Infravörös és Raman spektroszkópia a fehérjeszerkezet vizsgálatában

Átírás

1 Infravörös és Raman spektroszkópia a fehérjeszerkezet vizsgálatában Mi történhet, ha egy mintát fénnyel világítunk meg? megvilágító fény (elnyelt fény) minta átjutott fény Abszorpció UV-VIS, IR, CD spektr. Smeller László kibocsátott fény Lumineszcencia (Fluoreszcencia és Foszforeszcencia) szórt fény Raman és Rayleigh szórás Abszorpciós és emissziós spektroszkópia Az átjutott vagy kibocsátott fény analizálása a hullámhossz függvényében. Információ: atomok, molekulák azonosítása, molekuláris szintű szerkezetváltozások (konformációváltozások) detektálása, koncentráció meghatározás Miért nyel el ill. bocsát ki fényt egy atom v. molekula? Energiaátmenet: ld. ablonski diagram Gerjesztett elektron- és vibrációs állapot* Gerjesztett elektronállapot Vibrációsan gerjesztett áll.* Alapállapot S S E *csak molekuláknál!

2 E Miért nyel el ill. bocsát ki fényt egy atom v. molekula? S S UV-VIS IR abszorpció Raman Fluoreszcencia Foszforeszcencia T Ehfhc/λ Abszorpciós spektroszkópia Abszorpciós törvény x dx x +d d d dx d µ dx d µdx d µ dx ln µ x + const e µ x Abszorpciós spektroszkópia Lambert-Beer törvény Elvi alapja: abszorpciós törvény: e -µx ahol µ(anyag,c,λ) Lambert-Beer törvény: A lg ε ( λ) cx spektrum: A(λ) mérés: spektrofotométer referencia oldat ( ) információ: azonosítás koncentráció. Infravörös spektroszkópia Infravörös fény: λ8 nm - mm közép infra tartomány:,5-5 µm abszorpciós spektroszkópia az elnyelt infravörös sugárzás molekularezgéseket kelt érzékeny a molekulaszerkezetre speciális detektálás: FT spektrométer (FTIR spektroszkópia)

3 Az infravörös spektrum mérése: Fourier transzformációs spektrométer fényforrás tk 6.7 ábra tk 6.8 ábra Az FT spektroszkópia elve részletesen Fourier transzformáció x/ xretardáció E i const (-cos(πx/λ)) DC +const cos(πx/λ) AC n i cos(πx/ λ i d ( λ) AC cos(πx/ λ) dλ dλ ) n Ai sin( ωit) E A sin(ωt) E da sin( ωt) dω dω Egy f(x) függvény Fourier transzformáltja a g(ν) fügvény: F( f ( x)) F πiνx f ( x) e dx g( ν ) A Fourier transzformáció inverze: πixν ( g( ν )) g( ν ) e dν f ( x) ϕ e i cosϕ + i sinφ

4 Tipikus Fourier transzformáltak Tipikus Fourier transzformáltak F(x) valós FT tulajdonságai G(ν) hermitikus (valóspáros, imagpáratlan) Def: Konvolúció ( f g)( t) f ( τ ) g( t τ ) dτ imaginárius anti-hermitikus (valóspáratlan, imagpáros) páros páros páratlan páratlan valóséspáros valós és páros(cosinus transformáció) valós és páratlan imaginárius és páros imaginárius és páratlan imaginárius és páratlan (sinus transzformáció) imaginárius és páros valóséspáratlan Konvolúciós tétel: F ( f g) F( f ) F( g) forrás:wikipédia

5 Diszkrét FT Diszkrét FT fj g k f(x) diszkretizálás f(x) x j Kettős diszkretizálás: véges lépések ( x) véges számú adat (L) x j j FT előre vissza g k f j j N j N k f j g k e πijk / N e πijk / N k E A sin(ωt) A spektrum számolása a Fourier transzformációs spektrométerben Az interferométeren keresztüljutott sugárzás: x/ xretardáció E i const (-cos(πx/λ)) DC +const cos(πx/λ) AC n i cos(πx/ λ i d ( λ) AC cos(πx/ λ) dλ dλ ) n Ai sin( ωit) E da sin( ωt) dω dω d ( λ) AC cos(πx/ λ) dλ dλ éppen a d ( λ) mennyiség cosinus transzformáltja dλ d A spektrum a ( λ) -nek a mintán való dλ áthaladása után megmaradt részének és a d ( λ) -nak a hányadosa (transzmissziós spektrum) dλ

6 Molekularezgések fényforrás Az elektronok könnyűek, gyorsan követik az atommag mozgását, ezért az atommagok rezgéseit az elektronok nem befolyásolják. FT A klasszikus fizikai leírásban az atommagok közti kötést, egy rugóval vesszük figyelembe. Molekularezgések: kétatomos molekula a középiskolából ismert: f π D m m m l l m l l l l m + m m l + l l l l l l F D l / D F / D F D D

7 tehát: m + m D, amit az f π m D D m egyenletbe helyettesítve a rezgési frekvencia: f az mredukált mm m + m π D(m + m ) mm mennyiséget redukált tömegnek is nevezik, ezzel a frekvencia: f π D mredukált Kvantummechanikai leírás A hullámhossz: λ mredukált c πc f D Az infravörös spektroszkópiában a λ reciprokát, a hullámszámot (ν) használják: ν: hány hullám fér D el egységnyi ν hosszúságon? [cm-] λ πc mredukált Példa: CO A mért rezgési hullámszám: ν 43 cm- Ö λ4,67µm Ö f 6,43 3 Hz mc -6 kg, mo,7-6 kg Ö D875 N/m Ha ν ismert, D számolható ha D ismert, ν számolható Klasszikus fizikai rezgések és energianívók kapcsolata Klasszikus kép E Energianívók E ψ ψ n3 n3 n n n n f π x En hf ( n + ) D n E n mredukált n,,. Ehf rezonancia az f frekvenciájú fénnyel u.a.!!! x

8 A rezgési frekvencia függése a tömegtől és a kötéserősségtől Sokatomos molekulák rezgései Tömeg kötéserősség Infravörös rezgési frekvenciák (cm - ) B-H 4 Al-H 75 C-H 3 Si-H 5 Ge-H 7 N-H 34 P-H 35 As-H 5 O-H 36 S-H 57 Se-H 3 F-H 4 Cl-H 89 Br-H 65 Kötéserősség: C-N: cm -, CN: 66 cm -, C N: cm -. N atomos molekula: 3N szabadsági fok, 3-3 a teljes molekula transzlációja ill. rotációja 3N-6 rezgési szabadsági fok (lineáris molekuláknál csak 3N-5) normálrezgések normálkoordináták Víz (O-H): 36 > nehézvíz: 6 cm - Normálkoordináták A kétatomos molekula példáján bemutatva: x c x O m C m O x O x ν x TKP Normálrezgések Minden atom ugyanazzal a frekvenciával, fázissal, de különböző amplitúdóval és irányban rezeg. Pl. víz: x C Általános esetben 3N dimenziós koordinátarendszer forgatása Lineáris transzformáció (mátrixművelet) A normál módusok nem hatnak kölcsön egymással.

9 A víz normálrezgései Néhány tipikus rezgési frekvencia Ezek nem rezgések, hanem gátolt forgások (libráció) Példa: Formaldehid Analitikai alkalmazások szintézis: közti és végtermék azonosítás szerkezet bizonyítás metabolit kimutatás gyógyszerellenőrzés (tisztaság vizsgálat) Megj.: Lambert-Beer tv. itt is igaz, koncentráció meghatározás is lehetséges. forrás:

10 Molekula azonosítás molekula azonosítás C 4 H 8 O Fingerprint (ujjlenyomat) tartomány forrás: Makromolekulák rezgései Az N-metilacetamid mint a fehérjelánc gerincének modellje Globális rezgések (bonyolultak) Lokalizált rezgések, pl: CH rezgések a lipidekben amid rezgések a fehérjékben (acetamid rezgések)

11 Fehérjék rezgési spektroszkópiája A víz abszorpciós spektruma Gerinc: amid rezgések konformáció (másodlagos szerkezet) H/D csere, (harmadlagos szerkezet) Oldalláncok kölcsönhatások más molekulákkal plca + kötés Fontos technikai megj.: nehézvíz (D O) Víz és nehézvíz spektrumok A fehérjék amid rezgései Bandekar BBA (99) 3

12 A fehérjék amid rezgései Az amid I vibráció és a másodlagos szerkezet amid I CO rezgés H-híd miatt konformációérzékeny amid II N-H nyújtási rezgés H-D cserére érzékeny Szerkezet kompaktsága (harmadlagos szerk.) β lemez α helix A másodlagos szerkezeti elemekhez tartozó jellegzetes amid I jel Intramolekuláris szerkezet β-lemez rendezetlen α-hélix Intermolekuláris külcsönhatás Intermolekuáris antiparallel β-lemez 6 7 ν cm ν cm -

13 Az amid I sáv átlapoló komponensek összege: dekovolúció A A Spektrum A Fourier öndekonvolúció elve A A mért spektrum vonalalak ν ν elvi spektrum ν FT Inverz FT ν ν A A A Fourier öndekonvolúció Vonalak szétválasztása vonalkeskenyítéssel Spektrum FT-ja x x x osztás a vonalalak FT-jával Alkalmazások lipid fázisátalakulás fehérjedenaturáció BPTI bovine pancreatic trypsin inhibitor Meersman és mtsai. Biophys.

14 aggregáció Mioglobin (Nyomásciklus) aggregáció Ca + kötés Parvalbumin Raman szórás Raman spektroszkópia 8 C Absorbance 43.8 C 67.5 C Sir Chandrasekhara Venkata Raman Nobel Nobel-díj díj C 9 C 3 C Wavenumber (cm - ) 5

15 Mi történhet, ha egy mintát fénnyel világítunk meg? Energiaátmenetek a vibrációs spektroszkópiában megvilágító fény (elnyelt fény) minta átjutott fény Abszorpció UV-VIS, IR, CD spektr. Gerjesztett elektron- és vibrációs állapot* Gerjesztett elektronállapot S E kibocsátott fény Lumineszcencia (Fluoreszcencia és Foszforeszcencia) szórt fény Raman és Rayleigh szórás Vibrációsan gerjesztett áll.* Alapállapot *csak molekuláknál! S IR Raman Stokes anti-stokes Raman szórás: a klasszikus leírás a beeső fény frekvenciája A beeső fény elektromos térerőssége: A szóró molekula polarizálhatósága: A rezgés frekvenciája E E sin πν t α α + Asin πν i t Szórt intenzitás anti-stokes Rayleigh Stokes A polarizálhatóság változik a rezgés során! A polarizáció során előálló dipól: µ α E E ( α + Asin πν t)sin πν t I αe sin πν t + i AE cos π ( ν + ν ) t + i AE cos π ( ν ν ) t i λ lézer λ ν lézer +v rezgés ν lézer ν lézer -v rezgés

16 Raman és infravörös Raman és infravörös Raman infravörös Fényszórás abszorpció A molekula rezgése során változik a molekula polarizálhatósága dipólusmomentuma forrás: Zavaró tényező: fluoreszcencia E gerjesztés: zöld piros infravörös lézerrel

17 Mérési összeállítás Speciális technikák minta PM cső v. CCD kamera monokromátor Resonance Raman Surface Enhanced Raman Tip-Enhanced Raman Raman Microscopy Confocal Raman Microscopy lézer Resonance Raman Surface Enhanced Raman S E Ha a virtuális nívó megközelít egy valódi elektrongerjesztési nívót az intenzitás megsokszorozódik. Fém (Ag, Au) kolloidokban fellépő felületi plazmonok erősítik a beeső fény elektromos terét polythiophene SERS, normal Raman S 3-5 Raman Resonance Raman Vibrational Spectroscopy Volume 3, 3, Pages 65 69

18 Raman mikroszkóp A konfokális elv Előny: nagyobb térbeli felbontás, fluoreszcencia elnyomás felbontás ~ néhány x nm Tip-Enhanced Raman Irodalom: források, ill. további olvasnivaló Raman Spectroscopy: Introductory Tutorial by: Daniel T. Schwartz Department of Chemical Engineering University of Washington Nanoscale structural analysis using tip-enhanced Raman spectroscopy by: Tanja Deckert-Gaudig and Volker Deckert, Current Opinion in Chemical Biology, 5: Bandekar BBA (99) 3 D. Eisenberg and W. Kauzmann, The structure and properties of water ( Oxford University Press, London, 969) Byler & Susi (Biopolymers 986 Mar;5(3):469-87) F. Meersmann, L. Smeller, K. Heremans () A comparative study of cold-, pressure- and heatinduced unfolding and aggregation of myoglobin Biophys L. Smeller, P. Rubens, K. Heremans (999) Pressure effect on the temperature induced unfolding and tendency to aggregate of myoglobin Biochemistry L. Smeller () Pressure-temperature phase diagram of biomolecules Biophys. Biochim. Acta (sok anyafról található IR vagy Raman spektrum itt) Szőllősi, Fidy: Orvosi Biofizika