Molekuláris biológus M.Sc. Prokarióták élettana

Molekuláris biológus M.Sc. Prokarióták élettana Bakteriális DNS replikáció. A génexpresszió szabályozása prokariótákban. Plazmidok, baktériumok transzformálása. A prokarióta genom nukleoid egyetlen cirkuláris DNS molekula (lineáris: Borrelia, Streptomyces; diploid genom: Rhodobacter) méret: <5 Mb 30 Mb, kitekerve 1,6 mm hosszúságú szuperhelikális szerkezet (negatív, pozitív) DNS giráz (-) és reverz giráz (+) topoizomeráz I (replikáció, transzkripció) helikázok DNS-kötő fehérjék (Bacteria domén) HU protein (E. coli) nem specifikus DNS kötő fehérje (tetramer, 2 α és 2 β alegység) IHF (integration host factor) protein specifikus kötődés H-NS protein nem specifikus DNS kötő fehérje Archaea hiszton-szerű fehérjék plazmidok extrakromoszómális genetikai elemek; megaplazmidok (V. cholerae); lineáris forma is (Borrelia); integráció transzpozonok, inzerciós szekvenciák nincsenek intronok (Bacteria domén) restrikciós endonukleázok, modifikációs enzimek szimultán folyó transzkripció és transzláció a génexpresszió legfontosabb regulációs pontja a transzkripció iniciálása 1

DNS replikációja iniciáció (E. coli) egyetlen replikációs origó oric; kb. 245 bp régió, két replikációs villa két rövid repetitív motívum (5 db 9 és 3 db 13 nukleotidból álló elem) 9 nukleotidból álló repetitív elemek a DnaA kötőhelyei, a lekötődött DnaA további szabad DnaA molekulákhoz (30) kötődve kapcsolódik a kötőhelyhez (hordó struktúra); kapcsolódás csak negatív szuperhelikális szerkezet esetén a dupla hélix felnyílik a három AT-gazdag 13- nukleotidból álló régióban oka a DnaA kötődése miatt kialakuló torziós feszültség? HU proteins segíti a folyamatot DnaBC komplex prepriming komplex (a DnaC segíti a DnaB kötődését, majd ledisszociál) DnaB helikáz; dupla lánc további széttekerése; lehetővé válik a polimeráz kötődése SSB-k single-strand binding proteins; védik az egyszálú nukleinsavat DNS replikáció Elongációs fázis - polimerázok polimeráz 5 >>>3 irányú szintézis - vezető szál és követő szál DNS polimeráz III fő replikációs enzim csak 3-5 exonukleáz aktivitás több alegységből álló enzimkomplex core enzim (α polimeráz; ε 3-5 exonukleáz; θ -?) γ és τ β polimeráz komplex templáton tartása δ, δ, χ és ψ DNS polimeráz I pola gén 3-5 és 5-3 exonukleáz aktivitás követő szál szintézise primer lebontása és hiányzó szakasz szintézise DNS polimeráz II polb gén repair 2

DNS replikáció Elongációs fázis primerek és a primáz a DNS polimeráz csak dupla szálú struktúrához tud nukleotidokat ragasztani primáz speciális RNS polimeráz primer 4-15 nukleotidból álló RNS szakaszok vezető szálon egyetlen követő szálon több primer szintézise után DNS polimeráz III folytatja a szintézist Okazaki fragmentumok 1000 2000 nukleotid hosszúságú szakaszok (~4000 priming) Okazaki fragmentumok esetében minden egyes szakasz szintézise külön primert igényel >>> ennek lehasítása 5-3 exonukleáz aktivitást igényel DNS replikáció Elongációs fázis - helikázok helikázok DnaB helikáz prepriming komplex kialakítása ATP igényes folyamat 5-3 helikáz követő szálon szakaszos szétcsavarás PriA és Rep 3-5 helikázok DnaB kötődése után primoszóma kialakulása (vezető szálon) a primáz kötődése és az RNS primer szintézise, majd DNS szintézis a DNS polimeráz III által 3

DNS replikáció Elongációs fázis - SSBs single-strand binding proteins ragadós ss DNS stabilizálása reasszociáció megakadályozása degradáció gátlása DNS replikáció Elongációs fázis követő szál szintézise a követő szálon a szintézis csak akkor kezdődik, ha a vezető szálon 1000-2000 nukleotidnyi szakas megszintetizálódik primáz kapcsolódva a DnaBvel a primoszómában >>> primer szintézis DNS polimeráz III γ, δ, δ, χ és ψ kölcsönhatásban a β alegységgel szimultán szintézis a vezető és a követő szálon polimeráz orientáció DNS polimeráz III dimer és primoszóma >>> repliszóma 4

DNS replikáció Elongációs fázis követő szál szintézise DNS polimeráz III megáll az RNS primernél DNS polimeráz I folytatja a szintézist (5-3 exonukleáz aktivitás) DNS ligáz foszfodiészter kötések kialakítása a fragmentek között DNS replikáció - Termináció két terminációs régió terd és terc, B terminátor szekvencia E. coli 7 terminátor szekvencia (~23bp) egyik szekvencia a Tus szekvencia-specifikus DNSkötő fehérjék felismerési helye a Tus proteinek orientációja határozza meg, hogy folytatódhat-e a szintézis megakadályozza DnaB helikáz haladását repliszóma felbomlása a topoizomeráz IV szétválasztja a két egymásba fonódó cirkuláris DNS-t 5

Baktériumok genetikai változásai Mutáció szelektív előnyt jelenthet (AB rezisztencia) Genetikai anyag átvitele mobilis genetikai elemek segítségével: 1. Transzformáció exogén DNS felvétele a környezetből 2. Transzdukció bakteriofágok által közvetített génátvitel, lizogén konverzió; pl. diftéria toxin 3. Konjugáció plazmidok közvetítésével létrejövő génátvitel; átkerülhetnek virulenciagének (adhéziós faktorok, szideroforok) vagy rezisztencia plazmidok Kapcsolt transzkripció és transzláció 6

A bakteriális transzkripció egyetlen RNS-polimeráz = core enzim (α2ββ ) + σ-faktor(ok) core enzim szintetizál β dntp-t és szigma faktort köt; β DNS-t köt; az α alegység összeépülés és regulátorok kapcsolódása szigma faktor promoter felismerő a polimeráz direkt kötődése a promóterhez azonosítás, majd kapcsolódás transzkripció iniciálása RNS lánc felépítése transzkripció terminációja működését regulátor fehérjék szabályozzák policisztronális mrns egy mrns több fehérje iniciáció -35 (5 -TTGACA-3 ) és -10 (5 -TATAAT-3 ) pozíció Pribnow -box elongáció 20-50 bázis/sec termináció - ρ-faktor (ATP-dependens helikáz) dependens és ρ-faktor independens termináció nincs poszttranszkripciós módosítás 7

Kötődés a promóter régióhoz Zárt komplex A polimeráz kötődik a -40 - +20 régióban Nyitott komplex A polimeráz széttekeri a DNS láncot a -10 - +2 régióban. Az első NTP kötődése Magas purinbázis mennyiséget igényel [NTP] További NTP beépítés Kevesebb purin jelenléte is elég [NTPs] A szigma faktor leválása Az RNS lánc 6-10 tagú 8

Rho-faktor dependens termináció DNS szekvencia és fehérje függő termináció rho faktor helikáz enzim Rho-faktor independens termináció DNS szekvencia függő nem igényel speciális fehérjét hajtű struktúra kialakulása a palindrom szekvencia miatt >>> instabil polimeáz kapcsolódás a palindrom szekvencia közvetlenül egy poliadenozin régió előtt található intrinzik terminátor, amely segíti a polimeráz leválását (A-U kötődést hét H-kötés stabilizálja) 9

néhány perces féléletidő 3-5 irányban RNázE és/vagy RNázIII endonukleázok, a hajtű struktúra levágása RNázII exonukleáz; 3-5 irányú vágás PNPáz polinukleotidfoszforiláz; 3-5 exonukleáz aktivitás, de működéséhez koszubsztrátként foszfátcsoportot igényel degradoszómában (helikáz is)? mrns degradáció rrns szintézis és processing egy átírási egységben, multicopy formában pre-rrns >>> ribonukleázok (III, P és F) M16, M23 és M5 exonukleázok érett rrns-ek kémiai módosítás metiláció, uridin >>> pszeudouridin 10

trns szintézis és processing egyedi vagy multicopy átírási egységben, vagy közös átírási egységben a rrns-ekkel hajtű struktúrák a trns mindkét végén az RNázE/F hasít a 3 irányban lévő hajtű előtt, majd az RNázD visszavág az új 3 végről további 7 nukleotidot az RNázP lehasítja az 5 végen lévő hajtű struktúrát az RNázD további 2 nukleotidot hasít a 3 végről ha -CCA-3 >>> érett trns ha nincs >>> trns nukleotidiltranszferáz hozzáadja baktériumsejtben 30-45 féle trns Aminoacilt-tRNS szintetázok 11

Aminoacil-tRNS szintézis Bacillus megaterium archaeák (Asp-Asn) Bakteriális transzláció Bakteriális riboszóma J. Lake (1970) trns aminoacil-trns-szintetáz mrns 12

Iniciáció IF3 iniciációs faktor riboszóma disszociáció és mrns kötődés (Shine- Dalgarno szekvencia) a 30S-hez IF2 - formilmetionil-trns kötődés a START kodonhoz (AUG, GUG, UUG) IF-1 segítségével 50S alegység kapcsolódása Elongáció P peptidil-kötőhely A aminoacil-trns kötöhely EF-Tu (G protein) a megfelelő aminoacil-trns szállítása az A-kötőhelyre peptidil-transzferáz aktivitás a 23S rrns-en (ribozim) peptidkötés kialakulása (energiaigény GTP) >>> EF-Tu inaktivációja EF-Ts - EF-Tu regenerációja transzlokáció EF-G; az A hely felszabadulása 13

Különleges elongációs mechanizmusok E. coliban Programozott kereteltolódás DNS polimeráz III γ és τ alegységei - dnax gén γ alegység rövidebb mrns τ alegység teljesmrns Transzlációs csúszás (slippage) riboszóma transzlokációja egy rövid nem-kódoló mrns szakasz mentén triptofán operon laktóz operon Transzlációs bypass T4 bakteriofág gén60 >>> DNS topoizomeráz két különböző fehérje egy mrns-ről Termináció STOP kodon - RF1 (UAA, UAG) és RF2 (UAA, UGA) RF3 hidroláz, RF1 és RF2 leválása a riboszómáról; GTP-t igényel RRF ribosome recycling factor 14

Pozitív vs negatív kontroll Ha a szabályozó fehérje jelen van A regulátor fehérje A mutáció funkcióvesztést okoz Pozitív kontroll az OPERON bekapcsolva AKTIVÁTOR OPERON kikapcsolva Negatív kontroll az OPERON kikapcsolva REPRESSZOR OPERON bekapcsolva 15

Az transzkripció iniciációjának szabályozása negatív szabályozás represszor csak a korepresszorral együtt kötődik a promóterhez korepresszor a biokémiai útvonal specifikus terméke anabolikus enzimek szintézisének szabályozása pl. aminosavak szintézise (arginin, triptofán) Az transzkripció iniciációjának szabályozása negatív szabályozás alapállapot represszált (laktóz represszor) induktor represszor inaktiválása derepresszió katabolikus enzimek expressziójának szabályozása pl. laktóz operon 16

Az transzkripció iniciációjának szabályozása pozitív szabályozás alapállapot inaktív promóter regulátor fehérje az aktivátor az aktivátor csak az induktor molekula jelenlétében aktív pl. mal operon A transzkripció iniciációjának szabályozása globális reguláció karbon-katabolit represszió katabolit aktivátor protein (CAP) adenilát-cikláz camp szint 17

A transzkripció iniciációjának szabályozása globális reguláció specifikus promóter (DNS-kötő motívum) specifikus szigma faktor E. coli hősokk promóter (normál promóter - σ70 subunit; hősokk promóter σ32 subunit) Klebsiella N 2 fixálás σ54 subunit Bacillusok spóraképzése Elongáció vagy termináció? Transzkripció szabályozás a termináció szintjén Antitermináció antiterminátor protein a DNS-hez kötődik a promóter közelében a transzkripció során átkerül az RNS polimerázra, megakadályozva ezzel, hogy az 1. terminációs szignálnál véget érjen a transzkripció 18

Elongáció vagy termináció? Transzkripció szabályozás a termináció szintjén Attenuálás aminosav bioszintézis enzimjei a triptofán operon attenuálása E. coliban két hajtű struktúra alakulhat ki a trpe előtt nagy hairpin >>> transzkripció mehet (lefedi a kisebb hairpint) kis hairpin >>> termináció hairpinek kialakulása triptofán tartalmú leader peptid Trp operon represszió + attenuálás hisztidin, leucin és treonin csak attenuálás Elongáció vagy termináció? Transzkripció szabályozás a termináció szintjén Bacillus subtilis a triptofán operon szabályozása két hajtű struktúra alakulhat ki trpe előtt nagy hairpin >>> transzkripció mehet (lefedi a kisebb hairpint) kis hairpin >>> termináció trp RNA-binding attenuation protein TRAP RNS-kötő protein kapcsolódik az operon leader régiójához >>> kis hairpin >>> termináció TRAP jórészt β-redőből álló 11 identikus alegység, mindegyikben Trp >>> cirkuláris struktúra kialakulása 19

A transzláció szabályozása az iniciáció szintjén Riboszómális fehérjék szintézisének szabályozása feedback mechanizmus E. coli L11 operon L11 és L1 riboszómális fehérjék génjei ha az L1 kötőhely betelik a 23S rrns-en, az L1 az mrns-hez kapcsolódva gátolja a további transzlációt amíg van szabad rrns, addig van transzláció A transzláció szabályozása Antiszensz RNS - regulátor RNS-t kódoló gének antiszensz gének pl. E. coli porin fehérjék szintézise OmpC (nagy OP, kis pórus) ompc gén OmpF (kis OP, nagyobb pórus) ompf gén Nagy ozmózisnyomás esetén: ompc ompf OmpR fehérje A R micf RNS G 20

Poszttranszlációs módosítás Fehérjék 3D struktúrájának kialakulása E. coli molekuláris chaperonok Hsp70 (dnak gén és DnaK protein) család a transzlálódó fehérje hidrofób régióihoz kötődve akadályozza annak aggergálódását a teljes szintézisig; membrántranszport; hőkárosodott fehérjék lebontása Hsp40 (dnaj gén) és GrpE chaperoninok - GroEL/GroES komplex aggregáció akadályozása más proteinekkel hidrofób régiók becsomagolódása Poszttranszlációs módosítás Fehérjék lebontása - proteázok hőshock lon proteázok sporuláció vegetatív sejtre jellemző fehérjék lebontása SOS válasz repair enzimek termelődése, replikáció gátlása Kovalens módosítás regulátor fehérje kovalens módosítása (pl. N-asszimiláció glutaminszintetáz adenilálása) Allosztérikus szabályozás allosztérikus enzimek szabályozása (aktív hely és allosztérikus vagy regulatórikus hely effektor) pl. E. coli aszpartát-karbamoil transzferáz Végtermék-gátlás allosztérikus enzimek végtermék gátlása (pl. aminosavak szintézise) izoenzimek elágazó anyagcsereutak szabályozása 21

Bacillus subtilis sporulációjának szabályozása SpoOA vegetatív sejtekben jelen lévő transzkripciós aktivátor; σ faktorok szintézisének regulációja σ A és σ H vegetatív sejtek transzkripciós folyamatai σ F prespóra-specifikus subunit σ E anyasejt-specifikus subunit SpoOA extracelluláris szignálra (stressz) foszforilálódik, ami aktiválja a σ F és σ E géneket anyasejtben σ F SpoIIAB-hoz kapcsolódva inaktív formában SpoIIAA foszforilált formában akadályozza a σ F felszabdulását a prespórában az anyasejtben a SpoIIAB foszforilálja a SpoIIAA-t, így a σ F inaktív állapotban van σ F aktivációja a σ F felszabadul a SpoAB kötésből, ezt indirekt módon a membránhoz kötött SpoIIE szabályozza ha SpoIIAA nem-foszforilált, akkor a SpoIIAB-höz kötődik és felszabadul a σ F subunit a prespórában a SpoIIAB SpoIIAA-t foszforiláló hatásával a SpoIIE antagonizál, ha ez jelen van a σ F felszabadul a SpoIIAB-ről és aktiválódik σ E az anyasejtben az inaktív σ E prekurzor protein proteolitikus hasításával aktiválódik; a proteáz a SpoIIGA a SpoIIGA proteáz pedig a SpoIIR segítségével fog aktiválódni, a spoiir gén promóterét pedig a σ F ismeri fel 22

A spóra differenciálódás késői lépései a prespórában újabb σ subunit a σk szintézise >>> a spóra differenciálódásának késői fázisában szerepet játszó gének promóterének felismerése SpoIVB SpoIVF szeptumhoz kötött proteáz aktiválása a SpoIVB emellett egy második anyasejt-specifikus σ faktort is aktivál, ez a σk a σk a σe által átírt gén, ami az anyasejtben inaktív formában van jelen mindaddig, amíg a prespórából aktivációs jelet nem kap σk irányítja azon fehérjék génjeinek a transzkripcióját, melyek az anyasejt differenciálódásának késői lépéseiben vesznek részt Transzkripció - RNS polimeráz - rifampicin - in vitro transzkripció - operonok jelenléte - promóterek - transzkripció reguláció - mrns termináció - mrns capping és tailing - mrns splicing EUBACTERIUM 4 alegység RNS polimerázt gátol + + Pribnow-box (-35/-10) σ-faktor ρ-faktor dependens/independens - - ARCHAEA 8-14 alegység RNS polimerázt nem gátol - (transzkripciós faktor szükséges) + TATA-box-szerű (-32/-25) több transzkripciós szabályozó molekula ρ-faktor independens AT-gazdag szekvencia? + 23

Transzláció - riboszóma méret - trns - iniciátor trns - chloramphenicol/tetraciklin/ erythromycin - diphtheria toxin - posztranszlációs módosítás EUBACTERIUM 70S timin a T-karon formilmetionil-trns fehérjeszintézist gátol EF2-t nem gátol + ARCHAEA 70S pszeudouridin a T-karon metionil-trns fehérjeszintézist nem gátol EF2-t gátol + (eukariótákhoz hasonló) Rekombináns DNS technikák Genetic engineering - alapkutatás gén replikáció és expresszió vizsgálata - alkalmazott kutatás gyógyszeripari, élemiszeripari felhasználás Klónozás in vitro rekombináció Cél: specifikus gének, génszakaszok nagy mennyiségben, tisztított formában történő előállítása 1. A gént hordozó DNS szakasz izolálása, előállítása. 2. A DNS szakasz klónozó vektorba történő beillesztése ligálás; polycloning site tompa és tapadós vég. 3. A vektor gazdasejtbe juttatása transzformáció. Klón előállítás. 4. A megfelelő klón kiválasztása. 5. A klónt hordozó sejtek/bakteriofágok elszaporítása. 24

PLAZMIDOK, mint klónozó vektorok A baktériumsejtekben természetesen is előforduló genetikai elemek. Kis méret, könnyű izolálás és manipuláció. Dupla szál, cirkuláris szimmetria stabilitás. A gazdasejt kromoszómájától független replikáció. Több kópia a sejtben. Rezisztencia gének hordozása szelekciós marker. Transzformáció vagy elektroporáció. Plazmid replikáció kontroll (szoros vagy laza). Polilinker régió. Inzerciós inaktiválás klón szelekció (pl. antibiotikum rezisztencia megszűnése). 25

LAMBDA BAKTERIOFÁG, mint klónozó vektor Nagyobb méretű ( 20 kb) DNS klónozható. Becsomagolódás jó hatásfokkal. Képes fertőzni a gazdasejtet, nincs szükség transzformálásra - transzdukció. Modifikált fágok alkalmazása restrikciós helyek módosítása. Replacement vektorok alkalmazása. Szelekciós marker (pl. β-gal gén) beépítése. Kozmid vektorok nagy méretű ( 40 kb) DNS fragment beépítése. cos régió lambda fágba csomagolódás nagyobb stabilitás, hosszú idejű tárolhatóság. transzdukcióval juttathatók baktérium- sejtekbe. Egyéb vektorok - expressziós vektorok az idegen gén által kódolt fehérje előállítása tisztán, nagy mennyiségben - szekréciós vektorok az expresszált fehérje ki is választódik a sejtből - shuttle vektorok genetikai anyag mozgatása nem rokon organizmusok között - M13 szekvenáló fág ssdns képzése - fágmid (szekvenálás) fág és plazmid replikációs origó - élesztő műkromoszóma (yeast arteficial chromosome) (10-800 kb inzert beépítése) - vírusvektorok nukleinsavak bejuttatása eukarióta sejtekbe 26

Expressziós vektorok Gén kópiaszáma Megfelelő promóter Pribnow box, Kozák-féle szekvencia Transzláció iniciációja Kodon felhasználás ritka kodonok Fehérje stabilitás, toxicitás Mutáns gazdasejt vagy gén használata Szabályozó mechanizmusok represszor-operátor rendszer alkalmazása Klónozó vektorok gazdasejtjei kompetens gazdasejt szükséges baktérium (E. coli, Bacillus subtilis) élesztősejtek (Saccharomyces cerevisiae) A megfelelő klónok kiválasztása, izolálása szelekciós markerek 1. Vektor szelekciós marker antibiotikum rezisztencia gén 2. Génhez kapcsolt riporter gén β-galaktozidáz, luciferáz, GFP, fehérje kimutatása ellenanyagok felhasználásával (replikatechnika) 3. Klónozott gén kimutatása nukleinsav próbák (kolónia hibridizáció) 27

Eukarióta gének klónozása baktériumsejtbe Fehérje izolálás AA sorrend meghatározása Reverz transzláció Oligonukleotid próba mrns Irányított mutagenezis Pontmutáció létrehozása Új restrikciós hely beépítése Mutáns gén teljes szintetizálása Kazetta mutagenezis inzerciós mutánsok 28

Gyakorlati alkalmazások I. 1. Mikrobiális fermentáció enzimek, antibiotikumok előállítása 2. Vakcina előállítás alegység vakcinák pl. HBV rekombináns élő vakcina pl. veszettség elleni oltás állatok esetében DNS vakcinák pl. vaccinia és adenovírus 3. Bakteriális és emlőssejt fehérjék nagy mennyiségű előállítása polimeráz enzimek inzulin, növekedési hormonok Gyakorlati alkalmazások II. 4. Transzgén növények és állatok - A. tumefaciens Ti-plazmid - antibiotikum-gén növénybe juttatása - gyomirtókkal szembeni rezisztencia - kártevőkkel szembeni védekezés - vakcinatermelés - környezetvédelem - termékenység és testtömeg növelés - betegségekkel szembeni rezisztencia - kutatás 5. Környezetvédelmi biotechnológia - rovarirtószerek lebontása 6. Génterápia - szérumfehérjék - hormonok - immunmodulátor fehérjék - vakcinák 29