2. Festett készítmények vizsgálata A mikroszkópos gyakorlatban a sejtek színe általában gyenge és mikroszkóppal vizsgálva nem feltőnı. A sejt plazmája és egyes struktúrái azonban a festéket felveszik, magukba sőrítik, ami egyrészt lehetıvé teszi a jobb megfigyelést, másrészt speciális festékeket alkalmazva különbözı citokémiai reakciók elvégzésére is alkalmas. A mikroszkópos gyakorlatban a mikroorganizmusok színezésére használt festékanyagok kémiai szempontból három fı csoportba sorolhatók. A bázikus színezıanyagok színes, un. kromofor csoportja kation jellegő, ezáltal a sejtek savas karakterő alkotórészeihez, fıként a nukleotidokhoz kötıdnek. Ebbe a csoportba tartoznak a legelterjedtebben használt festékek, mint a metilénkék, a fukszin, a malachitzöld, a kristályibolya és a neutrálvörös A savas karakterő festékek kromofor csoportja anion jellegő, tehát a sejt bázikus karakterő anyagaihoz képes kötıdni. Ebbe a csoportba tartozik pl. az eozin. A semleges karakterő festékek jellemzı tulajdonsága, hogy disszociációra nem hajlamosak, minden phtartományban azonos mértékben festenek (pl. rhodamin B), A mikroorganizmusok sejtszerkezete elpusztulásuk után megváltozik, ezért törekedni kell arra, hogy úgy öljük el a sejteket, hogy minél kevesebb strukturális elváltozás történjen. Ezt a célt szolgálja a preparátum rögzítése, ami egyúttal biztosítja a sejtek megtapadását is a tárgylemezen. A rögzítési eljárások igen széles skálája áll a mikrobiológiai laboratóriumok rendelkezésére. Ezek közül a legegyszerőbb és leggyorsabb a hıvel való rögzítés, ami viszont durva változásokat idéz elı a sejtek ultrastruktúrájában, ezért finom ultracelluláris részletek vizsgálatakor alkalmazása nem célszerő. A teljes sejt vizsgálatához azonban kiválóan alkalmas. Minden mikrobiológiai morfológiai vizsgálat elıtt a tárgylemezt tisztítani kell. E célból elıször 96 %-os alkohollal zsírtalanítjuk, majd száradás után a tárgylemezt Bunsen- égı lángja felett néhányszor áthúzzuk. Ezt követıen készítjük el a preparátumot (kenet, szuszpenzió), majd fixáljuk oly módon, hogy a tárgylemez alját néhányszor láng fölött óvatosan. áthúzzuk. Fixáláskor a tárgylemez ne melegedjen 60-70 C-nál magasabb hımérsékletre, mert a sejtek összezsugorodnak, és a preparátum értékelhetetlen lesz. A festéses módszerek között megkülönböztetünk egyszerő és összetett festéseket. Az egyszerő festések során egyetlen festékoldattal kezeljük a készítményt. A festés lehet pozitív vagy negatív attól függıen, hogy a sejtek, vagy a háttér festıdik. Az egyszerő festés speciális formái a polikróm festés, a mikroanalitikai festések és az indikáló festések. A polikróm festés során is egy festéket használunk, a készítményben azonban az egyes alkotórészek más-más színőek lesznek. Ide sorolható pl. a Bacillus anthracis (a lépfene kórokozója) festése karbolvizes toluidinkékkel, aminek hatására a baktérium burka rózsaszínre, a többi része pedig kékre festıdik. A mikroanalitikai festések a preparátum meghatározott részeinek illetve anyagainak kimutatására szolgálnak a festésre használt anyaggal történı színreakció révén (pl. keményítıszemcsék kimutatása). Az indikáló festések a készítmény vagy a készítmény egyes részleteinek redoxpotenciál, vagy phviszonyairól, ad a kialakuló, színreakció alapján felvilágosítást. Az összetett festések során a preparátumot többféle festékoldattal kezeljük. Az összetett festés eredményeként a preparátum más-más részei eltérı festıdést mutatnak (Gram-festés, Ziehl-Neelsen-féle festés). Az összetett festések között kell megemlíteni a differenciáló festéseket, amelynek lényege, hogy egy adott mikroorganizmus egyes sejtalkotói más-más színőre festıdnek (Bacillus cereus differenciáló spórafestése).
2.1. Egyszerő festési eljárások 2.1.1. Joghurtkultúra festése metilénkékkel A savanyított tejtermékeket pasztırözött tejbıl állítják elı savanyító kultúrával történı beoltás útján. A joghurtkultúra Streptococcus thermophilus és Lactobacillus bulgaricus szimbiózisban élı vegyestenyészetébıl áll. A kultúrában a gömb alakú streptococcusok és a pálcika alakú lactobacillusok aránya 1:1, esetleg 3:1. GYAKORLAT Mikroszkóp immerziós objektívvel, tárgylemez, oltókacs, 96 és 33 %-os alkohol, Löfflerféle metilénkék, festıtál, immerziós olaj, xilol Mikroorganizmus: Joghurtkultúra (Streptococcus thermophilus és Lactobacillus bulgaricus vegyes tenyészete) A 96 %-os alkohollal letisztított, lelángolt tárgylemezre 1-2 kacsnyi joghurtkultúrát egyenletesen, vékony rétegben felkenünk. A készítményt láng felett óvatosan rögzítjük. Ügyeljünk rá, nehogy megégjen! Mivel a joghurtból készített kenet zsíros, azt zsírtalanítani kell, különben a festék lepereg róla. A preparátum zsírtalanítása festıtálca felett néhány csepp 33 %-os alkohollal történjen. A kenet száradása után cseppentsünk rá 1-2 csepp Löffler-féle metilénkéket, és 1 percig hagyjuk a készítményt festıdni. A festési idı eltelte ~után a festéket vízzel le kell öblíteni, a preparátumot szárítani. A száraz festett készítményre 1 csepp immerziós olajat kell cseppenteni, és immerziós objektívvel vizsgálni. A vizsgálat után az immerziós objektívet minden esetben xilollal meg kell tisztítani! Megfigyelések: 2.1.2. Vitális festés A vitális festés lényege az élı és holt sejtek megkülönböztetése, szükség esetén arányuk megállapítása. A festés azon az elven alapul, hogy híg festékoldatokból a holt sejtekbe lényegesen több jut, mint az élı sejtekbe. Az élı sejtekbe bejutott festékek pedig a különbözı dehidrogenáz-enzimrendszerek hatására elszíntelenednek, így a holt sejtek megfestıdnek, az élı sejtek pedig színtelenek maradnak. GYAKORLAT
Mikroszkóp, tárgylemez, fedılemez, pipetta, híg metilénkék-oldat vitális festéshez, festıtál, szőrıpapírcsíkok, 60 C-os vízfürdı, 96 %-os alkohol Mikroorganizmus: Saccharomyces cerevisiae vizes szuszpenziója A gondosan zsírtalanított, lelángolt tárgylemezre cseppentsünk 1 cseppet az élesztısejtek elıre elkészített szuszpenziójából, majd egy fedılemezzel fedjük le buborékmentesen. Ezt követıen cseppentsünk a fedılemez mellé 1 csepp híg metilénkék oldatot, és az ellentétes oldalról szőrıpapírcsíkkal szívassuk be alá. Vizsgáljuk a készítményt 40-szeres nagyítású objektívvel! Határozzuk meg az élı és a holt sejtek arányát! Ismételjük meg a vizsgálatot 60 C-os vízfürdıben 5 percen át hıkezelt élesztıszuszpenzióval! Értékelés: 2.2. Összetett festési eljárások 2.2.1. Gram-festés A Christian Gram dán orvos által 1884-ben kifejlesztett eljárás a mikrobiológiai gyakorlatban a legjelentısebb festésnek tekinthetı. Segítségével a baktériumok két fı csoportra, a Gram szerint festıdı (Gram-pozitív) és a Gram szerint nem festıdı (Gramnegatív) baktériumok csoportjára oszthatók. A Gram pozitív baktériumok a festés során megtartják az elsıdleges festés színét, míg a Gram-negatívak elvesztik azt. A különbség oka mind a mai napig nem tisztázódott egyértelmően, de valószínőleg a baktériumok sejtfalának eltérı kémiai szerkezetével magyarázható. A Gram-festésnek számos változata alakult ki, de az alapelv valamennyiben azonos: A baktériumokat elıször trifenil-metán típusú festékkel kristályibolya v. genciánibolya) kell kezelni, aminek során minden baktérium ibolya színőre festıdik. Jód hatására jód-pararozanilin komplex képzıdik, ami 96 %-os alkohollal a Gram-negatív baktériumokból kivonható, a Gram-pozitívakból viszont nem. Az elszíntelenedett Gram-negatív baktériumokat az eredeti festéktıl eltérı színő kontrasztfestéssel (pl. fukszin, szafranin) kell láthatóvá tenni. Mikroszkóp immerziós objektívvel, tárgylemez, oltókacs, 96-os alkohol, kristályibolya, vagy genciánibolya-oldat, Lugol-oldat, szafranin- vagy fukszin-oldat, festıtál, immerziós olaj, xilol 2.2.2. Ziehl-Neelsen festés A Ziehl-Neelsen festést eredetileg a sav- és alkoholálló baktériumok kimutatására használták. A sav- és alkoholálló mycobacteriumok (pl. TBC-baktérium) sejtfalában mikolsavtartalmú glükolipidek és viaszok találhatók, ez az oka, hogy csak igen agresszív festési eljárásokkal festhetık meg. Az egyes Mycobacterium-fajok alkoholállóságában
lényeges különbségek mutatkoznak: az erısen sav- és alkoholálló patogén mycobacteriumok rubinpirosak, a kevésbé ellenálló szaprofita fajok pedig rózsaszínőre festıdnek. Akárcsak a mycobacteriumok, a bakteriális endospórák is sav- és alkoholállóak, csak agresszív festési eljárásokkal festhetık meg. A spórák festésére több eljárás létezik, köztük a Ziehl-Neelsen festés is kiválóan alkalmas rá. A festési eljárás lényege, hogy a festék a sejt vegetatív részeibıl híg savval vagy etanollal kimosható és más festékkel újrafesthetı. A Ziehl-Neelsen féle spórafestés során a spóra és a vegetatív sejt eltérı színő, ezért azt a festési eljárást a differenciáló festések közé soroljuk. Mikroorganizmusok:. Bacillus cereus és Pseudomonas fluorescens ferde agaros tenyészete Bacillus subtilis és Proteus mirabilis tenyészet. Bacillus subtilis és Escherichia coli tenyészet. A megfelelıen elıkészített tárgylemezre 1 csepp vizet cseppentünk, majd ebben szuszpendálunk 1-1 kacsnyit a Bacillus cereus és a Pseudomonas fluorescens tenyészetekbıl. Alapos elkeverés, és a tárgylemezen minél vékonyabb rétegben történı szélesztés után a készítményt láng felett rögzítjük. Kihőlés után a festést az alábbi séma szerint végezzük: 1. Festés genciánibolya-oldattal 1 percen át 2. Vizes öblítés 3. Pácolás Lugol-oldattal 1 percen át 4. Vizes öblítés 5. Színtelenítés 96 %-os alkohollal 0,5 percen át 6. Vizes öblítés 7. Kontrasztfestés szafraninnal 1 percen át 8. Vizes öblítés, szárítás A készítményt immerziós objektívvel vizsgáljuk. Benne a Bacillus cereus baktériumok kék színő (Gram-pozitív), a Pseudomonas fluorescens sejtek pedig piros színő (Gram-negatív) pálcikaként mutatkoznak. A preparátum értékelésekor tekintettel kell lenni arra a tényre, hogy a festés eredménye függ a tenyészet korától is. Gram-pozitív baktériumok idısebb tenyészete néha Gram-negatív jelleget mutathat. Megjegyzés: a gyakorlat során nagy körültekintéssel kell eljárni, mert a Bacillus cereus fakultatív patogén mikroorganizmus, a logaritmikus szaporodási fázisban hıstabil enterotoxint termel! Megfigyelések: GYAKORLAT Mikroszkóp immerziós objektívvel, tárgylemez, oltókacs, 33 és 96 %-os alkohol, karbolfukszin (fenolos fukszin), metilénkék-oldat, festıtál, immerziós olaj, xilol
Mikroorganizmusok: Clostridium butyricum 2 és 7 napos levestenyészete A megfelelıen elıkészített tárgylemezre a fiatal és az idıs tenyészetbıl 1-1 cseppet cseppentünk, majd oltókaccsal összekeverve vékony rétegben egyenletesen szélesztjük A preparátumot beszárítjuk és hıvel rögzítjük. Ezt követıen végezzük a festést az alábbiak szerint: 1. Festés karbolfukszin-oldattal melegítést követıen 5 percen át (a melegítést Bunsenégı lángja felett gızölésig végezzük) 2. Színtelenítés 33 %-os alkohollal vagy 5 %-os kénsavval, esetleg ecetsavval 3. Vizes öblítés 4. Kontrasztfestés metilénkékkel 2 percen át (hidegen) 5. Vizes öblítés, szárítás A készítményt immerziós objektívvel vizsgáljuk. A Clostridium-fajok spórás alakjaira jellemzı, hogy a spóra átmérıje nagyobb a baktérium átmérıjénél. Aszerint, hogy a spóra a sejtben centrálisan vagy excentrikusan helyezıdik, beszélünk klostridium (orsó), vagy plektridium (teniszütı) alakról. A készítményben; a spórák pirosra, a vegetatív sejtek kékre festıdnek. Megfigyelések: 2.2.3. Bacillus cereus-differenciáló spórafestés Az alábbi festés, akárcsak a Ziehl-Neelsen féle spórafestés a differenciáló festések közé tartozik. Ezt az eljárást alkalmazva a Bacillus cereus sejtek jellegzetes festıdési képet mutatnak. GYAKORLAT (Bemutató) Mikroszkóp immerziós objektívvel, tárgylemez, oltókacs, 5 %-os vizes malachitzöld-oldat, 0,3 %-os alkoholos (70 %) szudánfekete-b-oldat, 0,5 %-os vizes szafranin-oldat, festıtál, immerziós olaj, xilol Mikroorganizmusok: Bacillus cereus 5 napos levestenyészete A tárgylemez zsírtalanítása után a levestenyészetbıl egy cseppet a tárgylemezre cseppentünk, egyenletesen szélesztjük, beszárítjuk, majd hıvel rögzítjük. A preparátumot az alábbi festési eljárásnak vetjük alá: 1. Festés malachitzöld-oldattal melegítés közben 2 percig 2. Vizes öblítés 3. Festés szudánfekete-b-oldattal 15 percig
4. Xilolos mosás 5. Kontrasztfestés vizes szafranin-oldattal 0,5 percig 6. Vizes öblítés, szárítás 7. Vizsgálat immerziós objektívvel A Bacillus cereus sejtek 4-5 x 1-1,5 µm nagyságúak, téglalap alakúak, általában láncot képeznek, bennük nagy mennyiségő feketére színezıdött intracelluláris zsír található. A zöldre festıdı spórák centrálisan vagy szubterminálisan helyezıdnek, de a piros színőre festıdı sporangiumot sosem szélesítik ki.