SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA A nociceptinerg rendszer jelentosége krónikus anyagcsere -betegségekben és neuropszichés kórképekben Doktori (Ph.D.) értekezés HANTOS MÓNIKA BEATRIX Témavezetok: Prof. Dr. Tekes Kornélia, egyetemi tanár Prof. Dr. Szalay Ferenc, egyetemi tanár az orvostudományok kandidátusa Experimentális és klinikai farmakológia címu program Programvezeto: Prof. Dr. Magyar Kálmán Semmelweis Egyetem, Gyógyszerhatástani Intézet Budapest, 2003.
TARTALOMJEGYZÉK I. BEVEZETÉS 6 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 9 2.1. A NOCICEPTIN ÉS RECEPTORA 9 2.1.1. A nociceptin és a nociceptin-receptor elnevezés 9 2.1.2. Az OP 4 receptor 9 2.1.3. Az OP 4 receptor ligandjai (nociceptin, nocistatin) 12 2.1.4. A nociceptin/orphanin FQ metabolizmusa és bioaktív metabolitjai 15 2.2. A NOCICEPTIN NEUROKÉMIAI HATÁSAI 18 2.2.1. A nociceptin hatása az acetil-kolin (Ach) felszabadulásra 18 2.2.2. A nociceptin hatása a dopaminerg rendszerre 19 2.2.3. A nociceptin hatás a glutamát és GABA -erg rendszerre 20 2.2.4. A nociceptin hatása az noradrenalin felszabadulásra 20 2.2.5. A nociceptin hatása a szerotoninerg rendszerre 21 2.2.6. A nociceptin hatása a hisztamin felszabadulásra 21 2.2.7. A nociceptin hatása egyéb neuropeptidek (CCK, NPY, SP) felszabadulására 22 2.3. A NOCICEPTIN FARMAKOLÓGIAI HATÁSAI 23 2.3.1. A nociceptin központi idegrendszeri hatásai 23 2.3.1.1. A nociceptin fájdalomkelto és fájdalomcsillapító hatása 23 2.3.1.2. A nociceptin szerepe a fájdalomérzet feldolgozásában 25 2.3.1.3. A nociceptin hatása a gondolkodásra 25 2.3.1.4. A nociceptin szerepe a motivációban (reward) 26 2.3.1.5. A nociceptin szerepe a táplálkozásban 26 2.3.1.6. A nociceptin szerepe a mozgásban 27 2.3.1.7. A nociceptin szerepe a neuroendokrin elválasztásban 27 2.3.1.8. A nociceptin szerepe a neuronális differenciálódásban 28 2.3.2. A nociceptin perifériás hatásai 28 2.3.2.1. A nociceptin hatása a légzorendszerre 29 2.3.2.2. A nociceptin hatása a cardiovasculáris rendszerre 29 2.3.2.3. A nociceptin hatása a urogenitális rendszerre 30 2.3.2.4. A nociceptin hatása a gyulladásos fájdalom kialakulására 30 2.3.2.5. A nociceptin hatása a gastrointestinális rendszerre 31 N N 7 Beszúrt: 7 2
2.4. A NOCICEPTINERG RENDSZER KLINIKAI VONATKOZÁSAI 32 2.4.1. A nociceptin szerepe néhány hepatológiai kórképben 32 2.4.1.1. Wilson-kór és a nociceptinerg rendszer kapcsolata 32 2.4.1.2. Primer Biliáris Cirrhosis és a nociceptinerg rendszer kapcsolata 33 2.4.1.3. Hepatocelluláris karcinóma és a nociceptinerg rendszer kapcsolata 34 2.4.2. A nociceptin szerepe különbözo neuropszichés kórképek etiológiájában 34 2.4.2.1. Major depresszió 34 2.4.2.2. Elsodleges fejfájások (Migrén és Cluster) 35 III. CÉLKITUZÉSEK 37 IV. MÓDSZEREK 42 4.1. A BETEGKIVÁLASZTÁSI SZEMPONTJAI 42 4.1.1. Kontroll csoport 42 4.1.2. Beteg csoport 42 4.1.2. Hepatológiai betegek 43 4.1.3. Pszichiátriai betegek 45 4.1.4. Neurológiai betegek 45 4.2. KÍSÉRLETES ÁLLATMODELLEK 46 4.2.1. Streptozotocin indukált diabetes modell patkányokon 46 4.2.2. Májcirrhosis modell F-344 patká nyokon 47 4.3. MÉRÉSI MÓDSZEREK 48 4.3.1. Mintavétel, elotisztítás és extrakció 48 4.3.2. A mintaelokészítési módszer validálása, stabilitás, reprodukálhatóság, extrakciós hatásfok 50 4.3.3. A nociceptin é s a nocistatin radioimmunoassay meghatározása 52 4.4. STATISZTIKAI ANALÍZIS 53 V. EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS 54 5.1. A NOCICEPTINERG RENDSZER VIZSGÁLATA KÍSÉRLETES ÁLLATMODELLEKEN 54 5.1.1. A vérplazma és a liquor cerebrospinalis nociceptinszint korfüggése Wistar patkányokban 54 CÉLKITUZÉSEK Formázott: Felsorolás és számozás KRITÉRIUMOK 3 Beszúrt: 3 1 5 1 6 2 2 2 st 2 3 3 Formázott: Felsorolás és számozás 3
5.1.2. A vérplazma, és a liquor cerebrospinalis nocistatin tartalmának vizsgálata patkányban. 56 5.1.3. Streptozotocin indukálta diabetes modell Wistar patkányokon 57 5.1.4. Cirrhosis modell F-344 patkányokban. 61 5.2. A NOCICEPTINERG RENDSZER VIZSGÁLATA HEPATOLÓGIAI ÉS NEUROPSZICHÉS KÓRKÉPEKBEN 72 5.2.1. Hepatológiai kórképek 72 5.2.1.1. Plazma nociceptinszint vizsgálatok Wilson-kórban 72 5.2.1.2. Plazma nociceptinszint vizsgálatokprimer Biliáris Cirrhosisban 75 5.2.1.3. Primer biliáris cirrhosis talaján kialakult hepatocelluláris carcinóma (esetismertetés) 79 5.2.1.4. Plazma nociceptinszint vizsgálatok hepatocelluláris carcinómában és egyéb daganatos megbetegedésben 82 5.2.2. Neuropszichés kórképek 84 5.2.2.1. Plazma nociceptinszint vizsgálata depresszióban 84 5.2.2.2. Plazma nociceptinszint vizsgálata migrén illetve cluster fejfájásban 85 VI. KÖVETKEZTETÉSEK, ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK 90 VII. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 95 VIII. IRODALOMJEGYZÉK 97 IX. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT SAJÁT KÖZLEMÉNYEK 108 Krónikus diabetes hatása a plazma és CSF nociceptin és a nocistatin szintjére k 1 Beszúrt: 1 Formázott: Felsorolás és számozás Formázott: Felsorolás és számozás 4
Ach APN camp CCK CGRP CH CHO CNS CRF CSF DA DAT DEN EFS EP EPP GABA GAT GIT i.c.v. i.p. i.t. IPP KIR MA MO NBH NC NDV NMDA NPY NT OP4 PACAP PPNC RIA s.c. SP SP TFA TIU TM VIP RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE acetil-kolin aminopeptidáz N ciklikus-adenozin-monofoszfát cholecystokinin calcitonin-gén-rokon-peptid cluster fejfájás kínai aranyhörcsög petefészek sejtvonal központi-idegrendszer corticotrop releasing faktor cerebrospinalis folyadék dopamin dopamin-transzporter dietil-nitrozamin elektromos tér ingerlés endopeptidáz excitatoros posztszinaptikus potenciál?-aminovajsav GABA-transzporter gasztrointestinális rendszer intracerebroventrikuláris intraperitoneális intratekális inhibitoros posztszinaptikus potenciál központi idegrendszer migrénes fejfájás, aurával migrénes fejfájás, aura nélkül naloxon-benzoylhydrazon nociceptin neurogén durális vasoconstrictio N-metil-D-aspartát neuropeptid Y nocistatin nociceptin / oorphanin FQ receptor hypophysis adenilát cikláz aktiváló polipeptid pre-pronociceptin (nociceptin percursor) radioimmunoassay subcután P-anyag substance P trifluoro-ecetsav tripszin inhibitoros egység tuberomamillaris vasoactiv-intestinalis-peptid A DOLGOZATBAN ELOFORDULÓ NC nociceptin OP 4 nociceptin / o Beszúrt: Beszúrt: neurogén durális vasoconstrictio TIU orphanin FQ receptor PPNC pre -pronociceptin (nociceptin percursor) CRF corticotrop releasing faktor CCK cholecystokinin NPY neuropeptid Y SP substance P CSF cerebrospinalis folyadék camp ciklikus-adenozinmonofoszfát APN aminopeptidáz N EP endopeptidáz i.c.v. intracerebroventrikulá ris i.p. intraperitoneális i.t. intratekális s.c. subcután DA dopamin DAT dopamin-transzporter GABA?-aminovajsav GAT GABA-transzporter Ach acetil-kolin CNS központi-idegrendszer CHO kínai aranyhörcsög petefészek sejtvonal EPP excitatoros poszt szinaptikus potenciál IPP inhibitoros posztszinaptikus potenciál... [1] EFS elektromos tér ingerlés Beszúrt: o DEN dietilnitrozamin RIA radioimmunoassay... [2] CGRP SP VIP CH cluster fejfájás MA migrénes fejfájás, aurával... [4] MO migrénes fejfájás, Beszúrt: cluster fejfájás Beszúrt: fejfájás, aurával migrénes Beszúrt: migrénes fejfájás, aura nélkül... [3] 5
I. BEVEZETÉS Még nincs tíz éve, hogy a nociceptint (NC) és receptorát (OP4), mint az opioid peptid család egy új tagját elsoként leírták (i, ii), ami az azóta eltelt idoben a farmakológiai kutatások homlokterébe került. Ma már számos központi idegrendszeri és perifériás hatása ismert, és továbbra is kiterjedt kutatás folyik szerepének élettani és kórtani körülmények közötti megismerése, valamint farmakológiai jelentoségének feltárása érdekében. A nociceptin egy 17 aminosavból álló polipeptid, amely szerkezetében leginkább a dinorfin-a-hoz hasonlít. A dinorfin-a szintén 17 aminosavból áll, és nagy hasonlóságot mutat a nociceptinhez az N-terminálison lévo 4 aminosavban (message domain) is, amely meghatározó a receptoron való kötodés szempontjából. A nagy hasonlóság ellenére a nociceptinben a többi opioid peptidtol eltéroen az elso helyen Tyr helyett Phe található. Hasonlóság mutatkozik még a C-terminálison lévo 16.-17. aminosavig terjedo szakaszban, amelynek azonban a receptoraktivációban nincs szerepe. A szerkezeti egyezések ellenére a nociceptin nem kötodik a klasszikus? -,?-, és?- opioid receptorokhoz (ii). A nociceptin a pre-pronociceptinbol (PPNC) enzimatikus hasítással képzodik a központi idegrendszerben és a periférián egyaránt. Ebbol a 176 aminosavat tartalmazó polipeptidbol a nociceptinen kívül több biológiailag aktív neuropeptid, mint a nocistatin és a nociceptin II hasad le, amelyek nem az OP4 receptoron, hanem saját receptoraikon fejtik ki hatásukat (iii). A pre-pronociceptin génje emberben a 8. kromoszómán, a 8p21 régióban található (iv). A nociceptin receptora az állatkísérletes adatokkal jól egyezoen (viii) számos humán idegrendszeri struktúrában megtalálható. Az immunhisztokémiai vizsgálatok eredménye szerint az OP4 receptor megtalálható a központi idegrendszeri szabályozó rendszer szinte valamennyi magcsoportjában, így az adrenerg/noradrenerg, kolinerg, dopaminerg, szerotonerg magcsoportokban. Az OP 4 receptor és a receptor mrns nagy koncentrációban van jelen az adrenerg rendszer részét képezo locus coeruleus területén. Mivel a locus coeruleus összetett feladatokat lát el az agyban, ezért feltételezhetoen a nociceptinerg rendszernek is szerepe van számos a stresszhatás kapcsán fellépo vegetatív és viselkedési reakcióban. A nociceptin nagy mennyiségben van jelen az amygdalában, a septohippocampalis régióban, a thalamicus és a hypothalamicus magvakban, valamint a paraventricularis hypothalamusban, mely területek részt vesznek a félelem, a szorongás, de -ig 2 8 k Oldaltörés 6
és a stressz érzelmi komponenseinek összehangolásában. Az OP 4 receptor szintén nagy koncentrációban kimutatható nucleus tractus solitarii-ban és az oldalsó retikuláris magcsoport területén. Ezek a magcsoportok olyan vegetatív funkciók szabályozásában vesznek részt, mint az artériás vérnyomás, a szívfrekvencia, a légzés és az endokrin szabályozás (xiv). Az OP 4 receptorok megtalálhatók az elülso bazális kolinerg complexben, a telenkefalon és a tegmentális magcsoportok területén. A kolinerg neuronok kapcsolatban állnak a kérgi területekkel a hippocampus -szal, a thalamus-szal, és az agytörzsi területekkel, amelyek a figyelem, a tanulás, és a memóriafunkciók szabályozásában vesznek részt. Ezen kívül jelen vannak a szintén kolinerg rostokat tartalmazó retina amakrin sejtjein (v). Az OP4 receptor mrns expressziója a substancia nigra területén azt mutatja, hogy a nociceptin hatással van a mozgáskoordinációt szabályozó nigro-striatralis dopaminerg rendszerre. Az OP4 receptor jelenléte a ventrális-tegmentális area területén arra utal, hogy a nociceptinerg rendszer befolyásolja a mezokortikolimbikus rendszeren keresztül a motivációt, a hangulatot, és a gondolkodást (vi). A raphe magvak a központi idegrendszeri szerotonin szintézis helyei, ahol szintén nagy mennyiségben megtalálhatóak az OP4 receptorok és a receptor mrns is. A nociceptin a raphe magvak területén a K + -áram fokozásán keresztül gátolja a neuronális aktivitást (vii). A nociceptin jelenléte a nucleus raphe magnus-ban arra enged következtetni, hogy a szerotonerg rendszerre (raphe-magvak) hatva a fájdalomérzés supraspinalis kontrolljában tölt be szerepet (viii). A legújabb vizsgálatok szerint az opioid receptor családból az OP4 receptor aktiváció mutatkozik a kérgi szerotonin felszabadulás legfontosabb preszinaptikus modulátorának (ix). Az OP 4 receptor a gerincvelo hátsó szarvának valamennyi rétegében reprezentált, legnagyobb mennyiségben a II. laminában; elsosorban az interneuronokban van jelen. A nociceptin jelentos mennyisége a paraventricularis hypothalamusban, (mint a corticotropin-releasig faktor (CRF) forrása), arra utal, hogy a nociceptin a hypothalamo-hypophyseális rendszer muködésének is szabályozója. Fontos szerepet tulajdonítanak a nociceptinnek az akut stresszre adott válasz endogén szabályozásában (x), miután más fontos stressz neuropeptidek hatásának összehangolásában is részt vesz, mint az a CRF, a cholecystokinin (CCK), a neuropeptid Y (NPY), és a supstance P (SP) esetében bizonyított (xi). 14 o a K + -áram fokozásán keresztül ul 7
Munkánkat a nociceptin kutatás azon korai fázisában kezdtük, melyben a vérplazma, a CSF és a májszövet nociceptin, és nocistatin tartalmának vizsgálatával kísérletes állatmodellekben (krónikus diabéteszes és májcirrhosis), valamint humán vérplazma nociceptinszintjének meghatározásával krónikus májbetegségekben és neuropszichés kórképekben új adatokkal szolgálhattunk. Valamennyi a nociceptinszint meghatározására irányuló vizsgálat egy komplex vizsgálat részét képezte, mely a klinikai állapot monitorozását is magában foglalta. Új módszert dolgoztunk ki különbözo szövetekbol (agy, máj, lép, thymus, here) történo nociceptin és nocistatin meghatározásra.. nociceptin 8
II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. A NOCICEPTIN ÉS RECEPTORA 2.1.1. A nociceptin és a nociceptin-receptor elnevezése A közelmúltban azonosított és a klasszikus opioid receptorokkal nagy homológiát mutató új receptort ORL1 (opioid-receptor-like 1) receptornak nevezték el. 1996-ban az a IUPHAR (International Union of Pharmacology) Opioid Receptor Sub Committee -je új nevezéktan használatát javasolta az opioid receptorcsaládra vonatkozóan, így a korábban használt ORL1 helyett az OP4 elnevezést javasolta. A nociceptin-receptor szerkezete és transzdukciós mechanizmusa alapján az opioid receptorcsalád új, negyedik tagja lehet, annak ellenére, hogy a klasszikus nem szelektív opioid receptor ligandok (naloxon), amelyek egyforma nagy affinitással kötodnek a?-,?-,?-, receptorokhoz rendkívül alacsony affinitást mutatnak az ORL1 receptorhoz. Ezért nevezték az azonosítást követo idoszakban árva (orphan) receptornak. E receptor heptadecapeptid ligandját késobb azonosították, és orphanin FQ-nak, majd nociceptinnek nevezték el. A receptornak és ligandjának elnevezése az irodalomban nagyon eltéro volt, használták a nociceptin (NC, Noc, Noci), orphaninfq receptor nevet (OFQR, NOR hasonlóan a klasszikus opioid receptorokhoz MOR, DOR, és KOR), de végül is az OP 4 elnevezést fogadták el (xii). Ezt követoen a IUPHAR 2000. évi nevezéktan jelentésében a NOP (nociceptin-receptor) és a N/OFQ (nociceptin) elnevezést javasolta. 2.1.2. Az OP 4 receptor Az OP4 receptor génje a humán 20. kromoszóma q13.2-13.3 régiójában található (i). A klasszikus opioid receptorokhoz hasonlóan az OP4 receptort is hét transzmembrán domén alkotja. Összehasonlítva a humán OP4,?,?,?-opioid receptorok cdns által meghatározott aminosav szekvenciát, nagyfokú hasonlóság tapasztalható (1. ábra), különösen a transzmembrán doménekben és az intracelluláris hurkokban. A szekvenciaazonosság az OP 4, a?,?, és? receptoroknál igen magas. A második (ezen 1 9
régiót alkotó 22 aminosavból 17 azonos, 77,3%), a harmadik (16/22, 72,7%), és a hetedik (15/20, 75,0%) transzmembrán doménben a legnagyobb a hasonlóság. Kisebb mértéku a hasonlóság az elso (11/24, 50%), az ötödik (13/23, 56,5%) és a hatodik (9/22, 40,9%) transzmembrán doménben. A legkevésbé hasonló szegmens a negyedik (5/23, 21,7%) transzmembrán domén. A szekvenciabeli azonosság szintén nagy az intracelluláris hurkokban: az elso (6/7, 85,4%) a harmadik (18/24, 75,0%), a negyedik (9/12, 75,0%) és a második (13/22, 59,1%) intracelluláris hurokban. Az összes többi régióban a homológia foka nagyon alacsony (?8%). Összességében az OP4 receptor nagymértékben hasonlít a három klasszikus opioid receptorhoz (63-65%-os homológia) (xiii). 1. ábra: A hét-transzmemebrán domént tartalmazó, G protein kapcsolt opioid receptorcsalád. Rágcsálók agyának és a gerincvelo egyes részeinek immunhisztokémiai vizsgálata során, az OP 4 receptor mrns-t számos területen megtalálták, különösen a kérgi és a cortico-limbikus területek (amygdala, hippocampus, habenula, septum), a hypothalamikus területek (ventromedialis és paraventricularis magvak), a thalamus, az agytörzs (locus coeruleus, parabrachialis magvak, központi szürke állomány, hátsó raphe magvak) és a gerincvelo hátsó és elülso szarvai mutattak nagy aktivitást (i, xiv) (2. ábra). A patkány központi idegrendszerében maga az OP 4 receptor -fehérje megtalálható a cortex, amygdala, hypothalamus, (ventromedialis és paraventricularis magvak), az agytörzs területén (viii), hasonlóképpen megtalálható a humán agy ul ul 1 8 10
különbözo területein is, ahol a kérgi részek, a striatum, thalamus és a hypothalamus területén a legmagasabb a mennyisége (xv, xvi). Humán vizsgálatok, és állatkísérletek egyaránt igazolják jelenlétét a perifériás szövetekben is: a belekben, vas deferens -ben, a lépben, a májban (xvii) valamint a limphocytákban (xviii, xix, xv). 15 2.ábra: Az OP 4 receptor elofordulása patkány központi idegrendszerében (Darland et al., 1998) Az OP 4 receptor ezen központi idegrendszeri eloszlása alapján feltételezheto volt, hogy ligandjai a fájdalomérzet kialakulására, a tanulásra, az emlékezésre, a figyelemre, az érzelmekre, a mozgásra, a szimpatikus, paraszimpatikus és érzo neuronokra, valamint a hypothalamo-hypophiseális tengely muködésére egyaránt hatással lehetnek. Az OP 4 receptor jelenléte bizonyított a perifériás idegrendszerben és különbözo szövetekben. Az OP 4 receptort azonosított ák patkány bélen, vas defferensen, sertés gyomor-bél traktusában, májában és a veséjében. RT-PCR-al az OP 4 receptor jelenlétét igazolták tengerimalac idegdúcaiban, mint a prevertebrális és paravertebrális szimpatikus idegdúcokban, valamint a nyaki idegdúcokban. A receptorkötési t a 11
vizsgálatok alapján a nociceptin nagy affinitással kötodik patkány retinán (v) és szíven (lxxix). Az OP 4 receptorhoz intracellulárisan másodlagos ingerületátvivoként egy G- proteinhez kötött rendszer kapcsolódik, amely az adenil-cikláz gátlása révén megakadályozza a camp felhalmozódását (xx), ill. a feszültség függo Ca 2+ csatornák aktivációját (xxi, xxii), valamint stimulálja a sejtbe irányuló K + áramlást (xxiii). Az opioid receptorokhoz való nagy hasonlóság ellenére az OP 4 receptorhoz az eddig ismert opioid agonisták és antagonisták rendkívül kicsi affinitással kötodnek, mely jelentosen megnehezíti a receptor vizsgálatát. Ezért mostanában sokan foglalkoznak specifikus antagonisták eloállításával. A mai napig számos peptid és nem peptid antagonistát állítottak elo. 5 79 2.1.3. Az OP4 receptor ligandjai (nociceptin, nocistatin) Az OP 4 receptor és a?-opioid receptor szerkezeti hasonlósága alapján feltételezték, hogy a receptor ligandja is dinorphin-szeru vegyület lesz. Az elso OP 4 receptor ligandot a nociceptint (NC) 1995-ben találták meg patkány agyban (ii) és sertés hypothalamusban (xx). (3. ábra). le 2 20 dynorphin A YGGFLRRIRPKLKWDNQ dynorphin B YGGFLRRQFKVVT nociceptin FGGFTGARKSARKLANQ beta-endorfin YGGFMTSEKSQTPLVTLFKNAIIKNVHKKGQ Leu-enkephalin YGGFL Met-enkephalin YGGFM alpha-neoendorfin YGGFLRKYPK endomorfin 1 YPWF endomorfin 2 YPFF 3. ábra: A nociceptin és más opioid peptidek aminosav szekvenciája (Meunier et al., 1997; Darland et al. 1998). 12
A 17 aminosavból álló nociceptin, a 176 aminosavból álló prekurzor molekulából a pre-pronociceptinbol (PPNC) hasad le, amelynek génje a 8. kromoszóma 8p21 régiójában található (iv). A perkurzor molekulát meghatározó gén hasonló szerkezetet hoz létre mint a pre-proenkephalin, pre-proopiomelanocortin, preprodinorphin. A többi prekurzor molekulához hasonlóan a PPNC is a NC-en kívül más biológiailag aktív peptidet is tartalmaz, mint a nocistatin (NT) és a nociceptin II (NCII). A nocistatin a nociceptin antagonistájának bizonyult, és kimutatást nyert, hogy a nociceptin II egyes hatásait is antagonizálja. A NC és a NCII szerkezeti analógja a szintén PPNC-bol származtatható NCIII, amely a farmakológiai vizsgálatok szerint az OP4 receptoron inaktív (xxiv) (4. ábra). ból 4 o signal peptid MKVLLCDLLLLSLFSSVFSSCQRDCLTCQEKLHPALDSFDLEV CILECEEKVFPSPLWTPCTKVMARSSWQLPAAPEHVAALYQ nocistatin PRASEMQHLRRMPRVRSLFQEQEEPEPGMEEAGEMEQKQLKR nociceptin NCII NCIII FGGFTGARKSARKLANQKRFSEFMRQYLVLSMQSSQ RRRTLHQNGNV 173 4. ábra: A humán nociceptin prekurzor szekvenciája (Salvadori et al.1999; Calo et al. 2000). A nociceptin 17 aminosavából az N-terminálison lévo 4 aminosav (Phe-Gly- Gly-Phe) a message domain, amely meghatározó a receptoron való kötodés szempontjából. Ebben a doménben jelentos eltérés van a többi opioidokhoz viszonyítva, mivel az elso helyen Tyr helyett Phe található. A NC következo aktív része az 5.-13.-ig terjedo aminosav szakasz (Tyr-Gly-Ala-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys) az address domain, amely szintén meghatározó jelentoségu az OP 4 receptorral való kölcsönhatásban. Az ezt követo 14-17.-ig terjedo szakasz (Leu-Ala-Asn-Gln) a receptoraktiváció szempontjából inaktív, tehát elegendo a NC 1-13 szakasza (NC -(1-13)) a receptor aktivációjához. Farmakológiai vizsgálatok szerint a NC-amid (NC-NH 2 ) a 13
hasonló hatással rendelkezik, mint a természetes NC, de szignifikánsan nagyobb az affinitása a receptorhoz (xxv). A NC 1-13 aktív szakaszának amidálása (NC-(1-13)- NH 2 ) jó farmakológiai aktivitást, és jobb affinitást biztosít. A NC-(1-13)-OH mind aktivitásában, mind affinitásában jelentosen gyengébb, mint a természetes NC (xxvi). Az elso szelektív nem peptid OP 4 receptor agonistaként az NNC 63-0532 azaz a 8-naphtalin-1-ilmetil-4-oxo-1-fenil-1,3,8-triaza-spiro?4.5?-dec-3-il-ecetsav metil észter írták le. Az NNC 63-0532 affinitása az OP4 receptorhoz alacsonyabb mint a nociceptiné, de aktivitása hasonló a nociceptinéhez (xxvii). Az Ro 64-6198 újabb szelektív nem peptid OP 4 receptor agonista, melyet 2001.- ben Dautzenberg írt le. Az Ro 64-6198-nek 130-3500-szor nagyobb a szelektivitása az OP 4 receptorra, mint a klasszikus opioid receptorokra. Humán embrionális vese 293 (HEK 293) sejteken végzett vizsgálatok alapján az OP4 receptoron teljes agonista míg a? -opiát receptoron parciális antagonista tulajdonságot mutat. Az Ro 64-6198 gyorsan és reverzibilisen deszenzitizálja az OP 4 receptort in vitro, és nem vált ki toleranciát in vivo (xxviii). A szisztematikus szerkezet-hatás vizsgálatok során kiderült, hogy a NC N- terminális szekvenciájának megváltoztatása különösen az 1. helyen (Phe) antagonista hatású vegyülethez vezet. Ilyen vegyület a?phe? (CH 2 -NH)Gly?-NC(1-13)-NH 2, amely a központi-idegrendszeren kívül antagonista hatású, de a központi idegrendszerben agonista hatást mutat. A?Nphe?-NC(1-13)-NH2 mind a KIR-ben mind a periférián antagonista hatású (xxvi). en y hyl phenyl yl acetic acid methyl estert Egy az Ro 64-6198 amely 26 A gyógyszerkutatás szempontjából rendkívül fontos az elso nem peptid OP 4 receptor antagonista, a J-113397, amely 360-szor nagyobb affinitással kötodik az OP 4 receptorhoz, mint a többi opioid receptorhoz. A J-113397 egy eros kompetitív antagonistája az OP 4 receptornak, és nem fejt ki agonista hatást más opioid receptorokon (xxix). A 4-aminoquinolin származék az N-(4 amino 2 metilquinolin 6 yl) -2-(4-etilfenoxi-metil) benzamid hidroklorid egy újonnan leírt OP 4 receptor antagonista, melynek analgetikus hatása is van, mely hatás naloxonnal nem antagonizálható (xxx, xxxi). A III-BTD jelu nem szelektív OP 4 receptor ligand synthetic peptide etylphenoximethyl hydrochlorid combinatorial library szurovizsgálat alapján került meghatározásra. Hatása az OP 4 receptoron kompetitív jellegu antagonista hatás, amely nem befolyásolható a szelektív 14
OP 4 receptor antagonista?nphe?-nc(1-13)-nh 2 -val, de hatásosan antagonizálható a nem szelektív, általános opioid receptor antagonista naloxonnal (xxxii) (1. táblázat). 1. táblázat: OP4 receptor ligandok affinitása és aktivitása (Salvadori et al. 1999; Calo et al. 2000; Ozaki et al. 2000; Thomsen et al. 2000; Bigoni et al. 2000; Hisashiet al. 2000; Dautzenberg et al. 2001) Ligand Receptor binding Bioassay pk i (M) pec 50 (M) pa 2 (M) NC 8,7 7,8 - NC-NH 2 9,1 7,7 - NC-(1-13) 8,7 7,8 - NC-(1-13)-NH2 9,1 7,7 - NC-(1-13)-OH 6,9 5,6 - NNC 63-0532 7,3 305 - Ro 64-6198 9,4 9,6 Phe? Gly-NC-NH 2 7,7-7,0 Phe? Gly-NC(1-13)-NH2 8,0-6,8 Nphe-NC-NH 2 6,9-6,3 Nphe-NC-NH 2 7,0-6,4 III-BTD 6,6-6,9-5,91-6,18 4-Aminoquinolin/JTC-801 8,2-7,11 J-113397 8,7-8,3 2.1.4. A nociceptin metabolizmusa és bioaktív metabolitjai. A nociceptin metabolizmusát in vitro körülmények között egéragy kortikális metszetében (xxxiii), illetve humán vérmintában vizsgálták (xxxiv). Két fo metabolikus utat tártak fel: az egyik során az aminopeptidáz-n (APN) hasítja a heptadekapeptidet (ez elsosorban a plazmában jelentosebb), a kortikális régióban viszont az endogén opiátoktól eltéroen (EP 24.12), az endopeptidáz 24.15 (EP 24.15) aktivitás a meghatározóbb., 15
A heptadekapeptid nociceptint az APN illetve az EP 24.15 négy kritikus helyen hasítja a Phe 1 -Gly 2, Ala 7 -Arg 8, Ala 11 -Arg 12, és Arg 12 -Lys 13 kötéseknél (xxxiii) (5. ábra). Az így keletkezett metabolitok, N-, és C-terminális hasadékok teljesen inaktívak az OP 4 receptoron, hiszen az OP 4 receptor aktiválásához szükséges minimális aktív szekvenciát NC (1-13) már nem tartalmazzák (iii). 33 3 FGGFTGARK + SARK EP FGGFTGARKSARK + LANQ EP FGGFTGARKSARKLANQ APN EP24.15 F + GGFTGARKSARKLANQ FGGFTGARKSAR + KLANQ FGGFTGARKSA + RKLANQ FGGFTGA + RKSARKLANQ 5. ábra: A nociceptin in vitro és in vivo enzimatikus hasítása az aminopeptidáz-n (APN) és az endopeptidáz 24.15 (EP) által. (Salvadori et al. 1999) A metabolizmusban elsodleges jelentoségu az APN, mely egy Zink-kötött proteolitikus ectoenzim. Szelektív gátlása (EDTA) szinte teljes (95? 2,6%) védelmet nyújt a nociceptin metabolizmusa ellen. A szelektív EP inhibitor rhetrothiorphan csak kis csökkenést (10?3,1%) okoz a NC metabolizmusában (xxxiii) (2. táblázat). 33 16
2. táblázat: Specifikus enziminhibitorok hatásai a nociceptin metabolitok keletkezésére. (Montiel et al. 1997) Inhibitor Metabolitok Fragmensek F FGGFTGA RKLANQ KLANQ Kontroll 100 100 100 100 Rhetrothiorphan 95 88 84 89 Bestatin 24 137 156 93 PC18 28 105 152 90 Inh. 24.15 45 29 32 7 Inh. mix 58 0 0 0 Bestatin+Inh. 24.15 6 18 20 0 Bestatin+Inh. mix 5 0 0 0 PC18+Inh. mix 11 0 0 0 EDTA 0 0 0 0 A nociceptin Phe 1 -Gly 2 helyen történo enzimatikus hasításáért az aminopeptidáz-n felelos, hiszen szelektív APN gátlószert (PC18, bestatin) alkalmazva jelentosen csökken a Phe metabolitok keletkezése. A nociceptin hidrolízise során gyors hasítás történik az Ala 7 -Arg 8, Ala 11 -Arg 12, és Arg 12 -Lys 13 kötéseknél, amely aminopeptidáz inhibitorokkal nem védheto ki, hiszen ezeken a helyeken a hidrolízist az endopeptidáz enzimek végzik. Az Ala 7 -Arg 8, Ala 11 -Arg 12, és Arg 12 -Lys 13 kötések teljes védelme az EP24.15 és a EP24.16 inhibitorok kombinációjával (Inhibitor mix) valósult meg. Ellentétben az EP24.16 inhibitor egyedüli alkalmazásával, amely nem befolyásolja a nociceptin metabolizmusát. Megerosítve ezzel az endopeptidáz 24.15 ectoenzim elsodleges szerepét a heptadekapeptid metabolizmusában. Mivel az aminopeptidáz és az endopeptidáz inhibitorok együttesen sem gátolják teljes mértékben a NC metabolizmust, valószínusítheto egy újabb enzim részvétele a nociceptin metabolizmusban, amely feltételezhetoen a karboxipeptidase (xxxv). Egereken végzett viselkedésfarmakológiai kísérletek az in vitro metabolizmus vizsgálatok eredményeit igazolták. In vivo a nociceptin intracerebroventrikuláris (i.c.v.) alkalmazása különbözo mértéku spontán motoros aktivitás csökkenést eredményez. A, m car y 17
nociceptint szelektív aminopeptidáz gátlóval (bestatin) és szelektív endopeptidáz gátlóval (Inh.-24.15) együtt adva, a spontán lokomotoros aktivitás csökkenés szignifikánsan nagyobb, bizonyítva ezzel az APN és az EP együttes metabolikus aktivitását (xxxvi). 2.2. A NOCICEPTIN NEUROKÉMIAI HATÁSAI A nociceptin farmakológiai hatásainak sokszínusége alapján feltételezheto volt, hogy a NC/OP4 rendszer a klasszikus neurotranszmitterek modulációján keresztül a biológiai válaszreakciót közvetett módon is szabályozza. 2.2.1. A nociceptin hatása az acetil-kolin (Ach) felszabadulásra Számos közlemény bizonyítja, hogy az opioid peptidekhez hasonlóan a NC általános hatása az Ach felszabadulás gátlása (xxxvii, xxxviii). Éber, szabadon mozgó patkány striatumában a nociceptin hatására csökken az Ach felszabadulás. A tengerimalac légcsövén nyert adatok alapján a nociceptin gátolja a stimulációs elektromos pályákat, amelyek indukálják az Ach felszabadulást a kolinerg innervációjú idegekbol (xxxix). Altatott nyulak retináján vizsgálva a fény által kiváltott acetil-kolin felszabadulást, nociceptin hatására dózis-függo mértékben csökken (xl). Patkány gyomor-bél traktusában nociceptin hatására csökkent az elektromos inger kiváltotta izom-összehúzódás és Ach felszabadulás mind a gyomorban, mind pedig a vékonybélben, a vastagbélben azonban nem (xli). Patkányagy striátumában in vitro és in vivo végzett vizsgálatok egyaránt azt mutatják, hogy az opioid peptideknek Ach felszabadulást gátló hatása van (xxxvii, xxxviii), amely a? -opioid receptorok aktivációja révén fokozza a dopamin (DA) felszabadulást (xlii). A nociceptin hatására létrejövo OP 4 receptor aktiváció gátolja a kolinerg transzmissziót, ugyanakkor ez a hatás független a? receptor hatástól mivel a nociceptinnek elhanyagolhatóan csekély az aktivitása a klasszikus opioid receptorokon (xiii, xx). 2.2.2. A nociceptin hatása a dopaminerg rendszerre acetil-kolin acetil-kolin acetil-kolin acetil-kolin acetil-kolin 37 38 csökkenti Tehát azt mondhatjuk, hogy A Beszúrt: A a nociceptin kiváltotta Ach felszabadulás-csökkenés patkányagy striatumában a? - opioid agonistákhoz hasonló. 13 20 18
Murphy és mtsai.-nak egy közelmúltban végzett vizsgálata bizonyítja, hogy a nociceptinnek az i.c.v. és i.v.t.a.-ba (intra-ventriculotegmental-area) történo adagolását követoen csökken az extracelluláris dopamin koncentráció a nucleus accumbensben (55). A további vizsgálatok annak tisztázása irányultak, hogy a nociceptinerg rendszernek a dopaminerg transzmisszióra kifejtett hatása vajon egy közvetlen dopaminerg neuronon kifejtett hatás-e. In situ hibridizációs (ISH) vizsgálatok igazolják, az OP4 receptor jelenlétét a középagyi dopaminerg neuronokon, így a ventrális tegmentális area, és a substanicia nigra területén (xliii, xliv). Ezek alapján a nociceptinnek a középagyi dopaminerg neuronokra kifejtett direkt modulátor hatása feltételezheto. Ezt a feltételezést a farmakológiai vizsgálatok is megerosítették. A nociceptin 0,1? M koncentrációban gátolja tengerimalac (Emax30%) és egér striátrális területén (E max 50%), valamint tengerimalac retináján (E max 55%) a dopamin felszabadulást. Ez a hatás az (Ac-RYYRIK-(NH2)) 0,032? M és a naloxonbenzoylhydrazon (NBH) 5? M koncentrációjával antagonizálható (xlv). A nociceptin hasonló hatását írták le i.c.v. adagolást követoen a mediális eminencia, a striatum és a nucleus accumbens, a hypothalamikus paraventrikuláris nucleus területén, ahol a nociceptin dózis (0,01-10?g) és ido (30-90 perc) függo mértékben csökkentette a dopamin felszabadulást (xlvi, xlvii). A dopaminerg transzmisszió szabályozása a KIRben a dopamin transzporter (DAT) muködésének függvénye. CHO sejtvonalon expresszált patkány DAT -én, valamint patkány striatralis szinaptoszomáján is a nociceptin a dopamin felvételt jelentos mértékben gátolja (xlviii). Ezek az eredmények is azt mutatják, hogy a nociceptin közvetlen hatással van a dopaminerg transzmisszióra és így a dopaminerg rendszer által szabályozott funkciókra. In situ hybridizációs vizsgálatok eredményei alapján az adenozin, és a dopamin neurotranszmissziót gátló kezelés nem okoz változást a nociceptin expresszióban szeptális és striatrális területen (xlix). Az a tény, hogy a dopaminerg neurotranszmisszió gátlása a septum és a striatum területén nem befolyásolja a nociceptin expressziót arra utal, hogy a nociceptinnek a félelem, a szorongás és a stressz érzelmi komponenseinek összehangolásában tulajdonított hatása a dopaminerg rendszer közvetlen befolyásolásának eredménye lehet. (intraventriculotegmental -area) indítéka egy a középagyi dopaminerg neuronokra median eminence z van a 2.2.3. A nociceptin hatása az glutamát és GABA -erg rendszerre 19
A nociceptin és a nocistatin glutamát és GABA szinaptikus transzmisszióját befolyásoló hatását patkány laterális amygdala sejteken patch-clamp technikával vizsgálva a nociceptin koncentráció-függo mértékben csökkentette a glutamát receptormediált excitátoros posztszinaptikus potenciál (EPP) amplitúdóját, de a GABA receptor-mediált inhibitoros posztszinaptikus potenciál (IPP) mértékét is. Ezzel ellentétben a nocistatinnak nem volt kimutatható hatása sem a glutamát sem a GABA felszabadulásra (l). A K + -kiváltotta glutamát felszabadulását in vivo vizsgálva patkány kérgi területein, a fenti in vitro adatokkal egyezo eredményre jutottak. Ezek a vizsgálatok azt mutatják, hogy a nociceptin gátolja a glutamát és a GABA preszinaptikus felszabadulást a laterális amygdalában, ezt a hatást a nocistatin nem mutatta. Feltételezhetoen ezzel a mechanizmussal is befolyásolja a nociceptin a stresszhatásokkal szembeni érzékenységet., 2.2.4. A nociceptin hatása a noradrenalin felszabadulásra [ 3 H]-noradrenalinnal, és (NBH) elokezelt egéragy különbözo részletein (cerebellum, hippocampus, hypothalamus, és cortex) in vitro vizsgálták a nociceptinnek a noradrenalin felszabadulásra gyakorolt hatását. Az eredmények azt mutatják, hogy a nociceptin koncentrációfüggo mértékben (0,01-0,5?M) gátolja a noradrenalin felszabadulást (Emax=80%-os gátlás) a cerebellumban, a hippocampusban, a hypothalamusban, és a cortexben. A nociceptinnek a noradrenalin felszabadulást gátló hatása minden vizsgált agyrészletben NBH-al (5? M) antagonizálható volt (li). A nociceptinnek ez a gátló hatása a noradrenerg neuronok pres zinaptikus? 2- autoreceptoraival kapcsolatban álló OP4 receptoron keresztül valósul meg. y 2.2.5. A nociceptin hatása a szerotonerg rendszerre In vitro patkány kortikális szinaptoszomában vizsgálták az OP4 receptor, valamint egyes? -,?-,?- receptor agonisták szerotonin felszabadulásra kifejtett hatását., 20
Megállapították, hogy sem a deltorphin-i (szelektív?-receptor agonista), sem az U- 50,488 (szelektív?-receptor agonista) sem a endomorphin-i (szelektív? -receptor agonista) szignifikánsan nem befolyásolta a szerotonin felszabadulást. Ezzel szemben a nociceptin koncentrációfüggo mértékben (0,001-1? M) gátolja mind a spontán, mind pedig a K+ kiváltotta [ 3 H] - 5-HT kiáramlást (Emax=52%-os gátlás). A nociceptinnek ez a hatása 10? M naloxonnal nem volt gátolható. De egy új szelektív OP 4 receptor antagonistával a [Nphe1]nociceptin(1-13)NH2-nal és a szintén szelektív NBH 10? M-os koncentrációjával antagonizálható volt. A nociceptinnek az OP 4 receptoron keresztül kifejtett ezen hatása alapján a nociceptin a legfontosabb preszinaptikus modulátora a kérgi szerotonin felszabadulásnak (ix). Ezért feltételezhetoen a nociceptinerg rendszernek jelentos szerepe van a központi idegrendszeri 5HT mediált biológiai funkciók irányításában. 9 z 2.2.6. A nociceptin hatása a hisztamin felszabadulásra Ismert, hogy a morfin jelentosen fokozza a KIR-ben, különösen a tuberomammillaris (TM) neuronokban ahisztamin felszabadulást. A nociceptin ezzel ellentétben in vitro TM neuronokon végzett vizsgálatok alapján jelentosen gátolta azok kisülését. További vizsgálatok szerint patkány hypothalamusban a nociceptin dózisfüggo mértékben (10-300 nm) és reverzibilisen hyperpolarizálta a neuronokat. Ez a hatás tetrodotoxinra érzéketlen volt, ebbol következoen egy posztszinaptikus hatásról van szó, amelyben a hisztamin felszabadulás csökkenés a lassú K + áram fokozódásával hozható összefüggésbe (lii). Ismert továbbá, hogy a periaqueductalis szürkeállományban a hisztamin jelentos mértékben közremuködik az opioid mediált analgézia kialakulásában. Morfinnak és a nociceptinnek ellentétes hatása van a TM neuronokra, így a hisztamin felszabadulásra is. A? receptor mediált hisztamin felszabadulás antinocicepciót hoz létre. A nociceptinnek a fájdalom kialakulásában betöltött szerepének egy lehetséges útja, hogy gátolja az opioid kiváltotta hisztamin felszabadulást a TM neuronokból. tuberomammiláris 2.2.7. A nociceptin hatása egyéb neuropeptidek (CCK, NPY, SP) felszabadulására 21
A nociceptin, a PPNC, és az OP4 receptor egyaránt nagymértékben reprezentáltak a központi idegrendszernek azon területein (amygdaloid komplex, a septohippocampalis régió, a thalamikus és hypothalamikus magvak, valamint a periventricularis régió) amelyek a félelem, a szorongás, és a stressz emocionalis komponenseinek összehangolásában a vesznek részt. Rágcsálóknak i.c.v. adott nociceptin többféle nagy perdiktív értékunek tartott viselkedésfarmakológiai teszten dózis-függo mértéku anxiolitikus hatást okozott (liii), már nem szedatív dózisban is. Ez a hatás valószínusíthetoen a nociceptinnek az akut stresszre adott válasz szabályozásában betöltött fontos szerepére utal, de ennek a mechanizmusa még nem ismert. Jenck-nek és mtsai.-nak hypothézise szerint a félelem és a szorongás kialakulásában a CRF, a CCK, a NPY és a SP mellett a nociceptin szerepe egyaránt valószínusítheto (6. ábra), amelyek a GABA és monoamin rendszerek szabályozásán keresztül fejtik ki hatásukat (xi). ó 11 22
6. ábra: A nociceptin és egyéb neuropeptidek feltételezett együtthatása a félelem és a szorongás kialakulására (Jenc F. et al, 2000) 2.3. A NOCICEPTIN FARMAKOLÓGIAI HATÁSAI 2.3.1. A nociceptin központi idegrendszeri hatásai 2.3.1.1. A nociceptin fájdalomkelto és fájdalomcsillapító hatása Számos viselkedés-vizsgálat megerosítette, hogy a nociceptinnek fájdalomkelto és fájdalomcsillapító hatása egyaránt van. A fájdalomkelto hatása kiváltható, egérbe intracerebroventrikulárisan (i.c.v.) (0,05 nmol/állat) adott nociceptinnel, amelyet hot plate teszten is igazoltak (ii). Renscheid és mtsai. által végzett kísérletben a nociceptinnek (i.c.v. 1-10 nmol/állat) szintén hyperalgesiát kiváltó hatását igazolták tailflick teszten (xx). Többféle viselkedésfarmakológiai teszten igazolást nyert, hogy az i.t. beadott kis dózisú (5 pmol/állat) nociceptin is hyperalgesiát, illetve allodyniát vált ki, amely hatás naloxonnal nem antagonizálható (liv, lv). Az i.t.-an adott nagy dózisú nociceptin (0,5-5 nmol/állat) azonban analgetikus hatást mutat hot-plate illetve tail-flick teszten (ii, xx, lvi). A nociceptin analgetikus hatását bizonyítja még számos vizsgálat. 2 éziát 20 éziát. 2 20, 23
Patkányokon és egereken különbözo dózisú (0,5-10 nmol/állat) i.c.v. és i.t. adott nociceptin adását követo hot-plate és tail-flick teszten igazolták az analgetikus hatás létrejöttét (lvii, lviii, lix, lx). Azonfelül, az i.c.v. (2,5-25 nmol/állat) adott nociceptin antagonizálja a morfin analgéziát (s.c. 5 mg/ttkg), de a nociceptin önmagában nincs anti-opioid hatással a gerincveloi szinten. Egyes megfogalmazások szerint a nociceptin supraspinalisan antiopioid peptidként és spinalisan opioid peptidként viselkedik (lxi). A fentiekbol is látható, hogy a nociceptinnek, a fájdalom kialakulásában rendkívül összetett hatással van. Számos szerzo foglalkozik a nociceptinerg rendszernek a fájdalom mechanizmusában betöltött tényleges szerepének tisztázásával. Egy új megközelítés szerint a prosztaglandin és a nociceptinerg rendszer kölcsönhatása lehet a magyarázat a nociceptinnek a fájdalom kialakulásával kapcsolatban megfigyelt ellentétes hatásaira (lv) (7. ábra). amelyben p e 55 7. ábra: A prosztaglandinok és az opioid rendszer feltételezett kölcsönhatása az allodynia kiváltásában (Ito et al., 2001.). Beszúrt: 24
2.3.1.2. A nociceptin szerepe a fájdalomérzet feldolgozásában A nociceptinnek és az OP 4 receptornak a központi idegrendszerben való elhelyezkedésébol adódóan fontos szerepe feltételezheto fájdalomérzet kialakításában és komplex hatása valószínusítheto a gerincvelobol történo fájdalom továbbításában is. Elektrofiziológiai vizsgálatok során igazolást nyert, hogy a C-rostokból eredo ismétlodo elektromos impulzus a gerincvelo hátsószarvi neuronjainak eros izgalmát váltja ki, amely N-metil-D-aspartat (NMDA) receptor antagonistákkal gátolható. A hátsó szarvi neuronok izgalmi állapota szerepet játszik a neuropáthiás és a gyulladásos fájdalom kialakulásában és fenntartásában (lxii). Patkányoknak i.t. különbözo dózisban (2,8 és 124 nmol) adott nociceptin dózis-függo módon gátolja az izgalmi tüneteket. A nociceptin által így kiváltott gátló hatást csak igen nagy dózisú (140 nmol) naloxonnal lehetett antagonizálni. A nociceptin patkány hippocampusban is gátolja a hosszan tartó izgalmi tünetek kiváltását, amely NMDA receptor antagonistákkal is gátolható (lxiii). Decerebrált patkányok lumbális gerincbe adott nociceptin (6-60 pmol/állat) a mozgató neuronok supramaximális ingerlését követoen dózis-függo mértékben erosíti a flexor reflexet (lvii). Az i.t. adott nagyobb dózisú nociceptin (0,6-6 nmol/állat) viszont koncentráció-függo mértékben csökkentette a flexor reflexet (lvii). A nociceptin szerepe a nociceptiív transzmisszióban a szélesköru vizsgálatok ellenére sem tisztázott. is ul ul 57 57 2.3.1.3. A nociceptin hatása a cognit ív funkciókra gondolkodásra Knockout egerek tanulási képességét és a memória funkcióját labirintus teszten vizsgálva és összehasonlítva vad típusú egerekével (lxiv, lxv, lxvi) (a rövidtávú és a munkamemória használatát igényli) a nociceptin receptor hiánya a spontán viselkedésváltozásban nem mutatkozott meg. A vízmegtalálási feladatnál az állatokat több csoportra osztották. Az állatok egy részének megmutatták a vízivás helyét, egy másik részének nem. Mindkét csoportban az állatok egy részétol megvonták a vizet a másik részétol nem. Ahol nem alkalmaztak motivációs tréninget (csak azoknak az állatoknak mutatták meg a vízivás helyét, amelyektol nem vonták meg elozetesen a vizet) szignifikáns nociceptinhatás nem mutatkozott. Azonban, amikor a elozetes (ami a látens tanulás vizsgálatára alkalmazható), a 25
vízmegvonás történt, azok az egerek, amelyeknek volt elozoleg tapasztalatuk a vízivás helyére vonatkozóan, hamarabb eljutottak a vízhez, és találták meg a vízivás helyét, mint azok az állatok amelyeknek nem volt tapasztalatuk. A kísérlet során azt tapasztalták, hogy nincs szignifikáns különbség a vad-típus és a knockout egerek között az ivóvíz megközelítésének módjában és sebességében. A különbség a folyadékmegvont illetve a vizet kapott vad típusú és knockout állatok között van. A knockout egerek ivóvíz-megtalálási ideje rövidebb volt mint a vad-típusé, jelezve, hogy a koncentráló képesség és a latens tanulási képesség a knockout egerekben jobb. Dopamin receptor agonisták lerontják ezt a tanulási képességet, ami azt jelentheti, hogy a dopaminerg rendszer aktivációja gátolja ezt a folyamatot; a knockout egerekben a dopaminerg rendszer csökkent aktivációja feltételezheto. Ily módon a figyelem és a tanulási képesség növekedése nociceptinreceptor knockout egerekben feltételezhetoen, de nem kizárólag a dopaminerg funkciócsökkenés eredménye lehet (lxiv)., hogy a 64 2.3.1.4. A nociceptin szerepe a motivációban (reward) Az opiátok, az alkohol, az amphetaminok és a kokain közös tulajdonságaként tartjuk számon, hogy pozitív megerosítést, reward-ot hoznak létre. Ezen hatások összefüggésbe hozhatók az extracelluláris dopaminszint emelkedésével a nucleus accumbens-ben. A ventrális tegmentális nucleus accumbens aktivitációja úgy jöhet létre, hogy növekszik a dopaminfelszabadulás az amphetamin, vagy csökken a dopamin visszavétele a kokain esetében. Pozitív megerosítést a?-opioid agonisták is létrehoznak, viszont ismert, hogy a?-opiát receptor szelektív agonisták, amelyek negatív hatásúak, dysphoriát okoznak, csökkentik a dopamin felszabadulást a nucleus accumbensben. Intracerebroventicularis nociceptin (1,5-150 nmol) alkalmazást követoen altatott patkányokban a dopamin felszabadulás csökkenését lehetett megfigyelni a nucleus accumbensben (lxvii). 2.3.1.5. A nociceptin szerepe a táplálkozásban A nociceptin a többi opioidhoz hasonlóan (különösen a?-opioid receptor agonisták) stimulálják a táplálékfelvételt a patkányokban (lxviii). Az i.c.v. adott nociceptin (1, 3, 26
10 nmol) indukálja a táplálékfelvételt jóllakott állatokban is, és ez a hatás teljesen gátolható s.c. adott naloxonnal (1 mg/ttkg) (lxix), eltéroen más NC kiváltotta hatásoktól. Feltételezheto tehát, hogy a nociceptin kiváltotta táplálékfelvétel-fokozódás az opioid rendszer aktivációjának tulajdonítható. A nociceptint a nucleus accumbensbe vagy ventromediális hypothalamusba történo bejuttatása esetén (2,5-25 nmol) tapasztalható táplálékfelvétel-fokozó hatás rövidtávú (lxx). Valószínusítheto, hogy a NC-nek a táplálék felvételt fokozó hatása a jóllakottság központ koncentrációfüggo mértéku hyperpolarizációját jelenti. 2.3.1.6. A nociceptin szerepe a mozgásban Egereknek nyert adatok szerint az i.c.v. adagolt 10 nmol nociceptin a horizontális és vertikális locomotor aktivitás csökkenését, ataxia létrejöttét, valamint az egyensúlyérzék elvesztését okozza (xx). Ugyanakkor az i.t. adott 50 pmol nociceptint serkento hatásúnak találták a locomotoros aktivitásra és a felderíto viselkedésre (lxxi). A nociceptinnek ez utóbbi hatása érzéketlen naloxonra, de gátolható D1 és D2 receptor antagonistákkal. Patkányok esetén az i.c.v. adott 10 és 100 nmol nociceptin hatására tartós motoros gátlás, a koordináció zavara, az egyensúly elvesztése és az izomtónus csökkenése mutatható ki. Ezekhez a hatásokhoz 2 vagy 3 napon belül tolerancia kifejlodik ki, és ez a hatás megmarad a kezelést követo 7. napig (lxxii). Ha viszont a nociceptint (10 nmol) közvetlenül a hippocampusba juttatjuk az nem hat ki a patkány motoros teljesítményére (lxxiii). Patkányban a nociceptin által kiváltott csökkent motoros aktivitás speciálisan supraspinális hatásnak tunik, amely 0,5-10 nmol nociceptin adását követoen jön létre és nem indukál más tünetet a motoros elégtelenségen kívül. Mindezen eredmények ellenére az OP 4 receptor knockout egerekben nem mutatkozik nyilvánvaló rendellenesség a spontán és a felderíto mozgásokban (lxxiv). 20 Míg, ami arra utal, hogy a nociceptin csökkent dopamin felszabadulást okoz. leromlás ét Viszont e, de a gyors metabolizáció t egy rövid ideig tartó mozgásnövekedésben mutatkozik meg k 2.3.1.7. A nociceptin szerepe a neuroendokrin elválasztásban A nociceptin és az orphan opioid receptor hypothalamusban való elhelyezkedésébol feltételezheto volt, hogy befolyásolja a hipofizis hormon elválasztását. Patkányban a 27
nociceptin (i.c.v. 2,5? g) csökkenti a növekedési hormon szintet, de a prolaktin és a kortikotropin szintet nem. Magas nociceptin koncentráció (i.c.v. 12,5? g) azonban ellentétes hatású a növekedési hormonra és növeli a prolaktin és a kortikotropin szintet a stressz hatásnak kitett állatokban (lxxv). A nociceptin részlegesen antagonizálja a stressz hatására létrejövo növekedési hormonszint csökkenést és fokozza a prolaktin és kortikotropin szintnövekedést. Ezek a hatások valószínuleg nem kizárólag az OP 4 receptorhatáson keresztül valósulnak meg. 2.3.1.8. A nociceptin szerepe a neuronális differenciálódásban Egér NS20Y neuroblasztóma sejtvonalon nyert adatok szerint a dibutiril-camp indukálja a neurit növekedését és a kíséro up-regulációját az N23K és az N27K nociceptin prekurzoroknak (lxxvi). Az N27K nociceptin prekurzor fehérje felhalmozódik dibutiril-camp indukált növekedésu neuritek csúcsában, a fejlodo agyban, látszólagos neuroblasztként, és az ismert neuroblaszt migrációs minta szerint oszlik el. Azt nem tudjuk pontosan, hogy ez az N27K protein, vagy pedig az érési terméke a nociceptin játszik-e szerepet az agy fejlodésében. A adatok arra utalnak, hogy az N27K proteinnek valóban szerepe van az agy fejlodésében. ta Beszúrt: ta ja t. És a De az 2.3.2. A nociceptin perifériás hatásai A nociceptin perifériás idegrendszerben való jelenlétét elsoként a légutakban igazolták (lxxvii). Az OP 4 receptort számos központi idegrendszeren kívüli területen kimutatták patkányban, úgymint belek, vas deferens, máj, lép (lxxviii) és szív (lxxix), valamint humán limphocytán (xv). A nociceptinnek számos biológiai hatását bizonyították perifériás preparátumokon (lxxx). A perifériás hatások elsosorban a neuromodulátoros aktivitás következményei, melynek során a transzmitterfelszabadulást befolyásolják. Ezek a hatások hasonlóak az opioidoknak a perifériás idegrendszerre kifejtett neuromodulátoros hatásaihoz. A NC gátolja a depolarizáció kiváltotta transzmitter felszabadulást a kolinerg, noradrenerg, és a szenzoros idegekbol a tengerimalac ileumban, a bal pitvarban, a légcsoben, a 15 28
bronchusokban és a vesemedencében, az egér és a patkány vas deferensben és a patkány légcsoben (lxxxi). 2.3.2.1. A nociceptin hatása a légzorendszerre Tengerimalac légcsövének paraszimpatikus idegvégzodésein végzett vizsgálatok szerint a nociceptin koncentráció- függo mértékben (0,1-3?mol) az acetil-kolin felszabadulásának gátlása révén befolyásolja a kolinerg neurotranszmissziót (lxxxii), ez a hatás naloxonnal nem antagonizálható. A nociceptin szintén koncentráció-függo (1 nmol-1? mol) gátló hatást fejt ki az EFS kiváltotta atropin rezisztens bronhuskonstrikcióra a szenzoros idegvégzodésekbol felszabaduló tachykininen, substance P-n és a neurokinin A-n keresztül (lxxxiii). Ezt igazolja Helyes és mtsainak vizsgálata is, miszerint a nociceptin csökkenti a SP (63%-ban), a CGRP (44%-ban) felszabadulását patkány légcsövön (xcii). 92 2.3.2.2. A nociceptin hatása a cardiovasculáris rendszerre A nociceptin nm-os koncentrációban jelentos vazorelaxáns hatással van az elozetesen phenilephrinel kezelt macskavese, mezenteriális, szív és combcsonti érintetlen endotheliumú artériáin. Patkányon végzett vizsgálatok szerint a nociceptin szintén vazorelaxáns hatású az artériákon (lxxxiv). In vivo kísérletekben, altatott patkányokon a nociceptin (1? mol) általános artériás kontrakciót és bradikardiát okoz. Ez a hatás az vegetatív idegrendszer befolyásolásán keresztül valósul meg (lxxxv) és naloxonnal nem antagonizálható. A nociceptinnek a cardiovasculáris rendszeren kifejtett hatása független a klasszikus opioid receptorok aktivációjától, és OP4 receptor aktiváción keresztül valósul meg, amely mind prejunkcionálisan, mind postganglionálisan megtalálható a szimpatikus idegrostokon, és koncentráció-függo mértékben (0,01-0,5? mol) gátolja a noradrenalin felszabadulását az idegvégzodésekbol, amelyek a rezisztancia ereket szabályozzák. A nociceptin gátló neuromodulátoros hatást mutat a szívben is. Különösen a (tengerimalac) bal pitvarban (in vitro) képes negatív inotrop hatást kiváltani a noradrenalinnak, a szimpatikus idegvégzodésekbol való felszabadulásának gátlása révén (lxxxvi). rezisztanci a ereken autonom az acetil-kolinnak és 29