Ioncsatornák Aquaporinok Neurotranszmitter/neuro -modulátor receptorok Glutamát receptorok GABA receptorok Citokin és kemokin receptorok Endotelin receptorok Komplement rendszer Purinoreceptorok Glia fiziológia I. I. Csatornák, receptorok II. Kapcsoltság, Ca ++ Kapcsoltság Glia szincícium azaz network! Gap junctions Hemichannels Asztro network térbeli/időbeli szabályozása Gliális Ca ++, Ca ++ hullámok III.Gliotranszmisszió Gliotranszmitterek Nem vezikuláris release Vezikuláris release IV. Transzporterek, egyéb glia eredetű faktorok Gliális neurotranszmitter transzporterek Glutamát transzporterek GABA transzporterek Glycin transzporterek Egyéb transzporterek Ozmolitikumok Glia eredetű neuropeptidek Glia eredetű növekedési faktorok
Glia fiziológia Glia szincícium (syncytium) Kapcsoltság 1968-69 Gerschenfeld H.M. elsők közt írta le, hogy a gliasejtek karakterisztikus sajátsága, hogy rés-kapcsolatokon át kapcsoltak - a neurotranszmitterek ezt a kapcsoltságot modulálják, neuron-asztro kommunikáció Illetve: pan-glial syncytium : asztro-odc-ependyma.. izom egy, többmagvú sejt szívizom több sejt, gap junctions recently Christian Giaume Ken McCarthy Cx43 asztro tenyészet..glial cells are not organized as a syncytium, as initially proposed, but rather as networks of communicating cells with defined spatial organization and plasticity, as their modalities of intercellular communication are controlled by endogenous signals in normal and in pathological situations..
Glia fiziológia active contribution of glia to information processing Kapcsoltság glial cells have developed mechanisms alternative to synaptic transmission that is characteristic of neurons gap junction channels (GJ) gap junctional plaques gap junction kifejezés: gap : 2-2,5 nm rés a sejtek között Connexins Cx Pannexins Panx hemichannels (HCs) Giaume, Liu 2011 http://www.cytochemistry.net/cell-biology/membrane2.htm
Glia fiziológia Gap junctions http://www.unmc.edu/biochemistry/ Paul Sorgen - két sejt közti rés csak 2-2,5 nm - connexinek (6 db) connexon - ~20 altípus (26-62 kda; pl. Cx43 43 kda) - minden connexinben 4 TM domén - homomer vagy heteromer connexonok - homocelluláris vagy heterocelluláris kapcsolat - 1,5 nm pórus: relatív nagy, akár 1 kda molekulák is átjuthatnak, Ip3, ATP, vitaminok és ionok elektromos kapcsoltság is - open - closed állapotok - hemichannels
Glia fiziológia GJ csatorna nyitását szabályozza: - nagy Ca ++ ic : permeabilitás - ph : permeabilitás - connexin foszforiláltság, diszulfid hidak.. - feszültségfüggés Gap junctions Asztroban is van Hiánya: congenital deafness Plug gating model for transjunctional voltagedependent gating of the Cx26 gap junction channel. Maeda 2011 A: ha nincs feszültségklbség a két sejt között: N-terminális hélixek (NTH) az 1 TM régióhoz simulnak hidrofób módon B: pozitív elektromos mező kihúzza az Asp2-t (ez negatív töltésű-), NTH a pórusba kerül, dugót képez.
humán postmortem HC minták MDD és kontroll betegekből (post mortem) génexpr. study - downregulation of GJ gene expr. Cx43 point mutation (Cx43G138R) in radial glia like cells - proliferative activity and neurogenesis were significantly decreased.. we show that knockout of the gap junction subunit connexin 43 in astrocytes throughout the brain causes excessive sleepiness and fragmented wakefulness during the nocturnal active phase..!
Glia fiziológia Connexinek - Pannexinek Kapcsoltság PanX - gerinctelen innexinekkel homológok így azonosítják őket - tulképp nagy transzmembrán csatornák: csak hemichannel-t képeznek Asztro: - PanX: van (több in vitro adat) - Connexin: főleg: Cx43, Cx30, kevesebb: Cx26, Cx40, Cx45 - Cx43 embrionális kortól, Cx30-2. posztnat héttől csak szürkeállományban Mikroglia: - aktivációra Cx43, illetve Panx1, Cx32 Neuronok: - Cx26, Cx32, Cx36, Cx37, Cx40, Cx43, Cx45, Cx47 illetve Cx43 és Cx32 is jelen lehet - Cx36 csak neuronokban! Schwann sejt - myelináló sejt: Cx32 - éretlen Schwann: Cx46 NG2 glia: - nem kapcsolt (nincs erre jelenleg adat) - Panx1 is jelen van több neuronális populációban és PSD95-tel kolokalizál: szinaptikus funkcióban is szerepe lehet, szintje már születés környékén magas - Panx2 is jelen van neuronokban, főleg felnőttben Giaume, Liu 2011
Glia fiziológia Kapcsoltság Astrocyte astrocyte (A/A) coupling pan-glial network - Cx30 és Cx43 kolokalizál asztro GJ plakkokban - variációk: Cx30/Cx30, Cx43/Cx30, and Cx43/Cx43 - eddigi elfiz adatok: kolokalizáció ellenére inkább homotipikus GJ valószínű (nagyobb festékterjedés, ha csak Cx30-at vagy Cx43-at expresszáltatnak pl. HeLa sejtekkel) Astrocyte oligodendrocyte (A/O) coupling Lásd még: 3. előadás! - GJ-t sokkal inkább a szomszédos asztrokkal képeznek, mint más ODC-kal - A/O kapcsolat heterotipikus kell legyen, mert ODC-k más Cx-ket expresszálnak, mint asztrok: Cx29, Cx32, Cx45, Cx47 Oligodendrocyte oligodendrocyte (O/O) coupling - újabban van csak néhány adat O/O GKJ kapcsolatra (corpus callosumban) - Cx32 és Cx47 vesz részt ezekben az O/O kacsolatokban Neuron-glia coupling - kevés bizonyíték van neuron-glia GJ kapcsoltságra - neuron-neuron inkább? Neuronális kapcsoltság nő, ha neuron sérül! Giaume, Liu 2011 Orthmann-Murphy 2008
Glia fiziológia Kapcsoltság - átlagosan egy asztro-pár a szürkeállományban 230 GJ-vel kapcsolt: magas fokú kapcsoltság!! 300 um slice - Lucifer yellow, Alexa dyes (~450 kda), biocitin: 1 asztroba injektálva 50-100 szomszédos asztro jelölődik - kapcsoltság mértéke agyterületenként nagyon eltér: cortexben szinte teljes kapcsoltság (~100%); látóidegben 80%, HC-ban csak 50%, corpus callosumban szinte semmi 50 um slice Astrocytic coupling in the neocortex and in the corpus callosum. Biocytin. GFAP-GFP mice
Glia fiziológia Kapcsoltság P11 egér Sulforhodamine B Asztro biocitin jelölése cortexben Asztro azonosítás morfológia/elfiz alapján Houade, Giaume 2006
P11 egér, Asztro biocytin jelölése HC-ban, CA1 Glia fiziológia Kapcsoltság A1,A2: stratum radiatum közepén - koncentrikus B1 C2: stratum radiatum közel a piramissejt-réteghez : ekkor 2 féle jelölés B1,B2: biocytin jelölés megáll a pirmissejt-rétegben C1,C2: biocytin megjelöl asztrokat a stratum oriens-ben is - asztrociták a CA1-ben jobban (dye- coupled) kapcsoltak, mint CA3-ban - ennek funkcionális jelentősége még?? - de: CA1 kevés kapilláris CA3-hoz képest: metabolikus szignálok jobban terjedhetnek a kevésbé vaszkularizált területeken így?? Houade, Giaume 2006
Glia fiziológia Kapcsoltság barrel cortex: szomatoszenzoros kéreg IV. réteg http://www.bacofun.medizin.uni-mainz.de/102.php
Kapcsoltság Such anatomofunctional organization offers an ideal model to study how astrocytic networks are organized in reference to neuronal compartments A: akut szelet, infravörös megvilágítás B: morfológia és méret alapján kiválasztott asztro egy patch pipetta végén C, D: biocytin immunfestés, P5 és P10 E: carbenoxolone (100M) F: biocytin+ sejtek számolása: P5- P10 közt nagy váltás
Kapcsoltság A C: Barrel cortex, már P6-nál több a Cx43 a barrelekben. Diffúz, stellate pattern. D-E: Cx43 koronális és tangenciális metszeten, P10 F, G, Cx43 koronális metszeteken a barreleken belüli és azokon kívüli területeken, P20 H: Cx30 tangenciális metszeten, P20 I K: Cx43 és Cx30 fenőttben megmarad. Houades 2008
Kapcsoltság A1-A2: festékterjedés 20 perccel sulphorodamin beadása után, barrelen belüli asztrociták közt B1-B2, festékterjedés 20 perccel sulphorodamin beadása után, barrelek közti septumban levő asztrociták közt Houades 2008 P10, biocytin és sulforhodamine B-vel kapott kapcsoltság nagyon más!!! : kapcsoltsági csoportok mérete: Biocytin: 73 +-17 és SB:15+-1 astrocytic networks parallel the columnar compartmentalization of neurons in the somatosensory cortex Houades 2008
Kapcsoltság - Cx43 KO ellenére anatómiailag normál barrel struktúra - de in vivo elektrofiziológia szerint a vibrisszákon nagy frekvenciával, ritmikus stimulálással (100 Hz, 1s) kiváltott LTP válaszok eltűntek a Cx43 KO egérben - viselkedési vizsgálatok szerint a bajusszőrök általi környezet-érzékelés képessége romlott (de nem tűnt el)
Kapcsoltság - asztrok kapcsoltak glomerulusokon belül, de glomerulusok között nem - KO egerek: Cx30 végzi itt a kapcsolást bár Cx43 is van
Glia fiziológia Asztro network térbeli/időbeli szabályozásának szintjei milyen connexint expresszálnak Cx kipakolódás/visszavétel szabályozása Cx kompatibilitás (homo/heterotipikus kapcs) csatorna szelektivitása (tradicionálisan poorly selective channels de a dye spreading nem azonos biomolekulák átjutásával!! ) csatorna feszültség-függése GJ nyitottság szabályozása: neuronális aktivitás, más agyi sejtek által termelt faktorok, glia-aktiváció : neurotranszmitterek, endotelinek (gátlás!), citokinek Giaume, Liu 2011! Cx43 átengedi: Kapcsoltság - camp, InsP3 - Ca ++ - AS: glutamate, aspartate and taurine - nukleotidok: ADP, ATP, CTP, NAD - energia-metabolitok: glucose, glucose-6-phosphate and lactate - kis peptidek pl. glutathione - RNS Cx30 átengedi: - kevesebb info, eddig: -ATP, InsP3, aspartate, glutamate, glucose and lactate - selective for cations over anions Cx30/Cx30 és Cx43/Cx43 és Cx30/Cx43 csatornák is feszültségfüggőek (konduktanciájuk a transzmembrán feszültségtől függ) - sejtek izolálhatják magukat pl. sérült sejtektől
Glia fiziológia I. Csatornák, receptorok Kapcsoltság, Ca ++ Ioncsatornák Kapcsoltság Aquaporinok Glia szincícium Gliotranszmisszió Gliotranszmitterek Nem vezikuláris release Vezikuláris release Neurotransz mitter/neuro modulátor receptorok Glutamát receptorok GABA receptorok Citokin és kemokin receptorok Endotelin receptorok Komplement rendszer Purinoreceptorok Gap junctions Hemichannels Asztro network térbeli/időbeli szabályozása Gliális Ca ++, Ca ++ hullámok Transzporterek, egyéb glia eredetű faktorok Gliális neurotranszmitter transzporterek Glutamát transzporterek GABA transzporterek Glycin transzporterek Egyéb transzporterek Ozmolitikumok Glia eredetű neuropeptidek Glia eredetű növekedési faktorok
Ca ++ szignalizáció nagyon általános, rengeteg minden szabályozza ic Ca ++ szintet: térben/időben nagyfokú szabályozottság kell! Ca ++ Glia fiziológia szabad Ca ++ kevés a sejtben! 100 nm NMDA rec! LTP...
Ca ++ homeosztázis fő útvonalai/komponensei Verkhratsky Butt 2007 2.a 1.c 2.b 3.a 1.a 1.b * 1.d 3.c campdependent pathways??? excess Ca++ removal Glia fiziológia Ca ++ Store operated Ca ++ channel (SOOC) vagy capacitative Ca ++ entry ic Ca ++ raktár kiürülése Ca ++ influxot indukál. Más néven: Orai channels (in humans it is encoded by the 4. ORAI1 gene) NCX Na + /Ca 2+ exchanger; PMCA Plasmalemmal Calcium ATP-ase; Ca 2+ BP Ca 2+ binding proteins; InsP3R Inositol-1,4,5-trisphosphate Receptor/Inositol-1,4,5-trisphosphate-gated Ca 2+ channel; RyR Ryanodine Receptors/Ca 2+ -gated Ca 2+ channel; SERCA Sarco(Endo)plasmic Reticulum Calcium ATPase. Intra-ER Ca 2+ binding proteins also act as Ca 2+ dependent chaperones, which are enzymes controlling protein folding into the tertiary structure. PTP permeability transition pore (fiziológiásan zárva, patológiás esetben nyitva) 3.d 3.b 3.e *!
1.b 1.a 2.a 2.c 2.b 3.a 3.b 1.e 2.d 3.c 2.e 1.c 1.d 2.f 3.d 3.e Endoszóma: TRPML: transient receptor potential ion channels: proton leak channels e.g. TRPML1 in lysosomes responsible for preventing these organelles from becoming too acidic TRPM2 gene is highly expressed in the brain: plays role in activation of NLRP3 inflammasome TPC: Two-pore channels are a small family of cation-selective ion channels, P2X4: ATP-gated nonselective cation channel highly permeable to calcium Mitokondrium: MCU: mitochondrial calcium uniporter, a highly selective ion channel, regulates mitochondrial Ca 2+ uptake NCLX: the mitochondrial sodium calcium exchanger Plazma-membrán: TRP: Transient receptor potential channels ion channels located mostly on the plasma membrane, relatively nonselectively permeable to cations
* Calcium-induced Ca ++ release koffein! ic Ca ++ koncentráció : RyR2, RyR3 receptorokat (csak ez a szignál!) aktiválja: ER-ból is Ca ++ release citoszolba * Depolarization-induced Ca ++ release Depolarizáció RyR1 receptor-aktiváció * InsP3-induced Ca ++ release ha ic Ca ++ : InsP3-Rec érzékenysége nő InsP3-ra * Ca ++ spark, puff egyetlen RyR vagy Insp3R nyitása miatt bekövetkező citoszolikus Ca ++ és ez továbbadódhat: * propagating intracelllular Ca ++ wave * Ca ++ excitotoxicity ha túl sokáig magas az ic Ca ++ gliában ez a fő útvonal Glia fiziológia DE: gliában RyR szerepe Ca ++ signalingban kicsi vagy semmi!! Ca ++ RyR és InsP3 Ca ++ érzékenysége miatt alakulhat ki ez a tovaterjedő Ca ++ hullám nem maga a Ca ++ ion terjed tova, hiszen ez azonnal kikötődik Ca ++ kötő fehérjékhez hanem újabb és újabb Ca ++ efflux történik!
- Ca ++ influx érett gliába: főleg ligand-gated csatornákon: ionotróp glutamát receptor, P2X purinoreceptor Glia fiziológia Ca ++ - metabotrop receptorok Ca ++ hullám indításában fontosak intracelllular metabotrop receptorok InsP3 InsP3Rec aktiváció ER magas Ca ++ szint tovább fennmarad, mint maga a stimulus ER kimerül Ca ++ influx (SOOC) ER-ből Ca ++ release citoszolba - ez lehet egyszeri (peak), több száz mp-ig tartó Ca ++ plateau - vagy ismétlődő oszcilláció!! - glia neuron közti különbség: gliasejtekben ritka a feszültségfüggő Ca ++ csatorna: legtöbb érett gliában (asztro, ODG, Schwann) nincs, progenitorokban van éréskor eltűnik - másik különbség: glia ER-ben a Ca ++ konc.:100-300 um (neuronban: 300-800uM)
Glia fiziológia Ca ++ waves Spontán calcium oszcillációk asztrocitákban. Hippocampus, CA1. A: Calcium Green AM B: GFAP/S100 immunostaining. C: overlay D: average fluorescence intensities from boxes 1 5 normalized to baseline level, and plotted over time. Four of the 5 cells exhibited spontaneous calcium oscillations and all cells responded to tacpd (mglur agonist) application with a calcium increase. s.r., stratum radiatum; s.p., stratum pyramidale
Glia fiziológia Ca ++ waves Ca ++ oszcillációk HC asztro nyúlványaiban Oregon Green BAPTA-1 töltés A: regions of interest (ROI) B: a 4 nyúlvány elég különböző Ca ++ jeleket ad C. II. csoport kinagyítva: Ca ++ ROIs 9-10 területén kezdődött, innen ic. calcium hullám halad végig a nyúlványon Nett 2002
Asztroglia monolayer in vitro
propagating intercelllular Ca ++ wave Glia fiziológia Ca ++ calcium hullám átugrik a sejtmentes sávon Ca ++ hullám a stimulált sejt körül ATP Ca ++ hullám amit a perfúzió eltérít Hassinger 1996 InsP3
propagating intercelllular Ca ++ wave fenntartása: Glia fiziológia Ca ++ waves A: intracell InsP3 diffúzió B: regeneratív Ca ++ - függő gliotransmitter release és extracell diffúzió C: fokális gliotranszmitter release, mely nagy távolságra diffundál (több száz um-re is, ~15-20 um/sec) Asztrocitahálózatok az agy klb területein máshogy szabályozódnak: Pl. Cx43 KO esetén kéregben nincs hullám de HC-ban megmarad Neuronális akciós potenciál: ms Asztro Ca ++ hullám: sec-min!
Glia fiziológia Ca++ waves Nucleus accumbens, Patkány agyszelet Fluo-4AM töltött sejtek, ATP hatás Molnár, Kardos 2011
Na de mire jók ezek a Ca ++ hullámok?
Intercelluláris Ca ++ hullámok : - ahol kimutatták: - in vitro - in vivo a fejlődő agyban - specializált szövetekben (pl. retina) - patológiás esetekben (pl. Alzheimer kór, epilepszia) - de normál felnőtt agyban, in vivo :??? sokáig nem tudták kimutatni in vivo a tovaterjedő intercelluláris gliális Ca++ hullámokat
- genetically encoded calcium indikátorok (G-CaMP) - Bergmann gliában spontán Ca++ hullámok transzgliális Ca++ hullámok - melyek P2-receptor antagonistákkal blokkolhatóak és - melyeket ATP adásával ki lehet váltani Please check: https://www.youtube.com/watch?v=_cbfwon2myq - egér hippocampus több száz asztrocitájának monitorozása, in vivo - minden asztro részt vesz regeneratív, sejtről sejtre terjedő hullám kialakításában: glissandi - glissandi függ a neuronális aktivitástól és glissandi alatt csökken a vörösvértest-áramlás - alacsony lézerintenzitások mellett látható csak mindez!!! glissando: https://www.youtube.com/watch?v=qphxz3lk2pe
- glia Ca++ hullám: szignálterjedés glia neuronok erek között - spontán Ca++ hullámok 20x gyakoribbak öreg állatokban, mint felnőttben és - ez korrelál a nyugvó agyi oxigén tenzióval - felnőtt állatban a nyugvó agyi oxigén tenzió növelése növelte a gliális Ca++ hullámok gyakoriságát - ATP által kiváltott hullámok csökkentették a szöveti oxigén tenziót - Purkinje sejtek aktivitása nem okozott megnövekedett gliális Ca++ hullám gyakoriságot - ugyanakkor a spontán glia Ca++ aktivitás befolyásolta a neuronok ic. Ca++ aktivitását
Glia fiziológia I. Csatornák, receptorok Kapcsoltság, Ca ++ Ioncsatornák Kapcsoltság Aquaporinok Glia szincícium Gliotranszmisszió Gliotranszmitterek Nem vezikuláris release Vezikuláris release Neurotransz mitter/neuro modulátor receptorok Glutamát receptorok GABA receptorok Citokin és kemokin receptorok Endotelin receptorok Komplement rendszer Purinoreceptorok Gap junctions Hemichannels Asztro network térbeli/időbeli szabályozása Gliális Ca ++, Ca ++ hullámok Transzporterek, egyéb glia eredetű faktorok Gliális neurotranszmitter transzporterek Glutamát transzporterek GABA transzporterek Glycin transzporterek Egyéb transzporterek Ozmolitikumok Glia eredetű neuropeptidek Glia eredetű növekedési faktorok
Volterra, Meldolesi 2005 Glia fiziológia Gliotranszmitterek Asztrocitákban!
Nem vezikuláris release Glia fiziológia Gliotranszmitterek I. II. Hemichannels Glu, Asp, ATP release P2X7 purinoreceptorok nagy pórus ATP release patológiás esetekben, ha extracell ATP szint magas III. Volume-activated anion channels glutamát és taurin ürülése; hipozmotikus körülmények közötti asztro swelling hatására nyílnak Pl.: pituicitákból taurin release, ez VP/OT neuronok glicinreceptoraival kerül kapcsolatba: VP/OT release: a test ozmotikus homeosztázisának szabályozása IV. Transzporterek megfordulása pl. Glu release asztroból csak patológiás esetekben
Glia fiziológia Gliotranszmitterek Vezikuláris release (exocitózis) - lokális!! Ca ++ indukálja a plazmamembrán/vezikula fúziót - vezikuláris Ca ++ szenzor: synaptotagmin I - vezikuláris még: synaptobrevin II - plazmamembrán: syntaxin, SNAP25 - ezek alkotják együtt a SNARE komplexet - asztroban minden komponens jelen van - VGLUT is van asztroban - szinaptikus-szerű mikrovezikulák... stb, persze sokkal komplexebb...
ELMI: szinaptikus-szerű mikrovezikulák (SLMVs) asztrocitában (hippocampus) Gliotranszmitterek Vezikuláris release (exocitózis) méretre és formára is hasonlítanak a szinaptikus vezikulákhoz Volterra, Meldolesi 2005
Glia fiziológia Gliotranszmitterek Vezikuláris release (exocitózis) Asztro glutamát release-t stimulálhatják: - P2YR, mglur, bradykinin, BDNF receptor aktiváció - Ca ++ kelátorok (pl. BAPTA-AM) teljesen gátolják - neuron: feszültségfüggő Ca ++ influx: gyors - glia: Ca ++ belső raktárakból: lassú, de hosszan tartó Asztro szekretálhat D-serine-t is, ez speciális gliotranszmitter, glia gyártja L- serin-ből racemase enzim révén: NMDAR glycin kötő-helyeit stimulálja Asztro/neuron kommunikáció! - HC asztrocitákban speciális exocitózis: kiss and run exocitózis: vezikula rövid ideig (~2 ms) nyit, aztán zár nem ürül ki teljes tartalma!
Gliotranszmitterek Glutamát exocitózis asztrocitákból TIRF mikroszkópia 2004 Bezzi, Paola [Ca ++ ] ic hatására FM-64 kiürül a vezikulumokból VGLUT EGFP TIRF FM-64 festék együtt Volterra, Meldolesi 2005
video astrocytes expressing the fluorescent synaptobrevin 2 derivative, synapto-phluorin
glutamaterg neuron tüzel glia mglur aktiválódik glia Ca++ szint nő ez kiváltható így is: photolysis of caged Ca++ glia erre Glutamátot ürít! gliából kiszabaduló Glutamát neuronokat aktivál neuronális epileptikus aktivitás http://www.rikenresearch.riken.jp/eng/research/7018