Paraît. Huna. 4. 87-%. 1971 A parazitológia modern vizsgáló eljárásai * Dr. ISEMESÉRI László Országos Állategészségügyi Intézet, Budapest Az utóbbi időben a parazitológiai kutatások mind volumenben, mind minőségben nagymértékben előrehaladtak, s ebben jelentős szerepe volt az uj technikai eszközök és az uj metodikai eljárások alkalmazásának. A hazai parazitológia területén is születtek ugyan komoly eredmények, ha azonban a külföldi intézmények kutatási eredményeit összevetjük a hazai eredményekkel, akkor komoly lemaradást állapithatunk meg. A fejlett nemzetközi színvonalhoz viszonyítva ez a lemaradás a parazitológia egyes ágazataiban 10-15 évre is becsülhető. A tudományos-technikai forradalom korában a korszerűség igényei t kielégíteni akaró tudományos vizsgálatok és ezen belül a parazitológiai kutatások is igen széles körüekké és komplikáltakká váltak. A teljességre való törekvés nélkül szeretnék a következőkben néhány olyan modern vizsgáló eljárást ismertetni, amelyet a külföldi parazitológiai intézményekben már kiterjedten használnak, alkalmazásukra azonban hazánkban csak a jövőben kerülhet sor. Általánosságban megemlítem, hogy ezek a korszerű vizsgáló eljárások olyan igényesebb feladatok megoldásával foglalkoznak, amelyek speciális szakmai tudást és különleges technikai felszerelést, műszerezettséget követelnek meg. A vizsgáx A Magyar Parazitológusok Társaságának 1970. október 2-i, miskolci ankétján elhangzott előadás alapján.
latok nemcsak a szakemberektől, hanem az asszisztenciától is nagy pontosságot, lelkiismeretességet és szaktudást igényelnek. 1. Először az elektronmikroszkópiával foglalkozom. Az elektronmikroszkóp a közönséges mikroszkóphoz hasonlóan főleg a közeli kis tárgyak nagyított képének előállítására szolgál.mig a közönséges mikroszkóp nagyitása legfeljebb 2500-szoros, addig az e- lektronmikro3zkóp nagyitása a 150 000-szerest is elérheti.az e- lektronmikroszkóp képalkotásának elve hasonlít a fénymikroszkópéhoz, de a fényforrást elektronágyu helyettesíti. Kezdetben az elektronmikroszkópot főleg szerkezeti analízisekre használták. A biológiai objektumok vizsgálatát nagymértékben hátráltatta, hogy nem tudtak elég vékony metszeteket késziteni. A biológiai alkalmazás akkor lendült fel, amikor feltalálták az ultramikrotómot, amellyel megfelelő vékonyságú metszetek készíthetők. Beágyazó szernek jól beváltak a műanyagok, a metszetek egyenletes elkészítését korszerűsítették az üveg- és gyémántkések. Ujabban sikerrel alkalmaznak különböző hisztokémiai módszereket elektronmikroszkópos vizsgálatok céljára. Az elektronmikroszkópnak hátránya, hogy élő objektum vizsgálatára nem alkalmas a légritkított tér és az erős elektronsugárzás miatt, amely minden élőlényt azonnal elpusztit. Napjainkban az elektronmikroszkópos vizsgálatok széles területre terjednek ki. Nemcsak az igen apró kórokozókban (a baktériumokban és a virusokban) fednek fel meglepő szerkezetet, hanem az állati sejtek, igy a paraziták felépítése is uj világot tár fel. Az ultrastrukturális hisztokémia és hisztoenzimológia alkalmazása lehetővé teszi, hogy a sejtfunkciók mechanizmusába, valamint a gazdaszervezet és a parazita közötti kapcsolat analízisébe mélyebben behatoljunk. Bár az elektronmikroszkópiát csak nemrégen alkalmazzák a parazitológiai kutatásokban, már eddig is jelentős lépéssel vitte előre a véglények és a férgek szerkezetére vonatkozó ismereteinket. Sok, korábban feltétele-
zett strukturális elemet láthatóvá tett, ami lehetőséget nyújtott fiziológiai jellegű ismeretek megszerzésére, és több vitatott morfológiai problémát is megoldott. Az elektronmikroszkópia nagyban hozzájárult pl. a laposférgek köztakarójának megismeréséhez.ezek a férgek ugyanis - ellentétben az eddigi felfogással - nem egyszerű kutikulával, hanem aktiv epidermisszel vannak boritva, amely résztvesz a férgek táplálkozási folyamataiban. A galandférgekben a köztakaró felszínén papillákhoz hasonló mikro-bolyhokat, továbbá pórusokat mutattak k i, amelyekből szubkutikuláris csatornáéskák vezetnek a parenchyma-szövetbe. A hámsejtekben mitochondrium és enzim jelenlétét észlelték; ezek a képződmények lehetővé teszik az e- mésztőcsatorna nélküli férgek táplálkozásának jobb megértését. Bár a mételyeknek van emésztőké szülekük, a tápanyagok felszívása - a nyelőcső lekötésével végzett kísérletek tanúsága szerint - nagyrészt a köztakarón át történik. Az epidermis sérülése tehát a mételyekre végzetes lehet; ilyen károsodást okoz,igy hat pl. a hexaklorofén a májmételyre. A fonálférgek esetén a kutikula nem vesz részt a tápanyag felszívásában. A fonálférgek emésztőcsovének szerkezete és funkciója nagy hasonlóságot mutat a magasabb rendű állatok emésztési folyamataihoz. A véglények elektronmikroszkópos vizsgálata során kiderítették, hogy jóval bonyolultabb szerkezettel rendelkeznek, mint amit a fénymikroszkóp mutat. A sarcosporidiumokon, a Toxoplasma gondiin végzett vizsgálatokkal e véglények elhegyesedő végén egy csonkakup alakú képződményt mutattak ki, amely egy poláris gyűrűbe folytatódik. Hasonló alakzatokat irtak le a plasmodiumokban és a piroplasmákban is. Ezeknek feltételezhetően az a szerepük, hogy fehérjeoldó enzim termelése révén a parazitáknak a gazdaszervezet sejtjeibe történő behatolását elősegitsék. Megállapították továbbá, hogy a toxoplasmosis esetén képződő cysták fala parazitás eredetű és nem a gazdaszervezet által termelt anyag. Számos elektronmikroszkópos vizsgálatot végeztek a coccidiumok morfológiájára, biokémiájára, fejlődésmenetére stb. vonatkozó-
an. Ezek eredményeként több faj fejlődésmenete, továbbá a sporozoiták, schizonták, merozoiták, mikro- és makrogamonták és gameták finomabb struktúrája jórészt ismeretessé vált. Megállaoitották továbbá, hogy a sejtbe hatolt coccidium a gazdasejt által alakított vacuolumban fekszik, és ez kitágulva az egész endogén fejlődés alatt változó alakban megtalálható a parazita körül. 2. A továbbiak során a radioaktiv izotópok diagnosztikai alkalmazásának alapelveivel szeretnék foglalkozni. A modern atomfizikai kutatások eredményeként előállított izotópok kutatási, diagnosztikai és terápiai alkalmazásában nagy lehetőségek rejlenek. Mig az orvosi kutatásokban és a rutinmunkában is az izotópok alkalmazása már régebben elterjedt, addig az állatorvosi munkaterületen az izotópok csak később kerültek felhasználásra. Manapság már az állatorvosi szaktudományokban, igy a parazitológiában is, egyre több országban veszik igénybe a sugárzó izotópokat. A különböző tömegszámú, de azonos rendszámú atomokat izotópoknak nevezzük. A természetben előforduló legtöbb izotóp stabil i s. Ismerünk viszont olyan elemeket, amelyek magja spontán, külső hatás nélkül különböző sugárféleségek kibocsátása közben szétbomlik. -izt a jelenséget természetes radioaktivitásnak nevezzük. Urániumreaktorban vagy ciklotronban végzett különleges eljárások során az atomok stabilis magja radioaktívvá alakitható át; ezek a magok azután sugárzások kibocsátása közben szétesnek. A sugárzás állhat OC -ré szecskékből, (o-ré szecskákból vagy ^-sugarakból. A radioaktivitás nemzetközi egysége a curie. A radioaktivitás mérésére különféle számlálókészülékek szolgálnak, amelyeknek nagy része a leadott sugárzás ionizáló hatása alapján működik. Ilyen eszköz pl. a Geiger-Müller számlálócső, vagy a szcintillációs detektor. A radioaktiv készitmény lehet un. zárt, valamint nyitott prepa-
rátum. A kereslet a preparátumok iránt manapság oly nagy, hogy azokat világszerte iparszerüen, nagy mennyiségben állitják elő. A jelzett preparátumok speciális izotópintázetekből szerezhetők be, természetesen csak azok az intézmények,amelyek működési engedéllyel rendelkeznek. A radioaktiv izotópok jelentősége abban rejlik, hogy a különféle kémiai reakciókban az élő szervezetben ugyanúgy viselkednek, mint az azonos elemek stabilis izotópjai. A jelzett atomokat tartalmazó vegyületek sorsa a szervezetben a radioaktivitás mérése utján aránylag könnyen kisérhető, nyomon követhető. A sokrétű diagnosztikai felhasználás modelljének tekinthető a radioaktiv jód felhasználása az emberi pajzsmirigy-diagnosztikában. A radioaktiv izotópok felhasználásával daganatokat lehet lokalizálni, meghatározható a vér mennyisége, jelzett molekulákkal *, 59 vesefunkcio-vizsgalatot lehet végezni, jelzett Fe-vel a vasháztartás viszonyai vizsgálhatók. Minthogy számos vegyület jelezhető "^C-vel, megvan a lehetősége a fehérje-, zsir- és szénhidrát-háztartás viszonyainak, továbbá különféle takarmányok összetevőinek az anyagcserére való hatásának tanulmányozására. Jelzett molekulákat tartalmazó gyógyszerek, pl. antiparazitikumok adagolásával megállapítható, hogy a szervezet mely részébe jut és milyen átalakuláson megy át a gyógyszer. A parazitológia területén eddig főként a férgek élettanának és táplálkozásának tanulmányozására alkalmazták a radioaktiv izotópokat, éspedig az 5 9 Fe, 5 1 Cr, 3 2 P, 1 3 1 J stb. elemet. A j e l zett preparátumot a gazdaszervezetnek parenterálisan vagy per os adják, majd bizonyos idő elteltével az állatot kiirtják, a parazitákat összegyűjtik és radioaktivitásukat megmérik. A radioaktiv izotópok elhelyezkedése és az egyes szövetek által k i bocsátott sugárzás intenzitása alapján következtetnek a vizsgált anyagcsere-folyamatokra. Ismeretes, hogy sokan kételkedtek a májmétely vérszivásában. A radioaktiv izotópokkal végzett vizsgálatok kétségtelenül igazolták, hogy a májmétely haematophag parazita. A májmétely által okozott vérveszteséget a kutatók mételyegyedénként és na-
ponként 0,2 ml-ben állapították meg. A májmételykór esetén keletkező vérveszteség természetesen nagyobb, mint amennyi vért a mételyek felvesznek, figyelembe kell ugyanis venni azokat a k i sebb vérzéseket is, amelyek a májmételyek megtelepedésekor ke- 51 letkeznek. Ennek értelmében az Cr-rel végzett vizsgalatok a- lapján az összes vérveszteséget 0,5 ml-re becsülik. mételyegyedenként és naponként Kutyákban jelzett vörös vérsejtekkel vizsgálták az ancylostomatosis okozta vérveszteséget. Megállapították, hogy a vérveszteség a fertőzést követő 8. napon kezdődik és a 15. napon éri el a tetőfokát. A féreg az ivarérés előtt válik haematophaggá. Ekkor a vérveszteség naponta féregegyedenként kb. 2 ml, ezután a 20. napig csökken, majd a kopuláció idején újra emelkedni kezd. A Haemonchus contortus vérszívásával kapcsolatosan megállapították, hogy a haematophagia főként a parazita ivaréretté válásának és szaporodásának időszakára esik. Az átlagos vérveszteség naponként és féregegyedenként 0,05 ml. Lúd amidostomosisa esetén a vérveszteség a prepatens periódusban nagyobb, mint a patens szakban. Közepes fokú fertőzöttség esetén a vérveszteség a 8. napon féregegyedenként kb. 450 mg, a 12. napon 380 mg. A véglényeken radioaktiv izotópokkal végzett vizsgálatok adatokat szolgáltattak a plasmodiumok és a trypanosomák anyagcseréjére, valamint az ellenük használt gyógyszerek hatásmechanizmusára. 3. Végezetül a férgek in vitro tenyésztési eljárásával foglalkozom. A szövettenyésztés a biológiai tudományok területén egyre inkább elterjedő eljárás. Korábban a viruskutatásban vették i - génybe, de ma már a biológia egyre több ágazatában alkalmazzák, ami azt is jelenti, hogy az egyes tudományágak saját céljaikra speciális tenyésztési eljárásokat dolgoznak ki. A legutóbbi é- vekbena szövettenyésztési eljárás nagymértékben tökéletesedett, és lehetőségei is mindinkább bővültek.
A férgek természetéből adódik, hogy fejlődésük nem történhet é- lettelen táptalajon, csupán fogékony állatban vagy - ujabb ismeretek szerint - különleges kultúrákban. A parazitikus férgek gazdájukon kívüli, in vitro tenyésztésével manapság külföldön több laboratóriumban foglalkoznak, és kutatják a férgek in v i t ro fejlődéséhez leginkább kedvező közeget,az ozmotikus nyomást, az ideális elektrolit-összetételt, az optimális hőmérsékletet, a ph-értéket stb. Több fonálféregfaj esetén sikerült eddig valamennyi parazitikus fejlődési stádiumot in vitro kitenyészteni, szaporodást azonban csak néhány esetben sikerült elérni, a fejlődési ciklus ugyanis a legtöbbször terméketlen peték lerakásával ért véget. A férgek in vitro tenyésztése a parazitológia egyes terület-ein uj korszak bevezetését jelenti. A paraziták folytatólagos tor vábbfejlesztése ismert összeállítású közegben, más élő szervezet jelenléte nélkül, ideális lehetőséget nyújt az anyagcserevizsgálatokra, valamint uj lárvicid anthelmintikumok felfedezésére és tesztelésére. Az in vitro kultúrák által hozzá lehet jutni a paraziták különleges exkrétumaihoz és szekrétumaihoz, amelyeknek patogén és immunizáló jelentőséget tulajdonítanak, továbbá lehetővé teszik a helmintózisok elleni vakcinák előállítását. A tenyésztett lárvák számára a tápfolyadék jelenti a közvetlen környezetet, tehát biztosítania kell a lárvák életéhez és szaporodásához szükséges tápanyagokat, az ideális fizikai és kémiai viszonyokat, ugyanakkor ide kerülnek az anyagcseretermékek is. A tenyésztés szempontjából tehát a tápoldat döntő fontosságú. A különböző lárvák tápigénye eltérő, ezért a tenyésztésükhöz más és más összetételű tápoldatot kell használni. A tápfolyadék általában 3 alkotórészből áll: vérsavóból, szaporodást serkentő anyagból (szövetkivonatból, egyéb biológiai eredetű a- nyagból) és higitófolyadékból, Sok esetben különféle egyéb a- nyaggal kell dúsítani a tápfolyadékot. Az in vitro tenyésztés eredményessége szempontjából nem elegendő, hogy jó táptalajokkal rendelkezzünk, hanem az is szükséges,
bogy a táptalajokba a tenyésztett féregfajnak a megfelelő fejlődési stádiumban levő életképes alakjait helyezzük. A bélsártenyészetből izolált 3. stádiumu fonálféreglárvákat fiziológiai konyhasóoldatban többször át kell mosni és a felhasználásig tápfolyadékba helyezve tárolni. A baktériumok és a gombák elpusztítása végett a lárvákat előzetesen különféle oldatokkal kell kezelni. A kultúrák kémcsövekben vagy nagyobb felületű palackokban készíthetők. A kémcsövekbe általában néhány ml tápanyagot és kb. 500 lárvát szoktak mérni. A tápfolyadékot megfelelő időközönként cserélni kell. A fertőzés után a kultúrákat megfigyelés alatt tartják. Ennek idejét a lárvák szaporodási üteme szabja meg. A lárvák finomabb szerkezetének megfigyelésére a tenyészetekből időnként mintát vesznek, a lárvákat fixálják, festik, majd mikroszkóppal vizsgálják. A férgek in vitro tenyésztése lehetővé teszi a férgek fejlődésének és morfológiai differenciálásának tanulmányozását, valamint adatokat szolgáltat a lárvák és a férgek tápanyagszükségletére, az egyes tápanyagok felhasználására is. Ez az eljárás különösen értékes az ember olyan specifikus parazitáinak tanulmányozására, amelyek kisérleti állatokban nem fejlődnek ki, s igy az állatok időnkénti kiirtásával morphogenesisük nem vizsgálható. Az in vitro tenyésztést mind kiterjedtebben alkalmazzák olyan vegyületek hatékonyságának vizsgálatára,amelyek antheimlntikumként jöhetnek szóba. Bár ezek a vizsgálatok nem helyettesithetik az in vivo kísérleteket, megelőzhetik és irányithatják azokat oly módon, hogy a kémiailag definiált táptalajokban az anthelmintikumok farmakodinamikájának a folyamatába betekintést nyújtanak. + + + Az ismertetett néhány korszerű vizsgáló eljárással elért eredmények alapján jogosan lehet, arra következtetni, hogy a kutatá-
sok határterülete szinte végtelen, és a jövője egyelőre még beláthatatlan fejlődés elé néz. E fejlődésre nekünk is fel kell készülnünk korszerű berendezésekkel, műszerekkel, különben nemcsak a tudományos, de már a rutinmunkában is messze elmaradunk a nemzetközi élvonaltól. A parazitológia színvonalának emelkedése megkívánja, hogy modern technológia álljon a szakemberek rendelkezésére felelősségteljes munkásságuk nyomán. NEMESÉRI, L.: Modern Methods in Parasitological Investigations The author discusses the advances made in the field of parasitology under the effects of the technical and scientific revolution and the important part played in this development by the application of new methods and instruments. The operation of the electron microscope and the results gained by its application in parasitology are briefly described. The basic principles of application of radio-isotopes in parasitological diagnosis and finally methods for worms cultivation in vitro are also dealt with. Érkezett: 1971. február 9. Dr. NEMESÉRI László Országos Állategészségügyi Intézet Budapest XIV., Tábornok utca 2.