MORFOLÓGIAI VIZSGÁLATOK

Átírás

1 VII. MIKROORGANIZMUSOK MINİSÉGI MEGHATÁROZÁSA (AZONOSÍTÁS) Az elızı fejezetben a mikroorganizmusok mennyiségének meghatározásának alapvetı módszereit mutattuk be. Ez a fejezet az egyes mikrobák identifikálásához (azonosításához) használt legfontosabb módszereket tárgyalja. A mikroorganizmusok azonosításához különféle határozók állnak rendelkezésre. A baktériumok rendszertani besorolásához világszerte a Bergey-féle baktériumhatározó a legelfogadottabb, melynek kilencedik kiadása (1984) tartalmazza a jelenleg érvényben levı nomenklatúrát, és egyben a legújabb azonosítási módszereket is. A mikroorganizmusok azonosításához számtalan vizsgálat használatos. A mikrobák identifikálása során alkalmazunk morfológiai, szaporodási minimum és optimum, az anyagcsere vizsgálatát célzó biokémiai, az antigénszerkezetet elemzı szerológiai, sıt újabban genetikai teszteket is. A mikroorganizmusok azonosítására részben célirányos felhasználásuk, részben az ellenük való védekezés szempontjából van szükség. MORFOLÓGIAI VIZSGÁLATOK A mikrobák morfológiai vizsgálatai között megkülönböztetünk mikromorfológiai és makromorfológiai vizsgálatokat. A mikromorfológiai vizsgálatok a sejt - vírusok esetében a virion - alaki tulajdonságainak megismerését célozzák. A baktériumok és gombák sejtjeinek mikromorfológiai vizsgálata fénymikroszkóppal - natív vagy festett preparátumok formájában - történik, mint ahogy arról már az V. fejezetben szó volt. Az akariota mikroorganizmusok vizsgálata, valamint a pro- és eukariota sejtek ultrastruktúrális vizsgálatának eszköze az elektronmikroszkóp. A makromorfológiai vizsgálatok a mikrobák folyékony és szilárd táptalajokban létrehozott tenyészeteinek alaktani tulajdonságait célozzák. A mikroorganizmusok telepeinek jól meghatározható, az adott mikroorganizmusra jellemzı morfológiai megjelenése van. A különbözı baktériumok és gombák szilárd táptalajon képzıdött telepeinek alakja, színe, szaga, szegélye különbözı. A telep fontos jellemzıje a pigmenttermelés formája is (extra-, vagy intracelluláris). Folyékony táptalajokban is más-más az egyes mikrobák megjelenési formája (üledékképzıdés, felszíni hártyaképzés, diffúz zavarosodás stb.). A.***Telepek A mikroorganizmusok néhány jellegzetes telepformája A)A baktériumok és gombák telepformái szilárd táptalajon: l. Telepek alakja felülnézetben 2. Telepek alakja oldalnézetben 3. Telepek szegélyei felülnézetben B) A baktériumtenyészetek néhány jellegzetes megjelenési formája folyékony táptalajokban: 1. Szaporodás a táptalaj belsejében; a. diffúz zavarosodás b. üledékképzıdés c. pelyhesedés 2. Szaporodás a táptalaj felszínén; a. hártyásodás b. pellikula-képzıdés (bırkésedés) c. győrős telepképzıdés A telepek jellege tekintetében megkülönböztetjük az R (rough)-, az S (smooth)- és az M (mucoid)-telepeket. Az R-telepek felszíne matt, rögös vagy érdes. Az S-telepek sima

2 felületőek, fénylık, vajszerőek. Az M-telepekre a nyálkás felszín jellemzı. Elıfordul, hogy a tenyészet elöregedése vagy a sorozatos passzálások hatására a telepmorfológia megváltozik. A burkos Gram-pozitív baktériumok, amelyek S telepeket képeznek, mutáció révén elveszíthetik buroktermelı képességüket (és ezzel együtt általában virulenciájukát is). A buroktermelı-képességüket elvesztett baktériumok R-telepeket képeznek. A gramnegatív baktériumok S R mutációjának leggyakoribb oka az "O"-antigént kódoló gének megváltozása, ami az LPS-komplexben található poliszacharid oldalláncok fokozatos elvesztésében; és így az antigénszerkezet átalakulásában nyilvánul meg. Az "O"-antigén elvesztése - akár a buroktermelı-képesség elvesztése - általában együtt jár a virulencia részleges vagy teljes megszőnésével. A mikroorganizmusok morfológiai tulajdonságainak ismerete nagymértékben leszőkíti azoknak a biokémiai teszteknek a mennyiségét, amelyet az adott mikroba azonosítása érdekében el kell végezni. A KÖRNYEZETI TÉNYEZİK HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA A MIKROORGANIZMUSOK SZAPORODÁSÁRA A mikroorganizmusokra ható élı és élettelen környezeti tényezık között meg kell említeni a tápanyagokat, a hımérsékletet, a sugárzást, a ph-t és a redoxpotenciált, a vízaktivitást, a különbözı gátlóanyagokat és a mikroorgamzmusok közti, valamint a mikroorganizmusok és magasabb rendő szervezetek közti kölcsönhatásokat. A mikroorganizmusok tápanyagigényének vizsgálata különbözı összetételő táptalajokon történhet, amirıl az elızı fejezetben már szó esett. Az ionizáló és nem ionizáló sugárzások mikrobákra gyakorolt hatásával a "Sterilezés" címő fejezetben foglalkoztunk. A mikroorganizmusok és a magasabb rendő szervezetek kölcsönhatásainak bemutatását külön tárgyaljuk az immunológia tárgykörében. l. Hımérséklet, mint környezeti tényezı A mikroorganizmusok élettevékenységüket (szaporodás, anyagcsere) csak egy bizonyos hımérséklet-tartományban képesek folytatni. Az életjelenségek mindegyike bonyolult, enzimekkel katalizált biokémiai folyamtok eredményeként jön létre. Az ezen enzimek mőködéséhez szükséges hımérséklet-tartományt három kitüntetett hımérséklettel jellemezhetjük. Hımérséklet-minimum: az a hımérséklet, amely alatt a mikroorganizmus nem képes szaporodni. (Nem azonos az anyagcsere megszőnését eredményezı hımérséklettel!) Hımérséklet-optimum: az a hımérséklet, amelyen a részfolyamatok eredıjeként maximális sebességő a szaporodás. (Az egyes anyagcsere-folyamatok, a termékképzés, a toxintermelés stb. optimuma nem feltétlenül esik egybe a szaporodás hıoptimumával!) Hımérséklet-maximum: az a hımérséklet, amely felett a mikroorganizmus nem képes szaporodni. (Nem azonos az anyagcsere megszőnését eredményezı hımérséklettel!)

3 A szaporodás minimum, optimum és maximum hımérsékletparaméterei nem éles határral meghúzott értékek, hanem - különösen az optimum esetében - néhány C-nyi hımérsékletintervallumként határozhatók meg. A mikrobák igen széles hımérsékleti tartományban képesek szaporodni. A klasszikus kategorizálás szerint hımérsékletigényük alapján három csoportba sorolhatók. E szerint megkülönböztetünk psychrophil (hidegkedvelı), mesophil és thermophil (melegkedvelı) mikroorgamzmusokat. A psychrophil csoportra jellemzı, hogy szaporodásuk hımérsékletoptimuma 15 C alatt van. Ezt a csoportot tovább tagolva beszélhetünk psychrotolerans (hidegtőrı) mikrobákról, amelyek szaporodása 5 C alatti hımérsékleten leáll, valamint kryotolerans mikrobákról, amelyek -18 C hımérséklet-minimumig szaporodásképesek. E hımérséklet alatt gyakorlatilag nem kell a mikroorganizmusok szaporodásával számolni. A mesophil mikrobák szaporodásának hımérséklet-optimuma C közé esik. Ebbe a csoportba tartozik a legtöbb pathogén, valamint élelmiszer-rontó, -fertızı és -mérgezı mikroorganizmus. A thermophil mikroorganizmusokra jellemzı, hogy szaporodásuk 40 C feletti hımérsékletén éri el a maximális sebességet, 65 C fölött pedig gyakorlatilag már nem kell mikrobaszaporodással számolni. A csoporton belül elkülönítjük az un. thermotolerans (melegtőrı) mikrobákat, amelyek szaporodásának hımérséklet-maximuma 50 C. A mikroorganizmusok hımérsékletigényének illetve tőrésének vizsgálata tiszta tenyészetbıl elıállított vonáskultúrák különbözı hımérsékleten, 1 héten át zajló inkubálásával történik. Az inkubálási idı eltelte után a tenyészetek szaporodásának mértéke alapján állapítjuk meg az optimális szaporodási hımérsékletet. Mivel ez a vizsgálat igen hosszadalmas, a mindennapi rutin diagnosztikában nincs helye. 2. A környezet redoxpotenciálja A szaporodási közeg redoxpotenciálja is meghatározó abból a szempontból, hogy mely mikroorganizmusok képesek elszaporodni, illetve milyen anyagcsere-folyamatok zajlanak le. Redoxpotenciál alatt értjük a közege a normál hidrogén (H 2 )-elektródra vonatkoztatott potenciálját, ha a közegben az oxidált és redukált alak homogén formában van jelen. Egy rendszer redoxpotenciálja a NERST-féle egyenlettel írható le: RT E = Eh + * ln ZF [ ox] [ red ] ahol E: a közeg redoxpotenciálja (mv) E h : a közeg normálpotenciálja, vagyis a hidrogén-elektródra vonatkoztatott potenciál abban az esetben, ha a rendszert alkotó oxidált és redukált formák aktivitása megegyezik (mv) R: egyetemes gázállandó (8,31 Ws/K) T: abszolút hımérséklet (K) Z: az oxidált és redukált formák közötti elektronátmenetek száma F: Faraday-állandó (9,65 x 10 4 As)

4 A mikroorganizmusok természetes környezete minden esetben összetett, soktényezıs rendszer, ezért az egységes értelmezhetıség céljából az elektródpotenciál kialakítását minden esetben az alábbi folyamatra vonatkoztatjuk: 2H + + 2e - H 2 E folyamat értelmezésében tehát a rendszerben mérhetı elektródpotenciál arányos a rendszerben lévı hidrogén-gáz parciális nyomásával. Ennek alapján a redoxrendszereket egy velük azonos elektródpotenciált eredményezı - azonos ph-értékő hidrogén-elektródban lévı hidrogén-gáz nyomásának negatív tizes alapú logaritmusa, az rh-érték használható: rh=-lgp H2 Az rh-skála 0-42-ig terjed; minél nagyobb az rh-érték, a közeg annál erısebb oxidáló hatással rendelkezik. A mikroorganizmusok oxigénigényét - rh-értékben megadva - az alábbi táblázat tartalmazza: Aerob mikroorganizmusok rh > 14 Mikroaerofil mikroorganizmusok 7,4 < rh < 14 Anaerob mikroorganizmusok rh < 7,4 A redukáló hatás vizsgálatát a biokémiai vizsgálatok között végezzük. 3. A ph hatása a mikroorganizmusok szaporodására A mikroorganizmusok ph-igénye illetve -tőrése - akárcsak a hımérsékletigénye - három paraméterrel - a minimális, az optimális és a maximális ph-értékkel -jellemezhetı. A mikroorganizmusok általában 3-11 ph-tartományban képesek szaporodni, de a többség ph-optimuma a semleges érték körül mozog. A legszélesebb ph-intervallumban (1,5-11) a penészgombák képesek szaporodni, de az élesztık ph-spektruma is igen széles (2,5-8,5). A baktériumok közül egyesek képesek savas kémhatású közegben is szaporodni, mint pl. a Staphylococcusok és a Lactobacillusok. Az emberi kolera kórokozója - a Vibrio cholerae - ugyanakkor bázikus környezetben éri el szaporodási sebességének maximumát. A minimum- és a maximum ph-értékek alatti illetve fölötti értékeken a szaporodás leáll, majd csírapusztulás következik be. Ennek alapján alkalmazzák a savanyítást élelmiszerek, takarmányok (silózás) tartósítására. 4. A vízaktivitás és az ozmotikus nyomás hatása a mikroorganizmusok szaporodására. A mikroorganizmusok számára a víz nemcsak a belsı környezet egyik legfontosabb összetevıje, hanem feltétlenül szükséges környezeti tényezı is. A belsı és a külsı víztér közti egyensúly fenntartását a sejtmembrán aktív és passzív transzportfolyamatok révén biztosítja. Lényeges szempont, hogy a mikroorganizmusok csak a kémiailag szabad vizet tudják hasznosítani, a vegyületekben kötöttet nem. A környezetben jelenlévı szabad vízmennység jellemzésére a vízaktivitás (a w ) szolgál. A vízaktivitás a közegben lévı vizes

5 oldat gıztenziójának és a tiszta oldószer (víz) gıztenziójának a hányadosa adott hımérsékleten: Pk a w = Pv ahol, a w : vízaktivitás adott hımérsékleten P k : a közegben lévı vizes oldat gıztenziója P v : a víz gıztenziója A vízaktivitás értéke 0 és 1 közötti érték. Zárt rendszerek esetében elmondható, hogy a légtér és a mikroorganizmus természetes környezete (élelmiszer, talaj stb.) között a víztartalom tekintetében egyensúly áll be. Adott hımérsékleten a légtérnek azt a relatív páratartalmát, amely mellett a közeg víztartalma már nem változik, egyensúlyi relatív páratartalomnak (ERP) nevezzük. Az egyensúlyi relatív páratartalom és a vízaktivitás között az alábbi egyenlettel kifejezhetı összefüggés áll fenn: a w 100=EPR A mikroorganizmusok szaporodásához szükséges vízaktivitás-értékeket az alábbi táblázat tartalmazza (Bíró, 1994): Mikroorganizmusok a w érték Szaporodás Gram-negatív pálcák 0,95 alatt nem szaporodnak Gram pozitív baktériumok 0,88 alatt nem szaporodnak Kiv. a St. aureus, mely 0,86 értékig szaporodik, de enterotoxint csak 0,92 értékig termel penészgombák 0,7-0,65 alatt nem szaporodnak A mikroorganizmusok vízaktivitás igényük alapján négy csoportba sorolhatók (Bíró, 1994): Csoportok Hidrophil (vízkedvelı) Xerotolerans (szárazságtőrı) Xerophil (szárazságkedvelı) Osmophil a w -érték 1-0,95 0,95-0,9 0,9-0,85 0, Élelmiszeripari szempontból a vízaktivitás csökkentésének igen nagy a jelentısége, mivel a nagy víztartalmú élelmiszerek kedveznek a mikrobák elszaporodásának. A vízaktivitás csökkenthetı szárítással, vagy a vizet kémiailag megkötı, ozmotikusan aktív anyagok, mint pl. sók, cukrok, vagy zsírok közegbe juttatásával. A mikroorganizmusok vízaktivitás-igénye igen jól jellemezhetı cukortőrésükkel is. A pathogén mikroorganizmusok többsége 1-2 % nátrium-klorid koncentráció mellett szaporodik optimálisan. Azokat a mikroorganizmusokat, amelyek még 7,5% sókoncentráció mellett is képesek szaporodni, halotoleraris mikróbáknak nevezzük. Ebbe a csoportba tartozik pl. a Staphylococcus aureus és a Bacillus cereus. A 15% sótartalom felett is szaporodni képes mikroorganizmusokat halofileknek nevezzük. Ezek közül

6 élelmiszerhigiéniai tekintetben kiemelkedı jelentıségő a Vibrio parahaemoliticus, amely fıként nyers, sózott tengeri állatok fogyasztása révén okoz ételmérgezést. Amellett, hogy az ozmotikusan aktív anyagok a vízaktivitás csökkentésén keresztül gátolják a mikroorganizmusok szaporodását, meg kell említeni, hogy némelyeknek specifikus gátló hatása is van. Így pl. a húsok pácolásához alkalmazott nitrát-sók - egyéb hatásaik mellett - specifikusan gátolják a Cl. botulinum spórák kicsírázását. GYAKORLAT (Bemutató) 2,5; 5; 7,5; 10 és 15 % NaCl-tartalmú, valamint sómentes TGY- (triptóz-glükóz élesztıkivonat) - levestáptalaj, oltókacs Mikroorganizmusok: Staphylococcus aureus és Escherichia coli ferdeagaros tenyészete A gyakorlat végrehajtása: A Staphylococcus aureus és Escherichia coli törzsekkel beoltunk egy-egy sorozat, különbözı sókoncentrációjú levestáptalajt. 24 órán át tartó 37 C-os inkubálást követıen a zavarosodás alapján elbíráljuk, hogy a csövekben történt-e baktériumszaporodás. 5. Gátlóanyagok hatása a mikroorganizmusok szaporodására Gátlóanyagoknak nevezzük mindazon vegyületeket, amelyek a mikroorganizmusok szaporodását gátolják. Hatás szempontjából ezen belül megkülönböztetünk sztatikus és cid hatású anyagokat. A sztatikus hatás csak a mikroorganizmusok szaporodásának gátlását jelenti, cid hatás alatt a mikrobák elpusztítását értjük. Gyakran egy anyagra nem lehet egyértelmően azt mondani, hogy sztatikus, vagy cid hatású, mivel ezt az anyagi minıségen kívül befolyásolja a koncentráció, a hımérséklet, a ph és a behatás ideje is. A baktericid, fungicid, sporocid, illetve viricid hatású vegyület elpusztítja a baktériumokat, gombákat, spórákat illetve vírusokat. Az az anyag, amely valamennyi mikroorganizmust, a gombák szaporítóképleteit és a bakteriális endospórákat egyaránt el tudja pusztítani, germicid hatású. Vannak fertıtlenítıszerek, amelyek kisebb koncentrációban csupán bakterio-, vagy fungisztatikus hatást fejtenek ki, magasabb koncentrációban viszont hatásuk cid jellegő. A gátlóanyagok lehetnek szervetlen vagy szerves, abiogén vagy biogén vegyületek. Biogén eredető szerves anyagok a fitoncidok, amelyeket magasabb rendő növények termelnek (pl. vöröshagyma, fokhagyma, kapor stb.), az állati eredető epesavas sók, vagy a természetes antibiotikumok. A gátlóanyagokat felhasználás szempontjából is csoportosíthatjuk, bár ez a csoportosítás - az alkalmazás szerteágazósága miatt - nem túl gyakorlatias. Gátlóanyagokat használunk pl. tartósítószerként, fertıtlenítıszerként, vagy gyógyászati célból, valamint a mikroorganizmusok szelektív tenyésztésekor.

7 5.1. A fitoncidok hatásának vizsgálata lyukteszttel A fitoncidok olyan - gyakran illó, a baktériumokra kis koncentrációban is mérgezı vegyületek, melyeket magasabb rendő növények termelnek. GYAKORLAT Tesztagar ph 7,2, agarfúró, lándzsa, fokhagyma-szuszpenzió, cseppentı Mikroorganizmusok: Staphylococcus aureus és Escherichia coli tenyészetekbıl készített szuszpenzió A gyakorlat menete: A baktérium-szuszpenziókból néhány cseppet Petri-csészébe pipettázunk, majd a felolvasztott tesztagarral lemezeket öntünk. A lemezek megszilárdulása után a lelángolt agarfúróval a lemezekbe 2-2 lyukat fúrunk. A kiszúrt agarkorongokat lelángolt lándzsával távolítjuk el a lemezbıl. Az egyik lyukba steril hígítóvizet, a másikba pedig fokhagymaszuszpenziót cseppentünk. 37 C-on 48 órán át tartó inkubálás után megvizsgáljuk a baktériumnövekedést a lyukak körül A festékek bakteriosztatikus hatásának vizsgálata Számos festékanyag; így pl. a trifenil-metán típusú festékek viszonylag nagy hígításban is gátolják a baktériumok szaporodását. GYAKORLAT Tesztagar ph 7,2, agarfúró, lándzsa, 0,1 és 0,01 %-os kristályibolya-oldat, cseppentı Mikroorganizmusok: Staphylococcus aureus és Escherichia coli tenyészetekbıl készített szuszpenzió A gyakorlat menete: A baktérium-szuszpenziókból néhány cseppet Petri-csészébe pipettázunk, majd a felolvasztott tesztagarral lemezeket öntünk. A lemezek megszilárdulása után a lelángolt agarfúróval a lemezekbe 3-3 lyukat fúrunk. A kiszúrt agarkorongokat lelángolt lándzsával távolítjuk el a lemezbıl. Az egyik lyukba steril hígítóvizet, a másik kettıbe pedig a különbözı koncentrációjú kristályibolya-oldatokat cseppentjük. 37 C-on 48 órán át tartó inkubálás után megvizsgáljuk a baktériumnövekedést a lyukak körül.

8 5.3 A fertıtlenítıszerek antifugális hatásának vizsgálata lyukteszttel A fertıtlenítıszerek olyan vegyületek, amelyek a mikroorganizmusokat a szervezeten kívül teszik ártalmatlanná. Annak alapján, hogy a kórokozót csupán fejlıdésében gátolják, vagy el is pusztítják, antiszeptikus, vagy dezinficiáló hatásról beszélünk. E két tulajdonság tekintetében a fertıtlenítıszerek között éles határt vonni azonban nem lehet, minthogy a fertıtlenítıszerek mikrobákra gyakorolt hatása több tényezı függvénye. A fertıtlenítıszerként használt kémiai vegyületek hatása a vegyülettıl és a mikroorganizmustól függıen változó. Az egyes mikroorganizmusok érzékenysége különbözı a használt fertıtlenítıszerrel szemben. A fertıtlenítıszerek egyetemes sejtmérgek, amelyek hatása az alkalmazott koncentrációtól is függ. A vegetatív sejtek viszonylag érzékenyebbek a szaporítósejteknél és a bakteriális endospóráknal. A fertıtlenítıszerek általános felosztása a mikroorganizmusokra gyakorolt hatásuk alapján történik: A bakterio- illetve fungisztatikus hatású fertıtlenítıszer nem öli meg a baktériumokat illetve gombákat, de gátolja azok szaporodását. A fertıtlenítıszer közömbösítése vagy a kritikus koncentrációértéknél kisebb koncentrációra hígulás után a mikroorganizmusok tovább növekednek és szaporodnak. A kémiai úton ható fertıtlenítık hatásmechanizmusa nem egységes, sok esetben nem is tisztázott. A fertıtlenítı hatás lényege a baktériumok, vírusok, gombák életfeltételeit jelentı hımérsékleti, ph-, ion- és ozmotikus viszonyoknak a mikrobákra nézve hátrányos megváltoztatása. A fertıtlenítı kemikáliák antimikróbás hatásukat a mikroorganizmus testének (membrán, sejtfal stb.) vagy enzimrendszerének károsítása útján érik el. A hatás esetenként többirányú is lehet. A hatékonyság szempontjából lényeges kérdés, hogy a létrehozott elváltozások reverzibilis vagy irreverzibilis jellegőek-e. A fertıtlenítıszerként használt anyagoktól elvárjuk, hogy csíraölı hatásuk széles spektrumú legyen, vízben vagy alkoholban oldhatók, kellıen stabilak, kellemes illatúak, vagy legalább szagtalanok legyenek. Az emberi és állati szervezetre ne vagy csak kevéssé legyenek toxikusak, szövetkárosítóak, allergizáló hatásúak, teratogén és mutagén tulajdonságokkal ne rendelkezzenek. Alkalmazásuk ne okozzon környezetszennyezést, a fém-, textil- és egyéb anyagokat ne károsítsák, szennyezı anyagok hatásukat lehetıleg ne csökkentsék, gazdaságosak legyenek. A fertıtlenítıszerek hatékonyságát befolyásoló fıbb tényezık a következık: a fertıtlenítendı felület, eszköz vagy tárgy anyagi minısége a fertıtlenítıszer koncentrációja a behatási idı a fertıtlenítıszer valamint a fertıtlenítendı anyag hımérséklete a fertıtlenítıszer kémhatása a fertıtlenítendı anyag szerves anyagokkal való szennyezettsége a mikroorganizmusok csíraszáma és ellenállóképessége. GYAKORLAT Malátaagar, agarfúró, lándzsa, Hypo, Neomagnol és Dürr fertıtlenítıszer 2 %-os oldata, cseppentı

9 Mikroorganizmusok: Fusarium oxysporum konídium-szuszpenzója A gyakorlat menete: A konídium-szuszpenzióból néhány cseppet Petri-csészébe pipettázunk, majd a felolvasztott maláta-agarral lemezt öntünk. A lemezek megszilárdulása után a lelángolt agarfúróval a lemezekbe 4-4 lyukat fúrunk. A kiszúrt agarkorongokat lelángolt lándzsával távolítjuk el a lemezbıl. Az egyik lyukba steril hígítóvizet, a másik háromba pedig különbözı fertıtlenítıoldatokat cseppentünk. Szobahımérsékleten történı 72 órán át tartó inkubálás után megvizsgáljuk a gombanövekedést a lyukak körül A mikroorganizmusok antibiotikum-érzékenységének kimutatása korongteszttel A mikrobiológiai vizsgálatok során igen nagy hangsúlyt kap a mikroorganizmusok antibiotikum-érzékenységének vizsgálata. Humán- és állategészségügyi szempontból nagy a jelentısége a célzott antibiotikum-terápia megvalósításában. Bizonyos - antibiotikumokra fokozottan érzékeny - törzseket (pl. Bacillus sterarothermophilus var. calidolactis) felhasználjuk az antibiotikumok élelmiszerekbıl történı kimutatására. A mikroorganizmusok antibiotikum-érzékenységének gyors kimutatására a legelterjedtebben alkalmazott módszer az agardiffúziós korongteszt. Ennek lényege, hogy logaritmikus szaporodási fázisban lévı tiszta levestenyészetbıl lemezöntéssel szilárd tenyészetet készítünk, majd a lemez felszínére különbözı antibiotikumokkal átitatott papírkorongokat helyezünk. A lemezeket megfelelı hıfokon adott ideig inkubáljuk. Ezalatt az antibiotikum radiálisan az agarba diffundál, és így a papírkorong körül - amennyiben az adott mikroorganizmus érzékeny az alkalmazott antibiotikumra - gátlási zóna alakul ki. Adott antibiotikumra vonatkoztatva a mikroba érzékenysége arányos a gátlási zóna átmérıjével. GYAKORLAT Tesztagar ph 7,2, antibiotikummal átitatott "RESISTEST" korongok (szumetrolim, chloramphenicol, ofloxacin, tetracyclin), steril csipesz Mikroorganizmusok: Staphylococcus aureus és Escherichia coli tenyészetekbıl készített szuszpenzió A gyakorlat menete: A baktériumszuszpenziókból néhány cseppet Petri-csészébe pipettázunk, majd a felolvasztott tesztagarral lemezeket öntünk. A lemezek megszilárdulása után a lemezek felszínére steril csipesszel negyedenként a Petri-csésze aljára írt számok fölé elhelyezünk 1-1 RESISTEST korongot, majd a lemezeket egyenes állásban 48 órára 37 C-os termosztátba

10 helyezzük. Az inkubációs idı eltelte után lemérjük a kialakult gátlási zónák átmérıjét, és így adjuk meg, hogy az adott mikroorganizmus melyik antibiotikumra a legérzékenyebb. 6. Mikroorganizmusok közti kölcsönhatások Természetes körülmények között a mikroorganizmusok kevert társulásokat alkotnak. A társulásokban részvevı mikroorganizmusok közti kölcsönhatásnak négy típusát különböztetjük meg: - szimbiózis - metabiozis - antibiózis - parazitizmus Szimbiózisról beszélünk, ha az együttélés mindkét fél számára elınyös. Egyik mikroorganizmus elısegítheti a másik fejlıdését pl. tápanyag-produkció révén is. Például a B-vitaminokat igénylı Lactobacillusok csak olyan környezetben életképesek, ahol a szaporodó élesztık, penészek vagy bizonyos baktériumok B-vitamint szintetizálnak. A metabiotikus társulásra jellemzı, hogy az egyik faj tevékenysége elısegíti a másik fejlıdését. Például mikrobiológiai laboratóriumban oly módon is tenyészthetünk anaerob mikroorganizmusokat, hogy vele közös légtérbe aerob baktérium tenyészetét helyezzük, amely elfogyasztja a légtérben lévı oxigént. Az antibiózis vagy antagonizmus alatt egy másik mikroba szaporodásának gátlását, vagy elpusztítását értjük. A gátlóhatás oka lehet tápanyagkonkurencia vagy gátló hatású anyagcseretermékek kiválasztása (antibiotikumok, savak stb.). Parazitizmus jön létre, ha az egyik faj a másik rovására él. Baktérium és baktérium között igen ritka a parazitizmus. Ezzel szemben a bakteriofágok élısködése a baktériumokban általános jelenség CAMP teszt A diagnosztikai célokat szolgáló CAMP-teszt azon az elven alapul, hogy egyes hemolizáló (vérsejteket oldó és/vagy vérfestéket bontó) baktériumok egymás hatását erısítik. GYAKORLAT (Bemutató) véresagar, oltókacs Mikroorganizmusok: Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Listeria innocua

11 A gyakorlat végrehajtása: A véresagar-lemezre átlósan vonal alakban β-hemolizáló Staphylococcus aureus teszttırzset kell oltani az alábbi ábra szerint: ***CAMP A vizsgálandó baktériumok levestenyészetébıl ennek jobb oldalára úgy kell átoltani, hogy az oltási vonal éppen a Staphylococcus oltási vonal mellett kezdıdjön. 37 C-on 24 órán át történı inkubálás után CAMP-pozitívnak kell értékelni a tesztet, amennyiben a Staphylococcus ß-hemolízis zónájában egy teljes hemolízis zóna képzıdik. T E S Z T T Ö R Z S E K Staph.aureus L. monocytogenes Béta-hemolízis L.innocula Nincs hemolízis K O N T R O L L T Ö R Z S E K