Mycobacterium tuberculosis elleni hatóanyag-jelöltek vizsgálata egyrétegő membrán modell segítségével

Tudományos Diákköri Dolgozat PÉNZES CSANÁD BOTOND Mycobacterium tuberculosis elleni hatóanyag-jelöltek vizsgálata egyrétegő membrán modell segítségével Témavezetı: dr. Kiss Éva Konzulens: Hill Katalin ELTE Kémiai Intézet, Fizikai Kémiai Tanszék Határfelületi- és Nanoszerkezetek Laboratóriuma Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2007

Tartalomjegyzék 1. BEVEZETÉS... 3 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS... 6 2.1. MYCOBACTERIUMOK... 6 2.2. MEMBRÁN MODELLEK... 7 2.3. LANGMUIR-FILMEK... 8 2.4. KITEKINTÉS A MONORÉTEG TECHNIKÁT HASZNÁLÓ KUTATÁSOK IRÁNYÁBA... 8 3. CÉLKITŐZÉS... 11 4. KÍSÉRLETI RÉSZ... 12 4.1. FELHASZNÁLT ANYAGOK (A KÍSÉRLETEINK SORÁN)... 12 4.2. MÓDSZEREK... 12 4.2.1. Mérések Langmuir-mérleggel... 12 4.2.2. Megoszlási hányados meghatározása... 14 4.2.3. Felületi feszültség mérés... 15 5. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTELMEZÉSÜK... 16 5.1. A HATÓANYAGOK ÉS HATÓANYAG JELÖLT MOLEKULÁK FELÜLETAKTIVITÁSA... 16 5.2. A HATÓANYAG JELÖLT MOLEKULÁK OKTANOL/VÍZ RENDSZEREN VALÓ MEGOSZLÁSA16 5.3. LANGMUIR-MÉRLEGES MÉRÉSEK... 18 5.3.1. INH hatóanyag és annak konjugátuma: INH-redSer... 18 5.3.2. Új hatóanyag jelöltek Ligandum 3, 44, 69... 24 6. ÖSSZEGZÉS... 27 7. IRODALOM... 29

1. Bevezetés A Mycobacterium tuberculosis okozta fertızés eredményeképp leggyakrabban kialakuló gümıkór az emberiség egész történelmét végigkísérte. Biológusok a Mycobacterium DNS-ének vizsgálatával arra következtetnek, hogy a bacilus mintegy 3 millió évvel ezelıtt már létezett, valamint az ókori Egyiptomból fennmaradt múmiák között megtalálták már egykori, gümıkorban szenvedı betegekét is. [Gutierrez,2005]. A betegség terjedését a népvándorlások és az elhúzódó, nagy területre kiható háborúk is segítették, de igazi járványok csak a késı középkorban alakultak ki. A helyzet az 1920-as évekig nem javult jelentıs mértékben, amikor is bevezették a BCG (Bacille Calmette-Guerin) oltást, ami nagyfokú védettséget jelent a gyerekkori TBC ellen. A két világháborúban ennek ellenére növekedett a megbetegedések száma [Shisha,2005]. A II. Világháború után a súlyos általános gazdasági helyzet ellenére Magyarországon például komoly közegészségügyi problémaként kezelték a betegséget. Ennek eredményeként a 60-as évek végére kiépült a lakossági szőrıvizsgálati rendszer, amelynek 170 tüdıgondozó és több mint 10.000 fekvıbeteg intézeti ágy képezte a gerincét. A rendszer fontos építıköve az évenkénti kötelezı szőrıvizsgálat. Ennek köszönhetıen az új betegek megközelítıleg 30 %-át a mai napig ilyen mellkasi röntgen alapján diagnosztizálják. Ennek ellenére az igazi áttörést az addig gyógyíthatatlan és mindig halálos meningitis basilaris ellen, mely a betegség egyik megjelenési formája, a streptomycin hozta. Az elsı antituberkulotikumot követte a többi, így az 50-es években megjelent az INH (isoniazid), mely a mai napig is a leghatásosabb gyógyszer. A javuló járványügyi statisztikákon felbuzdulva az országok pillanatnyi vezetıi úgy gondolták, hogy a kórt megfékezve már csak szórványos megbetegedésekre kell számítani [Pataki,2005][Hutás,1999]. Ennek ellenére a politikai, gazdasági és társadalmi változások miatt, 1990-1996 között az új megbetegedések száma rohamosan nıtt (1. ábra) [WHO Report, 2007], és mindemellett megjelentek új, ún. multirezisztens baktériumok is. Ennek tükrében megfigyelhetı az 1. ábrán, hogy Magyarország szomszédai közül Romániában és Ukrajnában ez a növekedés a mai napig tart. A multirezisztencia sajnálatos módon kialakulhat a gyógyszeres kezeléshez való bakteriális alkalmazkodás vagy a megszakított kezelés miatt. Az elsı lehetıségét az orvosok úgy csökkentik, hogy az antituberkulotikumokat egymással kombinálva adagolják a betegeknek. Ennél fogva a baktériumnak kisebb a lehetısége adott gyógyszerhez hozzászokni és védekezı mechanizmust kialakítani. Ami ennél is fontosabb, hogy folyamatosan, 3

megszakítás nélkül, legalább 6 hónapig kezelés alatt álljon a páciens. Ennek biztosítására Amerikában és Nyugat-Európában megalkották a DOT-ot (directly observed therapy), vagyis a direkt ellenırzött gyógyszerszedést, amely esetében a beteg az orvos vagy a nıvér jelenlétében veszi be a gyógyszert. 1. ábra. Az évek múlása a tuberculosis-os betegek számának 100.000 fıre kivetített értékének függvényében a Kárpát-medence országaiban és Ausztriában. Az Egészségügyi Világszervezet adatai szerint, a Föld lakosságának egyharmada fertızött (2. ábra) [EuroTB. 2007]. Az elırejelzéseik alapján 2000 és 2020 között világszerte közel 1 milliárd ember válik újonnan fertızötté, közülük várhatóan 200 millió egyénben ez a fertızés klinikai megbetegedéshez vezet majd. Európa helyzete sem sokkal jobb, hiszen habár az Európai Unió országaiban eleve alacsony szinten lévı megbetegedések száma lassan csökken, ám ennek a csökkenésnek a mértékét jócskán túlszárnyalva növekszik Kelet-Európában (3. ábra) [EuroTB. 2007]. 4

2. ábra. Bejelentett TBC-s esetek (új és visszaesı) száma 100.000 lakosra nézve 3. ábra. A TBC-s esetek száma, Európa országainak különbözı csoportosítása mellett 100.000 lakosra nézve 5

2. Irodalmi áttekintés 2.1. Mycobacteriumok A Mycobacteriumok aerob, pálcika alakú (0.4x3 µm), spórával szaporodó, csillóval nem rendelkezı baktériumok. Gram-féle festéssel nem osztályozhatók, vagyis nagy kémiai rezisztenciával rendelkeznek. Ziehl-Neelsen saválló festéssel viszont kimutathatók, hiszen a felvett festéket savas-alkoholos kezelésre sem adják le, vagyis saválló baktériumok (4. ábra). A több, mint 50 fajt számláló nemzetségben három patogén faj létezik, ezek a Mycobacterium tuberculosis (TBC), leprae (lepra) és a bovis (bél-, miliáris TBC). Gram-negatív Gram-pozitív Komplex (Saválló) Építı egységek 4. ábra. Baktériumok festéses eljárással megkülönböztetett három csoportjának membrán szerkezete A tuberculosis bakteriális támadáskor a szervezet immunválasza azzal kezdıdik, hogy a baktériumokat a tüdıben található makrofágok bekebelezik. Eközben a T-sejtek felismerik a Mycobacterium antigént és mozgósítják a mono- és limfocitákat. Ezek a kölcsönhatás helyén Langerhans óriás- és epitheloid sejtekké alakulnak át. A Mycobacterium izolálása és részleges elpusztítása közben egy kompakt szerkezető cella, a granuloma jön létre. Ezt a folyamatot sajtosodásnak nevezzük (5. ábra). A tuberkulózis terápiájában ma elsı helyen a gyógyszeres kezelés áll [Tripathi,2005]. A már említett INH és streptomycin mellett pirazinamidot is használnak. Az immunválasz megismerésével és a tervezett molekulaépítéssel lehetıség nyílt a klasszikus, empirikus úton megismert hatóanyagok módosítása. A módosítás célja, hogy a sajtosodásban résztvevı makrofágokat megcélozva a bennük lévı életképes baktériumokat elpusztítsák. A másik 6

lehetıség az új hatóanyagok keresése, mely módszer a baktérium sejten belüli túléléséhez elengedhetetlen enzimek gátlásán alapul [Nagy][Póder][Vértessy, 2007]. 5. ábra. A szervezet immunreakciója a Mycobacterium tuberculosis támadásakor 2.2. Membrán modellek A hatóanyagoknak több membránon át kell jutniuk ahhoz, hogy a fertızött célsejthez elérjenek, így a kutatások egyik fontos eleme az, hogy megvizsgáljuk a membrán-hatóanyag kölcsönhatást, a hatóanyag membránhoz való affinitását. A többféle membrán modell között két csoportot lehet megkülönböztetni [McRitchie]: a membrán-mimetikus modelleket és a monorétegeket. A membrán-mimetikus csoportból számunkra kiemelkedı jelentıséggel bír az, amely foszfolipid kettısrétegbıl épül fel. Ezt liposzómás rendszernek nevezzük és fontos modellje a sejteknek, a biomembránoknak. Oldott anyag transzport, hatóanyag szállítás és sejtdiffúziós vizsgálatoknál használják. A monoréteg modellek használatának elınye a határfelületi folyamatok vizsgálatában, hogy a molekulák csaknem tetszılegesen megválaszthatóak és elrendezhetıek, valamint a határfelületen általuk elfoglalt terület szabályozható. Ezáltal lehetıvé válik, hogy különbözı tulajdonságokat pontosan meghatározott, kétdimenziós koncentráció függvényében mérjünk, ilyen például a vizes fázisban oldott komponens penetrációs képessége. Monorétegő membránok a Langmuir-technikával elıállított lipid filmek [McRitchie]. A Langmuirmérlegben a levegı/víz határfelületen olyan rendszer alakul ki, mely jól definiált, monorétegő, rendezett, speciálisan irányított lipid film. Igen fontos, hogy a kapott mérési adatok alapján a membrán-hatóanyag kölcsönhatásról kvantitatív információkat kapunk. Mindemellett a rendszer nagyfokú szabadságot biztosít a mérési körülmények megválasztásában, hiszen a szubfázis összetétele, ph-ja, oldott ionjai, a kétdimenziós felületi réteg összetétele, a molekulák sőrősége szabadon változtatható. Ezeken felül lehetıség van a film szilárd hordozóra történı átvitelére (Langmuir-Blodgett technika), aminek következtében 7

egyéb vizsgálati módszerhez (XPS, AFM, stb.) tudunk mintát készíteni a vizsgált filmbıl. Ezek ismeretében választottuk vizsgálatainkhoz ezt a modellt [Kiss,2006]. 2.3. Langmuir-filmek A folyadék felszínén a monomolekulás filmréteg kétféle módon alakulhat ki. Az egyik eljárás, amikor a tömbfázisban oldott felületaktív anyag molekulái a folyadék/gáz felületen adszorbeálódnak. A másik, az un. terítéses eljárás, amikor a filmet alkotó amfipatikus molekulákat egy a szubfázissal nem elegyedı, gyorsan párolgó oldószerrel hordjuk a folyadék felszínére. Az oldat szétterülése és az oldószer elpárolgása után kialakul a monoréteg. A szubfázis, általában víz felszínén kialakított, oldhatatlan, monomolekulás, rendezett felületi filmeket nevezzük Langmuir-filmeknek. A Langmuir-filmek vizsgálatánál a kialakult monomolekulás film felületi feszültségét mérjük, aminek segítségével az oldalnyomás értékét határozhatjuk meg. π = γ 0 γ, ahol π az oldalnyomás, γ 0 a tiszta szubfázis felületi feszültsége és γ a film jelenlétében mért felületi feszültség. Az oldalnyomás közvetlen mérése az automatizált Langmuir-mérleggel végezhetı el. A mérési módszer lényege, hogy az ismert területő filmet, meghatározott sebességgel komprimáljuk, majd expandáljuk és mindeközben rögzítjük az oldalnyomás értékének változását. Mivel ismerjük a felületre juttatott molekulák számát, az oldalnyomást a molekulák által elfoglalt terület függvényében ábrázolhatjuk, mely az oldalnyomás (π ) terület ( A ) izotermát adja [Kiss,2006]. 2.4. Kitekintés a monoréteg technikát használó kutatások irányába A monoréteg technika az utóbbi két évtizedben igen elterjedt lett, mivel egyszerő eszköz alkalmazásával értékes információt szolgáltat a molekuláris kölcsönhatásokról [Maget-Dana, 1999]. Egyre több közlemény jelenik meg különbözı hatóanyagok, gyógyszerjelölt molekulák biológiai membránhoz való affinitásának tanulmányozásáról. Az ilyen vizsgálatok gyógyszerészeti, gyógyászati jelentısége nagy, mivel hozzájárulnak ahhoz, hogy a hatóanyag hatásmechanizmusát fel tudjuk deríteni, illetve megfelelı gyógyszerhordozó rendszereket fejleszthessünk. 8

A lipid molekulák víz/levegı határfelületen kialakított rendezett rétege, a Langmuirfilm a biológiai membrán legegyszerőbb modelljének tekinthetı [McRitchie][Maget- Dana,1999]. Mint ahogy a terjedelmes irodalomból kiragadott néhány példa a továbbiakban mutatja, ezzel az egyszerő, egyrétegő membránmodellel is értékes információk nyerhetıek az egyes hatóanyagok membránszerkezetére, permeábilitására gyakorolt hatásáról, a hatóanyag penetrációjáról, a lipidrétegbe való behatolás és beépülés módjáról. A keverékfilmek kvantitatív analízisébıl pedig megállapítható a lipidfilm kompresszibilitására, stabilitására gyakorolt hatás jellege. Jablonowska és munkatársai dipalmitoil-foszfatidilkolin (DPPC) monoréteg modellen ibuprofén hatóanyag koncentrációfüggı hatását vizsgálták [Jabłonowska,2007]. Megállapították, hogy a hatóanyag kis koncentrációban kondenzálja a lipidréteget; míg nagyobb koncentrációban alkalmazva a hatás ellentétes, a lipidréteg szerkezetét fellazítja, megbontja. Ezeknek a változásoknak fontos szerepe lehet a membránfunkcióban. Hasonló következtetésre jutottak Ronkart és munkatársai egy antibiotikum (azitromicin) membránnal való kölcsönhatását tanulmányozva [Fa,2006]. A molekula beépülése a lipid monorétegbe, a hidrofób láncok közé, szélesítette a fázisátmeneti tartományt, és entalpiáját lényegesen csökkentette. A membránalkotó molekulák rendezettségének és fluiditásának ilyen változása a permeabilitást növeli, ami összefüggésben van az azitromicin endocitózisra gyakorolt befolyásával. A kísérleti munkák mellett molekuladinamikai szimulációról is beszámolnak, ami szintén a rendezett lipidréteg és a hatóanyag molekula kölcsönhatásának megismerésére irányul [Pickholz,2007]. Eszerint a hatóanyag, töltésállapotától függıen a lipidréteg felszínén, vagy az alkilláncok között helyezkedett el. Az eredményekbıl számított paraméterek a lipidfilm rendezettségének csökkenésére mutattak. A Langmuir-réteges módszerben a membrán összetétele az egykomponenső lipid filmhez képest tetszılegesen módosítható, miáltal a biológiai membrán összetételét közelítı modellrendszerhez jutunk. Zhao és Feng az egyik legelterjedtebben használt rákellenes szer, a placlitaxel DPPC monoréteggel való kölcsönhatását vizsgálta, annak függvényében, hogy a lipidfilm mennyi koleszterint tartalmazott [Zhao,2006]. A Langmuir-mérleges eredményekbıl megállapították, majd AFM és FTIR vizsgálatokkal is alátámasztották, hogy a koleszterinnek kondenzáló hatása van, ami gátolja a hatóanyag behatolást, és ennek klinikai következményei vannak. Ezzel összhangban van Banerjee értékes tapasztalata, ami ugyancsak a paclitaxel membránpenetrációjára vonatkozott [Preetha,2006]. Az egészséges és rákos sejtek membránját eltérı összetételő monoréteggel modellezve arra a megállapításra jutott, hogy a hatóanyagbehatolás jelentısen kisebb a beteg sejteknek megfelelı monorétegbe, mint az 9

egészséges sejt lipidfilmjébe. Ezt a különbséget a membrán összetételével, a beteg sejtmembrán nagyobb koleszterin és szfingomilelin tartalmával hozta összefüggésbe. A membrán modell komponenseinek megfelelı megválasztásával a szelektív kötıdés is meghatározható. Erre példa egy gombaelleni hatóanyag hatásmechanizmusának felderítése, amelyben a toxikus, és kevésbé toxikus származékok összehasonlításában fontos információt szolgáltatott a monoréteges technika [Hąc-Wydro,2005]. Annak tanulmányozása, hogy a hatóanyag hogyan épül be a lipidfilmbe, abból a szempontól is fontos lehet, hogy megfelelı stabilitású, liposzómás gyógyszerhordozót tudjunk kialakítani. A miltefozin (rákellenes hatóanyag) orális terápiája súlyos mellékhatásokkal jár. Mivel az állatkísérletek alapján a hatóanyag liposzómás alkalmazása biztató eredményeket mutat, részletesen foglalkoztak a miltefozin, lipid, koleszterin monoréteges keverékrendszerek analízisével [Miñones Jr.,2006]. A keverékizotermák analízise segítségével megállapították azt az összetételt, amelynél a legnagyobb stabilitás várható. A gyógyszerek jobb hatásának elérése érdekében a hatóanyag molekula kémiai módosítása, illetve speciális szerepő molekulával való kapcsolása is ígéretes eljárás [Manea,2005]. Pignatello és munkatársai egy modell hatóanyagot kétféle olyan molekularészlettel kapcsoltak, amelyek várhatóan megnövelik a membránhoz való affinitását [Pignatello,2006]. A módosítás hatását monoréteges, valamint liposzómás rendszerekben, továbbá differenciál szkenning kalorimetriás módszerrel követték. A konjugátumok viselkedésének összehasonlítása azt mutatta, hogy nem egyszerően a lipofilitás növelés, hanem az amfipatikus jelleg fokozása az, ami elısegíti a membránnal való kölcsönhatást. A tüdı mőködéséhez nélkülözhetetlen, tüdı felületaktív anyagnak nevezett keverék egyik fı komponense is lipid, a DPPC. Emellett más fontos, fehérjetípusú komponenseket is tartalmaz. Ezek hatását, és a tüdıfunkciót befolyásoló, segítı és gátló mechanizmusokat részletesen tanulmányozták Perez-Gil és munkatársai [Serrano,2006]. A DPPC tüdıbeli jelenlétébıl adódik a következtetés, hogy a tuberkulózis kezelésére alkalmas hatóanyagot DPPC-s liposzómás gyógyszerhordozóval célszerő a szervezetbe juttatni. Ehhez végezett monoréteges modell kísérleteket Banerjee és munkatársa a monorétegek dinamikus vizsgálatával [Chimote,2005]. A DPPC INH hatóanyaggal kevert monorétegeit olyan sebességgel komprimálták, amely a tüdımőködés során tapasztalható. Megállapították, hogy az INH, valamint rifampicin és etánbutol hatóanyagok olyan módon változtatják a lipid film dinamikus paramétereit, ami hasznosítható lehet a liposzómás tuberkulózis terápiában. 10

3. Célkitőzés A statisztikákat megfigyelve látszik, hogy milyen fontos egy ilyen, jelen pillanatban nehezen gyógyítható, rohamosan terjedı fertızı betegséget jobban megismerni és az ismereteinket arra fordítani, hogy gyorsabban és hatékonyabban tudjunk reagálni a baktérium szervezetre mért támadására. A baktérium elpusztításához szükséges gyógyszerek hatóanyag molekuláinak a szervezetben több sejtmembránon kell átjutniuk, hogy kifejtsék a hatásukat. Ennek a szervezetben történı, célzott mozgásnak a lehetı legjobb hatékonysággal kell lezajlania, hiszen ez jelentısen befolyásolhatja azt, hogy milyen mennyiségben kell alkalmazni a hatóanyagot. Így a szervezetre mért terhelés csökkenthetı lehet. Ezért célomul tőztem ki a Mycobacterium tuberculosis elleni hatóanyag-jelöltek membránhoz való affinitásának vizsgálatát. Ehhez olyan membrán modell kiválasztása szükséges, mely egyszerő és lehetıvé teszi a molekuláris kölcsönhatások vizsgálatát. Ez az egyrétegő membránmodell, mely a valódi sejtmembrán fı alkotó részébıl, lipidbıl álló, egyetlen, rendezett molekularéteg. Ez víz/levegı határfelületen, Langmuir-mérlegben alakítható ki. A vizsgálatok, a molekulák tulajdonságaihoz mérten két csoportba oszthatóak. Így az elsı esetben a keverék izoterma meghatározása, második esetben lipidfilmbe való penetráció mérése lehet a kérdéseim megválaszolásához szükséges mérési technika. Kiegészítı mérésként célom a hatóanyag-jelölt molekula felületi és polaritási tulajdonságaik jellemzése. A vízben jól oldodó hatóanyag molekulák felületaktivitását felületi feszültség méréssel szeretném meghatározni, míg a polaritás jellemzésére a gyógyszerhatóanyagok esetében alapvetı paramétert, az oktanol/víz megoszlási hányadost kívánom használni. Az így kapott eredmények segítséget jelenthetnek a hatóanyagjelölt molekulák összehasonlításában, annak megítélésben, hogy az egyes hatóanyagok, hatóanyagkonjugátumok és hatóanyag-jelöltek milyen affinitással rendelkeznek a membrán felületéhez való kötıdés, illetve a membránba való behatolás tekintetében. Ez szelekciós lehetıséget kínál a további vizsgálatokhoz. 11

4. Kísérleti rész 4.1. Felhasznált anyagok (a kísérleteink során) a lipid membrán kialakításához disztearoil- és dipalmitoil-foszfatidilkolin 85:15-os keveréke (Phospholipon, Nattermann GmBH) vizsgált hatóanyagaink izoniazid (INH) és ennek peptiddel alkotott konjugátuma (INH-redSer), valamint három újonnan azonosított bakteriális enzimgátló vegyület Ligandum3, 44 és 69-es jelő terítıoldatként kloroform (Fisher Scientific)/metanol (Reanal) 3:1 arányú szennyezıdés mentes elegye Lipofilitás vizsgálathoz oktanol (a.r., Reanal) szubfázisként bidesztvíz, melynek felületi feszültségét (71,8 mn/m, 23 C) minden mérés elıtt ellenıriztem 4.2. Módszerek 4.2.1. Mérések Langmuir-mérleggel A Langmuir-mérleges mérések elsı típusa (I.) a keverék-filmek izotermáinak meghatározása (6.ábra) A másik mérésben (II.) a vízben oldott komponens penetrációját határoztuk meg (7.ábra). Ezeket a méréseket két, különálló Wilhelmy-lemezes ( ±0,05 mn/m pontosságú) felületi feszültségmérıvel felszerelt, automatizált Langmuir-mérleggel végeztük, 23,0 ± 0,5 C-os hımérsékleti intervallumban. Wilhelmy-lemez elektromérleg 1 mozgó gát elektromérleg Wilhelmy-lemez víz 6. ábra. A Langmuir-mérleg sematikus ábrája és az izoterma felvételéhez szükséges mérési elrendezés. Az 1. jelzéső fecskendıbıl tiszta lipid-, tiszta hatóanyag-, vagy keverék-oldat került a szubfázis felszínére. 12

A megfelelı monoréteg kialakításához a kísérletek során a lipidnek és a keverék oldatoknak (c lipid = 0,1 g/l) két különbözı mennyiségét alkalmaztuk (V = 30 és 50 µl) a terítési eljárás során. A keverék oldatok esetén 5:1 volt a lipid/hatóanyag mólaránya. Ennél a módszernél (I. mérés) Hamilton mikrofecskendıvel cseppenként juttattuk a vizsgált anyag kloroformos oldatát a szubfázis felszínére. Az oldószer elpárolgására 5 percet hagytunk, mely után a gát mozgatásával felvettük az izotermát. Minden mérésnél háromszor ismételtük meg a komprimálási/expandálási ciklust, állandó sebességgel mozgó gáttal, majd nagyobb sebességgel vettük fel a 4. és az 5. izotermát. A kezdeti kb. 104 cm 2 -es felületi réteget 1-3. izoterma felvétele során 1000 relatív sebességgel (25,60 cm 2 /min), míg a 4-5. izoterma esetén 2900 relatív sebességgel (88,03 cm 2 /min) mozgatott gáttal, teljes komprimáció esetén kb. 21 cm 2 -ig nyomtuk össze, majd a komprimációhoz használt sebességgel hagytuk a filmet expandálni. A molekulák filmen belüli legkedvezıbb elhelyezkedésének lehetıséget biztosítva, az elsı izotermát nem használtuk a kiértékelés során, mert azt a molekulák elırendezéseként hajtottuk végre. Ezt a lépést nemcsak az izotermák felvételénél, hanem más mérések elıtt is el kellett végezni. A penetrációs vizsgálatok (II. mérés) során az elkészített, adott felületi koncentrációjú és irányított elhelyezkedéső molekulákból felépülı lipid filmet készítünk. Ezt az I. mérési típusnál látott módon tesszük, annyi különbséggel, hogy a második kompressziós/ expanziós ciklus során a kívánt oldalnyomás értéknél megállítjuk a gát mozgását. Ezután a szubfázisba injektáljuk a hatóanyag-jelölt vizes oldatát ( c = 80µ M, V = 2ml ). Az így kialakult szubfázisbeli koncentráció 2 µ M. Wilhelmy-lemez elektromérleg 1 elektromérleg Wilhelmy-lemez mozgó gát 2 víz hatóanyag drug 7. ábra. A Langmuir-mérleg sematikus ábrája és a penetráció vizsgálathoz szükséges mérési elrendezés. Az 1. jelzéső fecskendıbıl a lipid kloroformos oldata került a szubfázis felszínére, míg a 2. jelzéső fecskendıbıl a hatóanyag vizes oldatát juttattuk a szubfázisba. 13

A penetráció meghatározásához 1 órán keresztül győjtöttem az adatokat, majd ennek a folyamatnak a végén a gátat, a komprimáláskor használt sebességgel, de azzal ellentétes irányba mozgatva, expandáltattam a filmet. Az eredményeimet, az izotermák és penetrációs vizsgálatok, többször reprodukált adatsoraiból állítottam össze. 4.2.2. Megoszlási hányados meghatározása A hatóanyagok lipofilitásának jellemzése céljából megmértem a megoszlási hányadosukat, hiszen a gyógyszerek szervezetbeli sorsát (felszívódását, eloszlását, raktározódását stb.) alapvetıen meghatározó lipofilitás számszerő jellemzésére a gyógyszerkémiában az oktanol/víz rendszerre vonatkozó megoszlási hányados logaritmusa (log P) használatos [Novák, 2005]. Ez az oldószerrendszer a biológiai megoszlás jó prediktorának bizonyult, mert az oktanol amfifil jellegénél fogva valamelyest modellezni képes a gyógyszer és a membrán lipid kettıs rétegével és a fehérjéivel létrejövı kölcsönhatásokat. A nernsti definíció szerint a valódi megoszlási hányados (log P) a mindkét megosztó fázisban azonos molekuláris állapotban lévı (nemionizált, monomer) részecske koncentráció arányát fejezi ki. Mivel a mi hatóanyagaink ilyenek, így [ hatóanyag] O [ hatóanyag] V P =, így a lipofilitás = log P. A méréseimet a referenciaként használt rázótölcséres módszerrel végeztem el [Leo, 1971]. Az elıkészületek során 12 órán keresztül rázógépen rázattam az azonos térfogatú oktanolból és vízbıl álló rendszert, majd a beálló egyensúly után elválasztottam a fázisokat. Ezek után elkészítettem az oktanollal telített vízbıl és a hatóanyagból a kalibrációs görbe felvételéhez szükséges megfelelı koncentrációjú oldatokat és azonos térfogatú, vízzel telített oktanolt mértem hozzá. Ezután 25 C-on, 1 órán keresztül rázógépben rázattam. Az idı elteltével a fázisokat szétválasztottam, majd spektrofotométerrel [Spektromom 195, MOM, Budapest] felvettem elıször egy teljes spektrumot, majd a többi koncentráció esetében a kiválasztott csúcs(ok) környezetében mértem az extinkciót. A kalibrációs görbe felhasználásával kiválasztottam azt a koncentráció tartományt, mely elegendıen nagy ahhoz, hogy a megoszlás utáni értéket is detektálni tudjam. Az oldat elkészítés, majd vízzel telített oktanollal való összemérés után azonos körülmények között elvégeztem a rázatást, elválasztást és a spektrofotometriás mérést. 14

4.2.3. Felületi feszültség mérés A vizes hatóanyag és hatóanyag-jelölt oldatok felületi feszültségét tengelyszimmetrikus csepp-profil analízissel, OCA 15+ készülék használatával (Dataphysics, Germany), 0,1 mn m pontossággal határoztuk meg. Minden mérést háromszor hajtottunk végre minden adott anyagon, 23± 0, 1 C -on. A felületi feszültség értékeit kevesebb, mint ± 0,5mN * m szórással reprodukáltuk. A kapilláris felszín profilját a függıcsepp alakjának analízisével kaptuk CCD kamera és hozzákapcsolt videokép-profil digitalizáló segítségével, ami PC-hez kapcsolódik (8.ábra). A vizes oldat cseppjét egy Hamilton fecskendı PTFEbevonatú tőjének hegyén alakítottuk ki, 2 µ l s sebességgel. A tő hegye és a függıcsepp vízgızzel telített üvegküvettába nyúlt. A méréseket elvégeztük. 2 µ M és 80µ M -os koncentráción is 8. Ábra. OCA 15+ készülék összeállítása 15

5. Eredmények és értelmezésük 5.1. A hatóanyagok és hatóanyag jelölt molekulák felületaktivitása A vizsgált hatóanyagok közül az INH, a ligandum 3 és ligandum 44 vizes oldatának felületi feszültségét a függıcsepp-profil meghatározására alapuló módszerrel végeztük. A koncentrációt az adott vegyület vízoldhatósága, valamint az szabta meg, hogy milyen koncentrációnál tudtunk penetrációs mérést végezni a Langmuir-mérlegben. Ezek alapján a megfelelı koncentrációjú vizes oldatok statikus felületi feszültségét mértük. Ebben a koncentráció tartományban egyik komponens sem mutatott a kétszer desztillált vízétıl eltérı felületi feszültséget, tehát az adott kísérleti módszerrel nem kaptunk észlelhetı felületaktivitást sem az INH-ra, sem a két ligandumra. Így e mérés alapján nem tudtunk következtetni a polaritásukra, a víz/levegı határfelületen való adszorpciójuk mértékére. 5.2. A hatóanyag jelölt molekulák oktanol/víz rendszeren való megoszlása A három ligandum molekula UV és látható hullámhossz tartományba esı spektrumát a 9., 10., 11. ábrák mutatják. Az ábrákon megjelöltük a méréshez használt hullámhosszakat is. Abszorbancia 1,50 1,25 1,00 100 µm Ligand 44 spektrum Abszrbancia max = 1,38 Hullámhossz = 398 nm 0,75 0,50 0,25 0,00 270 300 330 360 390 420 450 480 510 λ / nm 9. ábra. Ligandum 44 spektruma 16

Abszorbancia 2,25 2,00 1,75 1,50 1,25 1,00 100 µm Ligand 3 spektrum Abszorbancia max1 = 2,10 Hullámhossz 1 = 227 nm Abszorbancia max2 = 0,578 Hullámhossz 2 = 275 nm 0,75 0,50 0,25 0,00 220 240 260 280 300 320 340 360 380 λ / nm 10. ábra. Ligandum 3 spektruma Abszorbancia 0,30 0,25 0,20 100µM Ligand 69 spektrum Abszorbancia max = 0,279 Hullámhossz = 352 nm 0,15 0,10 0,05 0,00 280 300 320 340 360 380 400 420 440 λ / nm 11. ábra. Ligandum 69 spektruma Ligandum 44 Ligandum 3 Ligandum 69 Számított logp 2,10 3,20 - Mért logp 0,94 ± 0,05 0,89 ± 0,05 0,61 ± 0,05 1. táblázat. A három ligandum molekulának a számított és mért logp értéke 17

A lipofilitás jellemzésére szolgáló logp-re a mért adatok alapján, a Ligandum vegyületek sorrendjét fel tudjuk állítani, melyet a 1. táblázat foglal össze. A táblázat tartalmazza a három ligandumra meghatározott megoszlási hányadosok logaritmusának értékét, valamint két vegyültre a számított logp értékeket is [Irwin, 2005]. A ligandumok membránnal való kölcsönhatásának értelmezéséhez az általunk mért kísérleti értékeket használtuk, mivel a számított értékeknek éppen az adott tartományban nagy, ±1,5 egység a bizonytalansága [ZINC]. 5.3. Langmuir-mérleges mérések 5.3.1. INH hatóanyag és annak konjugátuma: INH-redSer A Langmuir-mérleges mérések eredményeinek kiértékelését kezdjük az izoterma vizsgálattal! Ennél a mérési típusnál az adott, tiszta vagy keverék anyag felületi monorétege által létrehozott oldalnyomás növekedést mérjük, miközben a felületi sőrőséget növeljük, majd ugyanolyan sebességgel csökkentjük. π / mn*m -1 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0-2 INH red-ser 2,3,5. Izoterma V=30 µl, c=0,1 mg/ml, RelSeb=1000, 2900, T=23,5 C 2. izoterma π(1) max = 8,306 mn/m Helyigény: 362,27 Å 2 3. izoterma π(1) max = 7,461 mn/m Helyigény: 342,12 Å 2 5. izoterma π(1) max = 6,338 mn/m Helyigény: 318,70 Å 2 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 A / (Å 2 /molekula) 12. ábra. INH-redSer izotermái, c = 0,1 mg/ml, V = 30 µl terítı oldatot használva 18

π / mn*m -1 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0-2 INH red-ser 2,3,5. Izoterma V=50 µl, c=0,1 mg/ml, RelSeb=1000, 2900, T=23,5 C 2. izoterma π(1) max = 13,654 mn/m Helyigény: 333,94 Å 2 3. izoterma π(1) max = 13,351 mn/m Helyigény: 315,88 Å 2 5. izoterma π(1) max = 14,775 mn/m Helyigény: 239,53 Å 2 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 A / (Å 2 /molekula) 13. ábra. INH-redSer izotermái, c = 0,1 mg/ml, V = 50 µl terítı oldatot használva A 12. és 13. ábra az INH-redSer izotermáit tünteti fel. Látható, hogy egy stabil, terített, felületi film hozható létre, mely többszöri komprimációs/expanziós ciklus hatására sem változik meg jelentısen. π / mn*m -1 40 36 32 28 24 20 16 INH red-ser + phospholipon 2,3,5. Izoterma V=30 µl, c=0,1 mg/ml, RelSeb=1000, 2900, T=23,5 C 2. izoterma π(1) max = 27,625 mn/m Helyigény: 134,95 Å 2 3. izoterma π(1) max = 29,558 mn/m Helyigény: 126,87 Å 2 5. izoterma π(1) max = 28,958 mn/m Helyigény: 128,29 Å 2 12 8 4 0 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 A / (Å 2 /molekula) 14. ábra. Lipid + INH-redSer keverék izotermái, c = 0,1 mg/ml, V = 30 µl terítı oldatot használva 19

π / mn*m -1 56 52 48 44 40 36 32 28 24 20 16 12 8 4 0 INH red-ser + phospholipon 2,3,5. Izoterma V=50 µl, c=0,1 mg/ml, RelSeb=1000, 2900, T=23,5 C 2. izoterma π(1) max = 49,262 mn/m Helyigény: 100,44 Å 2 3. izoterma π(1) max = 48,300 mn/m Helyigény: 92,47 Å 2 5. izoterma π(1) max = 45,226 mn/m Helyigény: 89,23 Å 2 50 75 100 125 150 175 200 225 250 A / (Å 2 /molekula) 15. ábra. Lipid + INH-redSer keverékfilm izotermái, c = 0,1 mg/ml, V = 50 µl terítı oldatot használva A 14. és a 15. ábra a lipid + INH-redSer keverékfilm izotermáit tünteti fel. A keverékfilm izotermája azt mutatja, hogy a lipid mellett az INH-redSer is jelen van a felületi rétegben. Az izotermák a komprimációs/expanziós ciklus ismétlésekor kis mértékben tolódnak az oldalnyomás tengely felé, ami a lipidbe adagolt hatóanyag komponensnek a filmbıl való részleges kiszorulása okoz, illetve a nagyobb peptidláncot tartalmazó molekula esetén a konformáció változásával is magyarázható. Az izotermák összehasonlításával megfigyelhetjük, hogy az azonos körülmények között nagyobb komprimációs sebességnek nincs jelentıs hatása. A 16. ábra a lipid film, lipid + INH, lipid + INH-redSer keverékfilmek izotermáit tünteti fel. A három izoterma összevetésekor megállapíthatjuk, hogy az izotermák eltolódnak az egy molekulára esı nagyobb területigény irányába, valamint az INH-redSer izotermájának a jellege is megváltozott, hiszen megjelenik egy plató szakasz is. Ezek az eredmények azt támasztják alá, hogy a lipiddel együtt terített hatóanyag a lipid molekulákkal való kölcsönhatás következtében a lipidrétegben marad. Még a többszöri komprimálás során sem szorul ki a rétegbıl. 20

π / mn*m -1 60 50 40 30 Lipid, INH és INH-redSer keverékfilmek 2.izotermái V=30 µl, c=0,1 mg/ml, RelSeb=1000 T=23,5 C lipid lipid+inh lipid+inh-red-ser 20 10 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 A / (Å 2 /molekula) 16. ábra. Lipid és a keverék izotermák komprimációs szakaszának összehasonlítása 30 µl felvitele esetén. A lipid + hatóanyag keverékfilmek esetén, hogyha önálló izotermájukat is meg tudjuk határozni, akkor megvizsgálhatjuk a hatóanyag keveredését vagy kompatibilitását a lipidfilmen. Egy egyszerő, kétkomponenső keverékfilmben, adott oldalnyomáson, ideális esetben a monomerek által elfoglalt átlagos terület ( A id = A x +, 1 1 A2 x2 A id ) az alábbi összefüggéssel adható meg: ahol x 1 és x 2 a monomerek móltörtjei a keverékben, A 1 és A 2 pedig a monomerek átlagos helyigénye a tiszta filmekben. Az izoterma felvétele során két lehetséges állapot jöhet létre a hatóanyag és a lipid kölcsönhatásától függıen. Ha a lipid izoterma és a keverék oldat izotermája egybeesik, akkor a vizsgált anyag nem épült be a filmbe, vagy ideális keveréket hoztak létre, vagyis a monomerek aktuálisan elfoglalt átlagos terület ( A 12 ) meg fog egyezni az ideális esetre számolt ( A id ) értékkel. Ha különbözik, a lipid és a hatóanyag közösen alkotják a felületi filmet. Ekkor a komponensek között fellépı intermolekuláris kölcsönhatásnak köszönhetıen az ideális helyigénytıl el fog térni a kísérletileg meghatározott ( A= A Aid 12 ) (17.ábra). 21

π / mn*m -1 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 lipid+inh-redser keverék film additivitás görbéi mért adatok (keverékfilm) számolt adatok, ideális eset 60 80 100 120 140 160 A / (Å 2 /molekula) 17. ábra. Additivitás ábrázolása INH-redSer hatóanyag esetén A 17. ábra a lipid + INH-redSer keverékfilm számolt, illetve mért additivitási görbéit tünteti fel. Mivel a mért érték széles tartományban kisebb az ideális esetre számoltnál, a molekuláris keveredés igazolt, és a molekulák közötti vonzó kölcsönhatásra következtethetünk, vagyis az INH-redSer kompatibilis a lipid molekulákkal. A Langmuir-mérleges mérések eredményeinek kiértékelését folytassuk a penetráció vizsgálattal! Ennél a mérési típusnál az INH és az INH-redSer hatóanyag molekuláinak adott felületi sőrőségő lipidfilmbe történı beépülését mérjük. A penetrációs görbék az idı függvényében azt az oldalnyomás változást ábrázolják, amely a lipidfilmhez kötıdı vagy abba behatoló hatóanyagnak a többleteként mérhetı. 22

π / mn*m -1 5,5 INH és konjugátuma - penetráció 1. 5,0 4,5 4,0 3,5 INH-redSer INH 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 600 1200 1800 2400 3000 3600 4200 t / sec 18. ábra. INH és INH-redSer penetrációja π = 15mN m oldalnyomású lipid-filmbe π / mn*m -1 5,5 INH és konjugátuma - penetráció 2. 5,0 4,5 4,0 INH-redSer INH 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 600 1200 1800 2400 3000 3600 4200 t / sec 19. ábra. INH és INH-redSer penetrációja π = 20mN m oldalnyomású lipid-filmbe A 18. és a 19. ábra a hatóanyagok különbözı felületi sőrőségő lipidfilmbe való beépülését tüntetik fel. A természetes membránok oldalnyomása π = 20mN m érték körüliek [Preetha,2006], ezért kétféle oldalnyomású lipidfilmbe való hatóanyag beépülést 23

vizsgáltunk. Az egyik a π = 20mN m, a másik az ennél kisebb, π = 15mN m oldalnyomású lipid film felhasználásával készült mérés sorozat. Az ábrák alapján megállapíthatjuk, hogy penetrációt a hatóanyag-konjugátum esetén tapasztaltunk, mely olyan nagy mértékő beépülést mutat a lipid filmbe, hogy a vizsgált idıtartam alatt folyamatosan növekedett. INH-redSer π = 15mN m π = 20mN m π max 4,9 2,5 2. Táblázat. A hatóanyag-konjugátum kétféle oldalnyomású lipid filmbe való beépülésekor kialakuló oldalnyomáskülönbség maximumok Mivel az INH esetén egyáltalán nem tapasztaltunk penetrációt, így megállapítható, hogy a konjugálás növelte az INH membrán affinitását. 5.3.2. Új hatóanyag jelöltek Ligandum 3, 44, 69 Az INH hatóanyag és annak konjugátumának vizsgálatánál megismert módon a ligandum vegyületekkel is elvégeztük a penetrációs vizsgálatot. π / mn*m -1 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 Ligand vegyületek - penetrációja 1. Ligand 44 Ligand 3 Ligand 69 0,0 0 600 1200 1800 2400 3000 3600 4200 t / sec 20. ábra. A ligandum vegyületek penetrációja π = 15mN m oldalnyomású lipid filmen 24

π / mn*m -1 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 Ligand vegyületek - penetrációja 2. Ligand 44 Ligand 3 Ligand 69 0,0 0 600 1200 1800 2400 3000 3600 4200 t / sec 21. ábra. A ligandum vegyületek penetrációja π = 20mN m oldalnyomású lipid filmen A 20. és a 21. ábra a ligandum vegyületek penetrációját tüntetik fel π = 15mN m és π = 20mN m oldalnyomású lipidfilmen. A penetrációs görbék megvizsgálása során láthatjuk, hogy szignifikáns, stabil beépülésnek lehetünk tanúi. Érdemes megfigyelni a görbéken a kb 300. másodperc környékén lévı maximumot, ami az injektálásnak, a mérési adatokban megfelelı jele. Ekkor ugyanis nagy koncentráció gradiens lép fel a szubfázisban, ami nyilvánvalóan a határfelületet is érinti. Viszont a koncentráció kiegyenlítıdés közben ez a csúcs csökken, majd beáll a valódi penetrációs értékre. A lipid film tömörségének jelentıs befolyása van a szubfázisból történı beépülésre. Ennek táblázatos összefoglalóját a 3. táblázatban tüntettük fel. Ligandum 44 Ligandum3 Ligandum69 π max 4,9 3,6 0,5 π stab 2,9 3,1 0,1 3. táblázat. A ligandum vegyületek π = 15mN m oldalnyomású lipidfilmbe való beépülésekor kialakuló oldalnyomáskülönbség maximumok és a kialakuló stabil értékek 25

Ligandum 44 Ligandum3 Ligandum69 π max 2,5 1,2 0,3 π közép 2,0 0,1 0,0 4. táblázat. A ligandum vegyületek π = 20mN m oldalnyomású lipidfilmbe való beépülésekor kialakuló oldalnyomáskülönbség maximumok és a kialakuló stabil értékek 26

6. Összegzés Munkánkban a Mycobacterium tuberculosis elleni hatóanyag, hatóanyag-konjugátum és hatóanyag-jelölt molekulák membránhoz való affinitását vizsgáltuk. Célunk az volt, hogy információt nyerjünk az INH és konjugátuma, valamint az új hatóanyag-jelölt molekulák membránba épülésérıl, melyhez egyrétegő membrán modellt használtunk. Langmuir-mérleg segítségével a membránalkotó lipidbıl, valamint a hatóanyagkonjugátumból keverékfilmet hoztunk létre víz/levegı felületen, valamint a hatóanyag-jelölt molekulák penetrációs vizsgálatait végeztük el. Vizsgáltuk a keverékfilmek esetében az oldalnyomás-terület izotermákat a tiszta komponensekéhez képest, valamint a penetrációs vizsgálatok esetében az oldalnyomás-idı izotermákat. Elemzésükbıl megállapítottuk, hogy a hatóanyagok beépülnek a lipidrétegbe (kivéve a Ligandum 69), kompatibilisek a lipiddel, mivel molekuláris keveréket képeznek. Kiegészítı mérésként a hatóanyag-jelölt molekulák statikus felületi feszültségét függıcsepp-profil analízissel tanulmányoztuk polaritásuknak jellemzése érdekében. Mivel ezzel a kísérleti módszerrel nem mértünk észlelhetı felületaktivitást, nem tudtunk következtetni a víz/levegı határfelületen való adszorpciójuk mértékére. Meghatároztuk a hatóanyag-jelölt molekulák oktanol/víz rendszerben való megoszlását. Ennek a módszernek az eredményei összhangban vannak a penetrációs kísérletek eredményeivel. A hatóanyag-konjugátum és a három gyógyszerjelölt közül kettınek a lipiddel való kedvezı kölcsönhatása arra utal, hogy affinitását mutatnak a membránhoz, valószínősítve a membránon való áthatolást, ami kívánatos a fokozott hatóanyagtranszport szempontjából. 27

Köszönetnyilvánítás Köszönöm a kutatási lehetıséget az ELTE TTK Fizikai Kémiai Tanszékének. Köszönetemet szeretném kinyilvánítani témavezetımnek, Dr. Kiss Éva egyetemi docensnek és Hill Katalin PhD hallgatónak az érdekes és újszerő kutatási téma kijelöléséért, a munkám figyelemmel kíséréséért és támogatásáért. Szeretném megköszönni Bısze Szilvia tudományos fımunkatársnak és Horváti Kata PhD hallgatónak, tudományos segédmunkatársnak az együttmőködés lehetıségét és a munkánkhoz szükséges kísérleti anyagok biztosítását. Végezetül köszönöm Hórvölgyi Zoltánnénak a kísérletek során nyújtott segítségét. 28

7. Irodalom 1. G. Chimote, R. Banerjee: Respiratory Physiology & Neurobiology 2005, 145, 65 77 2. E. Jabłonowska, R. Bilewicz: Thin Solid Films 2007, 515, 3962 3966 3. N. Fa, S. Ronkart, A. Schanck, M. Deleu, A. Gaigneaux, E. Goormaghtigh, M.-P. Mingeot-Leclercq: Chemistry and Physics of Lipids 2006, 144, 108 116 4. Global tuberculosis control WHO Report 2007 5. MC. Gutierrez, S. Brisse, R. Brosch, M. Fabre, B. Omais, M. Marmiesse, P. Supply, V. Vincent: PLoS Pathog, 2005, 1(1), 55-61 6. K. Hąc-Wydro, P. Dynarowicz-Łątka, J. Grzybowska, E. Borowski: Biophysical Chemistry 2005, 116, 77 88 7. I. Hutás: Hippocrates, 1999, 1, 260-264 8. J. J. Irwin, B. K. Shoichet: J. Chem. Inf. Model. 2005, 45, 177-182 9. É. Kiss: A kémia újabb eredményei 95, Akadémiai Kiadó, Budapest, 2006, 2-25 10. A. Leo, C. Hansch, D. Elkins: Chem. Rev. 1971, 71, 525-616 11. F. MacRitchie: Chemistry at Interfaces, Academic Press, San Diego, 1990, 215-217 12. M. Manea, F. Hudecz, M. Przybylski, G. Mezı: Bioconjugate Chem., 2005, 16 (4), 921-928 13. J. Miñones Jr., I. Rey. Gómez-Serranillos, O. Conde, P. Dynarowicz-Łątka, J. Miñones Trillo: Journal of Colloid and Interface Science 2006, 301, 258 266 14. K. Nagy: Mycobaktériumok Nocardia Actinomyces http://mikrobiologia.sote.hu/eload/nagykar/myco_m.pdf 15. G. Pataki: Hippocrates, 2005, 1, 18-21 16. M. Pickholz, O. N. Oliveira Jr., M. S. Skaf: Biophysical Chemistry 2007, 125, 425 434 17. R. Pignatello, S. Guccione, F. Castelli, M. G. Sarpietro, L. Giurato, M. Lombardo, G. Puglisi, I. Toth: International Journal of Pharmaceutics 2006, 310, 53 63 18. A. Preetha, N. Huilgol, R. Banerjee: Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 2006, 53, 179 186 19. Gy. Póder: Pneumóniák gyermekkorban http://gyermekklinika.hu/ppt/poder_pneumoniak.ppt 20. R. Maget-Dana: Biochimica et Biophysica Acta 1999, 1462, 109-140 21. Report on tuberculosis cases notified in 2005. EuroTB. 2007 22. A. G. Serrano, J. Pérez-Gil: Chemistry and Physics of Lipids 2006, 141(1-2), 105-118 29

23. T. Shisha, K. Köllı, S. Kiss, Gy. Szıke: Osteologiai Közlemények, 2005, 4, 203-206 24. K. Takácsné Novák, G. Völgyi: Magyar Kémiai Folyóirat, 2005, 4, 169-176 25. R. P. Tripathi, N. Tewari, N. Dwivedi, V. K. Tiwari: Medicinal Resarch Reviews, 2005, 25(1), 93-131 26. B. Vértessy, B. Varga, Z. Szabadka, V. Grolmusz: A scrin-silico projekt: Mycobacterium tuberculosis elleni ígéretes új gyógyszerjelölt molekulák azonosítása nem-konvencionális multidiszciplináris protokoll útján Az MTA Peptidkémiai Munkabizottságának tudományos ülése Balatonszemes 2007. június 5-7. 27. L. Zhao, S. Feng: Journal of Colloid and Interface Science 2006, 300, 314 326 28. ZINC database: http://zinc.docking.org/ 30