikulához az endocitózis során. A dinamin szerepére vonatkozóan a kísérleti adatok alapján 5 modell lett felállítva [120]. Ezek sematikusan az 5.ábrán vannak ábrázolva. 20

1. modell: Dinamin, a végrehajtó molekula A dinamin egyedülálló biokémiai sajátosságai, és az első in vivo és in vitro kísérletek alpján állították fel a dinaminra funkciójára vonatkozó első modellt [121]. A modell szerint a dinamin a klatrinburkos gödröcskékhez GDP kötött vagy nem kötött formában kapcsolódik. A GTP megkötése egy olyan konformációs változást okoz a dinaminban, ami ahhoz vezet, hogy a dinamin leválik a klatrin hálóról és a vezikula nyaka körül alkot oligomerizálódott struktúrát. A gyors és koordinált GTP hidrolízis egy második konformációs változást okoz a dinaminban, amely a vezikula nyakát összeszorítja és a vezikula plazmamembránról történő levágódásához vezet [122]. 2. modell: Dinamin, a molekuláris rugó Egy teljesen ellentétes konformációs változást is leírtak a dinaminnal kapcsolatban. Lipidkeverékből álló lipid-nanotubulusokon GTPγS, illetve GDPAlF 4 jelenlétében spirális gyűrűkbe rendeződött, amelyben a gyűrű belső átmérője 11±1.5 nm volt. Ezzel szemben GDP jelenlétében nagyobb átmérőjű 20±3 nm hélixek keletkeztek (4.ábra). Ez azt bizonyítja, hogy a dinaminnak két különböző konformációs állapota létezik a nukleotid kötött aktív állapotában. Amikor GTP hidrolízist idéztek elő MgCl 2 adásával, a dinamin a GDP kötött formára emlékeztető, lazább konformációt vette fel. Ez a konformációs különbség az oligomerekbe összeállt GDP-t és GTP-t kötött dinamin között, vezetett annak a hipotézisnek a felállításához, hogy a dinamin rugószerű megnyúlása okozza az endocitotikus vezikula levágódását [123]. 4. ábra Dinamin lipid-nanotubulusokon. a., a mérték az ábra alján 100nm-t jelöl, az ábra a dinamin nélküli, lipidkeverékből összeálló lipidtubulusokat ábrázolja b., a GTPγS-kötött dinamin a lipid-nanotubulusok felületén c., a GDP-kötött dinamin a lipidtubulusokon felületén, látható, hogy a dinaminhélixek megnyúltak (Stovell és mtsai alapján [123]). 21

3. modell: Rigid membránt körülvevő elasztikus dinamin hélixek A lipid kettősréteg elasztikus sajátságaira alapul ez a matematikai modell. E szerint a dinamin hélix megnyúlása az alatta lévő lipidkettősréteg olyan alakváltozását okozza, ami a vezikula összeszűküléséhez, illetve záródáshoz vezet. A dinamin gyűrű egy rigid külső vázat képez amely mechanikailag összeszorítja a vezikula nyakát. Megfelelő körülmények között a nyak elveszti stabilitását és összeroppan [124]. 4. modelll: Dinamin, a molekuláris csukló Ebben a modellben a dinamin funkciója nem igényel összehangolt konformációs változást. Ez a modell a dinamin egyes doménjei között kialakuló kölcsönhatásokon alapul. A GED domén interakcióba képes lépni a GTP-áz doménnel, a középső doménnel és egy másik GED doménnel is A GED és a GTP-áz domén közötti kölcsönhatás nukleotidkötés függő. Ez a nukleotidfüggés egy olyan modelll felállításához vezetett amelyben a dinamin spirálban az egyik molekula elcsúszik a másikon, és a dinamin GTP hidrolízise vezet a dinamin domének összekapcsolódásához és szétválásához, hasonlóan, ahogyan a miozin mozdul el az aktin mentén, így szűkítve a vezikula nyakát [103]. 5. modell: Dinamin, a szabályozó GTP-áz Ezen modellek után meglepetés volt, amikor azt találták, hogy az a dinamin mutáns, amelyben az oligomerizáció által fokoztt GTP-áz aktivitás volt elrontva, nem gátolta, hanem fokozta az endocitózist. A dinamin egyedülálló a GTP-ázok között abból a szempontból, hogy a GED doménje egy intramolekuláris GAP-ként funkcionál, amely a dinamin molekulák összekapcsolódásakor aktiválódik. A GED doménben van egy arginin ujj, amelyben az R725 ös aminosav játszik szerepet a GTP-áz aktivitás szabályozásában. Amikor ezen aminosavakat mutálták, a dinamin fokozta a transzferrin endocitózisát in vivo. Ez arra utal, hogy a dinamin elsődleges szerepet játszik a 22

transzferrinendocitózis sebességmeghatározó lépésében. Ezek az adtok azt mutatták, hogy a GTP kötött dinamin az aktív forma, amelynek az életideje ezekben a mutánsokban meghosszabbodott. A klasszikus GTP-ázok mintájára azt a modellt javasolták, hogy a GTP kötött dinamin a klatrin-mediált endocitózisban szereplő egyéb fehérjék összekapcsolásának szabályozásában játszik szerepet. Ennek alapján a GAP aktiváció szerepe a dinamin kikpacsolása, amely a dinamin molekulák szétkapcsolásához vezet [95]. A dinamin család fehérjéi A dinamin GTP-áz családba tartozik, többek között, az antivirális védekezésben szerepet játszó Mx fehérje, a mitokondriális morfológia fenntartásában szerepet játszó Dnm1p fehérje és a kloroplaszt biogenezisben szereplő ADL1, fragmoplasztin. A legnagyobb szekvencia homogenitás a dinamin fehérjecsalád tagjain belül a GED és GTP-áz doménben van, a középső domén változatosabb. A PH domén csak a dinaminban és az ADL3-ban, míg a karboxi-terminalis prolingazdag domén csak a dinaminban található meg. A dinamin család többi tagjára is jellemző, hogy a dinaminhoz hasonlóan képesek oligomerizálódni [125]. 23

1. A kivégző molekula 2. A molekuláris rugó 3. Rigid membrán, elasztikus hélix 4. A molekuláris csukló 5. A szabályozó GTP-áz 5.ábra A dinamin funkciójára vonatkozó modellek. Az ábrán a szövegben ismertetett dinamin működését leiró különböző modellek vannak vázlatosan ábrázolva (Sever és mtsai alapján [120]). 24

A dinamin endocitózison kívül betöltött szerepe Egyre több adat található azzal kapcsolatban, hogy a dinaminnak szerepe van az aktin citoszkeleton szabályozásában, a MAPK kaszkádban és az apoptózisban, ami arra utal, hogy a dinamin a jelátvitelben is szereplő GTP-áz fehérje. Az ubikviter dinamin2 izoforma aktivalja a p53 transzkripciós faktort és apoptózist indukál HeLa sejtekben [126]. A DRP1, ami a dinaminok családjába tartozik és az élesztő Dnm1p-nek az emlős homológja, megakadályozza a staurosporin-indukált apoptózist HeLa sejtekben [127]. Egyes adatok arra utalnak, hogy a dinaminnak fontos szerepe lehet a MAPK útvonal aktiválásában is [128]. T3-1 sejtekben kimutatták, hogy a GnRH receptor általi ERK aktivációnak két útvonala van, amelyek a Raf-1 szintjén találkoznak. Az egyik a Raf-1 PKC általi aktivációja a másik az Src általi, amelyben a dinaminnak van központi szerepe [129]. A dinamin2-ről ezen kívül kimutatták, hogy szerepe van az aktin citoszkeleton átrendeződésének szabályozásában is. A prolingazdag domén hiányos dinamin mutáns a sejtalak változását idézi elő, és az aktin stresszszálak száma nagymértékben megnő ezekben a sejtekben [130,131]. A foszfoinozitidkötő és prolingazdag domének altalános jellemzése, szerepük az endocitózisban A foszfoinozitidek a különböző membránok citoszólikus oldalán szintetizálódnak, ahol effektor fehérjék kapcsolódását, illetve aktiválását teszik lehetővé. A foszfoinozitid szint lokális változását kinázok és foszfatázok működése teszi lehetővé a membrán egy speciális régiójában, amely a membránfolyamatok időbeli és térbeli szabályozását teszi lehetővé. Az elsőként azonosított foszfoinozitidkötő domén a PH domén volt [132]. Ezután számos új foszfoinozitidkötő domént is felfedeztek, mint amilyen a FYVE domén, PX domén, ENTH domén. A foszfoinozitidkötő doméneket a lokalizációjuk és a kötésspecificitásuk alapján lehet csoportosítani [133,134,135]. A PH és az ENTH domén a plazmamembránon funkcionál, míg a FYVE és a PX domén a különböző 25

intracelluláris vezikula membránokon. A FYVE és az ENTH doménnek egy bizonyos foszfoinozitidhez van specifictása, míg a PH és PX domén specificitása redundáns. Mindegyik foszfoinozitid kötő domén sajátos karakterisztikával rendelkezik és funkciójuk nem átfedő. A foszfoinozitidkötő doméneket tartalmazó fehérjék általánosan 4 csoportba sorolhatók be. Az első a foszfoinozitideket lebontó enzimek, a második a kis molekulasúlyú GTP-ázok szabályozói, mint a GEF és a GAP. A harmadik csoportba a protein kinázok, és a negyedikbe az endocitózisban szereplő adapter fehérjék tartoznak [136]. A foszfoinozitidkötésnek az endocitózis során vagy az adott fehérje lokalizációjában, vagy pedig funkciójának szabályozásában lehet szerepe. A klatrin mediált endocitózis szigorúan szabályozott folyamatában számos foszfoinozitid kötő domén vesz részt, az AP2-ben található rövid peptid résztől kezdve a dinaminban található PH doménen keresztül, az epszinben, AP180-ban található ENTH doménig. Az AP2 α-alegysége a PIP3-hoz és a PIP2-höz tud kötődni az N-terminális részén keresztül, amley lizin tripleteket tartalmaz. A lizinek kicserélése glicinre, a foszfoinozitid kötést megszűnteti, és az AP2 klatrinburkos gödröcskéhez történő lokalizációját is megváltoztatja. [137,138]. A PH domén 100-120 aminosavból álló konzervált régió, amelyet a proteinkináz C szubsztrátjában, a pleksztrinben azonosítottak a vérlemezkékben. A PH domének szerkezetére jellemző, hogy 7 β-redőből és egy α-hélixből épülnek fel. 2 vagy 3 variábilis hurkot tartalmaznak, amelyek az aminosav szinten nagy változatoságot mutatnak. Ez alakítja ki az elektrosztatikusan polarizált domén pozitív töltésű részét, amely a foszfoinozitidek és az inozitolfoszfátok felismerésében játszik szerepet, azaz a PH domének ligandspecificitását adja [139]. A PH domén széles körben megtalálható a sejtben különböző fehérjékben, köztük protein kinázokban, foszfolipázokban, GTPázokban. In vitro kísérletek alapján a PH domént tartalmazó fehérjéket 4 csoportba sorolják. Az első csoport az, amely kizárólag a PI(3,4,5)P3-at köti, mint például a Btk, GAP1, SOS. A második csoportba tartozó fehérjék a PI(4,5)P2-vel lépnek a legszorosabb kölcsönhatásba, de más ligandjai is előfordulnak. Ide tartozik például a PLCδ1, β-ark1, spektrin, Ras-GAP. A harmadik csoportba a PI(3,4)P2-vel kölcsönhatásba lépő PH domént tartalmazó fehérjék tartoznak, mint amilyen az Akt/PKB. A negyedik csoportba sorolják be azokat, amelyeknek nincsen 26

ligandspecificitása [136]. A PH doméneknek összesen csak mintegy 15%-a mutat nagy affinitást és specificitást egy bizonyos ligand iránt. A nagy affinitású és specificitású PH domének képesek az adott fehérje megfelelő foszfoinozitidhez történő lokalizációját biztosítani a sejten belül. A maradék 85% esetében Lemmon és Ferguson felállított egy modellt, a negyedik csoportba sorolható dinamin PH doménjének példája alapján. E szerint az oliogomerizáció a PH domén affinitását olyan szintre növelheti meg, akkár mikromoláros affinitásra, amely elegendő lehet a membránkötéshez [107]. A FYVE négy fehérje nevének első betűjéből származó rövidítés (Fab1p, YOTB, Vac1p, EEA1), amelyekben ez a domén megtalálható. A domén 80 aminosav hosszúságú és a PI3P-t köti nagy affinitással. A FYVE domén lipid kötéséhez a Zn 2+ ionok és az RRHHCR szekvencia jelenlétére van szükség [140]. A FYVE domént az EEA1-ben (korai endoszómális antigén 1) azonosították, amely a szisztémás lupus eritmatozusban szereplő autoantigén. Az EEA1 esetében a PI3P kötése a korai endoszómákhoz való lokalizálását teszi lehetővé. Az EEA1 az N-terminális doménjén keresztül kötődik a Rab5-höz, amely kapcsolatot tovább stabilizál a C-terminális FYVE doménen keresztüli kötés [141,142]. A FYVE doménben létrehozott mutáció megszűnteti az EEA1 kolokalizációját a Rab5-el a korai endoszómákon és citoszólikus lokalizációhoz vezet [143]. A PX domén 100-140 aminosavat tartalmaz, és a NADPH oxidáz p47phox részében azonosították előszőr, funkciója a FYVE doménhez hasonló, a fehérje lokalizációját biztosíitja [134]. Az ENTH domén, 140 aminosavat tartalmazó, az epszin1-3-ban, AP180-ban található domén. Az ENTH domén PIP2-vel való kölcsönhatása az endocitózishoz alapvető jelentőségű, az epszin esetében bizonyították, hogy az ENTH-hez oly módon tud kötődni a PIP2, mely a membrán alakváltozásához vezethez, ami elősegíti az endocitózis során a plazmamembránról lefűződő vezikula kialakulását [65,144]. Egy érdekes megfigyelés, hogy a PH domén előfordulhat egyes fehérjékben együtt a FYVE vagy a PX doménnel, viszont a PX és a FYVE domén soha nem fordulnak elő együtt. Az ENTH egyik másik foszfoinozitid kötő doménnel sem fordul elő együtt, és mindig a fehérje N-terminális részén található. Egyéb domének amelyekről kimutatták, hogy kötődnek foszfoinozitidekhez, például a C2 domén és néhány SH2 domén [145,146]. 27

A prolingazdag domének más fehérjék SH3 doménjéhez képesek kötődni. A prolingazdag domének által kialakított kapcsolatok szintén a fehérje funkciójának a szabályozásában szerepelhetnek, de ezen felül ez a kölcsönhatás biztosíthatja egy adott fehérje lokalizálását is az által, hogy egy adott membránhoz már lokalizálni képes fehérjével hoz létre kapcsolatot. Az SH3 domének által közvetített interakciók szerepét először a jelátviteli útvonalakban fedezték fel, majd egyre több adat utalt arra, hogy az endocitózisban is fontos szerepük van. Az irodalomban legalaposabban leírt SH3 domén mediált interakció a Grb2/SOS komplex általi Ras aktiváció [147]. Az endocitózis során a dinamin álatal kialakított fehérje-fehérje kapcsolatoknak van központi szerepe. Ha megszűntetik a dinamin prolingazdag régiójának kapcsolatát az SH3 domént tartalmzó különböző endocitotikus fehérjékkel, mint amilyen például az amfifizin vagy az endofilin, az endocitózis gátolódik [148]. Az SH3 domének 50-70 aminosavbó álló fehérje domének. Az SH3 doménekkel kölcsönhatásba lépő prolingazdag doménnel rendelkező fehérjék legalább egy PXXP aminosavmotívumot tartalmaznak [149]. A prolin az aminosavak közül egyedülálló abban a tekintetben, hogy az oldalgyűrű nitrogén atomja a vázhoz tartozik, amely meghatározza a konformációját, illetve a prolin előtti aminosav konformációját is behatárolja [150]. Ebből következik, hogy egy fehérjében megtalálható poli-prolin szekvenciák egy II-es típusú poli-prolin hélixet alakítanak ki, ahol a PXXP szekvencia, az SH3 ligandot kötő doménban a hélix azonos oldalára kerül, amely könnyű ligandkapcsolodást tesz lehetővé. A prolinok egy folytonos hidrofób külső felszínt hoznak létre, míg a másik oldalon a hidrogén kötések kialakítására alkalmas karbonil lánc helyezkedik el. A poli-prolin hélix hozzáférését az is elősegíti, hogy általában a fehérjék C-vagy N-terminális részén helyezkednek el, mintegy ragadós véget alkotva. A PXXP váz körül elhelyezkedő prolinok a poli-prolin hélixstruktúra fenntartását elősegítik. Két alosztályát különítették el az SH3 doméneknek. Az első osztályba tartozó SH3 ligandok az RXqPXqP szekvenciát tartalmazzák, ahol a q hidrofób aminosavat jelent, és általában prolin, leucin, vagy valin. Ezek a prolingazdag ligandok, egy bal-kéz iranyú poliprolin hélix konformációt vesznek fel. A második osztályba tartozó fehérjék egy ellentétes irányú poliprolin konformációt vesznek fel és a qpxqpxr szekvenciát tartalmazzák [151]. Az SH3 domén konzervált aromás 28

oldalláncaival létrehozott hidrofób kötés nem olyan erős mint a globuláris domének esetében, azonban ennek előnye lehet az, hogy egy kevésbé erős kötés sokkal gyorsabb változást tesz lehetővé. Ez magyarázza azt a megfigyelést, hogy a prolingazdag domén gyakran található olyan fehérjékben, amelyek a gyors kapcsolódásért, illetve fehérjék gyors kicseréléséért felelősek, mint például amelyek a transzkripcióban, szignalizációs útvonalakban, citoszkeletális átrendeződésekben szerepelnek. Mivel az interakció a hidrofób kölcsönhatáson alapul, ezért nem igényel szigorúan komplementer felszíneket, ami magyarázat arra, hogy az egyes fehérjék prolingazdag doménjének miért van annyi SH3 domént tartalmazó ligandpartnere. Prolingazdag szekvenciákat ismernek fel az SH3 doméneken kívül a WW domének, illetve az EVH1 domének is [152,153]. A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok deszenzitizációjának és internalizációjának általános mechanizmusa Az agonista kötésének hatására a 7TM domén szerkezetű receptorok először egy olyan konformáció változáson mennek keresztül, amely lehetővé teszi számukra a heterotrimer G-fehérjéhez való kapcsolódást, illetve az effektor molekulák és jelátviteli útvonalak aktiválását. Ezután a 7TM receptorok saját válaszukat szabályozzák az által, hogy ezzel egyidőben olyan útvonalak is aktiválódnak, melyek a jelátviteli utak terminálásához, a receptor deszenzitizációjához vezetnek. A deszenzitizáció folyamatának első lépése, a receptor szétkapcsolása a G-fehérjétől. Ez a folyamat az aktiváció után másodpercekkel, illetve percekkel következik be, és a receptor foszforilációját jelenti G-fehérjéhez kapcsolt receptorkinázok, illetve másodlagos hírvivők által regulált kinázok által, mint amilyen a PKA és a PKC. A másodlagos hírvivők által regulált kinázok képesek az aktív receptoron kívül inaktívakat is foszforilálni amely heterológ deszenzitizációhoz vezet, míg a GRK csak az agonista által aktivált receptort képes foszforilálni, amely folyamat a homológ deszenzitizáció. A receptorok a harmadik intracelluláris hurok régióban és a C-terminális régióban található szerin és treonin aminosavakon foszforilálódnak. Azonban a foszforiláció önmagában nem mindig elég a deszenzitizációhoz, és arra szolgál, hogy lehetővé tegye az arresztin fehérjék kapcsolódását a receptorhoz, amelyek megakadályozzák a további 29

receptor G-fehérje kapcsolatot. Ezen kívül az arresztinek többirányú kapcsolatot biztosító molekulaként is szolgálnak, és a receptort az endocitózis útvonalához irányítják az által, hogy képesek kötni a klatrin, illetve az AP2 fehérje β-alegységét. Valamint más fehérjék számára is kapcsoló helyet jelentenek, melyek a MAPK/ERK útvonalát aktiválják. Internalizációra csak azok a receptorok kerülnek, amelyek a G- fehérjétől már szétkapcsolt állapotban vannak, ezért az internalizáció jelentősége nem a deszenzitizációban van, ahogyan azt eredetileg gondolták, hanem a receptor érzékenységének a helyreállításában, a reszenzitizációban, ugyanis a sejt belsejében defoszforilált receptor juthat vissza a sejtmembránba, ahol újra képes az agonista kötésére és újabb jelátvitelre. Az internalizációra került receptor másik útvonala a reciklizáció mellet a degradáció. A hosszas agonista stimuláció után megfigyelt receptorszám csökkenés, a receptor down-reguláció, a receptor degradációs útvonalakra kerülését jelenti. [154,155,156] A receptor útvonala a sejten belül A receptorok az endocitózist követően osztályozásra kerülnek, amely a receptorok kiválogatását jelenti a reciklizációs vagy degradációs útvonalakra, az endocitózis után néhány perccel. Az internalizált molekulák először a korai, vagy úgynevezett osztályozó endoszómákba kerülnek. Itt a legtöbb ligand ledisszociál a receptoráról és a késői endoszómákba, illetve a lizoszómákba kerül degradációra. A maradék olyan membránokban halmozódik fel, amely tubuláris vezikuláris struktúrákat tartalmaz és a mikrotubulus organizáló központ közelében helyezkedik el. Ezekhez a membránokhoz nem jutnak olyan molekulák, amelyek a késői endoszómákba vagy lizoszómákba kerülnének, és a PH-juk is kicsit magasabb, mint a korai endoszómáké, ezért ezeket külön organellumként, pericentrióláris reciklizáló endoszómaként, definiálták [157]. Az endocitózis útvonalának membránjaihoz kapcsolódó szabályozó fehérjék a Rab kis GTP-áz fehérjecsaládba tartoznak. A Rab fehérjék, melyek az élesztőben és növényekben Ypt néven ismertek, a Ras családba tartozó monomer GTP-ázok, amelyekből több mint 60 létezik. A posztranszlációs izoprenil módosítás lehetővé teszi, hogy különböző intracelluláris organellumokhoz és vezikulák citoplazmatikus membránjához kapcsolódjanak. A különböző Rab fehérjék specifikusan kapcsolódnak 30

egyes membránokhoz, speciális subcelluláris lokalizációval [158,159]. A Rab-ok, mint molekuláris kapcsolók szerepelnek, a GTP kötött formájuk az aktív forma, amely egy szolubilis effektor molekulához kötődik. Az egyes Rab fehérjék szabályzó funkciója az adott membrán kompartmenthez kötött. A Rab fehérjék a vezikula transzport négy lépéses folyamatában minden lépésében szerepet játszhatnak, a vezikula kialakulásától kezdve, a vezikula megfelelő kompartment felé való mozgatásában, a vezikula akceptor mebránhoz való kihorgonyzásában, és a két membrán közti fúzióban. A legalaposabban tanulmányozott a Rab5 fehérje, amely a plazmamembrántól a korai endoszómához való útvonalban, és az endoszómák fúziójában játszik szerepet. Számos citoszolikus fehérjét azonosítottak, amelyek a Rab5 aktivált formájához specifikusan kötődnek. Ezek a Rab5 effektor fehérjék, melyek együttműködésre képesek. A Rab5-öt a Rabaptin-5/Rabex-5 komplex aktiválja, amely lehetővé teszi a PI3-kináz kapcsolódását. A PI3-kináz lokálisan generál PI3P-ot. A PI3P és az aktivált Rab5 által biztosított környezet szükséges ahhoz, hogy az EEA1 kihorgonyzó fehérje az endoszómális membránhoz tudjon kötődni. Az EEA1 közvetlen kapcsolatba lép a SNARE-el egy dinamikus oligomerkomplexben, amely az endoszómák fúziójához vezet [160,161,162]. Immunfluoreszcens vizsgálatokkal, GFP-hez kapcsolt Rab proteinek segítségével az endoszómáknak legalább 3 populációját lehet elkülöníteni. Az első Rab5-t, a második Rab4-et és Rab5-öt, a harmadik pedig Rab4-et és Rab 11-et tartalmaz. Az első két Rab fehérje a korai, osztályozó endoszómán van jelen, míg a harmadik a perinukleáris reciklizáló endoszómához képes kötődni. Az internalizáló transzferrinről kimutatták, hogy először a Rab5-t tartalmazó doménekbe kerül, majd folyamatosan megy keresztül a Rab4 és Rab11 pozitív struktúrákon. A Rab4 és 11-et tartalmazó domén tartlamazza a reciklizációhoz szükséges egyéb fehérjéket [157]. A Rabaptin 5 képes a Rab5-el és Rab4-el is interakcióba lépni, ezért funkcionálisan és strukturálisan is összekapcsolhatja a két domént [163]. Rab proteinek és a Rab effektor proteinek meghatározott membrán doménekbe gyülnek össze az enoszómán. A különböző domén összetételű endoszómáknak, különböző a farmakológiai érzékenységük is, amely a biokémiai és funkcionális különbségükre utal. Ez alapján egy olyan modellt állítottak fel, amelyben az endoszómát, mint a különböző funkcionális doménekből összerakott mozaikot írják le, amelyeket a Rab proteinek, és egyéb hasonló szabályozó fehérjék 31

szerveznek, amelyek lehetővé teszik a specifikus effektor fehérjék lokális kapcsolódását [157,164]. Az endocitózis és a jelátvitel kapcsolata Az endocitózisnak fontos szerepe van a sejtfelszíni jelátvitelre képes receptorok és ligandjainak a számának a szabályozásában. Az endocitózis felerősítheti, illetve gyengítheti a jelátvitelt, vagy új utakra terelheti az által, hogy az endocitózissal újfajta jelátviteli komplexek jöhetnek létre. Az endocitózis szabályozásában szerepet játszó fehérjék közül számos tartalmaz olyan doméneket amelyek mind az endocitózisban, mind a hagyományos jelátviteli útvonalakban egyaránt szerepelnek. A receptor endocitózisának gátlása, a receptor tirozin-kinázok és a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok esetében az endocitotikus fehérjék domináns negatív mutánsaival, a MAPK útvonal elégtelen aktivációját okozza. Ez arra utal, hogy az endocitózis meghatározó szerepet játszik a MAPK útvonal aktiválásában [165,166,167,168]. A heterotrimer G-fehérjék a plazmamembránhoz palmitoil, illetve mirisztoil oldalláncon keresztül vannak kihorgonyozva, amely azt eredményezi, hogy a heterotrimer G-fehérjéhez kötött jelátvitel csak a plazmamebránról indulhat el. Az internalizált receptorok jelátvitele fehérje-fehérje kölcsönhatásokon keresztül jön létre, amelyben a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok esetében a β-arresztin játszik központi szerepet. A β-arresztinnek azon felül, hogy szerepe van a receptor deszenzitizációjában és az endocitózisában számos szignalizációban szereplő fehérjét is képes megkötni, mint az Src kinázok és az ERK/MAPK útvonal számos tagja. Néhány esetben a β- arresztin a receptorról rögtön ledisszociál az endocitózis után, azonban számos esetben stabilan asszociálva marad a receptorral az endoszóma membránján. Az Src-ről és az ERK/MAPK-okról is kimutatták már, hogy konstitutívan vagy ligand hatására hozzákötődnek a receptort tartalmazó endoszómákhoz. Ez vezetett annak a hipotézisnek a felállításához, hogy a β-arresztin, mint kapcsoló fehérje szerepel, amely összegyűjti a kináz kaszkád molekuláit és más jelátvitelben szereplő molekulákat. Arra még nincs válasz, hogy ezek a komplexek csak az endoszóma membránján jöhetnek létre, vagy a plazmamebránon is, illetve, hogy mi a különbség a kétféle helyről kiinduló szignalizációs útvonalban. A domináns negatív dinamin expressziója gátolta a β- 32

adrenerg receptor mediált ERK/MAPK aktivációt, anélkül, hogy az receptor aktivált adenil-cikláz aktivációt befolyásolta volna. Különböző sejt típusokban azonban különbség lehet ugyanazon receptor általi ERK/MAPK aktivációnak a mechanizmusában, illetve vannak olyan G-fehérjéhez kapcsolt receptorok, amelyek az ERK/MAPK aktivációhoz egyátalán nem igényelnek endocitózist [169]. 33

Az angiotenzin II receptorok Az angiotenzin szerepe Az angiotenzin II a renin-angiotenzin-aldoszteron rendszer fő effektor molekulája, mely egy oktapeptid hormon (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe). Renin hatására a keringő angiotenzinogénből angiotenzin I keletkezik, amely az angiotenzin konvertáló enzim (ACE) hatására alakul tovább angiotenzin II-vé (6.ábra). Az ACE nem játszik kizárólagos szerepet az angiotenzin II képződésében, szerepet tulajdonítanak egyéb enzimeknek is, mint például az elasztáznak, katepszin-g-nek, szöveti plazminogén aktivátornak, toninnak, kimáznak [170]. Az angiotenzin II nem csak a vérplazmában, hanem számos szövetben is keletkezhet lokálisan pl: a vesében, mellékvesében, tüdőben, pankreászban, placentában, központi idegrendszerben [171]. Az angiotenzin II-nek központi szerepe van a vérnyomás és a só-víz háztartás szabályozásában, és hormonhatása mellett a központi idegrendszerben mint neurotranszmitter is szerepel [172]. Az érfal simaizomzatra hatva vazokonstikciót okoz és sejtproliferációt fokozó hatása van, a mellékvesekéreg zona glomerulosa sejtjeiben fokozza az aldoszteron szekréciót, a vesében fokozza a nátrium visszaszívást a tubulusokban és főként az efferens arteriolán vazokonstrikciót hoz létre, a mezangiális sejtek kontrakcióját és prosztaglandin felszabadulást okoz. A központi idegrendszerre hatva fokozott szomjúság érzetet vált ki, fokozza a vazopresszin szekrécióját, befolyásolja a szenzoros funkciókat, a tanulást és a memóriát [173,174]. A szimpatikus idegrendszeri hatása, hogy fokozza a szimpatikus aktivitást, pozitív inotróp hatású és a szívben kóros körülmények között szerepet játszik a kamrai hipertrófia kialakulásában [175]. Az angiotenzin gyors vérnyomásemelő hatását a terápában is felhasználják, erre a célra angiotenzinamidot adnak intavénás infúzió formájában [176]. Azonban fiziológiásan az angiotenzin II gyors vérnyomás emelő hatásánál valószínűleg fontosabb a vérnyomás hosszútávú megemelése és stabilizálása. 34

6.ábra Az angiotenzin II és az egyéb angiotenzin pepidek keletkezésének mechanizmusa. A vese juxtaglomelurális sejtjeiből felszabaduló renin alakítja az angiotenzinogént angiotenzin I-gyé, majd a tüdőben található ACE enzim angiotenzin II-vé, amely aminopeptidáz hatására alakul angiotenzin III-má, illetve angiotenzin IV-gyé. Az ACE-gátlók és AT 1 -receptor antagonisták A renin-angiotenzin rendszer elégtelen müködése számos kardiovaszkuláris betegség kialakulásában szerepet játszik, mint amilyen a hipertónia, kongesztív szívelégtelenség, koronáriaiszkémia és veseelégtelenség. Az ACE-gátló gyógyszereket már régóta alkalmazták a hipertónia kezelésében, amikor az első angiotenzinreceptorgátló vegyület, a losartan megjelent a terápiában. Az ACE-gátlók csökkentik a vérnyomást, kedvező hatásúak balkamra-hipertrófiában, pangásos szívelégtelenségben és csökkentik a szívelégelenség kialakulásának veszélyét szívinfarktust követően. Emelett kedvező hatásúak diabéteszes nefropátiában. Azonban az ACE vagy más néven kinináz II nem csupán az angiotenzin II keletkezéséért felelős, hanem számos más peptid pl. a bradikinin, P-anyag, neurokininek, GnRH lebontásában is szerepet játszik. E peptidek felhalmozódása az ACE-gátlók adását követően az olyan mellékhatások forrása lehet, mint pl. a száraz köhögés vagy az angioödéma, amelyet a bradikinin felhalmozódásának tulajdonítanak. Az AT 1 -receptorgátló gyógyszerek rendelkeznek az ACE-gátló vegyületek összes kedvező hatásával, viszont nem hozzák létre azon angiotenzin II-től független fentebb említett mellékhatásokat. Az első AT 1 -receptor 35

antagonista vegyületek az angiotenzin II peptid származékai voltak, pl. saralazin, amelyek felhasználását azonban peptid természetükből kifolyóan számos probléma akadályozta. Az első orálisan alkalmazható nem-peptid AT 1 -receptorgátló vegyület, a losartan kálium sója, a hipertónia kezelése céljából került bevezetésre, melyet azóta több eltérő farmakokinetikai tulajdonsággal rendelkező angiotenzinreceptor-gátló vegyület követett, például a valsartan, irbesartan, candesartan, telmisartan, eprosartan [177,178,179,180,181]. Az angiotenzinreceptorok Az angiotenzin II receptorgátlók továbbfejlesztése során sikerült igazolni, hogy az angiotenzin II receptoroknak két farmakológiailag elkülöníthető csoportja létezik. Az AT 1 -receptorra jellemző a difenil-imidazol származékok iránt nagy az affinitása, míg az AT2R tetrahidroimidazopiridin származékokkal gátolható [182]. Mindkettő 7TM hélixből álló receptor, amelyeket a farmakológiai vizsgálatokat követően molekuláris biológiai módszerekkel is azonosítottak. Az AT 1 -receptor 359 aminosavból, az AT 2 - receptor 363 aminosavból álló glikolizált fehérje. A szekvenciaazonosság kb. 30% a két receptor között. A szekvenciahasonlóság ellenére a két receptor funkciója teljesen különbözik. Emberben csak egyféle AT 1 -receptor található, rágcsálókban két egymással 90% homológiát mutató altípusa van. Az AT 1A -receptor főként az érfal simaizomsejtekben, májban, vesében, tüdőben, és központ idegrendszerben, míg az AT 1B -receptor altípus a mellékvesében és a hipofízisben található. Jelentős funkcionális és farmakológiai különbséget e két altípus nem mutat. Bár az angiotenzin II a reninangiotenzin-aldoszteron rendszer fő effektor molekulája, más angiotenzin peptidek is képesek biológiai hatás létrehozására. Az angiotenzin II N-terminális aszpartátjának az eltávolítása az angiotenzin III-at eredményezi. Az angiotenzin III az AT 1 -receptor hatékony agonistája és egyes adatok szerint, agyban a fő effektora a renin-angiotenzinaldoszteron rendszernek [183]. Az AT 3 -receptor egyik antagonistával sem gátolható és egyenlőre csak neuroblasztoma sejtvonalban írták le [184]. Az 1-es aszpartát és a 2-es pozícióban lévő arginin eltávolítása az angiotenzin IV-et eredményezi, amely az AT 4 - receptorhoz képes kötődni, amely nem G-fehérjéhez kapcsolt receptor, hanem 36

aminopeptidáz [174]. Az AT 3 - és AT 4 -receptornak az angiotenzin II élettani és kórélettani hatásainak kialakításában nem tulajdonítanak szerepet [185]. Az AT 1 -receptor Az AT 1 -receptor, melynek az IUPHAR receptor kódja 2.1.Ang.01.000.00.00., a G- fehérjéhez kapcsolt, 7TM doménnel rendelkező receptorok rodopszin alcsaládjába tartozik. Az AT 1 -receptor génje a 3-as kromoszómán található. Az angiotenzin II kötödését a receptorhoz, és a receptor aktivációját angiotenzin II analógok és mutáns AT 1 -receptorok segítségével vizsgálták. A hormon és a receptor számos kapcsolódási pontját sikerült már azonoítani. Az AT 1 -receptor angiotenzin II kötőhelyének kialakításában a molekula extracelluláris régiói és a membránhélixek vesznek részt. Az agonista megkötése konformációváltozást okoz és feltételezhetően, ez a hélixátrendeződés közvetíti a jelet az intracelluláris molekularészek felé. Ezen konformációváltozás, molekuláris biológiai és farmakológiai módszerekkel történt, indirekt bízonyítékát írtuk le G. Vauquelin munkacsoportjával együttműködésben. Az AT 1 -receptor 111-es aszparaginjának mutációja, mely a III. transzmembrán hélixben található, az AT 1 -receptor konstitutív aktivációját eredményezi. Úgy találtuk, hogy a 111-es aszparagin mutációja glicinre az angiotenzin IV hatékonyságát 900-szorosára növeli. A VII. transzmembrán hélixben lévő 281-as aszpartát mutációja alaninra az angiotenzin II és angiotenzin III hatékonyságát csökkenti, viszont az angiotenzin IV hatékonysága nem vátozik. A 281-es aszpartát mutációjának hatását az 111-es aszapragin mutációja hatástalanította. Ezek alapján, a receptor aktivációját követő konformációváltozásra, egy modell lett felállítva, amely szerint alapállapotban a III. transzmembrán hélixben lévő 111-es aszparagin kölcsönhatása a VII. transzmembrán hélixel a receptor konformációját stabilizálja. Az angiotenzin II 2-es argininje a 281-es aszparaginnal egy olyan konformáció változást okoz, amely megszűnteti a VII-es transzmembrán hélix és a III. transzmembrán hélix közötti kapcsolatot, és amely hasonló az 111-es aszparagin glicinre történő mutációjának hatásához. A receptor ennek következtében egy sokkal lazább konformációt vesz fel, amely lehetővé teszi az angiotenzin II C-terminális 5 aminosavának a bekötődését, amely a preaktivált receptort teljesen aktív konformációba hozza. Az angiotenzin IV-ben hiányzik a 2-es pozícióból az arginin, ezért nem tud nagy affinitással a vad típusú receptorhoz kötődni. Amikor 37

viszont a receptor, a 111-es aszparagin mutációja hatására, preaktivált állapotba kerül az angiotenzin IV az angiotenzin II-höz hasonló nagy affinitással tud kötődni és a mutáns receptor teljes aktivációját okozza [186,187]. angiotenzin Ang II II angiotenzin Ang IV IV Alapállapot Átmeneti állapot Átmeneti, preaktivált állapot N111G mutáció Aktivált állapot 7.ábra Az AT 1 -receptor aktivációját kísérő konformációváltozások. A receptor aktiváció során először az angiotenzin II 2-es pozícióban lévő argininje (Arg=R) lép kölcsönhatásba a receptorral, ami a receptort preaktivált állapotba (R`) hozza. A következő lépés a 4-es tirozin (Y) kapcsolata a receptor 111-es aszparaginjával, amely egy további konformációváltozást hoz létre, ami a receptor teljes aktiválását okozza (R ). Ezt a konformációváltozást hozza létre az angiotenzin IV is, amely a 111-es aszparagin mutációját tartalmazó receptorhoz szabadon tud kötődni (Hunyady és mtsai alapján [186]). Az AT 1 -receptor jelátviteli útvonalai Az AT 1 -receptor fő jelátviteli útvonala, amely az angiotenzin II legfontosabb fiziológiás hatását is közvetíti, az a PLC β-1 enzim aktiválása a G q/11 -fehérje családon keresztül, amely inozitol-triszfoszfát választ és diacil-glicerol felszabadulást, valamint ennek következtében kalcium jelet és PKC aktiválást eredményez, amely a vazokonstrikciót okozza. Aktiválja a foszfolipáz A2 és foszfolipáz D enzimeket, amelyek arachidonsav felszabadulást okoznak, ami a prosztaglandinok prekurzora. A G i/0 -fehérje családon keresztül gátolni képes az adenil-cikláz enzimet számos 38

célszövetben, mint például a máj, vese, mellékvese. Valamint a G 11/12 - fehérje családon keresztül az L-típusú Ca 2+- csatornákat nyitásához vezet a szívizomsejtekben. Tartós angiotenzin II kezelés során a legtöbb célszervben a sejtek hipertrófiája mutatható ki. Az angiotenzin II ezen növekedési hatásainak létrehozásában számos jelátviteli folyamat szerepét felvetették. Az AT 1 -receptor aktiválja a foszfolipáz Cγ-1 enzimet, a JAK-STAT útvonalat, az Akt/PKB enzimet, valamint kis G-fehérjéket, köztük a Ras-t és a Rho-t. Ezek a növekedési hatások a c-fos, c-jun, c-myc gének expressziójának fokozódásához vezetnek, amely a sejtproliferációt fokozza. Ez a növekedési hatás összefüggésbe hozzható a kardiovaszkuláris betegségek kialakulásával, köztük a hipertenzióval, szívinfarktussal, arterioszklerózissal. Ezen jelátviteli útvonalakra hatással van a receptor gyors homológ és heterológ deszenzitizációja, valamint a hosszú távú receptorszám szabalyozás, a receptor szintézis szabalyozása által [188,189]. Az AT 2 -receptor A humán II-es típusú angiotenzinreceptor (AT 2 -receptor) génje az X-kromoszómán található. Az AT 2 -receptor nagy affinitást mutat a PD123319, illetve PD123177 vegyületek iránt, és alacsony a losartan iránti affinitása. Az angiotenzin II affinitása az AT 1 -receptorhoz és az AT 2 -receptorhoz azonos. Az AT 2 -receptorral kapcsolatban többféle lehetséges hírvivő mechaniznust is leírtak. Gátolja a cgmp termelést, kálium és kalcium csatornákat aktivál, fokozza a foszfolipáz A2 aktivitást, azonban nem kapcsolódik az eddig megismert G-fehérjékhez, ahogy az szerkezete alapján várható lenne. Az AT 2 -receptor nem internalizál. Az AT 2 -receptor szöveti eloszlására jellemző, hogy különösen magas a szintje a magzati szövetekben, amely a születést követően igen gyorsan csökken. Egyes szövetekben, elsősorban a központi idegrendszerben, a mellékvesében és az izomban felnőtt korban is megtalálható. Az AT 2 -receptor expressziója kóros körülmények között, mint például szívinfarktus, balkamrahipertrófia, érfal-neointima proliferáció, esetén előtérbe kerülhet. Az AT 2 -receptornak növekedésgátló hatása van, és apoptózist indukál [188,190]. 39

Az AT 1 -receptor internalizációja Az angiotenzin II sejtbe történő felvételét több mint 30 éve írták le endotél és simaizomsejtekben, majd számos másféle sejttípusban is leírták [191,192]. A morfológiai adtok többsége azt mutatja, hogy a receptor klatrinburkos vezikulákkal kerül felvételre [193,194]. A klatrin-mediált útvonal gátlása kálium deplécióval, fenilarzin-oxid kezeléssel vagy hiperozmotikus szacharóz kezeléssel gátolta az AT 1 -receptor endocitózisát [195,196,197,198]. Kimutatták továbbá a receptor kolokalizációját a klatrin-mediált útvonal markerének számító transzferrinreceptorral [199,197]. Polarizált sejteken végzett vizsgálatok azonban azt mutatták, hogy az AT 1 -receptor endocitózisának mechanizmusa különböző lehet az apikális és a bazolateláris membránban [200,201]. A kaveolák lehetséges szerepét is felvetették már az AT 1 - receptor endocitózisában, ugyanis szacharóz gradiens vizsgálatokban a kaveolinnal azonos frakcióban jelent meg a receptor [202]. Számos kísérleti eredmény azt támasztja alá, hogy, a struktúrális követelmények az AT 1 -receptorban a receptor internalizációjához és a jelátviteléhez különbözőek. Az AT 1 -receptor internalizációját peptid antagonisták is indukálják, azonban a nem peptid antagonista losartan nem internalizál, ami arra utal, hogy a receptor jelátviteléhez és endocitózisához vezető aktív konformáció nem egyezik meg teljesen [203,204]. A második transzmembrán hélixben található 74-es aszparagin aminosav helyettesítése megszűnteti a G-fehérjékhez történő kapcsolódást, viszont a receptor internalizációját csak minimálisan gátolja [205,206]. A nem internalizáló receptormutáns, amelynek hiányzik a C-terminális része, képes inozitol-foszfát válaszra és kalcium jel kiváltására, amely alátámasztja hogy, a receptor internalizációjához és a jelátvitelhez szükséges konformációváltozások különbözőek [207]. Számos internalizációs motívumot leírtak ami a plazmamembrán receptorok internalizációjához szükséges, mint például a tirozint tartalmazó motívumok, a dileucin motívumok, szerin-treonin motívumok, és a monoubikvitinálódott lizin maradékok. Az első két motívum a tápanyag és a növekedési faktor receptorok jellemzője, de mind a négy szerepét leírták már G-fehérjéhez kapcsolt receptorok internalizációjával kapcsolatban is [208]. A legtöbb G-fehérjéhez kapcsolt receptor esetében a konzervált NPXY motívum szerepel internalizációs szignálként [209]. Az AT 1 -receptor esetében az NPXY szekvencia aminosavjainak mutációja nem volt hatással az internalizációra, 40

amely azt mutatja, hogy ezen receptor eseteben nem szerepel internalizációs szignálként [210]. Viszont az AT 1 -receptor citoplazmatikus C-terminális részének a deléciója az internalizációt jelentősen gátolja [211]. Ezen belül a részletes analízis két régiót azonosított. Az egyik a szerin treonin gazdag régió, a másik a proximálisabban elhelyezkedő 316-os leucin és 319-es tirozin [212,213,214]. Azonban az utóbbi szekvenciák pontos szerepe még a mai napig ismeretlen. Az internalizáció függése a szerin-treonin gazdag régiótól arra utal, hogy ezen régió foszforilációja szabályozza az internalizációt. Számos adat azt mutatja, hogy a receptor foszforilálódik GRK-k és PKC által. A PKC indukálására bekövetkező receptorfoszforiláció teljesen megszűnik a karboxi-terminális 34 aminosav eltávolítása után. Az angiotenzin II hatására bekövetkező PKC foszforiláció agonista koncentráció függő, kis agonista koncentrációnál a PKC általi foszforiláció az összes foszforiláció mintegy felét teszi ki, míg növekvő agonista koncentrációnál ez az arány jelentősen lecsökken [215]. Ez összhangban van azokkal a megfigyelésekkel, hogy a másodlagos hírvivők által aktivált kinázok közreműködésével létrejövő heterológ deszenzitizáció már alacsony hormonkoncentráció esetén is kialakulhat, míg a GRK-ok által közvetített homológ deszenzitizáció magasabb hormonszintek esetén jön létre [216]. A β-arresztin és a dinamin szerepe az AT 1 -receptor endocitózisában Az első adtok arra utaltak, hogy habár az AT 1 -receptor klatrin-függő úton internalizál, a β-arresztin és a dinamin domináns negatív mutánsaival az internalizáció nem gátolható [217]. Később azt találták, hogy agonista stimuláció hatására a β- arresztin diffúz citoplazmatikus lokalizációja megváltozik és a β-arresztin a plazmamembránhoz lokalizál, amely arra utalt, hogy kapcsolatba tud lépni a receptorral [218,219]. Munkacsoportunk adatai alapján az AT 1 -receptor dinamin és arresztin dependens internalizációja koncentráció függést mutat. Fiziológiás (0,03 nm) angiotenzin II koncentrációnál, a β-arresztin V53D és N-terminális deléciós mutánsa és a dinamin K44A mutánsa is gátolta a receptorinternalizációt. Magas (30 nm) angiotenzin II koncentrációnál a receptorinternalizáció sebessége lecsökken, amelyet a 41

domináns negatív β-arresztin és dinamin mutánsok expressziója nem csökkent tovább [197]. A Rab fehérjék szerepe az AT 1 -receptor endocitózisában Az AT 1 -receptor C-terminális végét használva élesztő 2 hibrid rendszerben kimutatták, hogy a Rab5 közvetlen képes kötődni az AT 1 -receptorhoz és olyan módon aktiválódik, mely analóg a heterotrimer G-fehérjék aktiválásához. Az agonista stimuláció fokozza a Rab5-AT 1 -receptor fehérje komplex kialakulását és a Rab5 GTP kötését. A Rab5a-S34N GTP kötés hiányos mutáns nem akadályozza meg a receptor internalizációját, viszont megakadályozza a receptor késői endoszómába kerülését. Ez az adat arra utal, hogy egy internalizálódó fehérje szabályozza saját maga intracelluláris targetálását az által, hogy az intracelluláris útvonalért felelős egyik fehérjét szabályozza [220]. Az AT 1 -receptor internalizációja után a receptor többféle útvonalon kerülhet vissza a sejtmembránba. Az internalizációra került AT 1 -receptort tartalmazó klatrinburkos vezikulák, a vezikulák kicsomagolása után először a korai endoszómákkal fúzionálnak. Innen az internalizált receptor egy része a Rab7 pozitív késői endoszómákba jut, ahol az acidifikáció hatására a ligand ledisszociál és a receptor gyorsan visszajut a plazmamembránra. A ligand egy része a lizoszómákban kerül lebontásra más része a receptorral együtt egy Rab4 pozitív útvonalon visszakerül a plazmamembránra. A késői endoszómákból kerülhet a receptor is a degradációs útvonalakra. A PI3-kináz enzim wortmaninnal történő gátlása, a késői enodszóma felhalmozódásához vezet, amely tartalmazza az AT 1 -receptort és a ligandot is. Az internalizált receptorok egy másik része, egy másik útvonalon a Rab11 pozitív juxtanukleáris reciklizáló endoszómába jut, ahonnan a receptor csak sokkal lassabban jut vissza a membránba. Ez az útvonal nem wortmanin érzékeny [221]. 42

8. ábra Az AT 1 -receptor internalizációja. Az AT 1 -receptor az agonistakötést követően először foszforilálódik, ami elősegíti a β- arresztin kötődését a receptorhoz, amely fehérjék szétkapcsolják a G-fehérjétől, ezáltal deszenzitizálják. A β-arresztinek a receptort emellett, az AP2-höz való kapcsolódáson keresztül, a klatrinburokhoz irányítják, és az aktivált receptor endocitózisra kerül. A vezikula membránról történő levágásában a dinamin játszik szerepet. Ezután a klatrinburok leválása után, a vezikula a Rab5 fehérjét tartalmazó korai endoszómával fúzionál. Innen a receptor vagy a Rab7-et tartalmazó késői endoszómába kerül, ahonnan a degradációs útvonalra jut, vagy pedig egy gyors reciklizációs útvonalon Rab4-et tartamazó vezikulákon keresztül visszajut a plazmamembránra és reszenzitizálódik. A harmadik útvonal ami a receptor lassú reszenzitizációját okozza, a Rab11-et tartalmazó perinukleáris endoszómákon keresztül vezet. 43

MÓDSZEREK A kísérletekben felhasznált plazmidok: A patkány érfal simaizomból származó 1A típusú angiotenzinreceptor (AT 1A - receptor) Dr. K. E. Bernstein (Emory Egyetem, Atlanta, USA) ajándéka volt. A hemagglutinin epitóphoz kapcsolt, vad típusú és K44A mutációt tartalmazó, pcdna3 eukarióta expressziós vektorba beépített dinamin2 cdns-t Dr. K. Nakayama-tól kaptuk (Tsukuba Science City, Ibaraki, Japán). A GST-vel fúzionált Nck N-terminális SH3 domén Dr. Buday László (Semmelweis Egyetem, Budapest, Magyarország) ajándéka volt, melyet az emlős expressziós vektor, pegfp-c2-be építettünk be. A GFP-hez kapcsolt β2-adaptint Dr. Marc G. Carontól kaptuk (Duke Egyetem, Medical Center, Durham, Kanada). Az amfifizin II es az endofilin I SH3 doménje, az SH3 domén szegmens amplifikálásával készült, és pegfp-c2 vektorba lett beklónozva. A mutációk létrehozása a dinaminban: A dinamin2 535-ös lizin aminosavának alaninra való cserélése, a dinamin2 cdns-ében irányított mutagenezissel, a Startagene cég QuickChange Kit-jének segítségével történt. A prolingazdag domén deléciója, illetve a többi mutáció létrehozása is ugyanezzel a módszerrel történt. A prolingazdag domén deléciós mutáns esetében, a 746 os prolin aminosavat kódoló bázishármast stop kodonra cseréltük le. A dupla mutánsokban (dinamin-k44a/ PRD, dinamin-k44a/k535a) a dinamin K44A cdns-ét használtuk templátként a prolingazdag domén deléciójára, illetve az 535-ös lizin alaninra cserélésére. A mutánsok szekvenciáját DNS-szekvenálással ellenőriztük. Transzfekció: Az internalizációs vizsgálatokhoz és az expresszált fehérjék Western blot analízissel történő ellenőrzéséhez, 24 lyukú lemezen tenyésztett CHO-K1-sejteket tranziensen transzfektáltunk az AT 1 -receptor és a vad típusú vagy mutáns dinaminok, 44

illetve az SH3 domének 0,5 µg/µl cdns-ével, az adott kísérleteknek megfelelően, 12 µg/µl Lipofectamin (Life Technologies) transzfekciós reagenst használva. A konfokális mikroszkópos vizsgálatokhoz a sejteket üveg fedőlemezen tenyésztettük, és az ábrákon feltüntetett plazmidokkal transzfektáltuk 3 µl/ml FuGENE (Roche Diagnostics) transzfekciós reagenst használva. A sejteket Ham s F-12 médiumban növesztettük, amely 10% borjúszérumot, 100 IU/ml penicillint és 100 µg/ml sztreptomicint és NaHCO 3 -ot tartalmazott. A transzfekciót a kísérletek előtt 48 órával végeztük, melyet követően a sejtek tranziensen expresszálják a receptort, illetve a vizsgálni kívánt fehérjéket, amely lehetővé teszi a receptor, illetve az adott fehérjék funkciójának vizsgálatát emlős sejtekben. A receptorinternalizáció mérése: Az AT 1 -receptor internalizációs kinetikájának meghatározása céljából, 125 I- izotóppal jelzett angiotenzin II-t (2,5 kbq/ml) adtunk a tranziensen transzfektált CHO sejtekhez, 0,25 ml Hepessel pufferelt Hams F-12 médiumban, amely körülbelül 0,03 nm angiotenzin II koncentrációnak felel meg. A sejteket 37 C-on inkubáltuk az ábrákon feltüntetett időpontokig. Az inkubációt a sejtek jégre helyezésével állítottuk le. Ezután a sejteket gyorsan mostuk kétszer jéghideg PBS-sel (137 mm NaCl, 2,7 mm KCl, 10mM NaHPO 4, 1,8 mm KH 2 PO 4, ph: 7,4). A sejtfelszínen kötött ligandot, a kötés PH érzékenysége alapján, savas mosófolyadékban (15 mm NaCl, 50 mm ecetsav) történő 10 perces inkubálással távolítottuk el. A savrezisztens, intracelluláris radioaktivitás méréséhez a sejteket SDS/NaOH keverékével szolubilizáltuk. A radioaktivitást gamma-spektrofotométerrel mértük. Az internalizált ligand százalékos arányát minden egyes időpontban a savrezisztens kötés és a teljes specifikus kötés (savrezisztens + savérzékeny kötés) hányadosából számoltuk ki. Konfokális mikroszkópos vizsgálatok: A konfokális mikroszkópos vizsgálatokhoz, a sejteket fedőlemezen növesztettük és tranziensen transzfektáltunk a fentebb leírt módszerrel. 48 óra múlva a sejteket kétszer mostuk PBS-sel, majd 4%-os paraformaldehidet tarlamazó oldatban fixáltuk 30 45

percig. Ezután 1 mg/ml nátrium-borohidridet tartalmazó oldatban inkubáltuk 15 percet, majd 0,1% Triton X-100-at tartalmazó, PBS-ben permeabilizáltuk 30 percig. A HAepitóp ellenes elsődleges antitesttel (Babco), melyet 1:100 higitásban alkalmaztunk, 1 órát inkubáltuk szobahőn. Az inkubálást kétszer 15 perces mosás követte, 0,1% Tween 20-at tartalmazó trissel pufferelt sóoldatban. A rodaminnal konjugált kecskéből származó egér elleni másodlagos antitestet (Jackson ImmunoReaserch Laboratories) 1:100 hoz hígításban alkalmaztuk, egy órán keresztül szobahőn. A fedőlemezeket DAKO fluorszcens médiumban tartottuk. A felvételeket Zeiss LSM 510-es pásztázó lézer konfokális mikroszkóppal készítettük. A GFP t 488 nm-es argon, a rodamint 543 nm-es hélium/neon lézerrel gerjesztettuk. Az emittált fluoreszcenciát multitrack üzemmódban 500-550 nm-es, illetve 565-615 nm-es filterekkel detektáltuk. Western blot analízis: Immundetektáláshoz az expresszált proteineket 48 órával a transzfekció után, proteáz inhibitorokat (10 µg/ml aprotinin, 10 µg/ml leupeptin, 10 µg/ml tripszinkimotripszin inhibítor, 10 µg/ml pepstatin A, 10 µg/ml benzamidin) tartalmazó 200 µl Laemmli pufferben vettük fel. Homogenizálás és centrifugálás után a felülúszóban található fehérjéket 8%-os denaturáló poliakrilamid gélen választottuk el, majd a fehérjéket nedves blotolással nitrocellulóz membránra transzferáltuk. Ezt követően, a blotokat a megfelelő egérből származó HA (Babco), illetve nyúlból származó GFP (Clontech) elleni elsődleges antitesttel és torma-peroxidázzal konjugált megfelelő másodlagos antitesttel (Pierce) festettük. A Western blot reakciók detektálása SuperSignal West Pico Kit (Pierce) segitségével történt. 46

EREDMÉNYEK A dinamin2 PH doménjének szerepe az AT 1 -receptor internalizációjában Kísérleteink kiinduló pontját azok az adatok jelentették, amelyek arra utaltak, hogy a dinamin PH doménjének szerepe lehet a dinamin plazmamebránhoz való lokalizációjában a receptorendocitózis során. Annak a vizsgálatához, hogy az AT 1 - receptor endocitózisában milyen szerepet tölt be dinamin PH doménje, egy olyan pontmutációt tartalmazó dinamint készítettünk, amelyben az 535-ös lizin aminosavat cseréltük ki alaninra (dinamin-k535a). A kristályszerkezet alapján vetődött fel, hogy az 535-ös lizinnek, a PH doménen belül, pozitív töltése révén a foszfoinozitidek koordinálásában van szerepe, melyet funkcionálisan is igazoltak [111,112]. In vitro vizsgálatokkal megállapították, hogy ezen mutáns PIP2 kötése csökkent, és következményképpen a lipidnanotubulusok által stimulált GTP-áz aktivitása is csökkent [105]. A dinamin-k535a mutánst az AT 1 -receptorral koexpresszálva az 9. ábra A. részén látható módon, a receptorendocitózist domináns negatív módon gátolta. Ez az adat arra utal, hogy a dinamin PH doménjének lipidkötése szerepet játszik az AT 1 - receptor endocitózisában. A dinamin2 prolingazdag régiójának szerepe az AT 1 -receptor internalizációjában A másik lehetséges lokalizálásban szereplő régió a dinaminban a prolingazdag domén, amely fehérje-fehérje interakciók kialakítására képes. Számos adat van arra, hogy a prolingazdag régió kapcsolata SH3 domént tartalmazó másik fehérjével vezet egy adott fehérje lokalizációjához. A dinamin2 prolingazdag régiójának a szerepét az AT 1 -receptor endocitózisa során, a dinamin2 egész C-terminális prolingazdag doménjének az eltávolításával vizsgáltuk. A prolingazdag domén kezdetén lévő 746-os prolin aminosavat kódoló bázishármast stopkodonra cseréltük. Az így nyert dinaminban (dinamin- PRD), az összes lehetséges SH3 domént kötő régiót delécióval eltávolítottuk. A 9. ábra B részén látható, hogy a prolingazdag domén delécióját 47

tartalmazó dinamint az AT 1 -receptorral koexpresszálva, az AT 1 -receptor endocitózisára domináns negatív gátló hatással volt. A B 9. ábra A PH domén mutációját, illetve a prolingazdag domén delécióját tartalmazó dinamin hatása az AT 1 -receptor internalizációjára. A, CHO sejteket transzfektáltunk 24 lyukú lemezen 0,5 µg AT 1 -receptor cdns-sel és 0,5 µg dinamin cdns-sel ( ), illetve 0,5 µg dinamin-k535a cdns-sel ( ). A 125 I-angiotenzin II endocitózisát, az ábrán jelzett időpontokban, a módszerek fejezetben ismertetett módon mértük. Az internalizált specifikus kötést a teljes specifikus kötés százalékában tüntettem fel. Az ábrákon három független kísérlet eredményeinek átlaga és az átlag szórása van feltüntetve. B, CHO sejteket transzfektáltunk 24 lyukú lemezen 0,5 µg AT 1 -receptor cdns-sel és 0,5 µg dinamin cdns-sel ( ), illetve 0,5 µg dinamin- PRD cdns-sel ( ). A 125 I-angiotenzin II endocitózisát, az előzőekben ismertetett módon mértük. A PH domén és a prolingazdag domén szerepének vizsgálata a dinamin lokalizációjában kettős mutánsok segítségével A fenti adatok arra utaltak, hogy mindkét doménnek szerepe van az AT 1 -receptor endocitózisa során, viszont nem adtak információt arra nézve, hogy melyik domén játszik szerepet a dinamin klatrinnal borított struktúrákhoz történő lokalizálásában. A továbbiakban ezért a dinamin prolingazdag régiójának, illetve PH doménjének a szerepét a dinamin plazmamembránhoz történő lokalizációjában az AT 1 -receptor endocitózisa során, egy olyan dupla mutáns dinamin fehérje létrehozásával vizsgáltuk, amelyben a prolingazdag domén deléciója, illetve a PH domén pontmutációja mellett a K44A pontmutációt is jelen volt (dinamin-k44a/ PRD, illetve dinamin- K44A/K535A). Hipotézisünk az volt, hogy az a mutáció, amelyik a molekula plazmamembránhoz való lokalizációját gátolja, az a K44A mutáció domináns negatív 48

hatását felfüggeszti. Míg ha a mutáció nem a lokalizációt befolyásolja akkor a K44A dinamin hatását nem függeszti fel. A K44A mutációt tartalmazó dinamin (dinamin-k44a), a klatrin-mediált endocitózis gátlására legszélesebb körben használt dinamin mutáns. Ennél a mutánsnál a GTP-áz doménben lévő 44-es lizin aminosav van alaninra cserélve, amely a molekula csökkent GTP-kötését és csökkent GTP-áz aktivitását eredményezi [88]. A PH doménben pontmutációt tartalmazó dinamin gátló hatása kisebb, mint a K44A mutációt hordozó dinamin gátló hatása. A K535A és a K44A mutációk kombinációjának hatása a K44A mutáció hatásához volt hasonló (10.ábra A.). Ez az adat arra utal, hogy a PH domén, annak ellenére, hogy képes lipidekhez kötődni, mégsem játszik szerepet a dinamin plazmamembránhoz való lokalizációjában az AT 1 - receptor endocitózisa során, hiszen a lipidkötés megszűntetése nem képes felfüggeszteni a K44A mutációt hordozó dinamin gátló hatását. A dinamin prolingazdag doménjének eltávolításával létrejött gátló hatás szintén kisebb volt, mint a K44A mutáció gátló hatása önmagában. A K44A/ PRD kettős mutációt tartalmazó fehérje hatása viszont hasonlónak bizonyult, mint annak a dinaminnak a hatása, amely a prolingazdag domén delécióját tartalmazta önmagában (10.ábra B.). Ez a gátló hatás viszont kisebb, mint a K44A pontmutáns dinamin hatása önmagában, vagyis felfüggesztette a K44A mutáció által okozott gátló hatást. Ez az adat arra utal, hogy a prolingazdag domén a dinamin lokalizációjában szerepel, és ennek eltávolítása megakadályozza a dinamin klatrinburkos gödröcskékhez való lokalizációját. 49

A B 10. ábra A különböző dinamin mutánsok expressziójának hatása az AT 1 -receptor endocitózisára. A, CHO sejteket transzfektáltunk 24 lyukú lemezen 0,5 µg AT 1 -receptor cdns-sel és 0,5 µg dinamin cdns-sel ( ), illetve 0,5 µg dinamin-k535a ( ), 0,5 µg dinamin-k44a ( ), 0,5 µg dinamin-k44a/k535a cdns-sel( ). A 125 I-angiotenzin II endocitózisát, az ábrán jelzett időpontokban, a módszerek fejezetben ismertetett módon mértük. Az internalizált specifikus kötést a teljes specifikus kötés százalékában tüntettem fel. Az ábrákon három független kísérlet eredményeinek átlaga és az átlag szórása van feltüntetve. B, CHO sejteket transzfektáltunk 24 lyukú lemezen 0,5 µg AT 1 -receptor cdns-sel és 0,5 µg dinamin cdns-sel ( ), illetve 0,5 µg dinamin- PRD ( ), 0,5 µg dinamin-k44a ( ), 0,5 µg dinamin-k44a/ PRD cdns-sel( ). A 125 I-angiotenzin II endocitózisát, az előzőekben ismertetett módon mértük. Az 11. ábra A. része mutatja a kísérletekben használt dinamin fehérjékben a mutációk elhelyezkedését és a különböző dinamin mutánsok jelölését. A transzfektált dinamin fehérjék expresszióját Western blottal ellenőriztük hemagglutinin epitóp ellenes elsődleges antitest segítségével. A hemagglutinin epitóp a dinamin N-terminális részén helyezkedett el, ezért a prolingazdag domén delécióját tartalmazó dinamin mutánsok felismerését is lehetővé tette ez az antitest. A kísérletekben használt mutáns dinamin fehérjék egyforma expressziós szintjét az 11. ábra B. részén látható Western blot mutatja. A vad típusú, illetve a pontmutációt tartalmazó dinaminok a 100 kda körüli molekulasúlynak megfelelően futottak, míg a prolingazdag domén delécióját tartalmazó dinamin a deléciónak megfelelően körülbelül 84 kda-nál futott. 50

A GTP-áz PH PRD dinamin K535A GTP-áz PH PRD dinamin-k535a K44A K44A GTP-áz PH dinamin- PRD GTP-áz PH PRD dinamin-k44a GTP-áz PH dinamin-k44a/ PRD B K44A K535A GTP-áz PH PRD dinamin-k44a/k535a dinamin dinamin-k44a dinamin-k535a dinamin-k44a/k535a dinamin- PRD dinamin-k44a/ PRD 120 kda 84 kda 11. ábra A kísérletekben használt dinamin mutánsok sematikus ábrázolása és expressziójuk. A, A dinamin-k535a a PH doménban tartalmaz mutációt, a dinamin- PRD a dinamin egész C-terminális prolin gazdag régiójának delécióját tartalmazza, a 746-os prolin aminosavtól kezdve. A dinamin-k44a a GTP-áz doménben tartalmaz mutációt. A dinamin-k44a/k535a és dinamin-k44a/ PRD kettős mutációt tartalmaznak. A PRD rövidítés a prolingazdag domént jelenti. B, A vad típusú és mutáns dinaminok expressziós szintjét HA-epitóp elleni elsődleges antitest segítségével, Western-blottal detektáltuk. A kép 3 független kísérletből, a kísérleteket reprezentáló ábra. A különböző mutáns dinamin fehérjék sejten belüli lokalizációja Az internalizációs kísérletekből nyert elvi következtetéseket morfológiai vizsgálatokkal is alátámasztottuk. A mutáns dinamin fehérjék sejten belüli elhelyezkedésének meghatározására konfokális mikroszkóppal végeztünk vizsgálatokat. A vad típusú és mutáns dinaminokhoz kapcsolt HA-epitóp alapján, immunfestéssel 51

tudtuk megvizsgálni az egyes fehérjék lokalizációját a sejten belül. A vad-típusú dinamin a diffúz citoplazmatikus lokalizáció mellett plazmamembrán-lokalizációt is mutatott (12.ábra A.). Az 535-ös lizin alaninra cserélése a PH doménben, nem okozott szembeötlő változást a lokalizációban a vad típushoz képest (12.ábra B.). Ahogy azt már más munkacsoportok is leírták, a K44A mutációt tartalmazó dinamin nagyobb vezikuláris struktúrákba lokalizált intracellulárisan és a plazmamembránon is (12.ábra D.). A prolingazdag domén deléciós dinamin szintén vezikuláris struktúrákban, de kizárólag csak intracellulárisan volt megfigyelhető (12.ábra C.). A K44A/K535A és a K44A/ PRD mutációkat tartalmazó dinaminok a K44A, illetve a PRD dinaminhoz hasonló lokalizációt mutattak, amely adatok szintén arra utalnak, hogy valóban a dinamin prolingazdag régiója az, ami a dinamin klatrinnal borított struktúrákhoz történő kapcsolódását biztosítja az AT 1 -receptor endocitózisa során (12.ábra E. és F.). 12. ábra A különböző dinamin mutánsok lokalizációja CHO sejtekben. CHO sejteket transzfektáltunk AT 1 -receptor cdns-sel és dinamin cdns-sel (A), illetve dinamin-k535a (B), dinamin- PRD (C), dinamin-k44a (D), dinamin-k44a/k535a (E), dinamin-k44a/ PRD cdns-sel(f). A sejteket angiotenzin II stimuláció után fixáltuk, és HAepitóp ellenes elsődleges és rodaminnal konjugált másodlagos antitesttel festettük. A képeken 3 független kísérletből láthatóak, a kísérleteket reprezentáló tipikus sejtek. 52

A dinamin mutánsok kolokalizációja β2-adaptinnal a klatrinburkos gödröcskékben Az egyes dinamin fehérjék plazmamembránhoz való lokalizációját a GFP-β2- adaptinnal történő kolokalizációval bizonyítottuk, amely az AP2 egyik alegysége és bizonyítottan a plazmamembránhoz, illetve a klatrinburkos gödröcskékhez lokalizál, ezért mint a klatrinburkos gödröcskéket jelölő fehérje használható. A felvételeket a sejteknek azon szeletéből készítettük, amelyek a fedőlemezhez le voltak tapadva, mert itt lehet a legjobban látni a membránhoz való lokalizációt. A vad típusú és K535A mutációt tartalmazó dinamin2 nagyfokú kolokalizációt mutatott a klatrinburkos gödröcskéket jelölő β2-adaptinnal (13.ábra C. és F.). A K44A dinamin szintén kolokalizált a β2-adaptinnal, de a klatrintól független struktúrákban is jelen volt, és nagyobb intracelluláris vezikulákban is megtalálható volt, ellentétben a vad típusú dinamin2-vel (13.ábra I.). A K44A/K535A dupla mutációt hordozó dinamin2 hasonló, részleges kolokalizációt mutatott a β2-adaptinnal (13.ábra L.). A prolingazdag domén deléciós mutáns esetében, és a K44A/ PRD esetében a kolokalizáció egyátalán nem volt megfigyelhető a β2-adaptinnal, ami arra utal, hogy ezek a fehérjék egyátalán nem kapcsolódnak a klatrinburkos gödröcskékhez (13.ábra O. és R.). A prolingazdag domén delécióját tartalmazó mutánsok amellett, hogy a plazmamembránhoz nem kötődtek, lokalizációt mutattak valamilyen ismeretlen intracelluláris strukturához. Az 13. ábrán feltüntett képhez igen hasonló lokalizációt mutatott a sejtek jelentős többsége, több mint 90%-a. A mikroszkópos vizsgálatok adatai igazolják a funkcionális vizsgálatok alapján levont következtetéseket, hogy a dinamin prolingazdag régiója, és nem a PH domén az, ami szerepet játszik a dinamin klatrinburkos gödröcskékhez történő kapcsolódásában az AT 1 -receptor internalizációja során. 53

13. ábra A dinamin mutánsok kolokalizációja GFP-β2-adaptinnal a plazmamembrán klatrinburkos gödröcskéiben. CHO sejteket transzfektáltunk AT 1 -receptor, GFP-β2-adaptin, és dinamin cdns-sel (A, B, C képek), illetve dinamin-k535a (D, E, F képek), dinamin-k44a (G, H, I képek), dinamin- K44A/K535A (J, K, L képek), dinamin- PRD (M, N, O képek), dinamin-k44a/ PRD cdnssel. (P, Q, R képek). A sejteket angiotenzin II stimuláció után fixáltuk, és HA-epitóp ellenes elsődleges és rodaminnal konjugált másodlagos antitesttel festettük. A GFP-β2-adaptin fluoreszcenciája zöld szinnel látszik a A, D, G, J, M, és P képeken. A dinamin (B), dinamin- K535A (E), dinamin-k44a (H), dinamin-k44a/k535a (K), dinamin- PRD (N), or dinamin- K44A/ PRD (Q) fluoreszcenciája piros színnel látszik. A két fluoreszcencia egymásra vetített képe a C, F, I, L, O, és R képeken látszik. Az alsó képsor jobb alsó sarkában a kijelölt rész nagyítva látható. A képeken 3 független kísérletből láthatóak, a kísérleteket reprezentáló tipikus sejtek. Az amfifizin és az endofilin SH3 doménjének hatása az AT 1 -receptor internalizációjára A dinamin a prolingazdag régióján keresztül számos fehérje SH3 doménjéhez képes kötődni. Következő kísérleteinkben ezeknek, a prolingazdag régióhoz kötődő lehetséges partnereknek a szerepét vizsgáltuk az AT 1 -receptor internalizációja során. Két ilyen fehérje az amfifizin és az endofilin, amelyek a dinaminon kívül számos más fehérjével is kapcsolatba tudnak lépni és ezáltal szerepelhetnek a dinamin membránlokalizációjában. Valamint a dinamin mellett az amfifizinről és ez endofilinről is kimutatták, hogy képesek lipidekhez kötődni, illetve azok tubulus képzését előidézni 54

ezért a membrán görbület kialakításában is szerepük lehet. Ahogy azt a bevezetésben is leírtam, korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy az amfifizin és az endofilin a dinamin prolingazdag regiójának két különbözö részéhez képesek kötődni, amely arra utal, hogy mindkettőnek lehet, egymástól akár eltérő szerepe a dinamin működésében. Ahhoz, hogy tanulmányozzuk ezen fehérjék hatását a receptorinternalizació kinetikájára a GFPhez kapcsolt amfifizin es endofilin SH3 doménjét (SH3-Amf, illetve SH3-Endo) koexpresszáltunk az AT 1 -receptorral CHO sejtekben. A GFP-hez kapcsolt SH3 domének expressziós szintjét GFP ellenes antitesttel, Western-blottal ellenőriztük. Mindkét SH3 domén koexpressziója a receptor endocitózisára domináns negatív gátló hatást gyakorolt. Ezzel szemben, a kontrollként alkalmazott GFP önmagaban, illetve az Nck N-terminális SH3 doménje (SH3-Nck), ami in vitro nem kötődik a dinaminhoz, nem gátolta a receptor endocitózisát (14. ábra) [242]. Az endofilin es az amfifizin SH3 doménjének gátló hatása azt bizonyítja, hogy ezeknek a fehérjéknek a dinaminnal való kölcsönhatása szerepet játszik az AT 1 -receptor internalizációja során. 14. ábra Az endofilin I, amfifizin II és Nck SH3 domén expressziójának hatása az AT 1 - receptor endocitózisára. CHO sejteket 24 lyukú lemezen transzfektáltunk 0,5 µg AT 1 -receptor (AT 1A -R) cdns-sel ( ) és 0,5 µg GFP-SH3-Endo cdns-sel ( ), illetve 0,5 µg GFP-SH3-Amf cdns-sel ( ), illetve 0,5 µg GFP-SH3-Nck cdns-sel ( ). A 125 I-angiotenzin II endocitózisát, az ábrán jelzett időpontokban, a módszerek fejezetben ismertetett módon mértük. Az internalizált specifikus kötést a teljes specifikus kötés százalékában tüntettem fel. Az ábrákon három független kísérlet eredményeinek átlaga és az átlag szórása van feltüntetve 55

Annak igazolására, hogy az amfifizin, illetve az endofilin SH3 doménje valóban specifikusan a dinamin prolingazdag régiójához kapcsolódva gátolták az endogén dinamin fiziológiás kapcsolatait, a dinamin2 koexpresszálásának hatását vizsgáltuk a receptor internalizációjára. A vad típusú dinamin2 koexpresszálásának van egy kis mértékű gátló hatása az AT 1 -receptor endocitózisára. A dinamin2 koexpresszálása az amfifizin, illetve az endofilin SH3 doménjével részben, illetve teljesen kivédte az SH3 domének gátló hatását (15.ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a dinamin prolingazdag regiójának kapcsolódása az endofilinhez és amfifizinhez szerepet játszhat a dinamin klatrinburkos gödröcskékhez való irányításában az AT 1 -receptor internalizációja során, és felveti e fehérjék lehetséges szerepét az AT 1 -receptor internalizációjában. A B 15.ábra A dinamin2 expresszálása felfüggeszti az endofilin I és amfifizin II SH3 doménjének gátló hatását az AT 1 -receptor endocitózisára. A, CHO sejteket 24 lyukú lemezen 0,5 µg AT 1 -receptor cdns-sel együtt transzfektáltuk 0,5 µg dinamin cdns-sel ( ), illetve 0,5 µg GFP-SH3-Endo cdns-sel ( ), illetve 0,5 µg dinamin cdns-sel és 0,5 µg GFP-SH3-Endo cdns-sel ( ) B, CHO sejteket 24 lyukú lemezen 0,5 µg AT 1 -receptor cdns-sel együtt transzfektáltuk 0,5 µg dinamin cdns-sel ( ), illetve 0,5 µg GFP-SH3-Amf cdns-sel ( ), illetve 0,5 µg dinamin cdns-sel és 0,5 µg GFP-SH3-Amf cdns-sel ( ). A 125 I-angiotenzin II endocitózisát a az ábrán jelzett időpontokban, a módszerek fejezetben ismertetett módon mértük. Az internalizált specifikus kötést a teljes specifikus kötés százalékában tüntettem fel. Az ábrákon három független kísérlet eredményeinek átlaga és az átlag szórása van feltüntetve. 56

A dinamin2 lokalizációja az amfifizin, illetve az endofilin SH3 doménjét tartalmazó sejtekben A dinamin2 sejten belüli elhelyezkedése nagy mértékben megváltozott azokban a sejtekben, ahol az amfifizin illeteve az endofilin SH3 doménje koexpresszálódott a dinamin2-vel, azokhoz a sejtekhez képest amelyben csak a dinamin2 expresszálódott. A plazmamembrán-lokalizáció és az egyenletes citplazmatikus eloszlás megszűnt, és a dinamin festődése pettyezettséget mutatott, és kolokalizált a GFP-hez kapcsolt endofilin SH3 doménjével (16.ábra C.). A plazmamebrán lokalizáció szintén megszűnt azokban a sejtekben, amelyek az amfifizin SH3 doménjét expresszálták, de ebben az esetben a dinamin2 lokalizációja homogén maradt a citoplazmában (16.ábra F.). A GFP-hez kapcsolt Nck SH3 doménje homogén citoplazma és plazmamembrán eloszlást mutatott, de nem halmozódott fel a klatrinburkos gödröcskékben. A GFP-hez kapcsolt Nck SH3 doménjének koexpresszálása nem változta meg a dinamin2 lokalizációját (16.ábra I.). Tehát a dinamin prolingazdag doménjéhez kapcsolódó amfifizin és endofilin SH3 doménjénak a koexpresszálása, hasonlóan a prolingazdag régió deléciójához, a dinamin plazmamembrán-lokalizációjának megszűnését és máshova történő lokalizációját okozták. 57

16. ábra A GFP-vel fúzionált SH3 domének szubcelluláris lokalizációja a dinamint expresszáló sejtekben. CHO sejteket kotranszfektáltunk 0,5µg AT1-receptor cdns-sel és 0,5µg HA-dinamin cdns-sel valamint 0,5µg GFP-SH3-Endo cdns-sel (A, B, C képek), illetve 0,5µg GFP-SH3Amf cdns-sel (D, E, F képek) vagy 0,5µg GFP-SH3-Nck cdns-sel (G, H, I képek). A sejteket angiotenzin II stimuláció után fixáltuk, és HA-epitóp ellenes elsődleges és rodaminnal konjugált másodlagos antitesttel festettük. Zöld színnel a GFP-SH3-Endo (A kép), a GFP-SH3-Amf (D kép), illetve a GFP-SH3-Nck (G kép) látszik. A HA-dinamin lokalizációja a B, E, H képeken piros színnel látszik. A két fluoreszcencia egymásra vetített képe a C, F, és I képeken látható. A legfelső képsoron (A, B, C), a felvételen látható egy olyan sejt, amely nem expresszálja GFP-SH3-Endo-t, ebben az esetben a dinamin plazmamembrán-lokalizációja látható. A mellette lévő sejt, amelyben nagy mennyiségű GFP-SH3-Endo expresszálódott, a dinamin és a GFPSH3-Endo citoplazmatikusan, pöttyözött strukturához lokalizálódik, valamint a dinamin plazmamembrán-lokalizációja ebben az esetben eltűnt. A középső képsoron ( D, E, F) azon sejtben, ahol nem volt látható GFP-SH3-Amf expresszió, a dinamin a tipikus plazmamembrán-lokalizációt mutatja, míg a GFP-SH3-Amf-t nagy mértékben expresszáló sejtben ez a plazmamembrán-lokalizáció megszűnik. Az alsó képsoron ( G, I, H) a GFP-SH3-Nck-t expresszáló sejtben a dinaminra jellemző plazmamembrán-lokalizáció nem változott meg. A képeken 3 független kísérletből láthatóak, a kísérleteket reprezentáló tipikus sejtek. 58