Az RkpK fehérje termeltetése

DIPLOMAMUNKA Az RkpK fehérje termeltetése Készítette: HARCI ALEXANDRA biológus hallgató Témavezetők: PÁLVÖLGYI ADRIENN, DR. PUTNOKY PÉTER Pécsi Tudományegyetem, Természettudományi Kar Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék PÉCS, 2006.

1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS...3 1.1. Bevezetés...3 1.2. Nitrogénkötő mikroorganizmusok...3 1.3. A szimbiózis kialakulása a Rhizobium-oknál...4 1.3.1. A Nod faktor...4 1.3.2. Az endoszimbiózis kialakulása...5 1.3.3. A nif és fix gének...5 1.3.4. Sejtfelszíni poliszacharidok...6 1.4. Az rkp régiók...7 2. ELŐZMÉNYEK ÉS CÉLKITŰZÉSEK...11 3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK...12 3.1. Baktériumok, és plazmidok...12 3.2. Baktériumok növesztése...12 3.3. Totál DNS izolálás...12 3.4. Polimeráz láncreakció (PCR)...13 3.5. Fragmentizolálás...15 3.6. Ligálás...15 3.7. Szuper kompetens sejtek készítése...15 3.8. Kompetens sejtek készítése azonnali felhasználásra...16 3.9. Transzformálás...16 3.10. Plazmid DNS izolálás...16 3.11. Emésztés restrikciós endonukleázzal...17 3.12. Agaróz gélelektroforézis...17 3.13. Fehérje túltermelés...17 3.14. SDS-PAGE...18 3.15. Sejtek feltárása...18 3.16. Szekvenálás...18 3.17. Bioinformatikai módszerek...19 4. EREDMÉNYEK...20 4.1. Az rkp-2-es régió szerkezete, az rkpk gén izolálása...20 4.2. Az rkpk gén szekvenciaeltérése...21 4.3. Az rkpk klónozása génexpressziós vektorba...24 4.4. Orientáció megállapítása...24 4.5. Az RkpK fehérje expressziója...26 4.6. Az RkpK fehérje aminosavsorrendje és doménszerkezete...27 4.7. Az RkpK fehérje homológiavizsgálata...29 4.8. A fehérje aktivitása és további terveink...29 5. ÖSSZEFOGLALÁS...30 6. IRODALOMJEGYZÉK...31 7. RÖVIDITÉSEK...37 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS...38 2

1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 1.1. Bevezetés A nitrogén, mely a fehérjék, illetve nukleinsavak egyik legfontosabb építőköve, nélkülözhetetlen az élőlények életfolyamataihoz. A levegő 78%-ban tartalmaz nitrogént, ám ezt a növény nem tudja közvetlenül felhasználni. Számukra általában csak a talajban található oldott, szervetlen ionok (NO - 3, NH + 4 ) hasznosíthatóak mint nitrogénforrás, mely viszont nem minden esetben elegendő. A talajban a nitrogén utánpótlása többféle módon történhet. Ammonifikálás esetében a lebontó szervezetek révén a talajban ammónia jelenik meg, majd ebből nitriten keresztül nitrát ion keletkezik (NH + - 4 NO 2 NO - 3 ). Ez a folyamat a nitrifikáció. A növények a nitrogént ebben a formában tudják a legjobban hasznosítani. A leghatékonyabb mechanizmus a nitrogén megkötésére a nitrogénfixáció, mely a legtöbb energiát igénylő anyagcsere folyamat a biológiában (Simpson and Burris, 1984). Egy molekula megkötésekor 16 ATP-t hidrolizál el az enzimrendszer, miközben a következő egyenlet alapján megtörténik a reakció: N 2 + 10H++ 8e - + nmgatp 2NH 4 ++ H 2 + nmgadp + npi (n>15) A nitrát denitrifikáció során visszakerülhet a légkörbe, így zárva a nitrogéncirkuláció körét. 1.2. Nitrogénkötő mikroorganizmusok A nitrogénkötés kizárólag a prokariótákra jellemző folyamat. A mikróbák szabadon élve, illetve szimbiózisban képesek a légkörben található molekuláris nitrogén fixálására. Az az első modellorganizmus, melynek nitrogénkötő génjeiről írtak, a Klebsiella pneumoniae volt. Ismerünk szabadon élő, ezen belül anaerob (pl. bíborbaktériumok, Clostridium) és aerob (Azobacter) nitrogénkötő szervezeteket. Az utóbbi csoportba tartoznak a cianobaktériumok, melyek között szintén találhatunk szabadon élőket, és szimbiontákat (cianobionták), mint például a Nostoc, és Calothrix fajok, melyeket mohákról, cikászokról, és a zárvatermő Gunerra növényekről izoláltak (West and Adams, 1997). Ezek a fotoautotróf prokarióták állatokkal, növényekkel, gombákkal, algákkal és baktériumokkal egyaránt szimbiózist tudnak kialakítani. A nitrogén megkötése speciális sejtekben, az úgynevezett heterocisztákban történik. Az Eubacteriales rendbe, Rhizobiaceae családba tartozó Rhizobium, Sinorhizobium, Azorhizobium, Mezorhizobium és Bradyrhizobium fajokat összefoglalóan Rhizobium-oknak 3

nevezzük. Ezek Gram-negatív, diazotróf baktériumok, melyek a pillangósok (Fabaceae) gyökerén található gümő sejtjeiben élnek, és az atmoszférából légköri nitrogént képesek megkötni, mely folyamatos nitrogénforrást biztosít a gazdanövény számára. Így a növény nitrogénforgalma függetlenné válhat a talajétól (Hirsch, 1992). A baktériumok cserébe fontos tápanyagokat kapnak. A Sinorhizobium meliloti (régi nevén Rhizobium meliloti), legfontosabb szimbionta partnerei a lucerna (Medicago), a somkóró (Melilotus), és a lepkeszeg (Trigonella) fajok. 1.3. A szimbiózis kialakulása a Rhizobium-oknál 1.3.1. A Nod faktor A Rhizobium genusba tartozó baktériumok és gazdanövényeik speciális jelmolekulák révén ismerik fel egymást. A folyamatra magas fokú gazdaspecifitás jellemző (Dart, 1977). Az interakció kezdetén a növények gyökerei flavonoidokat választanak ki. Ezek aktiválják a NodD transzkripciós regulátorfehérjét, ami beindítja a baktériumban a nod, nol, és noe nodulációs gének expresszióját, melyek a psyma megaplazmid 275 kb-os csoportján belül találhatóak (Schlaman et al., 1998). Ezek a gének a Nod faktor szintézisében és szekréciójában vesznek részt (Zuanazzi et al., 1998). A Nod faktor különböző válaszokat vált ki a növény gyökerén (Dénarié et al., 1996; Downie, 1998), többek között a gyökérsejtben szignáltranszdukciós utat aktivál. A tisztított Nod faktor képes beindítani a gümőképződést, a gyökérszőrök begörbülését, a sejtek osztódását, illetve specifikus növényi géneket aktiválnak, melyeket korai nodulin géneknek (ENOD) nevezünk (Hadri and Bisseling, 1998; Downie and Walker, 1999). A Rhizobium fajoknál a Nod faktor egy lipo-kito oligoszacharid (LCO), mely a fajok között nagyon hasonló alapszerkezetet mutat, az ezt kódoló gének pedig jól tanulmányozottak (Ritsema et al., 1996; Kamst et al., 1998). A Nod gén mutációjakor (Nod - fenotípus) szimbiózis nem jön létre, mert a gümőfejlődés elmarad. A molekula általánosan ß- 1,4 N-acetyl-D-glükózamin alapvázból áll (Mergaert et al., 1997), S. meliloti esetében tetramer szerkezetű, illetve egy 16 C atomos acil láncot is tartalmaz, melyen két telítetlen kötés található. Ezen kívül van még egy acetil csoport a nem redukáló cukorvégen, illetve egy szulfát csoport a redukáló cukormaradékon (Lerouge et al., 1990). A gazdaspecifitásért, és a szimbiotikus partner felismeréséért az alapvázon található specifikus oldalláncok felelősek (pl. S. meliloti esetében a szulfát csoport). 4

1.3.2. Az endoszimbiózis kialakulása Az endoszimbiózis a szimbiózis legfejlettebb típusa, kialakulása igen összetett és bonyolult folyamat. A baktériumok a gazdanövényt az általa kiválasztott flavonoid vegyületek alapján felismerik, majd kemotaxis segítségével a gyökér közelébe kerülnek. Ezt követi a nodulációs gének expressziója, majd a Nod faktor szekréciója. A növény gyökerén egy lektin nevű fehérje található, mely specifikus szénhidrátláncokat tud megkötni, ezzel lehetővé teszi a szimbionta partnerek felismerését, valamint biztosítja a baktériumok tapadását (Bauer, 1981). A fertőzés következtében a gyökérszőrök meggörbülnek, ezzel csapdába ejtve a baktériumokat két sejt sejtfala között. Közben a gyökérszőrök sejtfalán strukturális változások jönnek létre, ami a gyökéri sejtfal invaginációjához vezet, majd létrejön az infekciós fonál. Ez egy csőszerű képlet, mely a leépült, és a módosult sejtfalból, illetve a plazmamembrán betűrődéséből jön létre (Callaham and Torrey, 1981; Ridge and Rolfe, 1985). A fent említett fonál belenő a rizodermisz sejttestjébe, majd ott összeolvad a disztális sejtfallal, végül a baktériumok endocitózissal bejutnak a gümősejt citoplazmájába (van Spronsen et al., 1994). A S. meliloti-ra az indeterminált gümőfejlődés a jellemző, melynek során az infekciós fonál nem a merisztéma sejtekbe jut be, hanem az infekciós zónába, ami a merisztémák zónája mögött található. Itt a baktériumok peribakteroid membránnal vannak körülvéve, és bakteroid formát vesznek fel, miközben a gümő érett gümővé fejlődik (Oke et al., 1999; Margolin, 2000). Ezáltal megindul a nif gének expressziója, így a bakteroidok képesek lesznek megkötni a légköri nitrogént, azt ammóniává alakítani, ami így beépül a növény anyagcseréjébe. Ezért a gazdanövény fontos tápanyagokkal látja el a baktériumokat. 1.3.3. A nif és fix gének Ahhoz, hogy a nitrogénkötés meginduljon, a baktériumoknak fiziológiai változáson kell átesniük, majd aktiválni kell a fixációhoz szükséges nif és fix géneket. A nitrogénkötés folyamatában kulcsfontosságúak a nif gének, melyek plazmidokon találhatóak (Prakash et al., 1981; Thiel 1993; Goodman and Weisz 2002). Nagyon sok esetben ez a géncsoport nem csak a nitrogenáz fehérje alegységeit kódolja, hanem a szabályozásban, aktivációban, metál transzportban, és bioszintézisekben résztvevő proteineket is (Kessler et al., 1998; Kessler and Leigh 1999; Halbleib and Ludden 2000). A nitrogenáz egy ATP-t hidrolizáló redox rendszer, mely két fő részből áll, ezeket a nifhdk gének kódolják. Az első komponens a dinitrogenáz, ami α 2 β 2 (α=nifd és ß = NifK fehérjék) heterotetramerből áll. Ez tartalmaz még két MoFe 7 S 9 - homocitrátot is. A másik része a dinitrogenáz reduktáz, ami egy 2 (NifH fehérje) homodimer, 5

és vasat is tartalmaz. A gének a nifhdken sorrendben követik egymást az operonon. A NifE, és NifN proteinek nagyfokú hasonlóságot mutatnak a NifD és NifK-val, emiatt a NifDK operon megkettőződésével magyarázzák eredetüket. Korábbi tanulmányok szerint, szerepük a FeMo-kofaktor szintézise is. (Fani et al., 2000). Mivel a nitrogenáz enzim működése oxigénfüggő, ezért mikroaerob környezetre van szükség ahhoz, hogy a Rhizobium-ok és a növény közötti kapcsolat tökéletes legyen. Az alacsony oxigénszintet a gümőkben egy oxigén diffúziós barrier tarja fenn (Soupène et al., 1995), ami a leghemoglobin nevű fehérjén, és a baktériumok respirációján keresztül szabályoz.. Alacsony oxigéntenzió esetén a FixL protein (hemoprotein kináz és foszfatáz) érzékeli az oxigénkoncentrációt, és foszforilálja a FixJ fehérjét. Ez a protein aktiválni tudja a nifa és fixk gének transzkripcióját (Reyrat et al., 1993 ; Agron et al., 1993), az utóbbi pedig majd aktiválja a fixnopq és fixghis operont (Batut et al., 1989). Az operonok hozzájárulnak egy citokróm oxidáz komplex szintéziséhez, aminek magas az oxigénaffinitása. Ez lehetővé teszi a Rhizobium-oknak, hogy extrém alacsony oxigénszintű környezetben is fenn tudjanak maradni. Ha a fix gének mutációt szenvednek (Fix - fenotípus), akkor a gümő kialakul, de működésképtelen. 1.3.4. Sejtfelszíni poliszacharidok Számos kutatás bizonyította, hogy a Rhizobium-ok által termelt specifikus sejtfelszíni poliszacharidok, és a nitrogén megkötésére alkalmas gümőképződés között szoros kapcsolat van. Ezek a poliszacharidok lehetnek a külső membránba ágyazódott lipopoliszacharidok, a felszínen található kapszuláris poliszacharidok, ciklikus glükánok, melyek szerepe még nem teljesen tisztázott, illetve a baktérium által szekretált exopoliszacharidok, amik a növény védekezőrendszerét nyomják el (Fraysse et al., 2005). A lipopoliszacharid (LPS) egy immunogén glikolipid, ami a Gram-negatív baktériumok külső membránján van jelen. Szerepe a fertőzés késői fázisában van, például segíti az infekciós fonál bejutását a kéregsejtekbe. Három domén építheti fel, az O antigén, a core oligoszacharid (3-deoxy-D-manno-2-oktulozonsav / Kdo), mely fajokon belül is erősen konzervált, illetve a lipida egység. A lipopoliszacharidoknak két típusát tudjuk megkülönböztetni; az egyik az R-LPS ( rough ), ami egy lipda és egy core oligoszacharid egységet tartalmaz, illetve az S-LPS ( smooth ), ami az O-antigént foglalja magában (Carlson et al., 1992). Az exopoliszacharidoknak (EPS) két típusa ismert S. meliloti-ban. Az EPS I oktaszacharidok (hét glükóz, és egy galaktóz) ismétlődéséből áll. Alegységein piruvil, acetil, 6

és szukcinil csoportok lehetnek, melyek nélkülözhetetlenek az infekciós fonál fejlődésében, és az invázióban. A szukcinoglükán molekula szintéziséért 22 exo gén a felelős, melyből 19 a psymb plazmid 24 kb-os géncsoportjában található, a többi magán a kromoszómán. Ezen gének szerepe jól ismert. Az exof és exoy gének szerepe a galaktóz hozzáadása a lipid hordozóra, majd az exoa, exol, exo M, exoo, exou, exow gének kapcsolják hozzá a lánchoz a többi cukrot. Az exoh, exoz, exov a szukcinát, acetát, és piruvát láncok addiciójához szükséges (Gonzáles et al., 1998). Az ExoP, ExoT, ExoQ fehérjék a polimerizációt és a szukcinoglükán molekula sejtfelszínre való exportját irányítják (Leigh and Walker, 1994). Az EPS II glükóz-galaktóz diszacharid alegységekből áll, piruvil és acetil módosításokat hordoz (Kereszt et al., 1998). A szintéziséért felelős 32 kb-ból alló exp gének a psymb megaplazmidban találhatóak, és 5 operonból állnak (expa, expc, expd, expe, expg) (Becker et al., 1997). Az EPS I-et nem termelő mutáns törzsek nagy része képes az EPS II előállítására, így be tudnak jutni a gyökérbe, vagyis a két poliszacharid helyettesíteni tudja egymást a fertőzési folyamatban (Leigh and Walker, 1994). A kapszuláris poliszacharid (KPS) a baktériumok felszínére szorosan simuló, horgonyzó molekulával nem rendelkező képlet, melyet erős immunogén hatása miatt K-antigénnek is neveznek. Fontos szerepe van a baktérium környezethez való kapcsolatában, illetve a szimbiózis kialakulásának korai fázisában (Becquart-de Kozak et al., 1997). A Sinorhizobium fredii USDA205 törzsnél írták le először, hogy az izolátumban lévő Kdo eltér az eddig ismert klasszikus LPS, és EPS szerkezetétől. Később igazolták, hogy ez a cukor tagja egy Kdogazdag poliszacharidnak (Kdops), ami szerkezetileg analóg azzal a savas KPS-sel (Reuhs et al.,1993), mely az Esherichia coli-nál a patogenitásért felelős (Jann and Jann, 1990). A Rhizobium meliloti AK631 és Rm41-es törzsein is kimutatták ezt a poliszacharidot, melyet Reuhs és munkatársai K R 5 antigénnek neveztek el. A molekula diszacharid alegységekből (glükuronsav és egy 5,7-diamino-3,5,7,9-tetradeoxi nonulozonsav) áll, amelyen 7-N-acetil és 5-N-β-hidroxibutiril módosítások lehetnek. Ezek szerkezete törzsspecifikus (Reuhs et al., 1998). A KPS molekula át tudják venni az EPS szerepét a szimbiózis kialakítása során (Putnoky et al., 1990), ha a baktérium nem termel exopoliszacharidot. 1.4. Az rkp régiók A KPS termeléséért három géncsoport felelős, ezek az rkp-1, rkp-2, és rkp-3 régiók. Különböző törzseken végzett kísérletek igazolták, hogy az rkp-1, és rkp-2-es régiók a Sinorhizobium nemzetségben általánosan jelen van, a hármas régió pedig törzsspecifikus (Kiss et al., 2001). 7

Az rkp-1-es régió 10 gént tartalmaz (rkpa-j). Génjeinek nagy része (rkpa-f) egy zsírsav szintáz komplexet kódol, melynek feladata a szintézishez szükséges lipid hordozó létrehozása. Az rkpj gén a kész molekula módosításában és szállításában játszik fontos szerepet (Petrovics et al., 1993). A régió a cukoralegységek szintézisében, és polimerizációjában nem vesz részt. Az rkp-3-as régió nélkülözhetetlen a KPS bioszintézisében. A benne található 10 gén (rkpl-z) a psymb megaplazmidban foglal helyet. Az rkpl-q gének a vad típusú K R 5 antigén termeléséért és a fertőzés folyamatáért felelősek az Rm41-es törzsek esetében. Mutációjuk esetén vagy hibás K-antigén kerül a sejt felszínére (Kiss et al., 2001), vagy szekréciójuk el is maradhat, mint a GH4046-os törzs esetén (Putnoky et al., 2003), ezért a szimbiózis zavart szenved. Az rkpr, rkps, rkpt gének a poliszacharid szállítását végzik. Az S. meliloti rkp-2-es régiója két ORF-et (open reading frame=nyitott leolvasási keret) (rkpk, lpsl) tartalmaz, melyek szerepe az LPS termelése, illetve az rkpk részt vesz még a KPS kialakításában is. Az LpsL fehérje egy UDP-glükuronsav epimeráz, mely UDPgalakturonsav bioszintézisénél fontos, az RkpK pedig egy UDP-glükóz dehidrogenáz (UGDH), mely az UDP-glükóz átalakulását katalizálja UDP-glükuronsavvá (UDP-GlCa) (1.ábra). 1. ábra Az rkpk és lpsl gének szerepe az LPS és KPS bioszintézisében S. meliloti-nál (Kereszt et al., 1998) 8

Az UDP-GlCa szintézise egy NAD-függő, irreverzibilis folyamat, 1 mol UDP-GlCa UDP-glükózból való előállításához 2 mol NAD szükséges. Az enzim működésének mechanizmusát a 70es években írták le először. A folyamat egy bi-uni-uni-ping-pong reakció (Campbell et al., 1997), melynek mechanizmusát a 2. ábra mutatja. 2. ábra: A bi-uni-uni-ping-pong reakció: Az UGDH lehetséges kinetikájának mechanizmusa (Campbell et al., 1997). A vonal az enzimet jelöli, a felfelé mutató nyilak a szubsztrát kötését, a lefelé mutató nyilak a termék felszabadulását mutatják. Első lépésben a szubsztrát (UDP-glükóz) és a koenzim (NAD + ) kapcsolódik az enzimhez, majd az UDP-glükóz aldehiddé oxidálódik, miközben a NAD + NADH-vá redukálódik. Ezt követően a második NAD + kötődik hozzá az enzimhez, ez is redukálódik, ezalatt pedig kialakul az UDP-Glca (3. ábra). Ez a molekula sejttípustól függően alakul tovább UDP-xilózzá, UDP-arabinózzá, UDP-galakturonsavvá, vagy egyéb vegyületekké. A folyamatra feedback gátlás jellemző, melyet a NADH és az UDP-Glca irányít (Ordman et al., 1977). Az UGDH ph optimuma 9, mégis a reakció ph 8. 7-en játszódik le, mert így az enzim stabilabb (Zalitis et al., 1972). 3. ábra Az UDP- glükuronsav kialakulása UDP-glükózból (De Luca et al., 1996). 9

A legtöbb eukariótában az UGDH egy kb. 300 kda-os homohexamer, melynek egy dimere egy szubsztrátmolekula megkötésére képes (Feingold et al., 1981). Prokarióták esetében mind a 45 kda-os monomer (Campbell et al., 1997), mind a 94 kda-os dimer (Schiller et al., 1973) aktív, ellenben az emlősöknél, ahol monomer formájában az enzim működésképtelen (Jaenicke et al., 1986). Ember és szarvasmarha közt 99%-os, ember és baktérium közt 58%-os, illetve ember és növény közt 21%-os homológia figyelhető meg (Roman, 2004). A baktériumok és gombák esetén az enzim a membránhoz kötött, míg a többi esetben ez a citoszólban van jelen (Griffith et al., 2004 ;Rigg et al., 1998). Számos kísérlet igazolta, hogy az UDP-Glca taxononként eltérő termékek prekurzor vegyülete. Baktériumoknál a kapszuláris poliszacharidok előanyaga, mely a rezisztencia kialakításáért felelős, növényeknél a sejtfal felépítéséhez szükséges mátrixpoliszacharidok (pektin, hemicellulóz) előállításához szükséges. Emlősök esetében glikoproteinek, és proteoglikánok szintézisének alapvegyülete, mely a glükózaminoglikánok (kondroitin szulfát, heparán szulfát, hialuronsav) polimerizációjához szükséges. 1. táblázat: Az RkpK fehérje jellemzői különböző taxonoknál. Organizmus Streptococcus pyogenes Cryptococcus neoformans Drosophila melanogaster Arabidopsis thaliana NAD kötő domén Domének hossza (aminosav) Centrális domén UDP kötő domén UDP-GlcA szerepe Hivatkozás 22-173 197-290 313-396 virulencia Dougherty, 1993 7-206 215-312 334-449 virulencia Bar-Peled, 2004 1-200 209-306 328-444 heparán szulfát bioszintézise szárny kialakítása Benevolenskaya, 1998 2-200 209-306 328-452 sejtfal bioszintézise Yamada, 2003 Szarvasmarha 5-204 213-310 332-446 Humán 5-204 213-310 332-446 glükózaminoglikánok szintézise glükózaminoglikánok szintézise Lind, 1999 Strausberg, 2004 10

2. ELŐZMÉNYEK ÉS CÉLKITŰZÉSEK A szimbiózis kialakulásához nélkülözhetetlenek a baktériumok által termelt sejtfelszíni poliszacharidok (EPS, KPS, LPS). Ezek előállításában az rkp régiók játszák a fő szerepet. Kereszt Attila és munkatársai 1998-as cikkükben új rkp régiókat írtak le S. meliloti esetében. A csoport Tn5-ös random mutagenezissel új mutációkat azonosított, melyek a KPS bioszintézisével kapcsolatosak. Kísérleteik alapján két új lókuszt írtak le, melyek az rkp-2, és rkp-3 nevet kapták. Jelenlétük meghatározza az endoszimbiózis kialakulását. Az rkp-2-ben található két ORF törzsspecifikus, monocisztronos egységet alkotnak. Ebben a régióban található két gén közül az rkpk feltehetően egy UDP-glükóz dehidrogenázt kódol (Kereszt et al., 1998). Ez az enzim az UDP-glükuronsav bioszintéziséhez szükséges, mely a sejtfelszíni poliszacharidok közül az LPS és KPS prekurzor molekulája (A másik gén az lpsl, mely csak az LPS kialakításában játszik szerepet). A további bioszintézisutakat valószínű az rkp-3-as régió irányítja. Bármely gazdanövény esetében a KPS helyettesíteni tudja az EPS-t a fertőzési folyamat során, melyet mutánsok vizsgálatával már előzőleg igazoltak. Ilyen például az AK631-es törzs, mely képtelen az exopoliszacharid előállítására, viszont a termelt KPS miatt mégis létrejön az endoszimbiózis (Petrovics et al., 1993 ; Putnoky et al., 1990). Kísérleteink célja az rkpk gén izolálása és felsokszorozása, majd ennek bejuttatása génexpressziós rendszerbe, a továbbiakban pedig az RkpK fehérje túltermeltetése E. coli baktériummal, illetve ennek elválasztása a többi fehérjétől. Utolsó lépésként szeretnénk az enzim szerkezetét és funkcióját bioinformatikai módszerekkel még jobban megismerni. 11

3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1. Baktériumok, és plazmidok A kísérleteink során felhasznált baktériumtörzseket és plazmidokat a 2. táblázat tartalmazza. 2. táblázat: Baktériumok, plazmidok Név Jellemző Referencia S. meliloti AK631 RM41 exob631 (Nod+ Fix+) Putnoky P. E. coli XL1 Blue K12, reca1, enda1, gyra96, thi-1, hsdr17, supe44, rela1, lacz M15 Strategene AV23 XL1Blue pbs EcoRV :: rkpk AmpR Ezen munka AV78 XL1Blue pet:: rkpk BamHI fragment AmpR Ezen munka AV269 BL21 (DE3) pav78 AmpR Ezen munka AV313 BL21 (DE3) pet3 AmpR Ezen munka PP3113 AT599 = DH5 alfa puc19:: 5.5. Bam ori-1, rkp-2. Putnoky P. BL21 (DE3) F - ompt hsdsb (r - Bm - B) gal dcm (DE3) Novagen Plazmidok pbluescript pbluescript II SK (+), AmpR, klónozó vektor Strategene pet3 Transzkripciós vektor, AmpR Novagen 3.2. Baktériumok növesztése Vizsgálatainkhoz Sinorhizobium meliloti, illetve Esherichia coli törzseket használtunk. Az S. meliloti törzseket steril TA (Orosz et al., 1973) táptalajon 32 o C-on, az E. coli törzseket pedig steril LB/komplett (Sambrook et al., 1989) táptalajon 37 o C-on növesztettük. A táptalajokba előzőleg belekevertünk ampicillint, melynek végkoncentrációja így 100µg/ml lett. 3.3. Totál DNS izolálás Az előző este leoltott baktériumkultúrát egy éjszakán át (O/N) növesztettük, majd másnap 1,5ml-t Eppendorf csőben lecentrifugáltunk. A felülúszó leöntése után 300µl TE (50mM TrisHCL, 20mM EDTA, ph 8,0) oldatban felszuszpendáltuk a sejteket, 100µl 5%-os 12

SDS-TE oldattal feltártuk azokat, végül 100µl előinkubált pronase oldatot (2,5 mg/ml pronase TE oldatban) adtunk minden csőhöz, mely a fehérjék nagy részét denaturálta. 37 o C-on 1-3 órát inkubáltuk az oldatot, majd utána 500µl TE oldattal telített fenollal ráztuk össze. 5 perc ülepítés után a felső fázist új csőbe pipettáztuk át, 500µl fenol-kloroform oldattal összeráztuk, majd centrifugáltuk, végül 500 µl kloroformot adtunk hozzá. Újabb centrifugálást követően a felső réteget új csőbe pipettáztuk, és a DNS-t két térfogat etanollal kicsaptuk. Ezt követően a DNS fehér, kocsonyás cseppet alkotott, melyet pipettahegy segítségével új csőbe tettünk át, amibe előzőleg már bemértünk 500µl 70%-os etil-alkoholt. Centrifugálás, és szárítás után a csapadékot 100µl steril desztillált vízben feloldottuk, a mintát pedig 5 o C-os hűtőszekrényben tároltuk (Meade et al., 1982). 3.4. Polimeráz láncreakció (PCR) Az rkpk gént is tartalmazó DNS szakaszt PCR segítségével sokszoroztuk fel. A reakciót a következőképpen állítottuk össze: 1 µl DNS 2 µl dntp (10x) 2 µl PCRmix (10x) 1 µl 3 primer 1 µl 5 primer 13 µl 3xH 2 O 0,5 µl Pfu (5 U/µl) Az amplifikációhoz az RKPK-LPS programot használtuk: 1. 1 30 95 o C 2. 30 95 o C 3. 40 57 o C 4. 2 72 o C 5. 4x a második lépésre 6. 30 95 o C 7. 40 64 o C 8. 2 72 o C 9. 30x a hatodik lépésre 10. End 13

A felsokszorozáshoz az RK-32, és RK-52 primereket használtuk, melyek szekvenciáit a 3. táblázat tartalmazza. Az így nyert DNS szakasz hossza 1383 bázispár, mely 1%-os agaróz gélen, marker jelenlétében detektálható. A pet3 vektorba való inszert beépülését kolónia PCR-ral ellenőrztük, mert ebben az esetben a kék-fehér szelekció nem használható. A fogpiszkálót a telephez érintettük, majd a lemezen csíkot húztunk vele, végül 20µl steril 3x H 2 O-ba szuszpendáltuk fel a baktériumsejteket. Egy-egy csőbe tíz telepet tettünk, majd a következő reakciót állítottuk össze: 1 µl DNS 5 µl 4xPCR mix 1 µl 3 primer 1 µl 5 primer 12 µl 3xH 2 O 0,5 µl Taq (5 U/µl) Az amplifikáció után a DNS-t 1%-os agaróz gélen elválasztottuk (5µl minta, 5µl 1xSTOP, 5µl 2xSTOP), majd a keresett DNS szakaszt tartalmazó mintákat tovább bontottuk ötös csoportokra, csíkoztuk, felsokszoroztuk, majd elválasztottuk őket. Végül az inszertet tartalmazó telepekkel egyesével is végrehajtottuk az előző műveletet. Polimeráz láncreakciót használtunk orientáció megállapítására is, melynek során azt vizsgáltuk, hogy az inszert milyen irányban épült be a pet3 vektorba. A kísérlethez az RK- 32, az RK-52 és a pet3-1-es primereket használtuk. Ezek szekvenciáját a következő táblázat tartalmazza. 3. táblázat: Munkánk során használt primerek szekvenciái. Primer neve Primer szekvencia RK-32 5 GGATCCGGAGGAAGAGCGATGAAAAT 3 RK-52 : 5 GGATCCAAGCTTCCCTCTGCTGACCAATCA 3 pet3-1 5 CGATATAGGCGCCAGCAACC 3 T3 primer 5 ATTAACCCTCACTAAAG 3 T7 primer 5 TTATGCTGAGTGATATC 3 14

3.5. Fragmentizolálás A kísérlethez csövenként 15µl a PCR reakció során felsokszorozott DNS-t, 4µl 5xSTOP-ot, és 1µl 3x H 2 O-t használtunk fel. A DNS szakaszok szétválása után a vizsgálni kívánt fragment előtt a gélbe szikével belevágtunk, és ebbe a résbe Whatman DE 81 papírt helyeztünk. 20 perces, 40V-on történő futtatás után a fragment a papírra került, melyet utána Eppendorf csőbe tettünk. A DNS-t a papírról kétszer egymás után 100µl 1M-os NaCl oldattal mostuk le, majd 20µl 3M Na-acetáttal (ph 7,0), és 140µl izopropanollal kicsaptuk. A csövet O/N -20 o C-ra tettük, majd centrifugálás, mosás, szárítást követően a csapadékot 30µl 3x H 2 O-ben vettük fel. 3.6. Ligálás Az inszert enzimatikus beillesztéséhez T4 ligázt használtunk. A reakciót a következőképp állítottuk össze: 1 µl DNS 1 µl vektor 3 µl 5x enzimpuffer 10 µl 3x H 2 O 0,5 µl T4 ligáz (10 U/µl) Az enzimpuffer 200mM TrisHCL-t, 50mM Mg Cl 2 -t, 50mM dithiotreitolt, 2,5 mm ATP-t, tartalmazott, ph-ja 7,8. Az elegyet 2 órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáltuk. 3.7. Szuper kompetens sejtek készítése Az XL1-Blue sejteket 200ml SOB tápoldatban (2% Bacto trypton, 0,5% yeast extract, 10mM NaCl, 2,5mM KCl, ph 7,0) 22 o C-on O/N OD 600 =0,5-0,6-ig növesztettük, majd a kultúrát 10 percre jégre tettük. 10 perc centrifugálást követően 80ml előzőleg behűtött TB pufferben (10 mm PIPES, 15mM CaCl 2, 250mM KCl, ph 6,7) szuszpendáltuk fel a sejteket. 10 perc jégen való inkubáció után a sejteket ülepítettük, és 20ml jéghideg TB pufferbe vettük fel őket. 0,07 tf DMSO hozzáadása után a sejteket Eppendorf csövekbe osztottuk el, majd a felhasználásig -80 o C-on tároltuk őket (Inoue et al., 1990). 15

3.8. Kompetens sejtek készítése azonnali felhasználásra A transzformálandó sejteket LB tápfolyadékba oltottuk le a megfelelő antibiotikum jelenlétében, majd O/N növesztettük őket. Másnap OD 600 =0,05-re visszahigítottuk, és 32 o C- on erős rázatással OD 600 =0,5-ig növesztettük a kultúrát. A lombikot 10 percre jégre tettük, majd előhűtött Eppendorf csövekbe 1ml-t átpipettáztunk, és a baktériumszuszpenziót lecentrifugáltuk. Az összegyűjtött sejteket először 0,4 tf, majd centrifugálás után 0,1 tf jéghideg TB pufferbe vettük fel. 0,07 tf DMSO hozzáadását követően a sejteket transzformáltuk. 3.9. Transzformálás A pbluescript-tel való munkához 200µl szuper kompetens sejtet használtunk, melyet jégen olvasztottunk fel. Ezek után hozzáadtunk 5µl DNS-t, és 20 percig 0 o C-on, majd 3 percig 37 o C-on inkubáltuk az elegyet. Következő lépésként 800µl LB tápoldatot pipettáztunk a sejtekhez, és 60 percre 37 o C-ra tettük őket. A transzformált sejteket szelektív táptalajra kentük, mely 100µg/ml ampicillint, 40µl Xgal-t (2%, dimetil-formamidban), illetve 40µl IPTG-t (24mg/ml) tartalmazott. A lemezeket 24 órára 37 o C-os termosztátba helyeztük. A pet3-ba való transzformáció során a 3.7. fejezet alapján készített kompetens sejteket használtuk fel. A szuszpenziót szelektív LB lemezre kentük ki. 3.10. Plazmid DNS izolálás Az izolálást Ish-Horowicz és Burke módszere szerint végeztük (Ish-Horowicz and Burke, 1981). A baktériumsejteket egy éjszakán át 3ml tápfolyadékban a megfelelő antibiotikum jelenlétében növesztettük. 1,5ml sejtkultúrát Eppendorf csőben lecentrifugáltunk, majd a felülúszó leöntése után 100µl TEG oldattal (25mM TrisHCL, 10mM EDTA, 50mM glükóz, ph 8.0) a DNS-t lebontó enzimeket inaktiváltuk. A sejteket 200µl NS oldattal (0,2N NaOH, 1% SDS) tártuk fel. A mintákat 5 percre jégre tettük, majd 160µl előre lehűtött Na-acetátot (3M, ph 4,8) adtunk hozzá, így a kromoszomális DNS, és a fehérjék nagy része kicsapódott. 5 perc 0 o C-os inkubálást követően 5 perces centrifugálás következett, a felülúszót pedig 400µl izopropanolt tartalmazó csövekbe pipettáztuk át. 10 perc -20 o C-os inkubálás után a csapadékot ülepítettük, 70%-os etanollal mostuk, majd termosztátban szárítottuk. A csapadékot 100µl TRIS-Ac pufferben (50mM TrisHCL, 100mM Na-acetát, ph 8,0) oldottuk fel. A DNS-t 200µl etanollal újra kicsaptuk, végül 5 perc inkubáció, 16

centrifugálás, mosás és szárítás után a csapadékot 50µl RNáz-os trideszt vízbe (100µl/ml RNáz) szuszpendáltuk fel. 3.11. Emésztés restrikciós endonukleázzal A reakciót a következőképpen mértük össze: 1µl DNS 1,5µl 10x enzim puffer 12,5µl 3x H 2 O 0,5µl enzim 10U/µl Az elegyet 3 órán át 37 o C-on inkubáltuk (Sambrook et al., 1989), majd agaróz gélelektroforézissel elválasztottuk a DNS-t. 3.12. Agaróz gélelektroforézis A fragmentek molekulasúlyuk szerinti elválasztására ezt a módszert használtuk. A DNShez 1/5 rész (5µl) 5xSTOP (10% ficoll-400, 0,25M EDTA ph 8.0, 0.2% brómfenolkék) oldatot adtunk, majd az 1%-ban agarózt tartalmazó gélt (1g agaróz, 100ml 1x TBE puffer, 100 µl etidium-bromid /100 µg/ml/ ) 0.5x TBE puffer (5x TBE törzsoldat: 54g TRIS, 27,5g bórsav, 20ml 0,5 M EDTA ph 8,0 /1000ml) tartalmú futtatókádba tettük. Az elválasztást kis gél esetén 60V-on, fragmentizoláláskor 40V-on végeztük. Kontrollként PstI enzimmel emésztett λ DNS-t alkalmaztunk. 3.13. Fehérje túltermelés A transzformált sejteket 4ml LB-ben a megfelelő antibiotikum jelenlétében O/N növesztettük. A másnapra felnőtt bakteriumokat 100x-ra higítottuk (4ml tápfolyadékba 200µl baktériumkultúra), 37 o C-on OD 600 =0,6 fölé növesztettük őket, majd IPTG-vel (283,3g/mol) 1mM-os végkoncentrációt állítottunk be. A kísérletnek megfelelően 3-5 órát inkubáltuk a mintákat. Ezután 1ml-t Eppendorf csőbe mértünk ki, és ülepítés, majd a felülúszó leöntése után a sejteket felhasználásig -20 o C-ra tettük. A maradék kultúrából 10x-es higítást készítettünk, és 600nm-en OD értéket mértünk. A mintákat a futtatás előtt az OD érték függvényében 2x sample puffer-be (124mM TRIS ph 6,8, 4% SDS, 20% glicerol, 10% merkaptoetanol, 0,1% BFB) vettük fel. Ezután 15 17

perc forralás, és 5 perc centrifugálás következett. A kék színű felülúszót (kb 100µl), új csőbe pipettáztuk át. 3.14. SDS-PAGE A fehérjéket SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel választottuk el egymástól. Először a 12,5%-os futtatógélt, majd a felső, 5%-os tömörítőgélt mértük össze. A mintákból 5-15µl-t, a kontrollból (Fermentas SM0431) 5µl-t vittünk fel a kísérletnek megfelelően, majd 50 ma-en a fehérjéket elválasztottuk egymástól. A gélt ezek után 24 órára 1%-os Comassie brilliant blue festékbe tettük. Másnap a géleket 4-5-ször vagy 30% metanol és 10% ecetsav tartalmú oldattal, vagy 40% etanolos és 10% ecetsavas oldattal mostuk át, végül a gélt lefotóztuk. A kísérlethez felhasznált oldatok a következők voltak: A 15%-os futtató gélhez: 29:1 akrilamid / bisakrilamid, 375mM TRIS ph 8,8, 0,1% SDS, végül 1y µl 10% APS, 0,33y µl TEMED A 10%-os tömörítőgélhez: 29:1 akrilamid / bisakrilamid, 125mM TRIS ph 6,8, 0,1% SDS, végül 5y µl 10% APS, 1y µl TEMED A higítópufferhez: 375mM TRIS ph 8,8, 0,1% SDS 10x glicin puffer: 250mM TRIS, 2M glicin, 1% SDS Festék: 0,15-0,20% comassie brilliant blue R-250 (CBBR), 40% etanol, 10% ecetsav 3.15. Sejtek feltárása A sejteket OD 600 =0,6 fölé növesztettük, majd 0,5mM IPTG-vel indukáltuk a fehérjetermelést. 4 o C-on 10 percig ülepítettük a sejteket, majd 1mM MgCl 2 tartalmú 100mMos TrisHCl pufferrel (ph 8,5) mostuk át a baktériumokat. Újabb centrifugálás után a csapadékot ismét pufferben vettük fel, mely tartalmazott még 1mM MgCl 2 -ot, 5mM DDT-t (dithiothreitol), 1mM PMSF-et (fenilmetilszulfonil fluorid), 20µg/ml DNáz I-et és ugyanennyi RNázt. A szuszpenziót ezután French Press -en háromszor átpréseltük, majd 30 perces centrifugálás következett 4 o C-on. 3.16. Szekvenálás A DNS fragmentek bázissorendjének meghatározása az MTA Szegedi Biológiai Központ DNS Szekvenáló Laboratóriumában történt. A pbluescriptben található inszert szekvenálásához a T3, és T7 primereket, a vad típusú baktériumból való rkpk gén bázissorendjének meghatározására az RK-32, és RK-52-es oligonukleotidokat használtuk. A 18

pet-3 inszertjének szekvenciameghatározására a pet3-1-es primer segítségével történt. Az oligonukleotidok szekvenciáit a 3. táblázat tartalmazza. 3.17. Bioinformatikai módszerek Az rkpk gén szekvenciáját az NCBI (National Center for Biotechnology Information) nukleotid adatbázisából (www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=nucleotide), az aminosavsorrendet pedig ugyanehhez az oldalhoz tartozó proteinadatbázisából (www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=protein) kerestük ki. Az RkpK fehérje homológiavizsgálatához az NCBI honlapon keresztül elérhető BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) programcsaládot alaklmaztuk, a domének vizsgálatához a Pfam (www.sanger.ac.uk/software/pfam) honlapját. 19

4. EREDMÉNYEK 4.1. Az rkp-2-es régió szerkezete, az rkpk gén izolálása Az rkpk és lpsl géneket a PP3113-as E. coli baktériumból izoláltuk, mely a pat599-es plazmidon tartalmazza az rkp-2-es régiót (4. ábra). A két gént speciálisan tervezett oligonukleotidok (RK-32, RK-52) segítségével PCR reakció során amplifikáltuk. A reakcióhoz Pfu polimerázt használtunk, mely nagyobb hatékonysággal hoz létre tompa véget a fragment végén, mint a Taq polimeráz. A két gént agaróz gélelektroforézissel méretük alapján elválasztottuk (5. ábra), végül az rkpk fragmentet izoláltuk. Az rkpk gén 1.314 kb (6. ábra), míg az lpsl 1.025 kb nagyságú (Kereszt et al., 1998). A primereket úgy terveztük, hogy azokkal BamHI-es hasítóhelyeket tudjunk bevinni a PCR termékbe. Ennek jelenlétét a későbbi kísérleteink során használtuk ki. Az én feladatom az rkpk gén vizsgálata volt, az lpsl génnel kutatócsoportunk másik tagja, Pálvölgyi Adrienn dolgozott. 4. ábra: Az rkp-2-es régió szerkezete. A felső ábrán a pat330-as kozmid fizikai térképe van feltüntetve (E=EcoRI ; B=BamHI), alul pedig a régió két génje néhány, a munkánk során használt restrikciós endonukleáz hasítóhelyével. 20

1. 2. 3. 5. ábra: A PCR fragmentek gélfotója (1. λpst ; 2. rkpk ; 3. lpsl). A kép alapján a két gén megkülönböztethető egymástól. 4.2. Az rkpk gén szekvenciaeltérése Az rkpk gént a továbbiakban pbluescript (pbs) plazmidba, EcoRV restrikciós helyre ligáltuk (7. ábra), majd ezt XL1-Blue sejtekbe juttattuk be. Ez a plazmid tartalmazza a lacz alfa fragmentet, melynek segítségével kék-fehér szelekcióval az inszertet tartalmazó baktériumok elkülöníthetőek egymástól. A fehér telepeket alkotó baktériumsejtekből plazmid DNS-t izoláltunk, majd a pbluescript vektor T3 és T7 primerei segítségével ezt megszekvenáltattuk. Az elvárásoknak megfelelő konstrukciót tartalmazó egyik törzset AV23 név alatt gyűjteményünkbe tettük. A nukleotidsorrend elemzése során két helyen is eltérést találtunk a közölt szekvenciához képest (AJ222661), ezért több klónt is megszekvenáltattunk. Ez az eltérés minden esetben tapasztalható volt, ezért elhatároztuk, hogy a vad típusú baktériumból is meghatározzuk ezen gén szekvenciáját. Az AK631 törzsből totál DNS-t izoláltunk, majd a gént polimeráz láncreakció segítségével amplifikáltuk, végül ezt is megszekvenáltattuk. Az eltérést itt is megfigyeltük, így megállapíthattuk, hogy az adatbázisban található szekvencia eltér a mi adatainktól, valamint a mi esetünkben nem PCR illetve szekvenálási hibáról van szó. Az eltérés oka az lehet, hogy Kereszt Attila és munkatársai más törzssel végezhették kísérleteiket (RM41). Az eltéréseket a 6. ábrán pirossal jelöltük. 21

atgaaaatca cgatgatcgg tgccggctat gtcggccttg tttccggtgt ttgctttgcg 60 RK52 gatttcggcc atgacgtcgt ctgcgtcgac aaggacgaag gcaagatctc ggcgctgaag 120 aagggtcaga ttccgatttt cgaacccggg ctggaccatc tcgtcgccag caacgtcgcg 180 tccgggcgcc tgaacttcac cgacgatctc aagaccgccg tggccgccag cgacgtggtt 240 ttcattgccg tcggaacgcc gtcacggcgc ggcgacgggc atgcggatct ttcctatgtt 300 tacgcagctg cacgcgaaat cgcctccaac cttcagggct tcaccgtcgt cgtgaccaag 360 tcgacggttc cggtcggtac cggagacgag gtcgagcgca tcatccgcga gaccaatccc 420 gcggttgacg tcaccgtcgt ctccaacccg gaattcctgc gggaaggtgc cgcgatcgag 480 gattttaaac ggcccgaccg gatcgtcatc ggggtcgacg gcagcgacgg tcgcgcgcga 540 gaggtgatga cggaagtcta taggccgctc tatctcaacc agtcgccgct cgtgttcacg 600 acacgccgca cttcggaact gatcaaatat gccggcaacg ccttcctggc gatgaagatc 660 accttcatca acgagattgc cgatctgtgc gagaaagtcg gtgccaatgt gcaggacgtc 720 gcccgcggca tcgggctgga cggccgcatc gggtcgaagt tcctgcatgc cgggccggga 780 tatggcggct cctgcttccc caaggacaca ttggcgctgg tcaagaccgc gcaggaccac 840 gacacccccg tgcggctcgt cgaaaccacg gtcgccgtca acgacaaccg caagcgggcg 900 atgggacgca aggtgatcgc ggcggccggc ggcgatatcc gcgggtccaa gtacgcggtc 960 at ctcggcctga ccttcaagcc gaataccgac gacatgcgcg acacgcccgg catcgcggtc 1020 gttcaggcgc tgcaggacgc aggcgcccgg gtcaccggct acgacccgga aggaatggaa 1080 gc aacgcgcgca agctgataga ggggctggac tgcgcgcgcg atccctatga agcggcggca 1140 gaggcggacg ctctggtgat catcaccgag tggaacgaat tccgggcgct ggatttcgac 1200 cgtttgaagt ctaccatgaa gacgcccctg ctcgtcgatt tgcgcaatat ctatcgcaag 1260 gacgaggtcg caaagcacgg cttccgctat gcgagcatcg gcaggccgga ctga 1314 RK-32 6. ábra: Az rkpk gén szekvenciája (AJ222661). Pirossal az általunk kapott eltéréseket jelöltük az adatbázis sorrendjéhez képest, alatta pedig feltüntettük az általunk kapott bázisokat. Zöld négyzet a primerek elhelyezkedését mutatja. 22

Ligálás EcoRV helyre Emésztés EcoRV enzimmel 7. ábra: Az rkpk gén klónozása pbluescript II SK(+) plazmidba. Az ábrán a klónozás első lépései vannak feltüntetve. Az rkpk gént tartalmazó PCR fragmentet a plazmid EcoRV helyére ligáltuk. 23

4.3. Az rkpk klónozása génexpressziós vektorba Az RkpK fehérjét a pet3 expressziós vektor segítségével kívántuk túltermeltetni. Ez a plazmid a pbr322-es vektorból származik, melynek tetraciklin génjének BamHI-es helyére lett beépítve egy erős promóter (ф10), és egy terminátor régió (Tф). Ezek közé ligáltuk be az rkpk gént. Ezt a konstrukciót a megfelelő gazdasejtbe juttatva a beépített gén átírása irányítható, mivel a gazdasejt kromoszómáján található T7 polimerázt kódoló gént IPTG hozzáadásával indukálni lehet. A polimeráz a vektor T7 promóteréhez (ф10) kötődik, így megindul a gén által kódolt fehérje expressziója. A vektor tartalmaz rezisztenciagént is, ez esetünkben a bla gén. Ennek terméke a béta laktamáz nevű enzim, mely bontani képes az ampicillint, így biztosítva a baktériumoknak a túlélést. A PCR reakció során bevitt BamHI restrikciós helyeket ennél a kísérletnél használtuk ki. A szekvencia ellenőrzése után a klónozott rkpk gént a pbs vektorból BamHI restrikciós endonukleázzal vágtuk ki, a megfelelő fragmentet izoláltuk, majd a 4,6 kilobázis hosszúságú pet3 génexpressziós vektorba ligáltuk (8. ábra). A ligált DNS-t XL1-Blue sejtekbe juttattuk be. Mivel ebben az esetben a kék-fehér szelekció nem használható az inszertet tartalmazó klónok kiválasztására, ezért a plazmidot tartalmazó baktériumokat kolónia PCR alkalmazásával (RK-32 és RK-52 primerek) teszteltük az rkpk gén jelenlétére. Egy telepet a törzsgyűjteménybe tettünk AV78 név alatt. 4.4. Orientáció megállapítása Mivel a gén bejuttatása nem volt irányított, ezért az inszert orientációját PCR reakcióval határoztuk meg. A kísérlethez az RK-32 és RK-52-es primereket használtuk, melyeket a pet3-1-es oligonukleotiddal párba állítva alkalmaztunk. A keletkező PCR-fragmentek méretéből következtetni lehetett az irányultságra. Jó orientáció esetén a pet3-1 RK-32 primerek egy ~1,3 kb nagyságú fragmentet adnak, a pet3-1 RK-52 primerek párosításakor nincs detektálható fragment. (9. ábra). Az utóbbi esetnél a gélképen a primerek, illetve szennyeződés látható. Az 1., 2., 5.-ös minták (AV269), illetve a 3., 4., 6.-os minták eltérő klónokból származtak. Az 5. és 6. minták kontrolként szerepeltek annak igazolására, hogy a reakció működik (lásd 4.1. fejezet). 24

Ligálás BamHI helyre Emésztés BamHI enzimmel 8. ábra: Az rkpk gén klónozása pet-3 vektorba. A vektort BamHI enzimmel vágtuk, majd ide ligáltuk be a PCR terméket. 25

A gélfotó alapján mindkét klónba helyes orientációban épült be a fragment. Az inszert irányultságának megállapítására restrikciós endonukleázzal való emésztés is használható, de ez a módszer időigényesebb, és jóval összetettebb, ezért nem alkalmaztuk. λ 1. 2. 3. 4. 5. 6. 9. ábra:orientáció megállapítása PCR-ral (1. pet3-1 RK-32; 2. pet3-1 RK52; 3. pet3-1 RK- 32; 4. pet3-1 RK52; 5. RK-32 RK-52; 6. RK-32 RK-52). 4.5. Az RkpK fehérje expressziója A továbbiakban a jó orientációjú fragmentet tartalmazó vektorokat BL21 (DE3) rendszerbe juttattuk be. Ez a pet vektorokkal együtt egy indukálható expressziós rendszer, melynek segítségével a vizsgálni kívánt fehérjét túl lehet termeltetni. Ez a konstrukció gyűjteményünkben az AV269-es nevet kapta. A fehérje expresszióját IPTG-vel indukáltuk, majd körülbelül 3-5 órán keresztül inkubáltuk a kultúrát. Kontrollként nem indukált baktériumokat is használtunk ugyanabból a törzsből, illetve az AV313-as baktériumot, mely nem tartalmazta az inszertet. A sejteket French Press segítségével, nagy nyomáson feltártuk, és a fehérjéket a sejttörmeléktől ülepítéssel különválasztottuk. A feltárás és centrifugálás után megvizsgáltuk, hogy a túltermeltetett fehérje mely frakcióban jelenik meg. (10. ábra). Az SDS-PAGE gélképen látható, hogy az expresszió sikeres volt, mert megjelent a 47kDa-nak megfelelő fehérje sáv, ami viszont az indukálatlan (AV269), és az inszert nélküli mintáknál (AV313) hiányzik. A feltárás utáni minták elválasztásából látszik, hogy az RkpK fehérje a csapadékban található, amiből arra következtetünk (szakirodalomban is találtunk erre utalást), hogy a fehérje úgynevezett inclusion body formában lehet jelen. 26

10. ábra: Az RkpK fehérje elválasztása az AV269-es törzsben (1. nem indukált; 2. indukált; 3. sejtfeltárás után a felülúszó; 4. sejtfeltárás után a csapadék). Az RkpK fehérje sávja piros nyíllal van jelölve. 4.6. Az RkpK fehérje aminosavsorrendje és doménszerkezete Mivel az adatbázis hibásan tartalmazta a nukleotidsorrendet, így az általuk kapott szekvenciát fordítottuk le, és ezt elemeztük a továbbiakban. Az aminosavsorrendet, és a domének elhelyezkedését a 11. és 12. ábra tartalmazza, az adatbázishoz képesti eltérést pirossal jelöltük. 11. ábra: Az RkpK fehérje doménszerkezete 27

MKITMIGAGYVGLVSGVCFADFGHDVVCVDKDEGKISALKKGQIPIFEPG 50 LDHLVASNVASGRLNFTDDLKTAVAASDVVFIAVGTPSRRGDGHADLSYV 100 YAAAREIASNLQGFTVVVTKSTVPVGTGDEVERIIRETNPAVDVTVVSNP 150 EFLREGAAIEDFKRPDRIVIGVDGSDGRAREVMTEVYRPLYLNQSPLVFT 200 TRRTSELIKYAGNAFLAMKITFINEIADLCEKVGANVQDVARGIGLDGRI 250 GSKFLHAGPGYGGSCFPKDTLALVKTAQDHDTPVRLVETTVAVNDNRKRA 300 MGRKVIAAAGGDIRGSKIAVLGLTFKPNTDDMRDSPAIAVVQALQDAGAR 350 Y T VTGYDPEGMENARKLIEGLDCARDPYEAAAEADALVIITEWNEFRALDFD 400 RLKSTMKTPLLVDLRNIYRKDEVAKHGFRYASIGRPD. 437 12. ábra: Az RkpK fehérje aminosavsorrenje, és doménjainak pozíciója (1. NAD kötő domén; 2. centrális domén; 3. UDP kötő domén). Pirossal az aminosavcseréket jelöltük. Az adatbázisban (CAA10918.1) a 318-as izoleucin helyett tirozin, a 335-ös szerin helyett pedig treoinin található. A szekvenciát a Pfam adatbázis segítségével is megvizsgáltuk. Az elemzés eredménye alapján az RkpK fehérje 437 aminosavból épül fel, és az UDP-glükóz/GDP-mannóz dehidrogenáz családba tartozik. Az enzim tartalmaz konzervatív szakaszokat, ami egy NAD kötő szekvencia, illetve katalítikus aminosavak. A katalítikus cisztein irreverzibilis kovalens kötést alkot a szubsztráttal, a lizin aldehidcsoportot tud megkötni, a prolin pedig meghajlítja a protein szerkezetét. A fehérje 3 doménjének jellemzői a 4. táblázatban vannak feltüntetve. Az E érték (expect value), mely azt mutatja, hogy a hasonlóság a véletlen műve-e megközelíti, sőt meg is haladja az 1e-50-et, ezért kimondhatjuk, hogy a domének valóban ebbe a proteincsaládba tartoznak. 4. táblázat: Az RkpK fehérje doménszerkezete Domén Kezdete (aminosav) Vége (aminosav) E-érték NAD kötő domén 1 192 5,2e-95 (N terminális) Centrális domén 202 297 3,4e-53 UDP kötő domén (C terminális) 319 420 7,1e-37 28

4.7. Az RkpK fehérje homológiavizsgálata Az aminosav- és DNS szekvenciákat más szekvenciákkal a BLAST programcsalád segítségével hasonlítottuk össze. A BLASTP programmal vizsgálva az aminosavsorrendet, azt tapasztaltuk, hogy az RkpK fehérje számos más baktérium UDP-glükóz dehidrogenázával mutat magas fokú homológiát. A legnagyobb hasonlóság más Rhizobium fajoknál tapasztalható (5. táblázat). Az identities értéke az aminosavak egyezésére utal, míg a positives azt jelenti, hogy a helyettesített aminosav mennyire hasonlít az eredetire, mennyire tudja átvenni annak szerepét. 5. táblázat: Néhány baktérium UDP-glükóz dehidrogenázának homológiája Név Egyezés ( identities ) Hasonlóság ( positives ) Rhizobium leguminosarum 80% 91% Rhizobium etli 80% 91% Xanthobacter autotrophicus 72% 84% Bradyrhizobium japonicum 70% 81% 4.8. A fehérje aktivitása és további terveink Munkánk során kísérletet tettünk az enzim aktivitásának mérésére is, de mivel nem állt rendelkezésünkre elég adat, ezért a kísérletet még többször el kell végeznünk. Már néhány előkísérlet után is, melyet Pálvölgyi Adrienn végzett, volt mérhető aktivitáskülönbség. Ez alapján feltételezhetjük, hogy az indukált RkpK fehérjének UDP-glükóz dehidrogenáz aktivitása van. A továbbiakban pontos adatokkal is szeretnénk ezt alátámasztani, illetve olyan kísérleteket végezni, mellyel az inclusion body problémáját meg tudjuk oldani. A UGDH szolubilis formában aktív, ezért a felülúszóban vártuk megjelenését, viszont a gélen csak a csapadékból vett mintából sikerült ezt kimutatni. Az enzim aktivitását a felülúszóból tudtuk mérni, melynek magyarázata az lehet, hogy a dehidrogenáz csak kis mennyiségben van jelen ebben a fázisban, és a gélen ez már nem látható. Terveink között szerepel még egy 6xHis Tag konstrukció létrehozása, melynek segítségével a fehérjét tisztább formában egy Ni-NTA gyanta oszlopon tudjuk kinyerni, és ezután ezt elemezni, vizsgálni. 29

5. ÖSSZEFOGLALÁS Az endoszimbiózis kialakításához nélkülözhetetlenek a baktériumsejtek által termelt poliszacharidok. Ezek szintéziséért többnyire az rkp régiók a felelősek, melyeket Kereszt Attila és munkatársai 1998-as cikkükben jellemeztek (Kereszt et al., 1998). A kettes régió rkpk génje fontos szerepet tölt be ezen cukrok kialakításában. A gén egy UDP-glükóz dehidrogenáz (UGDH) nevű enzimet kódol, mely feltehetően az UDP-glükóz UDPglükuronsav átalakítást katalizálja. Az UDP-glükuronsav a KPS és az LPS molekulák prekurzor vegyülete a mutáns baktériumok elemzése alapján. Célunk az RkpK fehérje termeltetése és enzimaktivitásának jellemzése az S. meliloti baktériumnál. Az ehhez szükséges klónozási lépéseket mutatja be jelen dolgozatom. Munkánk során sikerült izolálnunk az rkpk gént, mely 1314 nukleotidból áll, majd felsokszoroztuk, végül klónozással génexpressziós rendszerbe juttattuk azt. Mivel a többször is megszekvenáltatott nukleotidsorrend eltért az adatbázistól, így az általunk lefordított aminosavszekvenciával dolgoztunk tovább a bioinformatikai elemzések során. A továbbiakban az RkpK fehérjét túltermeltettük a baktériumsejttel, majd SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel elválasztottuk azt a többi fehérjétől. Az RkpK protein a túltermeltetés hatására inclusion body -t képezett, így a csapadékból volt kimutatható, mégis aktivitását a felülúszóból tudtuk mérni. Bioinformatikai elemzések alapján feltételezhető, hogy az RkpK fehérje az UDP-glükóz/GDP-mannóz dehidrogenáz családba tartozik, 437 aminosav építi fel. 3 domént tartalmaz, ezek a NAD kötő-, a centrális-, és az UDP kötő domének. Ezen domének konzervatív aminosavakat tartalmaznak, melyeknek az enzim működésében van nélkülözhetetlen szerepük. További kísérletekkel szeretnénk még több információt szerezni az S. meliloti UDPglükóz dehidrogenáz enziméről, ezt tisztább formában kinyerni, majd aktivitását megmérni, illetve a poliszacharid bioszintézisútban betöltött konkrét szerepét bizonyítani. 30

6. IRODALOMJEGYZÉK Agron PG, Ditta GS, Helinski DR. (1993), Oxygen regulation of nifa transcription in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A.;90(8):3506 3510. Bar-Peled M, Griffith CL, Ory JJ, Doering TL (2004), Biosynthesis of UDP-GlcA, a key metabolite for capsular polysaccharide synthesis in the pathogenic fungus Cryptococcus neoformans, Biochem J., 381, 131-136. Batut J., Daveran-Mingot M.L., David M., Jacobs J., Garnerone A.M., Kahn D. (1989), fixk, a gene homologous with fnr and crp from Escherichia coli, regulates nitrogen fixation genes both positively and negatively in Rhizobium meliloti, EMBO J. 8 1279 1286. Bauer WD (1981), Infection of legumes by Rhizobia. Annu Rev Plant Physiol 32: 407-449 Becker, A., S. Ruberg, H. Kuster, A. A. Roxlau, M. Keller, T. Ivashina, H. P. Cheng, G. C. Walker, and A. Pühler. (1997), The 32-kilobase exp gene cluster of Rhizobium meliloti directing the biosynthesis of galactoglucan: genetic organization and properties of the encoded gene products. J. Bacteriol. 179:1375-1384 Becquart-de Kozak, I., B. L. Reuhs, D. Buffard, C. Breda, J. S. Kim, R. Esnault, and A. Kondorosi. (1997), Role of the K-antigen subgroup of capsular polysaccharides in the early recognition process between Rhizobium meliloti and alfalfa leaves. Mol. Plant- Microbe Interact. 10:114 123. Benevolenskaya, E. V., Frolov, M. V., and Birchler, J. A. (1998), The sugarless mutation affects the expression of the white eye color gene in Drosophila melanogaster. Mol. Gen. Genet. 260, 131 143 Callaham, D. A. and Torrey, J. G. (1981), The structural basis for infection of root hairs of Trifolium repens by Rhizobium. Can. J. Bot. 59, 1647-1664. Campbell, R. E., Sala, R. F., van de Rijn, I. and Tanner, M. E. (1997), Properties and kinetic analysis of UDP-glucose dehydrogenase from group A Streptococci. Irreversible inhibition by UDP-chloroacetol. J. Biol. Chem. 272, 3416-3422 Carlson, R. W., U. R. Bhat, and B. Reuhs. (1992), Rhizobium lipopolysaccharides: their structures and evidence for their importance in the nitrogen-fixing symbiotic infection of their host legumes, p. 33-44. In P. M. Gresshoff (ed.), Plant biotechnology and development. CRC Press, Boca Raton, Fla. Dart, P. J. (1977), Infection and development of leguminous nodules. In A treatise on dinitrogen fixation (ed. R.W.F. Hardy), pp. 367-472. New-York: Wiley. De Luca C., Lansing M., Crescenzi F., Martini I., Shen G.-J., O'Regan M. and Wong Ch.-H. (1996), Overexpression, One-Step Purification and Characterization of UDP-Glucose Dehydrogenase and UDP-N-Acetylglucosamine Pyrophosphorylase Bioorganic & Medicinal Chemistry, Vol. 4, No. 1, pp. 131-142, 31