Precancerosus állapota proteomika tükrében

Átírás

1 Precancerosus állapota proteomika tükrében - diabetesben szenvedő betegek nyálmintáinak vizsgálata Doktori (PhD) értekezés Dr. Jancsik Veronika Ágnes Iskolavezető: Dr. Kovács L. Gábor, egyetemi tanár Programvezető: Dr. Olasz Lajos, egyetemi tanár Témavezető: Dr. Olasz Lajos, MTA doktora Dr. Márk László, egyetemi docens Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Fogászati és Szájsebészeti Klinika Arc-, Állcsont- és Szájsebészeti Tanszék Pécs 2014.

2 TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS PRECANCEROSUS ÁLLAPOTOK DEFINÍCIÓJA A DIABETES MELLITUS ÉS A SZÁJÜREGI LAPHÁMCARCINOMA KÖZÖTTI KAPCSOLAT NYÁLDIAGNOSZTIKA, PROTEOMIKAI VIZSGÁLATOK NYÁLBÓL VIZSGÁLATAINK CÉLJA ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK A VIZSGÁLATBA BEVONT DIABETES MELLITUSBAN SZENVEDŐ PÁCIENSEK MINTAVÉTEL A MINTÁK FELDOLGOZÁSÁHOZ HASZNÁLT MÓDSZEREK Elektroforézis Tömegspekrometriás vizsgálat A tömegspektrométer felépítése és működése Mintaelőkészítés Ionforrások Analizátor Triptikus emésztés és MALDI TOF/TOF MS A spektrogram értékelése Célzott peptid analízis STATISZTIKAI ELEMZŐ MÓDSZEREK EREDMÉNYEK ELEKTROFORÉZIS VIZSGÁLAT EREDMÉNYE TÖMEGSPEKTROMETRIÁS VIZSGÁLAT EREDMÉNYE Cukorbeteg páciensek nyálmintájának képe Egészséges kontroll minták képe Tömegspektrometriás kép összehasonlítása STATISZTIKAI EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA

3 5. MEGBESZÉLÉS AZ IDENTIFIKÁLT FEHÉRJÉK BEMUTATÁSA Annexin A8: Peroxiredoxin-2: Tirozin-protein kináz: KONKLÚZIÓ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA IRODALOMJEGYZÉK TUDOMÁNYOS KÖZLEMÉNYEK TÉMÁVAL KAPCSOLATOS PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE TÉMÁBAN MEGJELENT ABSZTRAKTOK JEGYZÉKE TÉMÁHOZ KAPCSOLÓDÓ ELŐADÁSOK EGYÉB TUDOMÁNYOS ELŐADÁSOK KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS MELLÉKLET A VIZSGÁLAT SORÁN HASZNÁLT KÉRDŐÍV ÉS BELEEGYEZŐ NYILATKOZAT DIABÉTESZES PÁCIENSEK ADATAIT ÖSSZEFOGLALÓ TÁBLÁZAT CLINPROTOOLS STATISZTIKAI ELEMZÉSSEL VALIDÁLT PEPTIDEK LISTÁJA

4 RÖVIDÍTÉSEK CPITN: Community periodontal index of treatment needs Da: Dalton DM: diabetes mellitus DNS: Dezoxiribonukleinsav Gl: glandula, mirigy MALDI TOF/TOF: Matrix segítette lézerdeszorpció, repülési idő MAPK: mitogén aktivált protein kináz kaszkád mm: millimol ml: milliliter mtsai: munkatársai m/z: tömeg és a töltéssel rendelkező ionok számának aránya ph: pondus Hidrogenii RAF: rapidan gyorsuló fibrosarcoma oncogén RAS: rat sarcoma oncogén, G-protein RNS: ribonukleinsav Rpm: revolutions per minute/ percre eső fordulatok száma SDS: Sodium-dodecyl-sulfate ún: úgy nevezett WHO: World Health Organization/ Világ egészségügyi szervezet µl: mikroliter 4

5 1. Bevezetés A cukorbetegség a XXI. század elejére népbetegséggé vált ben 171 millió cukorbeteget tartottak nyilván a világon. Bár a betegség diagnózisa egy egyszerű és kötelező szűrővizsgálattal felállítható, ennek ellenére a cukorbetegségben érintettek száma folyamatosan emelkedik (1. ábra). Becslések szerint 2030-ra 366 millióra fog növekedni. Friss adatok szerint a cukorbetegség Magyarországon is egyre több embert érint. A nyugat-dunántúli régióban a betegség előfordulása néhol eléri a 10%- ot is [19,27].Magyarországon a becslések szerint kb millió ember szenved diagnosztizált vagy nem diagnosztizált cukorbetegségben, illetve károsodott szénhidrát anyagcsere valamilyen formájában [27]. 1. ábra: WHO adatok, Diabetes "becsült" prevalenciája világszerte (2007). Az ábra a világ országaira lebontva demonstrálja az egyes és a kettes típusú diabetes százalékos előfordulását jelzi a teljes populációban. Sötétbordó színnel jelölt: 14-20% előfordulási gyakoriságot mutatja, míg a sárga színnel 4%-os gyakoriságot jelzi. 5

6 A diabetes mellitus a pancreas Langerhans-szigetek béta-sejtjeinek csökkent inzulintermelése, vagy a sejtek inzulinrezisztenciája miatt alakul ki. A betegséget 3 fő csoportra osztjuk. Megkülönböztetünk 1-es típusú DM-t, 2-es típusú DM-t, gesztációs diabetest, és egyéb okból eredő diabetest [19]. Táblázatba foglaltam az 1-es és a 2-es típusú diabétesz fő tüneteit, diagnosztikus kritériumait (1. táblázat). 1. táblázat: 1-es és 2-es típusú DM összehasonlítása [Williams textbook of endocrinology (12th ed.). Philadelphia: Elsevier/Saunders. pp ISBN ] 1-es típus 2-es típus Életkor Főleg gyermekek Főleg felnőtt Testalkat Vékony/ normál Gyakran elhízott Ketoacidosis gyakori ritka Autoantitestek Ált. jelen vannak nincsenek Endogen insulin Alacsony/ hiányzik Normál,/ csökkent/ megnövekedett szint Prevalencia ~10% ~90% 6

7 A diabetes következményeként kialakuló szövődmények között találhatóak szív- és érrendszeri megbetegedések, vesebetegség, retinopathia [24,7]. Az első szájüregi szövődményt említő tudományos értekezést már a 19. században publikálták [18]. Irodalmi adatok szerint a cukorbetegekben észlelt rosszabb szájhygiéné, a nyálsecretiós ráta csökkenése és a ph-csökkenés kedvező körülmény a szájnyálkahártya megbetegedéseinek (leukoplakia, lichen oris, illetve a nyelvhát nyálkahártyájának elváltozásai) kialakulásában [21,29]. Újpál és mtsai 2003-as vizsgálatai alapján elmondható, hogy a precancerosus léziók gyakorisága cukorbetegek körében elérte a 11%-ot, míg a nem cukorbetegek körébenez az érték 3,2% volt [3,39,63-65]. A Pécsi Tudományegyetemen Dr. Szántó Ildikó 2011-ben végzett a szájüregi daganatok korai felismerésére vonatkozó vizsgálatokat [58]. A kutatások folytatásaként, azok eredményeinek továbbgondolásával, a cukorbetegségben szenvedő páciensek lehetséges szájüregi precancerosus állapotára utaló korai biomarkerek detektálását céloztam meg. 7

8 1.1. Precancerosus állapotok definíciója Ma az Egészségügyi Világszervezet definíciója alapján precancerosus (rákmegelőző) elváltozásokat és állapotokat különböztetünk meg. E meghatározás szerint precancerosus elváltozásnak tekintjük az olyan, klinikailag és szövettanilag kóros elváltozásokat (leukoplakia, erythroplakia), melyekből a carcinoma gyakrabban alakul ki, mint a hasonló területre jellemző egészséges nyálkahártyán [6, 23,26,50,52,53]. A szájüregi carcinomát megelőzhetik olyan nyálkahártya-elváltozások, amelyek rosszindulatú átalakulásra hajlamosak. Az elváltozások már hónapokkal vagy évekkel a rák kialakulása előtt jelentkezhetnek, vagy a már kifejlett rákos elváltozások mellett találhatók [37,43,47,66,67]. A precancerosus elváltozások kialakulását elősegítik bizonyos precancerosus állapotok: ezek olyan szisztémás állapotokat jelölnek, amelyek a carcinoma kialakulásához kedvező feltételeket, és így jelentősen megnövekedett rizikót teremtenek (lichen, vashiányos vérszegénység, diabetes mellitus, submucosus fibrosis)[11,42,61] A diabetes mellitus és a szájüregi laphámcarcinoma közötti kapcsolat A megnövekedett vércukor szint az egész emberi szervezetet működését befolyásolja [24,41,17,14,35,7]. A nem kontrollált, és nem jól beállított diabetes szájüregi tünetei igen változatosak. A perioralis régió bőre szárazzá válik, így hajlamosabb különböző bakterialis 8

9 betegségekre (furunculus, carbunculus). Gyakori tünet a xerostomia, glossodynia és az ízérzés zavara is. Gyakori szájnyálkahártya ya tünet még a chronicus candidiasis (2. ábra), lichen oris, lichenoid reakció és a cheilitis angularis. A fogíny és a fogágy állapotára is befolyással vannak a diabetes mellitus szisztémás hatásai. Gyakori kísérő tünet a gingivitis és a parodontitis [29,3,39]. 2. ábra- Chronicus Candidiasis [ A diabetes mellitus és a szájüregi gyulladásos lesiok közötti ti kapcsolat leírását, már a 19. században publikálták. Ujpál és munkatársai 2004-ben publikálták azt az 9

10 epidemiológiai vizsgálat eredményét, mely kimutatta, hogy a vizsgált 2-es típusú diabeteses betegcsoportban a leukoplakiak aránya több mint háromszoros, 11% a kontroll csoportéhoz képest. Vizsgálták továbbá a jóindulatú elváltozások előfordulását (6,4% a kontrollcsoportban és 16,9% a beteg csoportban). Érdekes eredményt hozott a cancer állapotok elhelyezkedésének összehasonlítása is. Míg a nem diabeteses csoportban inkább a sublingualis régióban, addig a diabetes csoportban a gingivatumorokat regisztráltak [1,63,64] (3. ábra). 3. ábra Gingivatumor diabeteses páciensben [ Ennek hátterében a szájban levő chronicus gyulladás carcinogén hatása is állhat. Jól ismert tény, hogy a gastrointestinalis rendszer gyulladásos megbetegedésében szenvedőkben (ulcerativ colitis, Crohn betegség) gyakrabban alakul ki bélrendszeri malignus tumor [31]. Az epidemiológiai összefüggésen túl, ennek konkrét molekuláris biológiai magyarázata is van. 10

11 2004-ben Vaiktaris és munkatársai vizsgálatukban a diabetes oncogeneticus hatását vizsgálták állatkísérletes modell segítségével. A kísérlet során azt tapasztalták, hogy diabetesben az erbb2 és erbb3 receptorok indukciója által, aktiválódik a Ras/Raf/MAPK szignáltranszdukciós útvonal. Ennek következtében megnő a sejtek proliferációs rátája [59]. Ezzel párhuzamosan azt tapasztalták, hogy az apoptosis mértéke nem változott [65]. Ez eddig nem végeztek humán, laphámrákra utaló nyálban található molekuláris biomarker vizsgálatokat diabeteses betegekben. 11

12 1.3. Nyáldiagnosztika, Proteomikai vizsgálatok nyálból A nyálból nyerhető diagnosztikus értékű biomarkerek vizsgálata kis túlzással az XXI. század legígéretesebb vizsgálati módszere [69,71,49,57,58,25,16,62]. Az emberi nyálat a szervezetben három pár nagy nyálmirigy termeli: a gl. Parotis, gl. Submandibularis és a gl. Sublingualis (4. ábra). Ezen felül több száz kis nyálmirigy található a palatumon, az ajkak belső felszínén, ill. a buccán is. 4. ábra: A 3 pár nagy nyálmirigy elhelyezkedése a fej-nyak régióban [ ] Egészséges emberek esetén a nyálmirigyek kb. 1-1,5 liter nyálat termelnek naponta. Ennek összetétele 99,3% vízből és 0,7% szárazanyagból áll. A szárazanyag tartalom nagyrészt fehérjékből, anorganikus sókból, továbbá zsírból, de akár ún. testidegen anyagokból áll, mint például gyógyszermaradványok. A nyál mikrobiológiai flórája a születést követően alakul ki, és alakul át a élet során. Normál esetben előfordulnak Streptococcus fajok, stb. Egyes betegségekben akár vírusokat is detektálhatunk a nyálban ilyenek pl. EBV, HIV, Hepatitis [49]. 12

13 A nyál egy dinamikusan változó rendszer, melynek összetétele nem konstans. Az összetevőket és azok arányát sok tényező befolyásolja. Vizsgálatok szerint az összetétel függ a páciensek korától, nemétől, gyógyszereitől. A kiválasztott anyagokat és azok mennyiségét befolyásolhatja, hogy milyen napszakban történt a mintavétel, vagy éppen a páciens emocionális állapota [36]. Ezek a tényezők az emberi szervezet egészére hatással vannak. Így lehetséges az, hogy ezeket a változásokat kísérő, a szervezetben lezajló biokémiai folyamatok termékei, fehérjék, ionok véráram útján keresztül a nyálba kiválasztódjanak. A kiválasztódás módja 4 úton történhet (5. ábra): a, aktív transzporttal b, passzív diffúzióval c, filtrációval d, ioncsatornákon keresztül 5. ábra: Nyálba szekretálódó bioaktív molekulák transzport mechanizmusai 13

14 A humán nyál, mint diagnosztikus rendszer, 1990-es évek óta vált intenzív kutatások célpontjává. Ezen vizsgálatok kezdetben a szájüregi megbetegedésekre korlátozódtak, periodontium betegségei, caries, de a modern biokémiai módszerek segítségével ma már képesek vagyunk DNS, apasági-tesztek, HIV-teszt, de egyéb más szisztémás betegségek vizsgálatára is és akár különböző drogok, alkohol szint monitorozásában is bevált módszer [49,69]. Az új diagnosztikus értékű folyadék használata számos pozitív és előnyös tulajdonsággal rendelkezik. Majdnem minden vérben mérhető az egészségi állapotot reprezentáló molekula, ion, vegyület megtalálható a nyálban is. A vérrel ellentétben a nyálminták gyűjtése nem jár invazív beavatkozással, mely nem okoz szorongást, diszkomfort érzést, így a mintavétel megismétlése kevésbé komplikált a betegek compliancét tekintve. Klinikai gyakorlati használat szempontjából is sokkal előnyösebb tulajdonságokkal rendelkezik, mint a vér, vagy a serum. Az egyszerű gyűjtésen, tároláson kívül, nem kell számoljunk az alvadással, így csökken az elemző módszerek során használt szükséges manipulációk száma is. Hátránya közé sorolandó, hogy az informatív biomolekulák aránya a nyálban sokkal alacsonyabb, mint a serumban előfordulóké. De az új és nagy érzékenységű technológiák számára ez ma már nem jelent akadályt. Ezen technológiák kifejlesztésével megszülettek az ún. OMICS, proteomics, genomics tudományágak. A proteomikai vizsgálatok célja, hogy a szervezetben 14

15 található fehérjék összetételét elemezze. Ma már képesek vagyunk arra is, hogy a vizsgált fehérjéket ne csak összetételükben, de szerkezetbeli változásaik során is nyomon kövessük [49,57,58]. A proteomika két fő eszköze az elektroforézis és a tömegspektrometria. Az elektroforézis módszerrel a fehérjéket molekulasúlyuk szerint választjuk szét, majd a tömegspektrométer segítségével elemeire bontjuk. Az így kapott fragmenteket internetes adatbázisok segítségével azonosítva, következtetünk a vizsgált fehérjére, peptidekre [60]. 15

16 2. Vizsgálataink célja 1. Kutatásunk során arra kerestük a választ, hogy a precancerosus állapotnak számító diabetes mellitusban szenvedő páciensek körében előfordulnak-e korai szájüregi laphámrákra utaló biomolekulák? 2. Van-e különbség a 10 éve vagy annál hosszabb ideje diabetesben szenvedő páciensek nyál biomarker mintázatában? 3. Célunk volt továbbá, hogy egy megbízható és egyszerű vizsgálati protokollt dolgozzunk ki, melyek a későbbiekben egy nagy betegszámú, multicentrikus tanulmány alapjául szolgálhatnak. 16

17 3. Anyagok és módszerek 3.1. A vizsgálatba bevont diabetes mellitusban szenvedő páciensek január 4-e és november 30-a között 45 nyálmintát vettünk az önkéntesektől. A DM csoportba soroltuk a 2-es típusú diabetesben szenvedő pácienseket (n=25), míg a H csoportba a velük kor / nem relációban hasonló, egészséges egyedek kerültek (n=20). A férfiak-nők aránya: 55-45% volt, az átlag életkor 62 év. A kontrollcsoportban 10 férfit és 10 nőt involváltunk vizsgálatainkba, az ő átlag életkoruk 62,1 év volt. A DM csoportban levő betegek mind a Pécsi Tudományegyetem II. sz. Belgyógyászati Klinika és Nephrológia Klinika fekvőbeteg osztályának páciensei voltak. A vizsgálatban való részvétel kizárási kritériumait a következő táblázat foglalja össze (2. táblázat). 2. táblázat- Részvételt kizáró kritériumok 1. Nem jól kontrollált diabetes 2. Diagnosztizált tumoros megbetegedés, precancer lézió 3. Rossz szájhygiéné 4. Mentális problémák 5. Szájüregi aktív fertőzés vagy gyulladás, CPITN index >3 6. Kontroll vizsgálatokon való részvétel elutasítása 17

18 3. táblázat- Diabetesben szenvedő betegek főbb adatai Adatok Fő/n (%) HbA1c szint <7% 10 (41%) >7% 15 (59%) DM2 diagnosztizálásának ideje <10 év 8 (32%) >10 év 17 (68%) Gyógyszerelés Inzulin 24 (96%) A mintavétel előtt az önkéntes résztvevők egy saját szerkesztésű, nem validált kérdőívet töltöttek ki, melyben az egészségük állapotáról (3. táblázat), az általuk szedett gyógyszerekről, továbbá az alkoholfogyasztási szokásról és a dohányzási szokásról is kérdeztük őket. Ezt követően minden résztvevő egy stomatooncologiai szűrővizsgálaton esett át (anamnézislap, belegyező nyilatkozat "Függelék" részben található). 18

19 3.2. Mintavétel Mivel a nyál összetétele jelentős változásokat mutat a napi életciklus folyamán, ezért a projektünk megvalósításában fontos szerepe volt a mintavétel standardizálásának. Saját előzetes tapasztalataink és a szakirodalomban fellelhető ajánlások alapján mi a reggeli mintavétel mellett döntöttünk [38]. A páciensek nyálmintáit ugyanazon, délelőtti időben gyűjtsük, lehetőleg étkezés előtt. A mintavétel előtt nem történt invazív beavatkozás. Egy rövid tájékozató, a beleegyező nyilatkozat kitöltése után, a beteg anamnesztikus adatainak rögzítése történt. Ezt követően megkértük a pácienst, hogy a szájüreget kétszer hideg csapvízzel öblítse át. Szántó és munkatársai által használt taktilis mintavételi eljárással, steril, 5ml-es fecskendőbe gyűjtöttünk 1-1,5ml nyálat, ami a fecskendő érintésére mint taktilis ingerre képződött (6. ábra). 6. ábra: Mintavétel a sublingualis régióból 19

20 A mintákat tartalmazó fecskendőt rögtön jégen tároltuk, majd a mintavétel után, laboratóriumi körülmények között 12 perc 2500 rpm centrifugálást követően a minták felülúszóját Eppendorf csövekbe helyeztük és azonnal -80 C hőmérsékletre hűtöttük. A mintákat a további biokémiai vizsgálatokig itt tároltuk. A kontroll csoport nyálmintáinak gyűjtéséhez szintén a taktilis mintavételt alkalmaztuk. A mintavétel során használt anyagok: öblítőpohár, 5ml-es egyszer használatos fecskendő,eppendorf cső A minták feldolgozásához használt módszerek Elektroforézis Az elektroforézis működése a töltéssel rendelkező partikulumok elektromos térben létrehozott migrációján alapul. Mivel a különböző részecskék eltérő méretűek és töltésűek, ezért a vándorlás is eltérő sebességgel zajlik, így a különböző részecskék egymástól elválasztódnak. Az elektroforézis jelenleg az egyik legnagyobb hatékonyságú szeparáló módszer. A géles közegben végzett elektroforézis a biológiai makromolekulák (fehérjék, DNS, RNS) meghatározásának egyik legfontosabb eszköze. 20

21 A proteomikában proteinek és peptid molekulák analizálása során használják, de a módszer alkalmas sejt organellumok és natív fehérje komplexek szeparálására is. A proteinek és peptidek amfoterikus anyagok. Ez azt jelenti, hogy a fehérje környezeti ph értéktől függően, pozitív vagy negatív töltéssel rendelkezhetek. Az elektroforetikus szeparálás során pontosan beállított ph és konstans ionos erő mellett a partikulomok a műszer katód vagy az anód részének irányába vándorolnak. Az elektromos mezőben a vándorlás sebessége függ a molekula töltésétől, tömegétől és alakjától függő súrlódási együtthatótól, továbbá az elektromos tértől. A legtöbb elektroforézis szeparációt géleken végezzük. A géleknek két fő típusát különbözethetjük meg: a granulált, vagy az ún. kompakt géleket. Granulátumból készíthető gélek általában dextrán alapúak és főleg a kromatográfiás vizsgálatokban terjedtek el. A nyálminták elemzése során SDS-PAGE (nátrium-dodecyl-szulfát, poliakrilamid) géleket használtunk. Az SDS egy erős anionos detergens, szolubizálja a fehérjéket. A fehérjék hidrogénkötéseinek disszolvációja által, a másodlagos és harmadlagos szerkezetet bontja. Az SDS-PAGE segítségével a polipeptidek a molekulasúlyuk szerint szeparálódnak. A poliakrilamid géleket általában két üveglap között, géllemez formájában polimerizálják,az elektroforézis függőleges helyzetben történik. A futtatás során a proteinek az anód irányába vándorolnak. A minták fehérjesúlyának meghatározásához, ismert mólsúlyú kalibráló fehérjét is futtatunk. A futtatást követően a fehérje spot-okat különböző eljárásokkal (festés, labeling, autoradiográfia, Western blot) tehetők láthatóvá [12,69,28]. 21

22 Munkacsoportunk a fehérjék szeparálását a következő elektroforézis módszerrel végezte (7. ábra). A biomarker fehérjék azonosításához 100 µl nyálmintát Ultra Turrax homogenizátorral 20 mm Tris/HCl pufferrel (ph: 7,4) homogenizáltuk. A puffer 3 mm EDTA-t, 5 mm betamercaptoethanol-t és 1% SDS-t tartalmazott.ezt követően 1%-os bromphenolkék adtunk a mintákhoz, majd az elegyet 2 percig forraltuk, ezután centrifugáltuk (8000 g, 2 min). SDS-PAGE elektroforézist végeztünk, melyhez 12%- os gélt készítettünk, Laemmli módszere szerint [50]. A molekulatömeg meghatározásához Pharmacia alacsony móltömeg kalibrációs kitet használtunk. A géleket 30 Coomassie brillant blue R-250-nel festettük, a festékkivonó oldat 5% (v/v) ecetsavat és 16% (v/v) metanolt tartalmazott. Az elektroforetikus futtatás után a géleket szkenneltük, majd a vizuális összehasonlító elemzés után, az extra sávokat, amelyek a betegek mintáiban keletkeztek, szikével kimetszettük. A kimetszett sávokat Eppendorf csőbe helyeztük, festékmentesítettük 3x10 perces, 200µL 50%-os (v/v) acetonitril, és 50 mm NH4HCO3 oldatban. 22

23 7. ábra: Minták felvitele gélre, fehérjék futtatása 23

24 Tömegspekrometriás vizsgálat A tömegspektrometria (mass spectrometry, MS) egy analitikai technika, mellyel szerves és szervetlenkomponensekből képződött ionok tömeg/töltés (m/z) arányának mérésén alapuló, nagyhatékonyságú szerkezetvizsgáló és analitikai módszer. A módszer azon alapul,hogy az elemzett anyag részecskéiből a gép ionokat állít elő, majd ezeket elektromos és mágneses térbe helyezve, mozgásuk alapján relatívtömegük és töltésük hányadosa szerint szétválaszthatók A tömegspektrométer felépítése és működése 8.ábra: A TOF spektrométer működési elvének sematikus rajza 24

25 A tömegspektrométer főbb részei a következőek: 1, mintaelőkészítő- bevivőrendszer, 2, ionforrás, 3, analizátor 4,detektor 5, valamint az ezekhez kapcsolódó számítógépes adatfeldolgozó és irányítórendszer. Az analizátor, a detektor és az ionforrások viszonylag jelentős vákuum( mbar) mellett üzemeltethetők. A nagyvákuum az ionizáció hatékonyságának növelését, másrészt az ion-molekula ütközések minimalizálását szolgálja. Ezek a nem kívánt kölcsönhatások módosíthatnák az ionok repülési pályáit, részben vagy teljesen kiolthatnák töltésüket, így reprodukálhatatlanná tehetnék a tömegspektrumot. A nagyvákuum alkalmazása nagyban növeli az érzékenységet és a felbontást is (8. ábra) Mintaelőkészítés Tömegspektrometriával elméletileg bármilyen halmazállapotú sok komponensű rendszer vizsgálható, azonban ezt nagyban befolyásolja az alkalmazott mintabeviteli és ionizációs technika. Illékony vegyületeket (például: gázok, könnyen párolgóanyagok) közvetlenül be lehet vezetni a forrásba, ahol az ionizáció megtörténik. Ha a vegyület nem ilyen, akkor először fel kell oldani, oldat formájában cseppenteni a targetlemezre (9. ábra), majd valamilyen alkalmas megoldással gázfázisba juttatni; ez történhet elektromos erőtér vagy porlasztás és szárítógáz 25

26 segítségével. Az oldószerhelyes megválasztása alapvetően befolyásolja a tömegspektrum minőségét. Általánosságban kerülendő a pufferek és a nem illékony sók alkalmazása. 9. ábra: Minták felcseppentése a target lemezre Ionforrások Ionforrásnak nevezzük a tömegspektrométer azon részét, melynek segítségével a minta molekuláiból gázfázisok képződnek. A méréshez szükség van a vizsgált részecskék ionizálására, mivel a készülékben valómozgatásuk az elektromos töltésükre gyakorolt hatás alapján történik. Optimális ionizálási feltételek kellenek a megfelelő érzékenység eléréséhez, a maximális szerkezeti információ kinyeréséhez. 26

27 Az ionizációs technika megválasztását főként a vizsgálandó molekula és az azt körülvevő mátrix határozza meg. Mivel univerzálisan alkalmazható ionizációs technika nincs, így a készülékek fejlődésénél meghatározó szerepű a különböző ionforrások cseréjének gyorsasága és egyszerűsége. A legrégibb és igen gyakran alkalmazott eljárás az elektron-ionizáció vagy a kémiai ionizáció. Az 1980-as években mutatták be a mátrix asszociált lézer deszorpciós ionizációt. Ez a módszer képes volt nagyméretű biomolekulák ionizálására. Ennek a módszernek a lényege, hogy az előzetesen előkészített mintát kicsi, organikus molekulával keverjük össze, amely képes abszorbálni a lézerfény hullámhosszát. A lézer deszorpciót és ionizációt okoz mind a mátrixon mind pedig az analítikumon. Majd a keletkezett ionok egy gyorsítón keresztül az MS analizátorba jutnak (10. ábra). Tripszinnel emésztett biomolekulák vizsgálatához általában α-ciano-4-hidroxifahéjsavat (CHCA) használunk matrixként. Alkalmazásával igen magas szenzitivitású vizsgálatokat végezhetők, kb. 10 kda méréshatárig [60,69]. 27

28 10.ábra: MALDI ionizáció sematikus rajza, [A fehérjekutatás modern módszertana, Medicina kiadó, 2011.] A részecske ütközéses technikák, párolgáson-porlasztáson alapuló módszerek és lézerdeszorpciós módszerek. A részecske ütközésen alapuló technikák közé tartozik a kémiai ionizáció (CI), a szekunder ion tömegspektrometria (SIMS), a gyors atom és ionütköztetés (FAB, FIB) és a plazma deszorpció (PD). A párolgáson-porlasztáson alapuló eljárások a térdeszorpció (FD) és térionizáció (FI), termospray (TS) atmoszférikus nyomáson lejátszódó kémiai ionizáció és fotoionizáció (APCI, APPI) és elektrospray (ESI). A lézer deszorpciós (LDI) technikák közül a jelentősebbek a mátrix-segítette lézer deszorpció (MALDI) (10. ábra) és a felület-segítette lézer deszorpciós ionizáció (SELDI). 28

29 Analizátor Az analizátorban a képződött ionok szétválasztása történik a tömegük és a töltésük hányadosa szerint. Minél kisebb az ion tömege és minél nagyobb a töltése, annál nagyobb sebességre képes szert tenni egy adott gyorsító feszültség hatására. Tulajdonképpen ezt használják ki az ionok transzportján alapuló módszerek. Az újabb, modernebb készülékek inkább az ionok szelektív tárolása révén választják szét a részecskéket. Az analizátor jellemző paraméterei a maximális vizsgálható tömeg, az áteresztőképesség (a detektált és a képződött ionok számának hányadosa), illetve a maximális felbontóképesség. A legfejlettebb tömegspektrométerek esetében az utóbbi érték elérheti az egymilliót is. Az egyik legelterjedtebb analizátor típus az ún. quadrupol tömegszűrő elven működik. Itt az ionok négy párhuzamos hengeres rúd között haladnak, amelyekre egyenáramot és nagyfrekvenciás váltóáramot kapcsoltak. A szemben lévő rudak azonos, a szomszédosak ellentétes polaritásúak, így közöttük oszcilláló elektromos tér alakul ki. Az ide bejutó ionok különböző amplitúdójú kitéréseket végezve haladnak, a rudak közti ideális pályát csak meghatározott m/z értékű ionok képesek tartani. A quadrupol készülékek viszonylag egyszerűbben működtethetők, gyorsak, jól kombinálhatók különféle ionforrásokkal. Hátrányuk, hogy tömegpontosságuk és felbontóképességük viszonylag alacsony. Hasonló elven működik az ioncsapda is. Az elektrotechnika fejlődésével lehetővé vált igen kicsiny időkülönbségek pontos észlelése, amely a repülési időn (time-of-flight, TOF) alapuló elválasztás alapját képezi. A TOF készülékekkel ma már igen jó felbontóképesség, széles mérési tartomány érhető el, viszonylag egyszerűek és olcsók; megfelelő ionforrással 29

30 (MALDI) kombinálva a nagyobb biomolekulák vizsgálatában nélkülözhetetlenek [73].Vizsgálatainkban MALDI TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Timeof-Flight) típusú eszközt használtunk a mérések elvégzésére. Ez a technika a nem illékony biopolimerek, peptidek, fehérjék, valamint szintetikus rendszerek szerkezetének komplex tanulmányozására kitűnően alkalmas. A tömegspektrométerek rendkívül kis anyagmennyiségű minták (femtomolnyi mennyiségben) gyors, pontos, megbízható analízisére alkalmasak, az elválasztás technikában használatos módszerekkel jól kombinálható készülékek. Minőségi analízist végezhetünk, a gép alkalmas a nagy áteresztőképességet igénylőmérésekre (high through put típus), hiszen akár napi 6500 mérést is képes elvégezni automatizált üzemmódban. Használatával szekvencia információkhoz juthatunk, és kémiai módosítások pontos kimutatására valamint verifikációra is alkalmas. Mennyiségi mérésre nem használható, erre inkább kromatográfiás méréseket alkalmazhatunk. A vizsgált minták áttekintő felmérése (screening) egyszerűen és gyorsan elvégezhető. Az eszköz fenntartása relatíve olcsó, működési elvéből fakadóan nem jellemző a meghibásodása [22,57] Triptikus emésztés és MALDI TOF/TOF MS A gél darabokat szobahőmérsékleten dehidráltuk, majd 10 µl tripszin (0,04 mg ml- 1)Tris puffer (2,5 mm, ph 8,5) oldattal 37 C-on 1 éj szakán át inkubáltuk. A kivont peptideket 15 perces ultrahangos fürdőben 15 µl acetonitril és hangyasav (49/50/1v/v/v) vizes oldatban tartottuk. Az oldatból való kivonás után a peptideket liofilizáltuk,és újra feloldottuk vízben. A liofilizált fehérje triptikus emésztményének vizes oldatát a mintatartó lemezre (MTP 384 massive target plate, Bruker Daltonics, 30

31 Bremen,Germany) vittük fel. A mintatartó tálcán minden egyes 1 µl térfogatú mintaoldathoz 1µL telített mátrix oldatot kevertünk. A mátrix oldatot minden felhasználás előtt frissen készítettük: α-ciano-4-hidroxi-fahéjsavat (CHCA) acetonitril /0,1% TFA (1/2 v/v)-benoldva. A tömegspektrometriás méréshez Autoflex II TOF/TOF típusú (Bruker Daltonics,Bremen, Germany) készüléket használtuk. A MALDI TOF peptid mass fingerprint (PMF) elkészítésére a LIFT mode for PSD (post source decay) és CID (collisioninduceddecay) fragmentációt alkalmaztuk automatizált üzemmódban, FlexControl 2.4 számítógépes program vezérlésével. A PMF-hez 20 kv gyorsító feszültséget használtunk. A műszer 337 nm-en emittáló pulzáló nitrogén lézert alkalmaz a minta és a mátrix elpárologtatásához és ionizációjához (model MNL- 205MC, LTB Lasertechnik Berlin GmbH, Berlin, Germany). Minden egyes mérés előtt külső tömegkalibrációt végeztünk a Bruker Peptide Calibration Standard szet segítségével (# Peptide Calibration Standard, Bruker Daltonics, Bremen, Germany). A mérések során m/z 800és 5000 között detektáltuk a tömegspektrumokat, és minden egyes mérési eredményt 500 egymást követő lézer lövés egyesített adataiból számoltunk ki. 31

32 10. ábra: Bruker Daltonics, Autoflex II tömegspekrometriás készülék [ A fehérjék PMF azonosítása MSDB (Swiss-Prot) és NCBInr adatbázisok alkalmazásával, majd MASCOT adatbázis (MASCOT Server 2.2 search engine, MatrixScience Ltd., London, UK) keresőmotor és Bruker BioTools 3.0 software (BrukerDaltonics, Bremen, Germany) segítségével történt. A keresés során az egyszeresen pozitív töltésű monoizotópos peptidcsúcsokat vettük figyelembe, keresési hibahatárnak 100 ppm-et, illetve 1 kihagyott triptikus hasítási helyet adtunk meg. Az adatok további feldolgozását a Bruker FlexControl 2.4 (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) és a Bruker FlexAnalysis 2.4 (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) programok segítségével végeztük el. A MALDI-TOF/TOF tömegspektrometria felhasználásával azonosítottuk azokat a fehérjéket, melyek jelenléte kimutatható a betegségek manifesztációja során, illetve amik diagnosztikai értékűek lehetnek. A meghatározás során rögzítettük az elsődleges tömegspektrumot, majd ezt követően a nagyobb intenzitású, vagy diagnosztikailag 32

33 jelentős peptideket PSD,- vagy CID fragmentációval tovább bontottuk. Így tudtuk meghatározni a peptidek pontos elsődleges szerkezetét és annak módosulásait [58,25] A spektrogram értékelése Minden minta analízise során egy grafikont készít a számítógép, aminek az értékelésével határozhatjuk meg magát a keresett fehérjét. A grafikon y tengelyén a jelintenzitása (egyenes arányban az adott peptid mennyiségével), az x tengelyen a móltömeg/töltés látható. Ennek megfelelően minden mintából készült ábrasegítségével leolvasható, hogy milyen móltömegű peptid milyen arányban volt jelen. Az ábrán csúcsok láthatóak, amelyek 1-1 azonos móltömegű peptid mennyiségét jelzik. Ennek a grafikonnak, és az adatbázisban hozzáférhető fehérjék spektrogramjának összehasonlításával azonosíthatjuk a mintában lévő fehérjéket [57] Célzott peptid analízis Ezt az analitikai módszert azért választottuk, hogy a fent leírt módszer helyett egy időben rövidebb, ráfordításban olcsóbb eljárást keressünk, a nagy áteresztő képesség érdekében. Nem szükséges hozzá az elektroforetikus futtatás és peptid kivonás a gélből, direkt nyálminta felhasználással végeztük a méréseket, és az előzőleg kimutatott fehérjékre fókuszáltunk. 33

34 A célzott peptid analízishez 50 µl mennyiségű nyálat higítottunk 100 µl 50 mm koncentrációjú NH4HCO3 oldattal, ezt követően végeztük a tripszines emésztést, illetve a MALDI TOF/TOF MS analízist a korábbiakban leírtaknak megfelelően Statisztikai elemző módszerek Vizsgálataink statisztikai elemzését a ClinProTools 3.0 nevű szoftverrel végeztük el (Bruker Daltonics, Bremen, Germany). A rekalibrációra, a csúcsok normalizációjára, a csúcsok detektálására, a csúcsok kalkulációjára a szoftver automatikus beállításainak megfelelően került sor. The ClinProTools segítségével számos statisztikai próba végezhető el (t-próba, Wilcoxon- teszt, stb), mely prediktálja a jelentős diszkriminatív erővel bíró m/z értékeket. 34

35 4. Eredmények 4.1. Elektroforézis vizsgálat eredménye A gélen futtatott fehérjék mintázatát a gél beszkennelését követően szabad szemmel hasonlítottuk össze. 12. ábra: Kontroll csoport gélje (H csoport) kda Kalibráció H1 H2 H3 H4 H5 H6 H kda Kalibráció D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D ábra: Diabeteses páciensek gélje (D csoport) 35

36 A kész géleket átvilágító asztalra helyeztük, majd szkenner segítségével és digitális kamerával is rögzítettük a vizsgált gélek képét. Szabad szemmel is jól látható különbségeket találtunk a két csoport fehérje mintázatában. (12, 13. ábra) Jól látható eltéréseket figyeltünk meg a 7, 21, 37 és 86 kda tartományban. Ezek a fehérjék jellemzően a diabeteses betegek nyálmintáiban fordult elő. Az elméleti tömegértékek megfeleltek a korábban leírt laphámcarcinomával összefüggésbe hozható nyál biomarkerek elméleti tömegével, ezért ezeket a spotokat kimetszettük a gélekből és további elemzés céljából előkészítettük tömegspektrometriás vizsgálathoz. 36

37 4.2. Tömegspektrometriás vizsgálat eredménye Vizsgálataink során több mint 900 peptidet sikerült azonosítani. A következő táblázat foglalja össze a DM csoportban leggyakrabban előforduló laphámcarcinomára utaló peptideket. 4. táblázat: Az identifikált peptidek paraméterei Szám Név Azonosító kód Elméleti móltömeg (kda) Szekvencia fedettség% 1. Annexin A8-like 2 [Homo sapiens] 2. Annexin A8-like Homo sapiens gi ,84 47,63 Q5T2P8_HUMAN 36,86 32,72 3. Tyrosine kinase gi ,36 46, AX NID Homo sapiens CAF ,82 26,61 Protein kinase [Homo sapiens] gi ,35 31,59 6. Peroxiredoxin-2 gi , Annexin A2 gi ,44 30 A vizsgálatba bevont személyek nyálmintáiban előforduló laphámcarcinomára utaló fehérjék előfordulását az 5. táblázat mutatja be. 37

38 5. táblázat:a szájüregi laphámrákra jellemző biomarkerek előfordulását a diabeteses és a kontroll mintákban. A kontroll csoportban nem detektálható egyik jellemző biomarker sem. Diabetes Kontroll Biomarker n=25 n=20 Biomarker D001 1,2,3 H001 neg D002 1,2,3 H002 neg D003 1,3 H003 neg D004 1,2,3 H004 neg D005 1,2 H005 neg D006 1,2,3 H006 neg D007 1,2,3 H007 neg D008 1,2,3 H008 neg D009 1,2,3 H009 neg D010 1,2,3 H010 neg D011 1,3 H011 neg D012 1,2,3 H012 neg D013 1,2,3 H013 neg D014 1,2,3 H014 neg D015 1,3 H015 neg D016 1,2,3 H016 neg D017 1,2 H017 neg D018 1,2 H018 neg D019 1,2,3 H019 neg D020 1,2,3 H020 neg D021 1,2,3 D022 1,2,3 D023 1,2 D024 1,2,3 D025 1,3 1: Annexin A8 2: Peroxiredoxin-2 3: Tirozin- kináz 38

39 A 6. táblázatban foglaltam össze a peroxiredoxin-2 előfordulását a DM csoportban. A táblázatból leolvasható, hogy jellemzően a 5 éve vagy annál régebb óta diabetesben szenvedő betegben detektálható a peroxiredoxin táblázat: A peroxiredoxin 2 előfordulása a diabeteses csoportban Bevonási szám Nem DM Diagnosis felállítása (éve) D001 nő 13 D002 nő 9 D004 férfi 15 D005 férfi 13 D006 nő 12 D007 nő 6 D008 férfi 25 D009 nő 11 D010 férfi 19 D012 nő 13 D013 nő 18 D014 nő 25 D016 nő 8 D017 nő 10 D018 férfi 6 D019 nő 14 D020 férfi 7 D021 nő 15 D022 férfi 16 D023 férfi 12 D024 férfi 5 39

40 A vizsgálatokba bevont nyálminták tömegspektrográfiás képét az alábbi ábrákon mutatom be. A teljesség igénye nélkül csak a reprezentatív képet mutató nyálminták eredményeit demonstrálom. DM megjelöléssel a diabetes páciensek mintáját jelöltem, míg H jelöléssel az egészséges kontrollokét Cukorbeteg páciensek nyálmintájának képe Intens. [a.u.] DM1-13 éve diabetesben szenvedő, nő páciens. Mintájában megtalálható az m/z 991, m/z 1472-vel és m/z 1731-gyel jellemzett annexin A8, tirozin-protein kináz és peroxiredoxin-2. m/z Intens. [a.u.] DM2 9 éve diabetesben szenvedő nő páciens. Mintájában megtalálható az m/z 991, m/z 1472-vel és az 1731-gyel jellemzett annexin A8, tirozin-protein kináz és peroxiredoxin-2. m/z 40

41 Intens. [a.u.] DM3 6 éve diabeteses férfi nyálmintájában azonosított annaexin A8 és tirozinprotein kináz csúcsai. m/z Intens. [a.u.] x DM4-14 éve diabetesben szenvedő férfi betegben detektált mindhárom biomarker. m/z Intens. [a.u.] x DM5-13 éve diabetesben szenvedő férfi betegben kimutatott annexin A8 és peroxiredoxin-2. m/z 41

42 Intens. [a.u.] DM6 12 éve diabeteses női betegben megtalálható mindhárom biomarker. m/z Intens. [a.u.] x DM7-6 éve diabetesben szenvedő nő beteg nyálmintájában található annexin A8, tirozin-protein kináz és peroxiredoxin-2 csúcsainak képe m/z Intens. [a.u.] DM8-25 éve diagnosztizált diabetes férfi beteg nyálmintájában található annexin A8, tirozin-protein kináz és peroxiredoxin-2 csúcsainak képe. m/z 42

43 Intens. [a.u.] DM9-11 éve diabeteses nő beteg képe. Nyálmintájában megtalálhatóak az annexin A8, tirozin-protein kináz és peroxiredoxin-2 csúcsai. m/z Intens. [a.u.] m/z DM10-19 éve diagnosztizált diabetes férfi betegben mindhárom keresett biomarker csúcsa detektálható. Intens. [a.u.] m/z DM11-8 éve diabetesben szenvedő nő páciensben az annexin A8 és tirozin-protein kináz csúcsai. 43

44 Intens. [a.u.] m/z DM12-13 éve diabetesben szenvedő nő betegben előforduló annexin A8, tirozinprotein kináz és peroxiredoxin 2 csúcsai. Intens. [a.u.] DM13-18 éve diabeteses nő betegben előforduló annexin A8, tirozin-protein kináz és peroxiredoxin 2 csúcsai. m/z Intens. [a.u.] DM14-25 éve diabetesben szenvedő nő betegben előforduló annexin A8, tirozinprotein kináz és peroxiredoxin 2 csúcsai. m/z 44

45 Intens. [a.u.] DM15-10 éve regisztrált diabetes férfi betegben található annexin A8 és tirozinprotein kináz képe. m/z 45

46 Egészséges kontroll minták képe Intens. [a.u.] H1-62 éves nő nyálmintájának tömegspektrográfiás képe: nem található egyik keresett biomarker sem. m/z Intens. [a.u.] H2-67 éves nő önkéntes mintájának képe: a keresett biomarkerek nem jelennek meg. m/z Intens. [a.u.] H3-57 éves férfi nyálmintáját tömegspektrogáfiás képe. A keresett biomarkerek nem jelennek meg. m/z 46

47 Intens. [a.u.] H4-72 éves nő nyálmintájának tömegspektrográfiás képe. A 3 fő biomarker nem mutatható ki. m/z Intens. [a.u.] H5-55 éves férfi nyálmintájának tömegspektrogáfiás képe. A keresett biomarkerek spektrumjai hiányoznak. m/z Intens. [a.u.] H6-65 éves férfi, egyikkeresett biomarker sem található a mintában. m/z 47

48 Intens. [a.u.] H7-48 éves nő. A keresett biomarkerek nem találhatóak a mintában. m/z Intens. [a.u.] H8-70 éves nő nyálmintájának tömegspektrumos képe. Hiányoznak a jellegzetes biomarkerek. m/z 48

49 Tömegspektrometriás kép összehasonlítása 1.kép: DM13-18 éve diabetesben szenvedő, 61 éves női páciens mintájának képe, mindhárom jellegzetes laphámcarcinoma biomarkert tartalmazza. Intens. [a.u.] m/z Intens. [a.u.] m/z 2. kép: H3- Egészséges, 58 éves női kontroll egyed képe. A minta nem tartalmazza egyik keresett biomarkert sem. 49

50 4.3. Statisztikai eredmények bemutatása A minták normalizált tömegspektrumjain megfigyelhető csúcsok területeinek statisztikai elemzését egy speciálisan erre a célra készített ClinProTools 3.0 TM szoftver segítségével végeztük el. A program első lépésben újrakalibrálja, normalizálja majd intergálja a spektrumokat, ezt követően különböző statisztikai próbák segítségével (t-próba, Wilcoxon- teszt) prediktálja a jelentős diszkriminatív erővel bíró m/z értékeket. Ezekkel a tömegekkel (pontosabban m/z értékekkel) jellemezhető ionok, olyan potenciális biomarkerek, amelyek az adott mintacsoportok közötti molekuláris különbségek kimutatására alkalmasak. S p.# 2 4 a rb. u Da 14. ábra: A statisztikailag elemzett minták úgynevezett Gelview képe

51 A 14. ábrán látható a statisztikailag vizsgált egészséges kontroll és diabéteszes mintacsoportba tartozó minták gelview képe. Az X-tengelyen a peptidek tömegeit jelzik Dalton mértékegységben. A bal oldali Y-tengely a minták számát jelzi, míg a jobb Y-tengely a normalizált abszolút intenzitást jelöli. Az ábra jól reprezentálja a mintacsoportok közötti jelentős eltéréseket, ill. a mintacsoporton belüli viszonylag jó reprodukálhatóságot a teljes tömegtartományon (m/z ). Az 15. ábrától a 20. statisztikai ábráig mutatom be a főkomponens analízisének eredményeit. Az ábrákon jól látható az erős prediktív jelleggel bíró m/z értékek. Kiválóan alkalmasak a csoportok elkülönítésére. Az egészséges kontroll és diabéteszes nyálminták proteomikai vizsgálata során három olyan biomarkert mutattunk ki (annexin A8, tirozin-protein kináz, peroxiredoxin 2), amelyek alkalmasak lehetnek a két mintacsoport elkülönítésére. Az 15-os statisztikai ábrán látható m/z 991 jellemzett tömeg az annexin A8-ra, míg az m/z 1472 a tirozin-protein kinázra jellemző. Ez is jól reprezentálja hogy a proteomikai eszközökkel kimutatott, de statisztikailag nem validált biomarkerek statisztikailag is predikcióval bírnak. Az ábrán jól megfigyelhető, hogy a zöld színnel ábrázolt diabéteszes mintacsoport szignifikánsan elkülönül a piros színnel jelölt egészséges mintacsoporttól. Ez a tény azt mutatja, hogy az annexin A8 és tirozin protein kináz triptikus peptidjei és így a két fehérje is patológiás biomarker. 23mm biomarker a táblázat elején van, ennél prediktívabb értékkel bír, de ennek az azonosítása további vizsgálatok tárgyát képezi. 51

52 P k 7 6, Da P k 3 9, Da 15. ábra: Az m/z 991 és m/z 1472 vel jellemzett csúcsok főkomponens analízisének kétdimenziós reprezentációja. Zöld a diabeteses, míg a piros egészséges csoportot jelöli. P k 1 0 6, Da P k 3 0, Da 16. ábra: A m/z 2482 és m/z 912-vel jelzett tömegspektrum csúcsok főkomponens analízésnek eredménye. Zölddel a diabetes csoport, míg a pirossal az egészséges csoportot jelöltük. 52

53 P k 46 10, Da P k 4 2, Da 17. ábra: Az m/z 1010 és m/z 1029-vel jellemzett tömegspektrum csúcsok főkomponens analízisének eredménye. Zöld a diabeteses, míg a piros egészséges csoportot jelöli. Pk 4 6, Da P k 3 8, Da 18. ábra: Az m/z 1069 és m/z 973 tömegspektrum csúcsok összevetése. Zöld a diabeteses, míg a piros egészséges csoportot jelöli. 53

54 P k 3 0, Da P k 7 6, Da 19. ábra: Az m/z 912 és m/z 1472 csúcsok főkomponens analízisének eredménye. Zöld a diabeteses, míg a piros egészséges csoportot jelöli. P k 68 30, Da Pk 7 6, Da 20. ábra: Az m/z 1263 és m/z 1473 jelölt tömegspektrum csúcsok összevetése. Zöld a diabeteses, míg a piros egészséges csoportot jelöli. 54

55 S p.# 2 4 a rb. u Da ábra: Annexin A8 előfordulása a felső (diabetes csoportban) sávban, vele szemben az egészséges csoportban nem található. S p.# 2 4 a rb. u Da 22. ábra: Tirozin-protein kináz előfordulása a diabetes csoportban (felső sáv), míg vele szemben az egészséges csoportban nem jelenik meg

56 5. Megbeszélés Érdekes párhuzamot vélhetünk fel a diabetes és szájüregi laphámcarcinoma gyakoriságában. Az elmúlt négy évtizedben az intenzív kutatások, és gyógyszerfejlesztések és a szűrőprogramok kihangsúlyozása ellenére, több mint négyszeresére nőtt a szájüregi laphámcarcinomával diagnosztizált páciensek száma. A helyzet több, mint aggasztó: Magyarország Európában első helyet foglal el a rák statisztikai adatok között. [51,48,44] Ezen belül is a szájüregi laphámcarcinoma rendszerint az első háromban található [5,55]. Ennek hátterében sok tényező állhat. Az etiológiai faktorok közül kiemelkedő a magyar társadalom dohányzási szokása és a tömény szeszes italok fogyasztásának túlzott mennyisége [1,2,4,8-10,13,30,33,40]. Nem elhanyagolható faktor a súlyos szisztémás betegségek következtében kialakuló szövődmény sem [14,15,17,24,35,41]. Korábbi epidemiológiai vizsgálatok, már felvették annak lehetőségét, hogy a kettes típusú diabetes mellitus egyik súlyos szövődménye akár a szájüregi rák is lehet. A statisztikák szerint ezekben a páciensekben háromszor, de akár négyszer gyakrabban fordulnak elő gyulladásos szájüregi betegségek, precancerosisok, ill. tumorok, mint a velük kor- és nem eloszlásában megegyező kontroll csoportokban. Az egészséges szájüreg epithelium borítása képes védekezni a carcinogén behatás ellen. Diabetesben az oralis mucosa progresszív atrófiája következtében az epithel barrier védelmi funkciója csökken. Tovább súlyosbítja a helyzetet, hogy diabetesben a szájüregben gyakrabban fordulnak elő gyulladásos betegségek. A megnövekedett vércukorszint hatására a reaktív oxigén szabadgyökök aránya is megnő a szervezetben, ami szintén promotálhat carcinogenesist [68]. 56

57 Emellett megfigyelték, hogy a diabetes páciensekben mind a cellularis immunválasz, mind a T-sejtek funkciója csökkent, ami kedvez a carcinogen anyagok, vegyületeknek [39]. A microanginopathiák, mind szövődmények régóta ismertek. Így logikussá válik az a statisztikai eredmény is, mely szerint a nem diabeteses populációban a szájüregi laphámcarcinoma a nyelven, oropharynxon és szájfenéken fordul elő, addig a diabeteses betegekben, az microerekkel dúsan ellátott területeken (ajkak mucosája, ginigiván) találtak nagyobb arányban tumoros elváltozásokat [3,56]. Vizsgálataink során arra kerestük a válasz, hogy az epidemiológiai és állatkísérletes vizsgálatok eredményeit, sejtéseit felhasználva, diabeteses betegekben kimutathatók-e korai laphámrákkal megegyező biomarkerek. A diabeteses és egészséges egyedek géljeit összehasonlítva sok különbséget találtunk. A két csoportban eltérő spotokat tömegspektrometria segítségével azonosítottuk. Több mint 900 peptidet találtunk. A 4. táblázatban csak a diabeteses betegre jellemző laphámrákra utaló fehérjéket összegeztük. Az 5. táblázat foglalja össze a fehérjék előfordulását a mintákban. 57