Racém tejsav elválasztása speciális membrán technikákkal Racemic lactic acid separation by special membrane techniques Kulcsár Edina, Nagy Endre Pannon Egyetem, MIK, Műszaki Kémiai Kutató Intézet, 82 Veszprém, Egyetem u. 2 Summary Chirality is a phenomenon which is of great importance to biological/chemical processes. Under many circumstances, only one enantiomer could meet specific needs while the other one possesses less or even negative effect, which justifies the necessity of enantiomer separation. With the development of pharmaceutical and chemical industries, the demand of single enantiomers is increasing dramatically. Due to extremely similar physiochemical properties in nature with respect to enantiomers, enantiomer separation could not be achieved unless it is carried out with chiral-recognizable medium. Therefore, the separation of enantiomers is an arduous and challenging task. Membrane-mediated enantiomer separation process is a newly emerging and meanwhile promising technology, which has been receiving ever-increasing attentions recently. The use of room-temperature ionic liquids as an immobilized phase in a supported liquid membrane (SLM) is interesting due to the non-volatile character of the ionic liquids which makes it possible to obtain a very stable SLM without any loss of the membrane phase to the atmosphere. Enzymes usually have high substrate specificity and high enantioselectivity. In the present study, we have developed a novel SLM system based on ionic liquids in which lipase catalyzed reactions facilitate the transport of lactic acids. (L)-lactic acid is selectively esterified by Candida antartica (CRL) in the feed phase, and the resulting ester dissolves into the ionic liquid phase of the SLM and diffuses across the SLM. In the receiving phase, porcine pancreas (PPL) catalyzes the ester hydrolysis to produce the initial lactic acid and ethanol, which are water soluble. Finally, the (L)-lactic acid is selectively transported through the SLM, based on the enantioselectivity of lipases. This system integrated the enantioselective catalytic action of the enzyme and the selective permeability of the isomers through the SLM. The feed phase consisted of phosphate buffer (ph=8.) containing 5 mg/ml Candida antartica, 1 mm racemic lactic acid, dissolved 25 ml ethanol. The receiving phase consisted of phosphate buffer (ph=8.) containing 7 mg/ml porcine pancreas. The highest enantiomeric excess was 5 %. In all the used ionic liquid were almost the same effects of lacticacid enantioselectivity. Chitosan membranes and chitosan/cyclodextrin (CS/CD) composite membranes were prepared to investigate the influence of enantiomer separation of lactic acid racemate. Conspicuously, chitosan/cyclodextrin (CS/CD) composite membranes showed relatively higher enantiomeric excess. Due to lower complexation selectivity of chitosan membrane which narrows the difference between diffusion resistances of D- and L-lactic acid, the diffusion rate difference between D- and L-lactic acid diminishes, which accounts for a decreased permselectivity in the presence of chitosan membrane. The results in this study provided useful information for the development of composite membranes for enantiomer separations.
Bevezetés A biológiai, kémiai eljárásoknál a kiralitás fontos tulajdonság. Adott körülmények között csak az egyik enantiomerrel találkozhatunk, bizonyos eljárásoknál viszont a másik enantiomer jelenléte kedvezőtlen hatással bír, amely szükségessé teszi az enantiomerek elválasztását. Gyógyszer és a vegyipar fejlődésével drasztikusan növekszik az igény a tiszta enantiomerek iránt [1]. Mivel nagyon hasonló fizikai/kémiai tulajdonságaik, enantiomer elválasztást csak kiralitást felismerő közegben tudunk elérni. Az enantiomer szeparáció ezért nagyon nehéz és kihívást jelentő feladat. A membránnal összekapcsolt enantiomer elválasztás lehetséges és egyre nagyobb figyelmet kapó technológiai megoldás. Egyedülálló túlsúlya más hagyományos eljárásokkal szemben köszönhető az alacsony energiafogyasztásnak, magas feldolgozás képességének, összefüggő műveleti módnak stb. [2,3]. Azokat a vegyületeket, amelyek csak kationból és anionból állnak, továbbá olvadáspontjuk 1 o C alatt van ionos folyadékoknak (Ionic Liquids) nevezzük. Az ionos folyadékok egyik legfontosabb előnyös tulajdonsága azon kívül, hogy szobahőmérsékleten folyadékok az, hogy gőznyomásuk igen alacsony. Nem tűzveszélyesek. Szerkezetük változtatásával oldószer tulajdonságuk jól hangolható [4]. Az ionos folyadékokat, mint zöld oldószereket széles körben tanulmányozták a szeparációs eljárásoknál, mert alapvetően nincs gőznyomásuk, kiválóan helyettesítik az illékony szerves oldószereket az oldószer extrakciós és folyadék membrán eljárásoknál [5]. A támasztóréteges folyadék membrán (SLM) porózus szilárd anyag, aminek a pórusaiba folyadékot juttatnak. SLM alkalmazása ígéretes technológiai lehetőséget nyújt ugyanis kombinálva extrakciós eljárással és desztillálással jelentősen csökkenthető az extrakciós lépések száma. Viszont az instabilitása limitálja a kereskedelmi alkalmazását [6]. Scovazzo mtsi. [7] megállapították, hogy a támasztóréteges ionos folyadék membránoknak az az előnye a hagyományos SLM-nél, hogy az ionos folyadékok elhanyagolható gőznyomása aminek, következtében lényegesen javul a membrán stabilitása, és képes módosítani a membrán szelektivitását [7-1]. Mostanában számos kutatást végeztek támasztóréteges ionos folyadék membránokkal és vizsgálták szerves komponensek pl alkoholok, ketonok és aminok szelektív transzportját SLM-en. [9,1]. Kitozán [Poli-(1-4)- β-d glükozamin, CS] kitin származék. Egyre szélesebb körben alkalmazzák az orvos biológiában, mert nem toxikus, biokompatibilis, biológiailag lebontható, valamint jó membránképző. A kitozán mátrix mikropórusos szerkezete létrehozható fázis inverzióval vagy kitozán oldatban fokozatosan helyettesítjük a vizet szerves oldószerrel [11]. A ciklodextrinek ciklikus, nem redukáló oligoszacharidok. Három különböző ciklodextrin ismeretes: alfa-, béta- és gamma-ciklodextrin. Egyre több cikk jelenik meg ciklodextrin és származékaik királis szelektorként történő alkalmazásáról. Más királis szelektorokhoz képes az előnye a viszonylag alacsony költsége széleskörű alkalmazhatósága és nagyfokú tűrőképessége a változatos környezeti feltételek mellett [12]. Anyagok és módszerek Enzim: Sertés hasnyálmirigyből kivont lipáz E.C. 3.1.1.3., por, 15-35 units/mg M r ~5 (Sigma) Egyéb felhasznált anyagok: (D,L)-tejsav 9 %- os (Reanal, Magyarország), etanol abszolút (Spektrum 3D, Magyarország) 1-Ethyl-3-methylimidazolium bis (trifluoromethylsulfonyl) imide 99%, 1-n-butil-3-metilimidazolium bis (trimetilszulfonil)-imid (C4mimTF 2 N) (Iolitec), epiklorohidrin (Sigma), Kitozán közepes molekulasúlyú, (Sigma), (2-Hydroxy)propyl-β-Cyclodextrin (DS ~3) víztartalom <6, Mr ~139 (Cylolab) Membrán: STERLITECH Polipropilén.2 μm 47 mm
GC elemzések: ACME 61 gázkromatográfon. Kolonna típusa LIPODEX E,2 μm. Kolonna méret 25m x,25m, N 2 áramlási sebesség: 12 cm 3 /min, FID detektor. Rázatás, inkubálás: GFL 331 rázó inkubátorral. A reakciók enantioszelektivitását enantiomer feleslegben (e.e. %) fejeztük ki: L D e. e.( L)% = *1, L + D ahol L illetve D a két enantiomer koncentrációja. Membránok előállítása Támasztóréteges ionos folyadékmembrán előállítása Körülbelül 1 ml ionos folyadékot tartalmazó Petri csészét exikkátorban 1 napra vákuum alá helyeztük a víz eltávolítása miatt. Polipropilén membránt szintén vákuum alatt 24 óránt át exikkátorban szárítottuk. Ezután a membránt ionos folyadékba merítettük és további 1 napig vákuumoztuk, amíg az ionos folyadék teljesen átjárta a membrán pórusait. Membrán felületéről eltávolítottuk a többlet ionos folyadékot, majd a membrán modulba helyezve végeztük a mérést. Minden membránt csak egyszer használtunk fel. Kitozán membrán előállítása 3 g kitozánt 2 % ecetsavat tartalmazó 1 ml desztillált vízben feloldunk. Folyamatosan 1 napig szobahőmérsékleten kevertetjük. Fel nem oldott maradék anyagot üvegszűrőn szűrjük. Fél órára ultraszonikus fürdőbe helyezzük, melynek során az összeállt molekulák szétválnak és eltávoznak a levegő buborékok. Így kapott oldatot üveg edénybe (1mm fal vastagság) öntjük, késsel elegyengetjük és 4 napig szobahőmérsékleten szárítjuk. A formázott kitozán filmet 5 % glutáraldehid és 5 % sósavat tartalmazó aceton oldatba merítjük a keresztkötések kialakítása céljából. Felesleges acetont lemossuk a filmről és 2 %-os nátrium-hidroxidot tartalmazó vizes oldattal leöblítjük. Majd desztillált vízzel is többször átmossuk. A membrán vastagsága 5-6 μm [13]. Vízoldhatatlan β -ciklodextrin polimer (β CDP) előállítása. 1 g β-ciklodextrint feloldunk 6,7 g nátriumhidroxidot tartalmazó desztillált vízben. Miután teljesen feloldódott β a -ciklodextrin 7 ml epiklorohidrint (EP) adunk hozzá (EP:CD=1:1 mol arány). Világossárga gél szerű reakció elegyet többször alaposan átmossuk acetonnal, hogy eltávolítsuk a többlet epiklorohidrint. Majd vízzel is addig mossuk, hogy eltávolítsuk a vízoldható szennyeződéseket és a nátrium-hidroxidot, a ph közel semleges legyen. A megtisztított β - ciklodextrin polimert fagyasztva szárítjuk a felhasználásig. Kitosán/ciklodextrin összetett membrán előállítása 1 g kitozánt feloldunk 5 ml 2 %-os ecetsavat tartalmazó vizes oldatban. Miután eltávolítottuk a fel nem oldott maradék anyagot, β -ciklodextrin polimert kevertetve hozzáadjuk és az így kapott szuszpenziót 12 órán át szobahőmérsékleten kevertetjük. A támasztórétegnek szolgáló polipropilén membránt teljesen átitatjuk, desztillált vízzel mielőtt belemerítjük a szuszpenzióba és állni hagyjuk benne 1 órán át. Kivesszük és elterítjük a tiszta üveglapon és óvatosan eltávolítjuk a felesleges oldatot a membrán felszínéről. CS/CD felszínű polipropilén membránt miután 5 o C-on 8 órán át szárítottuk mossuk 1 mólos nátriumhidroxid oldattal majd desztillált vízzel. Végül kész a kitosán/ciklodextrin összetett membrán, amit 5 o C-on egy éjszakán át szárítunk [14].
Eredmények és értékelésük Három különböző membrán típust állítottunk elő és vizsgáltuk ezeken a membránokon a racém tejsav enantioszelektiv elválasztását. Támasztóréteges ionos folyadék membrán A végeredmény (L)-tejsav szelektív transzportja a támasztóréteges folyadékmembránon. Az előző MKN9 -ben már bemutatásra került racém tejsavból Candida antartica lipáz enzimmel történő tejsav-etil-észter előállítás vizsgálati körülményei és eredményei [15]. Tejsav- etil-észter hidrolízise sertés hasnyálmirigyből kivont lipáz enzimmel (porcine pancreas) A hirdolízist 37 o C on 24 órás 15 rpm folyamatos keverés mellett 3 g tejsav- etil-észter, 1, 25 g sertés hasnyálmirigy enzim 25 ml desztillált vízben feloldva fűthető rázógépen végeztük. A tejsav hozam 24 órás rázatott lombikos kevertetés után közel 9 %-os lett. (1. ábra) Relatív aktivitás(%) 12 1 8 6 4 2 7,5 8 8,5 9 9,5 1 ph 2. ábra. Sertés hasnyálmirigyből kivont lipáz enzimmel történő hidrolízis reakció során az enzim katalitikus aktivitásának ph függése. Hőmérséklet hatása Az enzim aktivitás hőmérséklet függését (3. ábra) vizsgálva 5 mm foszfát puffer (ph 8.9) alkalmazásánál 25-55 o C hőmérsékleti tartományban. Aktivitás hőmérséklet profilját 3. ábra mutatja. Jól látható, hogy a hőmérséklet optimuma 35 o C-nál van. 25 o C alatt és 55 o C felett minimálisra csökken az enzim aktivitás, oka az enzim inaktiválódása. 12 Hozam% 1 8 6 4 2 Relativ aktivitás (%) 1 8 6 4 2 25 3 35 4 45 5 55 Hőmérséklet ( o C) 3 5 8 1 15 24 Idő (h) 1. ábra. Tejsav-etil-észter sertés hasnyálmiriggyel történő hidrolízise során keletkező tejsav hozam az idő függvényében. 3. ábra. Sertés hasnyálmirigyből kivont lipáz enzimmel történő hidrolízis reakció során az enzim aktivitás hőmérséklet függése. Hőmérséklet stabilitás A ph hatása a katalitikus aktivitásra A 2. ábra mutatja az enzim katalitikus aktivitásának ph függését. Porcine pancreas enzimnél a ph optimum 9.2-nél van. A hőmérséklet hatását vizsgálva az enzim inaktiválódására 5 mm foszfát puffer alkalmazásánál ph 8.-on, 25-35-55 o C hőmérsékleten. 25 o C alatt és 55 o C felett minimálisra csökken az enzim aktivitás, oka az enzim inaktiválódása.
Maradék aktivitás (%) 12 1 8 6 4 2 35 oc 55 oc 25 oc permeátum idővel nőtt, míg a betáplálási csökkent. A növekedése és csökkenése az (L)-tejsavnak koncentrációjának nagyobb volt, mint az (D)-tejsavnak. Ez azt jeleni, hogy a lipáz szelektíven katalizálta az (L)-tejsav transzprortját (5. ábra). Az enantiomer felesleg közel 5 %-os. 6 12 18 22 24 idő (h) 4. ábra. Sertés hasnyálmirigyből kivont lipáz enzimmel történő hidrolízis reakció során a hőmérséklet hatása az enzim inaktiválódására. Az enantioszelektivitás érték csaknem megegyezik az összes vizsgált ionos folyadékoknál és ionos folyadékot használva a folyadékmembrán 12 óra után is stabil maradt. 5 A rázatott lombikos racém tejsav észterezés/hidrolízis reakció optimális körülményeit, és tapasztalatait felhasználva végeztük el a membrán szeparációt. Candida antarctica (CRL) lipáz jól katalizálja az észterképződést a betáplálási, míg a sertés hasnyálmirigy (PPL) katalizálja az észter hidrolízis reakciót a permeátum. (L)-tejsav szelektíven észtereződik a canadida antarctica által, a keletkező észter oldódik az ionos folyadék és átdiffundál a támasztóréteges folyadék membránon. A permeátum a sertés hasnyálmirigy katalizálja az észter hidrolízist és keletkezik tejsav, illetve etanol, amelyek vízoldhatóak. D,L tejsav candida antarctica (CRL) lipáz által katalizált észter képződést, valamint sertés hasnyálmirigy (PPL) enzimes hidrolízisét membrán szeparációt vizsgáltuk többfajta ionos folyadékot alkalmazva. A betáplálás fázis 1 mm racém tejsav 25 ml etanolos oldata 5 mg/ml Candida antarticát (CRL) tartalmazott. A permeátum fázis foszfát puffer (ph=8.) és 7 mg/ml sertés hasnyálmirigyet (PPL) tartalmazott. A hőmérséklet a membrán mindkét oldalán állandóan 37 o C volt mindkét az oldatokat szivattyúval keringettük. A vizsgálat kontrollját a lipáz alkalmazása nélküli membrán szeparáció képezte. Amikor lipáz is jelen volt a betáplálási és a permeátum, az (L)- és (D)- tejsavnak a koncentrációja a Hozam % 4 3 2 1 D-tejsav permeátum L-tejsav a permeátum D-tejsav a betáplálási L-tejsav a betáplálási 12 24 36 48 5 72 Idő (h) 5. ábra. (D)-és(L) tejsav transzportja vízoldhatatlan 1-Ethyl-3-methylimidazolium bis- (trifluoro- methylsulfonyl)imide támasztó-réteges folyadékmembránon. D,L- tejsav enantioszelektív elválasztása: kitozán és Kitosán/ciklodextrin összetett membránon A membránok tesztelésére a kutatóintézetben készített 5 ml térfogatú műanyag cella szolgált. A membránok átmérője 47 mm, 25 ml, 1 mg/ml D,Ltejsav vizes oldata a betáplálási fázis. A membrán mindkét oldalán lévő fázist állandó nyomáson, 37 o C-on szivattyúval folyamatosan kevertettük 5 napig és meghatározott időközönként mintát vettünk.
ee % 8 7 6 5 4 3 2 1 1 2 3 4 5 Idő (nap) CS membrán B-CDP membrán 6. ábra. Kitozán és kitosán/ciklodextrin összetett membránon történő tejsav transzport hozama. 1 8 enantioszelektivitást. Membránok előállításánál ionos folyadékot, kitozánt és β-ciklodextrin alkalmaztunk. Mindhárom anyag környezetbarát és érdekes kémiai és fizikai-kémiai tulajdonságaik miatt javítják a hagyományos membránok enantioszelektivitását és stabilabbá is teszik a membránt. Legnagyobb tejsav enantiomer felesleg értéket a kitozán/β-ciklodextrin polimer összetett membránnál kaptunk. Támasztóréteges ionos folyadék membrán, kitozán membrán és kitozán/β-ciklodextrin polimer összetett membrán alkalmas a racém tejsav enantioszelektív elválasztására, valamint más optikai izomerek elválasztására is. Hozam % 6 4 2 CS membrán B-CDP membrán Köszönetnyilvánítás A kutatómunka az OTKA 63615/26 projekt keretében készült. 1 2 3 4 5 Idő (nap) 7. ábra. Kitozán és kitosán/ciklodextrin összetett membránon történő racém tejsav enantioszelektiv transzportja az idő függvényében. A kitozán és kitozán/ β -ciklodextrin polimer membránnál 5 nap alatt a D,L tejsav hozam közel azonos 85 % (6. ábra). Enantioszelektivitás tekintetében különbség adódott, kitozán/βciklodextrin polimer membránnál 7 % míg a kitozán mebránnál csak 5 % (7. ábra). D,L-tejsav szelektivitását a kitozán és kitozán/β-ciklodextrin polimer membránon a szorpciós folyamat és a membrán két oldala közötti koncentráció gradiens határozza meg. A kitozán membránnál kisebb a különbség a D- és L- enantiomer szelektivitása között, mint kitozán/ β - ciklodextrin polimer összetett membránnál. Oka: kisebb a szorpciós kölcsönhatás a kitozán membrán anyaga és enantiomerek között. Összefoglalás D,L tejsav elválasztására három különböző membránt-típust állítottunk elő és vizsgáltuk az Irodalomjegyzék [1] J.T.F. Keurentjes, L.J.W.M. Nabuurs, E.A. Vegter, Liquid membrane technology for the separation of racemic mixtures, J. Membr. Sci. 113 351 36. (1996). [2] M. Pietraszkiewicz, M. Kozbial, O. Pietraszkiewicz, Chiral discrimination of amino acids and their potassium or sodium salts by optically active crown ether derived from D- mannose, J. Membr. Sci. 138 19 113 (1998). [3] N.M. Maier, P. Franco, W. Lindner, Separation of enantiomers: needs, challenges, perspectives, J. Chromatogr. A 96 3 33 (21). [4] M. Freemantle. Designer solvents - Ionic liquids may boost clean technology development Chem. Eng. News 76, (3th March) 32 37 (1998). [5] A.N. Visser, P.R. Swatloski, W.M. Reichert, H.D. Willauer, J.D. Huddleston, R.D. Rogers, Room temperature ionic liquids as replacements for traditional organic solvents and their applications towards Green Chemistry in separation processes, in: R.D. Rogers, K.R. Seddon, S. Volkov (Eds.), Green Industrial Applications of Ionic Liquids, NATO Science Series II-92, Kluwer, Dordrecht, p. 137 (22).
[6] M. Teramoto, Y. Sakaida, S.S. Fu, N. Ohnishi, H. Matsuyama, T. Maki, T. Fukui, K. Arai, An attempt for the stabilization of supported liquid membrane, Sep. Purif. Technol. 21 137 (2). [7] P. Scovazzo, A.E. Visser, J.H. Davis Jr., R.D. Rogers, C.A. Koval, D.L. DuBois, R.D. Noble, Supported ionic liquid membranes and facilitated ionic liquid membranes, in: R.D. Rogers, K.R. Seddon (Eds.), Ionic Liquids: Industrial Applications to Green Chemistry, ACS Symposium Series 818, Am. Chem. Soc., Washington, DC,, p. 68 (22). [8] L.C. Branco, J.G. Crespo, C.A.M. Afonso, Studies on the selective transport of organic compounds by using ionic liquids as novel supported liquid membranes, Chem. Eur. J. 8 3865 (22). [9] L.C. Branco, J.G. Crespo, C.A.M. Afonso, Highly selective transport of organic compounds by using supported liquid membranes based on ionic liquids, Angew. Chem. Int. Ed. 41 2771 (22). [1] E. Miyako, T. Maruyama, N. Kamiya, M. Goto, Use of ionic liquids in a lipase-facilitated supported liquid membrane, Biotechnol. Lett. 25 85 (23). [11] J.H. Kim, J.H. Kim, J. Jegal, K.H. Lee, Optical resolution of α-amino acids through enantioselective polymeric membranes based on polysaccharides, J. Membr. Sci. 213 273 283, (23). [12]. E. Schneiderman, A.M. Stalcup, Cylodextrins: a versatile tool in separation scinence, J. Chromatogr.B. 745, 83-12 (2). [13] H. Wang, L. Chu, H. S o ng, J. Y an g, R. X ie, M. Yang Preparation and enantiomer separation characteristics of chitosan/_-cyclodextrin composite membranes J. Membr. Sci 297 262 27 (27). [14] Z.Y. Gu, P.H.Xue, W. J. Li, Preparation of the porous chitosan membrane by cryogenic induced phase separation, Polym. Adv. Technol. 12, 665-669 (21) [15] E. Kulcsár, E. Nagy (L)-tejsav lipáz enzimmel katalizált enantioszelektív transzportja membránon, Műszaki kémiai napok 9 183 (29).