HETEROGÉN FÁZISÚ ENZIMES REAKCIÓK HOMOGÉN ENZIMES REAKCIÓK ELŐNYÖK/HÁTRÁNYOK El ny a rendszer homogenitása, az enzim - izolálásán kívül el készítést nem igényel. Gazdasági hátrányok: Az enzimek drágák, 1-10 $/mg Csak egyszer használhatók fel, a reakció után elvesznek, illetve kinyerésük a reakcióelegyb l bonyolult és drága. Technológiai hátrány: szennyezik a terméket, tisztítását nehezítik.
AZ ENZIMRÖGZÍTÉS MÓDSZEREI Enzim rögzités üreges szálban (Hollow fibre) M Enzim rögzités fonott szálas anyagban E S E FIZIKAI MÓDSZEREK Enzimbezárás oldhatatlan gél mátrixban Mikrokapszulázás
AZ ENZIMRÖGZÍTÉS MÓDSZEREI Enzimkötés hordozóhoz kovalens kötéssel M M E M=mátrix E KÉMIAI MÓDSZEREK Keresztkötés Enzim keresztkötés multifunkciós reagenssel
KÉMIAI MÓDSZEREK 1 Kovalens kötés nem esszenciális aminosav-csoport(!) és vizben nem oldódó, funkciós csoporttal ellátott hordozó mátrix között X + E E + X Hordozó: természetes polimer: agar, agaróz, kitin, cellulóz, kollagén,..., szintetikus polimer: poliuretán, polisztirol, nylon,..., szervetlen hordozók: üveg, alumínium, szilikagél, magnetit,... Kovalens kötés kialakítása: szabad α-, - vagy -COOH, α -, β NH 2 csoportok fenil-, OH-, SH- vagy imidazol-csoportok LÉPÉSEK: 1. Hordozó aktiválása ( KAR és -X, reaktiv csoport felvitele), 2. a kovalens kötés létrehozása az enzim és az aktivált hordozó között. Aktiv centrum védelme: S v. analogon jelenléte
DIAZOTÁLÁS p-nh 2 -benzil-cellulóz p-nh 2 -benzoil-cellulóz C H 2 N H 2 KÉMIAI MÓDSZEREK 2 SEPHADEX: amino-benzoil származék O C O NH2 M Á T R I X Amino kopolimerek: poli(-l-leu+p-nh 2 -D,L-Phe) Polisztirol származék NH 2 NH CH3 CH CH2 CH C H 3 O C NH 2 C H 2 NH CH NH 2 O C CH 2 CH Poliakrilamid származék (BIOGEL, ENZACRYL) NH C O szilán-származékok:pl. α NH 2 -propil-trietoxi-szilán C H 2 C H HNO 2 + - 1.: NH 2 N NCl HCl 2. reakció az enzimfehérje -NH 2, Tyr, His csoportjaival: OH + - N NCl HO E N N E
KÉMIAI MÓDSZEREK 3 BRÓMCIÁNOS KÖTÉS MÁTRIX: vicinális -OH : cellulóz,sephadex sepharose OH OH + CNBr O C NH + E O - NH 2 imido-karbamát szubsztituált NH izo-karbamid O C- NH E OH O C N O O OH O N-szubsztituált imido-karbamát E N-szubsztituált karbamát C- NH E
KÉMIAI MÓDSZEREK 4 Az enzim fenil-, amin-, szulfhidril- csoportjainak ( ) ALKILEZÉSE MÁTRIX: METAKRILÁT és CELLULÓZ szármezékok homoés kopolimerjei -OH BrCH 2 COBr BrCH 2 COOH dioxán E O -O-C-CH 2 -Br O -O-C-CH 2 E
KÉMIAI MÓDSZEREK 5 BIM SB Üvegfelületre rögzítés
KÉMIAI MÓDSZEREK 6 POLIFUNKCIÓS KÖTÉS MÁTRIX: -NH 2 csoport : AE-CELLULÓZ, DEAE-CELLULÓZ, KOLLAGÉN, KITIN, NYLON, stb -NH 2 + OHC-(CH 2 ) 3 -CHO -N C-(CH 2 ) 3 -CHO GLUTÁRALDEHID H H -N C-(CH 2 ) 3 -CH N-E E-NH 2 Schiff-bázis
Keresztkötések létrehozása KÉMIAI MÓDSZEREK 7
KÉMIAI MÓDSZEREK 8 KERESZTKÖTÉSEK LÉTREHOZÁSA
kémiai kötés esetleges hatásai: OK OK OK
FIZIKAI MÓDSZEREK 1 ADSZORPCIÓ IONCSERÉL N NEM SPECIFIKUS KÖNNYEN LEVÁLIK (ph) GÉLBE ZÁRÁS MIKROKAPSZULÁZÁS MEMBRÁN MÖGÉ ZÁRÁS
FIZIKAI MÓDSZEREK 2 GÉLBE ZÁRÁS ALGINÁT KÉPZÉS PUFFEROLT ENZIM + Na-ALGINÁT Frissen!!! GOLYÓCSKÁK, AMELYEK BEZÁRVA TARTALMAZZÁK AZ ENZIMET ALGINÁT: poli-anhidro- D-mannuronsav (1 4) Hidrofil, kolloid, egyenesláncú polimer Macrocystis pyrifera
FIZIKAI MÓDSZEREK 3 POLIAKRILAMID GÉLBE ZÁRÁS CH 2 CH E + + CONH 2 K 2 S 2 O 8 iniciátor β di-menh 2 -propionitril (DMAPN) gyorsitó akrilamid NH CO CH 2 CONH 2 CH CO NH CH 2 NH CO CH CH 2 N N -metilénbisakrilamid 100-400nm Pórus-átmér j szemcsék az enzim 300-2000 nm átmér j : BEZÁRÓDIK -CH 2 -CH-CH 2 -CH-CH 2 -CH-CH 2 -CH-CH 2 CO NH CH 2 NH CO CO NH CH 2 NH CO -CH 2 -CH-CH 2 -CH-CH 2 -CH-CH 2 -CH-CH 2 CONH 2 CO NH
FIZIKAI MÓDSZEREK 4 MIKROKAPSZULÁZÁS: ÁLLANDÓ POLIMER MEMBRÁNOS MK Szerves fázis M 1 M 1 E M 2 E M 2 M1 POLIMER HÉJ NAGY FELÜLET 2500cm 2 /cm 3 M 1 VIZES FÁZIS M 2 E E Szerves fázis M2 E M 1
FIZIKAI MÓDSZEREK 6 ULTRASZ R MEMBRÁNOS MEGOLDÁS
Módszerek összehasonlítása Tulajdonság fizikai adszorpció ionos kötés kovalens kötés keresztkötés (gél)bezárás megvalósítás könnyû könnyû nehéz nehéz nehéz enzimaktivitás nagysága kicsi nagy nagy közepes nagy S-specificitás nem változik nem változik változhat változhat kötõ erõ gyenge közepes erõs erõs erõs regenerálás lehetséges lehetség es lehetetlen lehetetlen lehetetlen alkalmazhatóság gyenge közepes közepes gyenge jó költség alacsony alacsony magas közepes alacsony mikrobás fertõzés elleni védelem nincs nincs nincs lehetséges megvalósul
RÖGZITETT ENZIMEK KINETIKÁJA So stagnáló folyadékfilm K D D hordozó részecske REAKCIÓ E+S K=konvekció D=diffúzió 1. konvektív transzport folyadék fõtömegébõl a rögz. enzim felületén lévõ stagnáló (nem kevert) folyadék filmhez. jó keveredés NINCS sebesség meghatározó transzport ellenállás. KÜLS BELS 2. Diffúzió a stagnáló folyadékfilmen keresztül a részecske felületére ANYAGÁTADÁS 3. Diffúzió a részecske belsejébe, a reakció tényleges helyére.
RÖGZITETT ENZIMEK OLDOTT ENZIMEK EL NYÖK HÁTRÁNYOK RÖGZÍTETT ENZIMEK EL NYÖK HÁTRÁNYOK * HOMOGÉN RENDSZER *EL KÉSZÍTÉS NINCS *CSAK REAKCIÓ-REZSIM VAN *DRÁGÁK 1-10-50 $/mg *ELVESZNEK *A TERMÉKET SZENNYEZIK *CSAK SZAKASZOS TECHNOLÓGIA *NEM SZENNYEZIK A TERMÉKET *KÖNNYEN ELVÁLASZTHATÓK *ÚJRA FELHASZNÁLÁSI LEHET SÉG *FOLYTONOS TECHNOLÓGIA IS...általános el nyei *KÖNNY TERMINÁLÁS *STABILISABB LEHET *RÖGZÍTÉS KÖLTSÉGES (EL KÉSZÍTÉS *CSÖKKEN AZ ENZIM AKTIVITÁSA *DIFFÚZIÓS GÁT (TZRANSZPORT-REZSIM IS)
RÖGZITETT ENZIMES REAKTOROK
RÖGZITETT ENZIMEK
Enzimlektród 1 Speciális alkalmazás AMPEROMETRIÁS i a.) FESZÜLTSÉG b) platina katód c) ezüst anód d) Telített KCl oldat e.) biokatalizátor rögzített enzim f) acetát membrán (oxigénre átereszt ) g) analyte h) polycarbonate membrán (permeábilis oxigénre, szubsztrátra termékre) i) az elektródok között folyó áram
Enzimlektród 3 ph és NH + 3 Speciális alkalmazás POTENCIOOMETRIÁS
Enzimlektród 4