Alkímia ma előadássorozat 2014 Február 20 Peptidekkel a sejtekbe: peptidek mint transzport molekulák Bánóczi Zoltán MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport
Aminosavak α-aminosavak Apoláris oldallánc N H 2 H 2 N N H 2 Gly, G H CH 3 H CH 3 H H 2 N H 3 H 2 N C H 2 N CH 3 H Ala, A H CH 3 H H 2 N H 3 C H N Val, V Leu, L Ile, I Pro, P H 2 N N H 2 H CH 3 H H * R H Poláris oldallánc N H 2 NH 2 H 2 N HS H H 2 N H N H 2 H 2 N H H H 2 N H Asn, N Gln, Q Ser, S Cys, C Thr, T H CH 3 H Phe, F NH Trp, W H 3 C S Met, M
Bázikus vagy savas oldallánc H 2 N H N H 2 H H 2 N H NH 2 H 2 N NH NH HN N Lys, K Arg, R His, H N H 2 H H H 2 N H H 2 N H H H Glu, E Asp, D Tyr, Y
Nem természetes aminosavak
Peptidek A peptidek aminosavakból felépülő oligomerek. N H 2 R H N H 2 R + -H 2 NH R' N H 2 H R' H H-AA 1 -AA 2 -AA 3 -AA 4 -H Alkalmazás: kutatás gyógyszeripar (inzulin, glukagon, octreotide (Sandostatin), oxicotin) édesítőszer (aszpartám: Asp-Phe-Me) szépségápolás (botox: Clostridium botulinum toxin)
A sejt A sejt felépítése - sejtmembrán - sejtmag - citoszol mitokondrium endoplazmatikus retikulum Golgi apparátus Bánóczi Z. et al, Bioconjugate Chem. 2010, 21, 1948 1955
A sejtmembrán Foszfolipid kettősréteg, mely tartalmaz - koleszterint -membránfehérjéket; receptorok, csatornák, transzport fehérjék - szénhidrátokat; glikoproteinek, glikolipidek H P H + R-H -H 2 H P R R: CH 2 CH 2 NH 2 foszfatidil-etanolamin (kefalin) CH 3 CH 2 CH 2 N + CH3 CH 3 foszfatidil-kolin (lecitin) H 3 C CH 3 CH 3 H 3 C CH 3 CH 3 CH 3 foszfatidsav CH 3 CH 3 H koleszterin
Na + Na + extracelluláris tér TM1 TM3 TM5 TM7 Na + Na + G α GDP G βγ intracelluláris tér
Transzport útvonalak Passzív transzport Aktív transzport - közvetlen diffúzió - transzport molekulák - csatornákon át - vezikuláris transzport - endocitóziós - makropinocitózis endocitózis diffúzió makropinocitózis Receptor mediált endocitózis lizoszóma lizoszóma transzporter fehérjék /ioncsatornák
Anyagok bejuttatása sejtekbe gyógyszermolekulák peptidek, oligonukleotiok polimerek közvetlen diffúzió????? vezikuláris transzport Lipinski-szabály: Ms < 500 H-kötés donor < 5 H-kötés akceptor < 10 partíciós koefficiens (lgp) < 5
Sejtpenetráló peptidek- az első megfigyelések Tat (transactivator of HIV transcription) Tat-86 fehérje - internalizál - sejtmagban lokalizálódik - aktiválja a transzkripciót Frankel AD, Pabo C. Cell 1988, 55, 1189 1193. 48 GRKKRRQRRRPPQ 60
A Drosophila Antennapedia fehérje homeodoménje Homeodomén - átjut az idegsejtek membránján - sejtmagban lokalizálódik - szabályozza az idegsejt fejlődését Joliot A, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1991, 88, 1864 1868. 43 RQIKIWFQNRRMKWKK 58
Sejtpenetráló peptidek Rövid peptidek, melyek bejutnak a sejtekbe, és a hozzájuk kovalensen kapcsolt molekulákat (fehérje, DN, PNS, gyógyszermolekula) szintén a sejtekbe szállítják, akár 30 kda méretig. Név Aminosavsorrend (fehérje) Származás Tat (48 60) 48 GRKKRRQRRRPPQ 60 HIV-1 Tat fehérje Penetratin 43 RQIKIWFQNRRMKWKK 58 Drosophila Antennapedia fehérje Szignálszekvencia peptidek AAVALLPAVLLALLAP EILLPNNYESYKYPGMFIALSK VQRKRQKLMP Kaposi fibroblast growth factor (K-FGF). Kaposi fibroblast growth factor (K-FGF). NF-kB p50 transzkripciós faktor Hidrofób peptidek MGLGLHLLVLAAALQGA Caïman crocodylus Ig(v) Viriális peptidek/fehérjék MGLGLHLLVLAAALQGAKKKRKV. VP22 fehérje kiméra peptid (Ig(v)-SV40 T-antigén) herpesz szimplex virus-1 1 AVGAIGALFLGFLGAAG 17 HIV gp41 glikoprotein, 8 Met Leu GLFEAIAGFIENGWEGMIDGGGYC Influenza hemaglutinin, Substance P RPKPQQFFGLM neuropeptid Transportan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL kiméra peptid, galanin-mastoparan
De novo tervezett peptidek ligopeptidek (Lys, Arg, rn, His) - Hexaarginin* - peptoid molekuláris transzporterek** - Arg távolságának változtatása - guanidino csoport távolsága * Mitchell DJ, et al. J. Pept. Res. 2000, 56, 318 325. **Wender PA, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97, 13003 13008.
ligoargininek - hexa- és oktaarginin* (Arg) n (Arg) n Lys S fluoreszcein - arginin fa** (Arg) n Lys Lys Gly-Cys (Arg) n n= 1, 2, 4 és 6 * Futaki S, et al. J. Biol. Chem. 2001, 276, 5836 5840. **Futaki S, et al. Biochemistry 2002, 41, 7925 7930. Modell peptidek - KLA modell peptid # KLALKLALKALKAALKLA - Modell peptid ## KETWWETWWTEWSQPKKKRKV # Scheller A, et al. J. Pept. Sci. 1999, 5, 185 194. ## Morris MC, et al. Nat. Biotechnol. 2001, 19, 1173 1176.
Sejtbejutás követése fluoreszcens technikákkal cf P E P T I D cf P E P T I D
lympus CKX41 fluoreszcens mikroszkóp BD LSR II áramlási citométer
Első kísérletek - fluoreszcens mikroszkóp - fixálás - 4 C - r n Újabb megfigyelések alapján - nincs fixálás - sejtmembránhoz kötött peptidek eltávolítása - tripszines emésztés - mosás heparinnal - inhibitorok alkalmazása ATP elvonás: NaN 3 és deoxiglükóz endocitozis inhibitorok: metil-β-ciklodextrin, klórpromazin, Richard P.J. et al. J. Biol. Chem. 2003, 278, 585 590.
További módszerek a sejtbejutás követésére Funkcionális vizsgálatok - luciferáz splice korrekciós teszt Lundin P. et al. Bioconj. Chem, 2008, 19, 2535-2542 - a luciferáz expressziójának gátlása RP-HPLC fluoreszcens detektorral Palm C, et al. Peptides 2006, 27 1710 1716. Tömegspektrometria alkalmazása Burlina F, et al. Angewandte Chemie 2005, 44, 4244-4247.
Sejtbejutás mechanizmusa Nincs receptor? Nem csak egy folyamat a meghatározó - endocitózis - közvetlen transzlokáció Az alkalmazott körülményektől függ Kosuge M. et al. Bioconj. Chem. 2008, 19, 656-664
Közvetlen transzlokáció hogyan? Prochiantz, A. Curr. pin. Cell Biol. 2000, 12, 400 406.
Kalpain aktivátor konjugátumok
Kalpain enzimek Ca 2+ függő intracelluláris cisztein proteázok. Ca 2+ jel beindítja a jelátviteli útvonalakban található fehérjék hasítását. Az m- és μ-kalpain az emlősök valamennyi szövetében megtalálható. Perrin J.B., et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 2002, 34, 722-725. Nem aktivált m-kalpain heterodimer Strobl S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000, 97, 588-592.
szubsztrát Szubsztrát vagy inhibitor? enzim ihibítor
Kalpasztatin Szervezetben megtalálható specifikus kalpain inhibitor. B Az inhibitor domének 3 régiót tartalmaznak: A, B és C. Csak a B régió rendelkezik inhibitor hatással. Az A és C régióknak megfelelő peptidek aktiválják az izolált kalpain enzimet. A leghatásosabb: A + C. Ca 2+ A Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ C Tompa P., et al., J. Biol. Chem., 2002, 277, 9022-9026.
Penetratin-Kalpasztatin A (C) N-terminális Konjugátumok szerkezete X-RQIKIWFQQNRRMKWKKC-NH 2 S S C-terminális H-CSGKSGMDAALDDLIDTLGG-NH 2 (AcCSKPIGPDDAIDALSSDFTS-NH 2 ) X-RQIKIWFQQNRRMKWKKC-NH 2 S CH 2 -C-SGKSGMDAALDDLIDTLGG-NH 2 (SKPIGPDDAIDALSSDFTS-NH 2 ) X-RQIKIWFQQNRRMKWKKSGKSGMDAALDDLIDTLGG-NH 2 (SKPIGPDDAIDALSSDFTS-NH 2 ) X: H vagy Hca
Két fluorofórral jelölt konjugátum CH H H λ ex = 360 nm λ em = 480 nm λ ex. = 490 nm λ em. = 520 nm 4-(7-hidroxikumaril)-ecetsav (Hca) H 5-karboxifluoreszcein (Flu) H Hca-RQIKIWFQQNRRMKWKKC-NH 2 S S Ac-CSK(Flu)PIGPDDAIDALSSDFTS-NH 2
Izolált m-kalpain aktiválása A konjugálás hatása (c = 75 µm) 150 [%] aktivitás 100 50 5 mm CaCl 2 0,1 mm CaCl 2 KalpA + KalpC (0,1 mm) PenKalpA + PenKalpC S-S (0,1 mm) 0 PenKalpA + PenKalpC amid (0,1 mm) PenKalpA + PenKalpC tio (0,1 mm) Bánóczi Z. et al. Bioconjugate Chem. 2007, 18, 130-137.
Jelölt konjugátumok bejutása CS-7 sejtekbe A) HcaPenKalpA amid B) HcaPenKalpC tioéter C) HcaPenKalpC tioéter HcaPenCalp(Flu)C konjugátum diszulfid híddal
Kalpain aktivitás CS-7 sejtek lizátumában m-kalapin aktivitás, szubsztrát emésztésben megadva (mm/s) x 10 2 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 1 mm CaCl 2 + 1 mm EDTA 10 mm CaCl 2 Kontrol Konjugátum A+C Kontrol Konjugátum A+C 0 perc 30 perc Kezelés: c= 330 µm; 4 h, 37 C-on
Intracelluláris kalpain aktivitás mérése
szubsztrát Enzim aktivitás mérése
FRET szubsztrát (fluorescence resonance energy transfer) Flu P E P T I D Abs enzim Flu + P E P T I D Abs
Kalpain specifikus szubsztrát Új és optimalizált FRET (fluorescence resonance energy transfer) szubsztrát, mely a kalpain hasítási helyek preferencia mátrixán alapul. H3C N H3C N N NH TPLKSPPPSPR NH NH - Na + S DABCYL EDANS Alkalmas in vitro mérésekre: a fluoreszcencia intenzitás csak a kalpain aktivitástól függ. Tompa P., et al. J. Biol. Chem. 2004, 279, 20775-20785.
Sejtpenetráló szubsztrát szintézise Rink-amid gyantán Fmoc/ t Bu stratégiával: DABCYL-TPLKSPPPSPRERRRRRRR-NH 2 1. Fmoc-Su 2. EDANS/BP/HBt/DIEA DABCYL-TPLK(Fmoc)SPPPSPRE(EDANS)RRRRRRR-NH 2 20 % piperidin/dmf DABCYL-TPLKSPPPSPRE(EDANS)RRRRRRR-NH 2 BP: benzotriazol-1-(iloxi)trisz(dimetil-amino)foszfonium-hexafluorofoszfát Bánóczi Z. et al. Bioconjugate Chem. 2008, 19, 1375-1381.
Sejtpenetráló szubsztrát emésztése FInt. 40 35 30 25 20 15 10 5 0 λ gerj. Emésztés előtt Emésztés után 350 400 450 500 550 600 650 (nm) c szubsztrát = 200 µm., c KalpainB = 0,5 µm λ gerj. =320 nm, λ em. = 480 nm Szubsztrát K M (µm) k cat (s -1 ) k cat /K M (M -1 s -1 ) DABCYL- TPLKSPPPSPR-EDANS 250 0.2 680 DABCYL-TPLKPPPSPRE(EDANS)RRRRRRR-NH 2 40 0.17 5000 Bánóczi Z. et al. Bioconjugate Chem. 2008, 19, 1375-1381.
Sejtpenetráló szubsztrát sejtbejutása a) b) fluorescence mean 16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 Dabcyl-TPLK(cf)SPPPSPRE-NH 2 Dabcyl-TPLK(cf)SPPPSPRERRRRRRR-NH 2 10 50 c [µm] CS-7 sejteket 3 órán át kezeltünk CS-7 sejteket kezeltünk C= 330 mm, 4 h
Kalpain aktivitás sejtlizátumban di/dt 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Ca 2+ nélkül 10 mm Ca 2+ Inhibitor jelenlétében c= 20 µm 0 A B C 600 + 10 mm Ca 2+ A) Szubsztrát S2 sejtek lizátumában B) Szubsztrát kalpaint túltermelő S2 sejtek lizátumában C) LY-AMC kalpaint túlteremelő sejtek lizátumában F int 500 400 300 c LY-AMC = 1 mm vagy c szubsztrát = 100 µm 200 100 0 LY-AMC: λ gerj. =380 nm, λ em. = 460 nm Szubsztrát: λ gerj. =320 nm, λ em. = 480 nm 0 200 400 600 800 1000 1200 t (s) S2 sejteket kezeltünk szubsztrát oldattal (c=150 µm) 25-28 C-on, 20 órán keresztül, majd lizáltuk.
Ex vivo vizsgálatok ktaarginin-kalpasztatin A és C konjugátumok Konjugátumok hatása a hosszútávú potancializálásra (long-term synaptic potentiation, LTP) LTP-t tetanizáló stimulálással indukáltuk: hippocampus szövetekben: stimulálás intenzitása T, frekvencia 100 Hz, időtartalma 5 s, és a cortex szövetekben 2T, frekvencia 10 Hz. 2T stimulálásra adott válaszokban bekövetkező változásokat 30 perccel az LTP indukció után mértük. (* P < 0.05, ** P < 0.001) Világi I. et al. Mol. Cell. Neurosci. 2008, 38, 629-636.
Hipocampus szöveteket kezeltünk 5 percig a sejtpenetráló szubsztrát oldatával (c=50 µm), majd kalpasztatin A és C konjugátumot adtunk az elegyhez (c=5 μm) és a kezelést további 15 percig folytatuk. Piramidális sejtek régiója (üres nyilak) és más régiók (tele nyilak). Hipocampus szöveteket 5 percig kezeltünk a sejtpenetráló szubsztrát oldatával (c=50 µm).
Nem számít semmi, csak az, hogy Kérdezz! Keresd a választ! Nem fontos semmi, csak az, hogy Kérdezz! Keresd a választ! Ne higgy el mindent, de mégis Kérdezz! Keresd a választ! Bárki vagy, mindegy, a lényeg: Kérdezz! Keresd a választ! Kérdezz! Tankcsapda: Kérdezz (Connektor:567, 1997)