A RecQ helikázok funkcionális anatómiája: a szárnyas hélix és a HRDC domének szerepe a RecQ helikázok működésében Harami Gábor Doktori (PhD) értekezés tézisei Biológia Doktori Iskola Iskolavezető: Prof. Erdei Anna Szerkezeti Biokémia Program Programvezető: Prof. Nyitray László Témavezető: Dr. Kovács Mihály, tudományos főmunkatárs Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar Biológiai Intézet Biokémiai Tanszék 2015
Bevezetés Az élő sejtek genomja elkerülhetetlenül sérül, emiatt folytonos javítás alatt áll. A pontatlan javítás kerülendő, ezért a folyamatnak hatékonynak és hibamentesnek kell lennie. A RecQ helikázok családja számos élőlényben központi szerepet tölt be több DNS-hibajavítási folyamatban és azok minőségellenőrzésében. A RecQ helikáz enzimek ATP-hidrolízishez kapcsoltan képesek az egyszálú (ss) DNS-en 3-5 irányultságban haladni és a haladáshoz kapcsoltan a kettősszálú (ds) DNS szálait szétválasztani. Egyedülálló módon e helikázok képesek a különféle hibajavítási folyamatok során kialakuló, kanonikus kettősszálú DNS-nél bonyolultabb DNS-struktúrák feldolgozására is, feltehetőleg moduláris felépítésük révén. Ilyen struktúrák pl. a rekombinációs (DNS-hibajavító) folyamatok során létrejövő, többszálú, elágazást tartalmazó D-hurok vagy Holliday-kereszt szerkezetek. Minden RecQ helikáz tartalmaz egy helikáz magi régiót (2 tandem RecA homológ motordomén és egy cinkkötő domén) és számos családtag (pl. E. coli RecQ, humán Bloomszindróma helikáz (BLM)) rendelkezik a szárnyas hélix (WH) és a helikáz és RNázD-Cterminális (HRDC) járulékos DNS-kötő doménekkel. A WH domén nagyszámú DNS-kötő fehérjében szekvencia specifikus dsdns kölcsönhatások kialakításában vesz részt. Ezzel szemben a RecQ helikázok esetében a domén szerepe eltérő. A feltételezések alapján a WH domén a hatékony DNS-szálszétválasztáshoz nélkülözhetetlen toló lapát funkciót tölt be. Továbbá a WH domén ezen felül jelentősen hozzájárul az eltérő DNS szerkezetek felismeréséhez. A HRDC domén az egyes RecQ családtagok esetében eltérő erősséggel képes az ssdns-sel kölcsönhatni. A humán BLM fehérje esetében a HRDC domén képes a fehérjén belül a helikáz magi régióval is kölcsönhatni. E kölcsönhatás feltételezhetően a helikázmag működését befolyásolja. Kimutatták továbbá, hogy a HRDC domén hozzájárul a humán BLM helikáz kettős Holliday kereszt-felbontó képességéhez. A fentiek alapján e két járulékos DNS-kötő domén teszi lehetővé a RecQ helikázok számára a különböző DNS-szerkezetek feldolgozását. Nyitott kérdés azonban, hogy a komplex DNS-szerkezetek feldolgozása milyen molekuláris mechanizmus alapján történik, mi a doménfelépítés pontos szerepe, és hogy e mechanizmusok milyen módon járulnak hozzá a sejtben lezajló hibajavítási folyamatok lebonyolításához és minőségellenőrzéséhez. 2
Célkitűzés Munkánk főcéljául tűztük ki, hogy felderítsük az E. coli RecQ típusú, konzervált doménfelépítés szerepét a RecQ helikázok működésében. Célunk volt eredményeink alapján megalkotni a különféle DNS-szerkezetek feldolgozását magyarázó mechanisztikus modellt, amely kitér az egyes domének szerepére is. Továbbá laboratóriumunkban Ferenczi Veronika doktori munkájának keretében fel kívántuk deríteni a doménfelépítés DNS hibajavítási folyamatokban betöltött szerepét E. coli baktériumon végzett in vivo kísérletek segítségével. Főcélunk elérése érdekében az alábbi specifikus kérdésekre kerestük a választ: 1. Milyen módon befolyásolja a doménfelépítés az ATPáz és ssdns-transzlokációs aktivitásokat? 2. Milyen módon befolyásolja a doménfelépítés és a DNS-szubsztrát geometriája a szálszétválasztási aktivitást? 3. Milyen módon járulnak hozzá a WH és HRDC domének a komplex DNS-szerkezetek felismeréséhez és feldolgozásához? Kísérleti megközelítés Kitűzött céljaink eléréséhez az E. coli RecQ és humán BLM fehérjék működésének különböző aspektusait vizsgáltuk számos különböző in vitro egyedi és sokmolekula biofizikai módszerrel. Vizsgálatainkban fehérjemérnökséggel és rekombináns géntechnológiával előállított, izolált vad típusú, pontmutáns és doméncsonkolt fehérjekonstrukciókat használtunk. 3
Alkalmazott eljárások Az E. coli RecQ és humán BLM helikázok különböző doménfelépítésű, csonkolt fehérjekonstrukcióit kódoló DNS-konstrukciók előállítása restrikciós enzim-alapú klónozással. Az E. coli RecQ helikáz (Y555A) és E. coli SSB (G26C) pontmutáns fehérjéket kódoló DNS-konstrukciók QuikChange eljárással való létrehozása. Rekombináns fehérjék termeltetése és tisztítása affinitás- és ioncsere-kromatográfia segítségével. Preparátumok ellenőrzése SDS-PAGE eljárással. Pontmutáns SSB (ssdns-kötő) fehérje MDCC fluoreszcens festékkel való jelölése tiol oldalláncon kovalens kapcsolással. Két- vagy többszálú DNS-szubsztrátok előállítása szálpárosítással és tisztításuk ioncsere-kromatográfiával. Triptofán fluoreszcencia illetve fluoreszcencia-anizotrópia vizsgálatok (Cy3 vagy fluoreszcein festékkel jelölt DNS-molekulákkal): a fehérje-dns kölcsönhatás egyensúlyi paramétereinek meghatározása. Steady-state ATPáz aktivitásmérések PK/LDH-kapcsolt fotometrikus módszerrel. Gyorskinetikai mérések stopped-flow készülékben: ATPáz mérések MDCC-PBP (fluoreszcensen jelölt foszfátkötő fehérje) fluoreszcencia nyomon követésével; ssdns-ről történő disszociáció nyomon követése triptofán fluoreszcencia segítségével; RAD51 nukleoprotein-szálak lebontásának nyomon követése MDCC-SSB fehérjével. DNS-szálszétválasztás nyomon követése fluoreszcensen jelölt DNS-molekulák segítségével natív PAGE és denzitometriás eljárásokkal. Globális kinetikai modellezés. 4
Tézisek 1.1 A cinkkötő domén nélkülözhetetlen az ATPáz aktivitáshoz a BLM helikáz esetében, a fehérjeszerkezet stabilizálásában betöltött szerepe miatt. 1.2 A járulékos domének nem befolyásolják a BLM és RecQ helikázok ATP-vel való kölcsönhatásának erősségét ssdns jelenlétében. 1.3 A RecQ helikáz esetében a HRDC domén ssdns-kötő képessége és jelenléte kismértékben, míg a WH domén nagymértékben hozzájárul az ssdns-kötéshez, mind ATP jelenlétében, mind távollétében. A BLM fehérje estében a járulékos domének nem befolyásolják jelentősen az ssdns kötést. 1.4 A HRDC domén jelenléte csökkenti az ssdns-aktivált ATPáz aktivitás sebességét. A RecQ helikáz esetében HRDC domén ssdns-kötő képessége nem befolyásolja az ATPáz aktivitást. A WH domén sem a RecQ, sem a BLM fehérjében nem befolyásolja az ATPáz aktivitást. 1.5 A HRDC domén jelenléte az ATPáz aktivitás lassítása révén csökkenti az ssdns-en történő transzlokáció sebességét, mind a RecQ, mind a BLM helikázban. Transzlokáció során egyik járulékos domén sem befolyásolja a mechanokémiai kapcsoltságot. 1.6 A RecQ helikáz esetében a HRDC domén jenléte csökkenti a disszociáció sebességét ssdns-transzlokáció közben. A HRDC és WH domének az enzim 5 ssdns-végről történő disszociációjának sebességét mind a BLM, mind a RecQ helikáz esetében gátolják. 1.7 A RecQ helikáz esetében a HRDC domén jelenléte kismértékben csökkenti a transzlokáció processzivitását, míg a WH domén adataink alapján nélkülözhetetlen a processzív transzlokációhoz. A BLM fehérje estében a járulékos domének nem befolyásolják a transzlokáció processzivitását. 1.8 A BLM helikáz esetében a HRDC és WH domének nélkülözhetőek a RAD51 nukleoproteinszálak lebontásához. 2.1 A WH domén hozzájárul az ssdns túlnyúlás(ok)at tartalmazó dsdns-szerkezetekkel való kölcsönhatáshoz mind a BLM, mind a RecQ helikázok esetében. 5
2.2 Mind a RecQ, mind a BLM helikázok esetében a hatékony DNS-szálszétválasztáshoz nélkülözhetetlen a WH domén, de a HRDC domén nélkülözhető. 2.3 A RecQ helikáz esetében a HRDC domén ssdns-kötő képessége és a domén jelenléte is lassítja a DNS-szálszétválasztás sebességét, de a mechanokémiai kapcsoltságra a domén nincs hatással. 2.4 Mind a BLM, mind a RecQ helikáz esetében a HRDC domén (ssdns-kötő képessége révén) jelenléte szálszétválasztás közbeni megállásokat és ingázást idéz elő hajtű DNSszerkezeten. 2.5 A RecQ helikáz esetében szálszétválasztás közben a HRDC domén a leválasztott (a helikázmag által kötött haladószállal komplementer) ssdns-szállal hat kölcsön. 2.6 A HRDC domén jelenléte (és ssdns-kötő képessége a RecQ helikáz esetében) csökkenti a DNS-szálszétválasztás processzivitását. A WH domén nélkülözhetetlen a processzív DNSszálszétválasztáshoz mind a BLM, mind a RecQ helikázban. 3.1 A RecQ és BLM helikázok nagy affinitással kötnek D-hurok szerkezetekhez. A HRDC domén a kötéshez kismértékben, míg a WH domén jelentősen járul hozzá. 3.2 A HRDC domén révén a D-hurok szerkezettel mind a BLM, mind a RecQ helikáz preferenciálisan olyan konfigurációban hat kölcsön, amely lehetővé teszi a D-hurkot alkotó szálinvázió megszüntetését. A HRDC domén ssdns-kötő képességének (RecQ helikázon vizsgálva) nincs szerepe a kölcsönhatás kialakításában. 6
Összegzés In vitro biofizikai méréseink rávilágítottak, hogy mind az E. coli RecQ, mind a humán BLM helikáz a dsdns-t annak geometriájától függően egyszerű vagy komplex (ingázó) módon választja szét. Kimutattuk továbbá, hogy mindkét enzim esetében egy adott orientációjú kölcsönhatás iránti preferencia teszi lehetővé a D-hurok DNS-szerkezetek hatékony feldolgozását. Eredményeink alapján megalkottunk egy a doménfelépítés szerepét is tisztázó mechanisztikus modellt a RecQ helikázok működésére. A helikázmag önállóan képes az ssdns-en való haladásra és alacsony hatékonyságú szálszétválasztásra, amit elősegít a WH domén jelenléte. Az összetett ingázó DNS-szálszétválasztási mechanizmus a HRDC domén geometriafüggő ssdns-kötő képessége és a WH domén dsdns-kötő képessége révén jön létre. A D-hurok orientált feldolgozását a HRDC domén jelenléte teszi lehetővé. Szintén kimutattuk, hogy a HRDC domén feltehetőleg a helikázmaggal való kölcsönhatás révén lassítja DNS-en történő haladást illetve szálszétválasztást, az ATPáz aktivitás gátlása révén. Összefoglalva eredményeinket elmondható, hogy a konzervált RecQ doménfelépítés (amely mindkét vizsgált helikázban jelen van) lehetővé teszi a helikáz számára a DNS geometriájának folytonos érzékelését és a pillanatnyi DNS-geometriától függő komplex aktivitások kialakulását a DNS átalakítása közben. A WH és HRDC domének DNS-sel és a fehérje egyéb részeivel kialakított kölcsönhatásai lehetővé teszik a RecQ helikázok számára számos DNS szerkezet feldolgozását, ami Ferenczi Veronika in vivo mérései alapján elengedhetetlen a precíz DNS-hibajavításhoz. 7
Az értekezés alapjául szolgáló közlemények Harami, G. M.*, Seol, Y.*, In, J., Ferencziová, V., Martina, M., Gyimesi, M., Sarlós, K., Nagy, N. T., Sun, Y., Vellai, T., Neuman, K. C., Kovács, M. (2015) E. coli RecQ and human BLM helicase perform DNA geometry-dependent complex processing to suppress illegitimate recombination (bírálat alatt) *a szerzők egyenlő arányban járultak hozzá a munkához Harami, G. M., Nagy, N. T., Martina, M., Neuman, K. C., Kovács M. (2015) The HRDC domain of E. coli RecQ helicase controls single-stranded DNA translocation and double-stranded DNA unwinding rates without affecting mechanoenzymatic coupling. Sci Rep 5, 11091 Harami, G. M., Gyimesi, M., Kovács, M. (2013) From keys to bulldozers: expanding roles for winged helix domains in nucleic-acid-binding proteins. Trends Biochem Sci 38, 364-371 Gyimesi, M., Harami, G. M., Sarlós, K., Hazai, E., Bikádi, Z., Kovács, M. (2012) Complex activities of the human Bloom s syndrome helicase are encoded in a core region comprising the RecA and Zn-binding domains. Nucleic Acids Res 40, 3952-3963 Harami, G., Gyimesi, M., Kovács, M., (2012) A kulcstól a bulldózerig: szárnyas hélix domének funkcionális adaptációja DNS-kötő fehérjékben. Biokémia 36(2), 30-42 A dolgozat témájában született konferencia kivonatok Gyimesi, M. Sarlós, K., Harami, G., Kocsis, Zs., Kovács, M. (2010) Deciphering the mechanochemistry of RecQ-family DNA helicases. EMBO DNA Repair Meeting, Brno, Czech Republic Gyimesi, M., Harami, G., Sarlós, K., Kovács, M. (2011) Basic homologous recombination activities can be performed by the minimal core of Bloom's syndrome helicase. Central European Meeting on Genome Stability and Dynamics, Bratislava, Slovakia Gyimesi, M., Sarlós, K., Harami, G., Kocsis, Zs., Pires, R. H., Módos, K., Derényi, I., Kellermayer, M., Kovács, M. (2011) Stability and variability: genome-maintaining activities of DNA-restructuring motor enzymes. TÁMOP Meeting, Dobogókő, Hungary Harami, G., Gyimesi, M., Sarlós, K., Kovács, M. (2011) Functional anatomy of the human Bloom s syndrome helicase. FASEB Helicase Meeting, Steamboat Springs, CO, USA Gyimesi, M., Harami, G., Sarlós, K., Roy, D., Kovács, M. (2011) Bloom s syndrome helicase: functional anatomy of a DNA-restructuring motor protein. Annual Meeting of the Hungarian Biochemical Society, Pécs, Hungary Harami, G., Gyimesi, M., Sarlós, K., Kovács, M. (2011) Enzymatic processes in DNA repair: Genome maintaining activities of RecQ helicases. 4th European Conference on Chemistry for Life Sciences, Budapest, Hungary Harami, G., Gyimesi, M., Kovács, M. (2012) Mechanism of D-loop disruption by the human Bloom s syndrome helicase. 56th Annual Meeting of the Biophysical Society, San Diego, CA, USA 8
Gyimesi, M., Harami, G., Pires, R. H., Sarlós, K., Hegyi, G., Módos, K., Kellermayer, M. S., Kovács, M. (2012) Mechanism of regulation of homologous recombination by the human Bloom s syndrome helicase. FEBS3+ Meeting, Opatija, Croatia Harami, G., Gyimesi, M., Sarlós, K., Kocsis, Zs., Nagy, N. T., Ferencziová, V., Kovács, M. (2012) Kommunikációs útvonalak DNS-kötő fehérjékben: A RecQ helikázok szerepe a genomkarbantartó folyamatokban. TÁMOP Konferencia, Dobogókő Martina, M., Harami, G., Gyimesi, M., Sarlós, K., Kocsis, Z. S., Nagy, N., Neuman, K. C., Kovács, M. (2013) Dynamic interactions of RecQ helicase accessory domains modulate the processing of DNA substrates. Central European DNA Repair Meeting, Vienna, Austria Harami, G., In, J., Seol, Y., Sarlós, K., Sun, Y., Martina, M., Neuman, K. C., Kovács, M. (2014) Domain architecture of RecQ helicase defines mechanochemical linkage via multipartite interactions with DNA substrate during unwinding activity. Annual Meeting of the Biophysical Society, San Francisco, CA, USA Harami, G., In, J., Seol, Y., Sarlós, K., Sun, Y., Martina, M., Neuman, K. C., Kovács, M. (2014) Conserved domain architecture of RecQ helicase supports a complex and efficient DNA processing mechanism. Dynamic Structures in DNA Damage Responses and Cancer, Cancun, Mexico Neuman, K. C., Seol, Y., In, J., Sun, Y., M., Harami, G., Sarlós, K., Kovács, M. (2014) DNA Sequence- and Geometry-Dependent Unwinding by RecQ Helicase. Gordon Research Conference on Single Molecule Approaches to Biology, Lucca, Italy Harami, G., Martina, M., Nagy, T., In, J., Ferencziová, V., Seol, Y., Sarlós, K., Sun, Y., Neuman K. C., Kovács, M., (2015) Complex DNA-processing activities are conserved between bacterial and human genome-guarding helicases. Hungarian Molecular Life Sciences Conference, Eger, Hungary A dolgozathoz nem fűződő közlemények Kocsis, Zs., Sarlós, K., Harami, G. M., Martina, M., Kovács, M., (2014) A nucleotide-dependent and HRDC domain-dependent structural transition in DNA-bound RecQ helicase J Biol Chem 289, 5938-5949 Nagy, N. T., Chakraborty, S., Harami, G. M., Sellers, J. R., Sakamoto T., Kovács, M. (2013) A subdomain interaction at the base of the lever allosterically tunes the mechanochemical mechanism of myosin 5a. Plos One 8(5):e62640 A dolgozathoz nem fűződő konferencia kivonatok Kocsis Zs., Harami, G., Gyimesi, M., Kovács, M. (2012) Bepillantás a RecQ molekulán belüli mozgásokba. TÁMOP Konferencia, Dobogókő Kocsis, Zs., Harami, G. M., Sun, Y., In, J., Seol, Y., Sarkar, S., Strub, M-P., Sarlós, K., Neuman, K. C., Kovács, M. (2013) Domain Movements and Sequence-specific Pausing of RecQ Helicase. Hungarian Molecular Life Sciences Conference, Siófok, Hungary 9
Kocsis, Zs., Harami, G. M., Sun, Y., In, J., Seol, Y., Sarkar, S., Strub, M-P., Sarlós, K., Neuman, K. C., Kovács, M. (2013) Domain Movements and Sequence-specific Pausing of RecQ Helicase. Student Scientific Conference on Biotechnology and Biomedicine, Brno, Czech Republic Sun, Y., In, J., Seol, Y., Sarkar, S., Strub, M., Harami, G., Sarlós, K., Kovács, M., Neuman, K. C. (2013) Sequence-specific pausing of RecQ helicase. HFSP Meeting, Strasbourg, France Neuman, K. C., Seol, Y., In, J., Sun, Y., M., Harami, G., Sarlós, K., Kovács, M. (2013) DNA Sequence dependent unwinding by RecQ helicase. Telluride Workshop on Biophysical Dynamics, Telluride, CO, USA 10