A dipeptidil peptidáz IV enzim és inhibitorainak szerepe az endomorphin 2 bioszintézisében

Átírás

1 A dipeptidil peptidáz IV enzim és inhibitorainak szerepe az endomorphin 2 bioszintézisében Doktori tézisek Dr. Király Kornél Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. Rónai András egyetemi docens, Ph.D. Hivatalos bírálók: Dr. Kőhidai László egyetemi docens, az orvostudomány kandidátusa. Dr. Helyes Zsuzsanna, egyetemi docens, D.Sc. Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Sándor Péter egyetemi tanár, D.Sc. Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Darvas Katalin, egyetemi tanár, Ph.D. Dr. Tarnawa István, Ph.D. Budapest 2011

2 Bevezetés Az opioid vegyületek máig a leghatékonyabb fájdalomcsillapító szerek, amelyek az orvostudomány rendelkezésére állnak. Az opioidok és az endogén opioid rendszer emiatt régóta intenzív kutatás alatt áll. A rendszer legtöbb elemét sikerült feltérképezni, azonban a legutoljára felfedezett endogén peptidek, az endomorphinok tekintetében máig sok a megválaszolatlan kérdés. Az egyik ilyen az endomorphinok endogén képződése. Az általunk végzett kutatások ezekre a kérdésekre kívántak választ adni. Az endomorphinok Az endomorphinokat (EM1: Tyr-Pro-Trp-Phe-NH 2 és EM2: Tyr-Pro-Phe-Phe- NH 2 ) 1997-es felfedezésük óta a µ opioid receptorok szelektív endogén ligandjának tekintik. Az endomorphinok a µ receptor felé több ezerszeres szelektivitással rendelkeznek, amely az endogén ligandok esetén is kirívóan magas. Emellett más egyedi farmakológiai tulajdonsággal is rendelkeznek, például az a tény, hogy parciális agonistái saját receptoruknak. Ez szintén nagyon ritka tulajdonság endogén ligandok esetén. Az endomorphinok a központi idegrendszerben egyenetlen eloszlást mutatnak. Az EM1 főként az előagy és a felső agytörzsi régiók területén a domináns forma, míg az EM2 található meg nagyobb mennyiségben az alsó agytörzsi régiókban, a gerincvelő hátsó szarvában, a hátsó gyöki ganglionokban, főként az olyan területeken, amelyek a nociceptio korai feldolgozása szempontjából stratégiailag kiemelt jelentőségűek. A ganglionokban és a hátsó szarvban az EM2 főként a peptiderg C-rostokban (szómában ill. terminálisban) fordul elő, és szoros kolokalizációt mutat CGRP-vel és SP-vel. Az endomorphinok lebomlása szempontjából kiemelt jelentőségű a dipeptidil peptidáz IV (DPP IV) enzim, amely az endomorphinokat a prolin után hasítja el. A többi endogén opioidhoz viszonyítva a lebomlási sebességük jelentősen kisebb, kivéve talán a β-endorphint. Akut nociceptiv tesztekben az endomorphinok hatékonysága jelentősen elmarad az in vitro tulajdonságaik alapján elvárttól centrális (intracerebroventricularis [icv.] és intratheacalis [it.]) adagolás esetén is. A hatásuk időtartama is rövidebb, mint azt az in vitro inaktiválási sebességük alapján feltételeznénk. Az endomorphinok lényegesen hatékonyabbak nem-akut fájdalmi modalitások esetén, mint a neuropathiás fájdalom, illetve a tartós vagy krónikus gyulladásos fájdalom. Főként allodynia tekintetében ennél jelentősen hatékonyabbak. Nociceptiv tolerancia mindkét EM esetén kialakul, azonban nem mutatnak sem egymással, sem egyéb µ agonistákkal tökéletes kereszttoleranciát. Légzésdepresszió, abúzus potenciál és fizikai dependencia kialakítása tekintetében, de összességében mérsékeltnek tekinthető. A dipeptidil peptidáz IV (DPP IV, CD26, EC ) enzim A DPP IV egy dipeptidil aminopeptidáz, amely elsődlegesen prolin és alanin után hasít. Az enzim a prolil peptidázok utoljára fölfedezett szerin proteáz családjába tartozik. A DPP IV membrán kötött ektoenzim, bár keringő formája is ismert. 2

3 Számos szövetben kimutatható, és kulcsszerepet tölt be több biológiailag aktív peptid inaktiválásában. Legmagasabb aktivitás a vese tubulusok lumináris membránján, az intesztinális epitéliumon éa az endotél sejteken észlelhető, de neuronális szövetben is jelen van. Többek között a neuropeptid Y (NPY), a P- anyag (SP), glukagon like peptid 1 (GLP 1), gasztrikus inhibitoros peptid (GIP), az endomorphinok, számos citokin, kemokin és növekedési faktor inaktivációjában döntő szerepe van. Számos inhibitora ismert. Kísérleteinkben a lassan bomló kompetitív szubsztrát jellegű tripeptid inhibitor Ile-Pro-Ile-t (IPI, Diprotin A) és a potens, szelektív, nem peptid (cyanopirolidin szerkezetű) vildagliptint használtuk. A vildagliptint orális euglikemizáló antidiabetikus gyógyszerként törzskönyvezésre került, amely hatást a GLP 1 és a GIP féléletidjének megnyújtása által fejti ki. Nem egyértelmű, hogy a DPP IV inhibitorok potencírozni tudják-e az endomorphinok antinociceptiv hatását, azonban icv. adott IPI opioid receptor mediálta antinociceptiv hatást tud kifejteni, bár önmagában in vitro nincs opioid aktivitása. Az endomorphinok bioszintetikus eredete Az endomorphinok endogén képződésére máig nincs általánosan elfogadott magyarázat. Nem sikerült sem a prekurzoraikat kódoló genomikus kód, sem a prekurzor proteinek identifikálása. Ezek az eredmények a normál riboszómális képződésnek a valószínűségét valószínűtlenné teszik. Emiatt, bár eretnek ötlet, azonban nem teljesen példa nélküli (gerincesek esetében a glutation és a carnosin esetében előforduló) egy de-novo képződés lehetősége. Bizonyos korábbi adatok megerősítik ennek a lehetőségét. Radioaktívan jelölt Tyr-Pro dipeptid patkány agykamrai injektálását követően időfüggően sikerült a jelölés beépülését kimutatni a tisztított agykivonatokból kromatográfiája (RP-HPLC, grádiens leválasztás) után endomorphin 2-höz köthető csúcsokba. Hipotézis Miután sikerült specifikus radioimmunoassay módszert kifejleszteni endomorphin 2-re, egy fontos technikai segédeszköz ált rendelkezésünkre a de-novo endomorphin bioszintézis kísérletes vizsgálatára. Mivel a hátsó gyöki ganglionban az SP immunreaktív kisméretű peptiderg neuronok szintén immunreaktívak EM2- re, emiatt ez a szövet tökéletes in vitro modellnek tűnt a hipotézisünk vizsgálatára. Első lépésként, meg szerettük volna vizsgálni az EM2 de-novo bioszintézisét Tyr-Pro prekurzorból Ha ez így történik, második kérdés a de-novo szintézis mechanizmusa volt. A peptid-szintetikus kémiában jó hatékonysággal peptidáz enzimeket peptidszintézis céljára szintetkius módban, kriogenikus, extrém poláros vagy lipofil környezetben. Mivel a DPP IV nagymértékben érintett az endomorphinok szempontjából, feltételeztük, hogy az enzim esetleg nagyjából fiziológiás körülmények között is működhet szintetikus irányban. Miután sikeresen demonstráltuk, hogy hátsó gyöki ganglionon nagy koncentrációjú Tyr-Pro bioszintetikus szubsztrát jelenlétében (amely 3

4 másfelől az EM2 DPP IV általi hidrolízisének végterméke) és a hidrolítikus funkció gátlásával az EM2 képződését, újabb hipotézist alkottunk, hogy az in vitro eredményeinket kiterjesszük in vivo körülményekre Mivel a DPP IV fokozott fordított működése depolarizáció függőnek bizonyult izolált hátsó gyöki ganglionon, feltételeztük, hogy tartós gyulladás által kiváltott fokozott C-rost aktiváció hasonló kísérleti körülményeket teremt in vivo a patkány gerincvelő hátsó szarvában. Mivel feltételeztük, hogy ha a fordított működésnek van fiziológiás jelentősége, akkor a bioszintetikus szubsztrátoknak ott jelen kell lenniük a szintézishez, ezért nincs szükség exogén szubsztrát(ok) adására. Módszerek Izolált hátsó gyöki ganglionon végzett vizsgálatok g súlyú hím Wistar patkányokból preparált L4 és L5 ganglionokat (a próba kísérlet során 3-4, a fő kísérletben 7-8 darabot csövenként) azonnal hideg (4 C ), karbogenált (O 2 : CO 2 = 95 :5) Krebs oldatba helyeztük (Összetétel mmol/l: NaCl: 119,7; NaHCO 3 : 25; Na 2 HPO 4 : 1,2; KCl 3,0; glukóz 11,0; CaCl 2 : 2,5; MgSO 4 : 1,2). A továbbiakban az alábbi kísérleti menetrendet alkalmaztuk: A próba kísérletben csak µl-es frakciót dolgoztunk fel a fürdő és a szöveti mintákból EM2 radio-immunoassay és SP enzyme-linked immunosorbent assay 4

5 (ELISA) céljára. A sótalanításra és részleges tisztításra Milipore ZipTip C18-at (0,6 µg gyanta / tip, egy tip-et mintánként) alkalmaztunk a gyártó protokollja szerint. A fő kísérletben használt protokoll során a teljes mintát feldolgoztuk, 4 tipet használva mintánként. Az immunreaktivitás értékeket a szövetek nedves tömegére normalizáltuk, és pg/mg nedves szövet tömegre (WTW) fejeztük ki. Az eredményeket egyszempontos ANOVÁ-t és Newman-Keuls post hoc teszt segítségével hasonlítottuk össze. In vivo kísérletek Az in vivo kísérletekhez g súlyú hím Wistar patkányokat használtunk, csoportonként 5-10 darabot. Az intrathecalis (it.) adagoláshoz direkt transcutan injekciózást alkalmaztunk. A vizsgált anyagokat 5 µl oldatban jutattuk be. Antihiperalgéziás vizsgálatok Intraplantarisan injektált carrageenannel (100 µl 1%) gyulladásos hiperalgéziát indukáltunk. A mechanikus nociceptiv küszöbérték csökkenését (ipszilaterális hiperalgézia) vizsgáltunk Randall-Selitto módszer segítségével. A hiperalgézia 180 perc után érte el a maximumát és a kísérletek végéig stabilan fennmaradt. A kontralaterális oldali talpon a küszöbérték nem változott a kísérletek során. A 180. percnél ipszilaterálisan mért értéket hiperalgéziás alapértékként határoztuk meg. Ezután injektáltuk a hatóanyagokat a fenti módszerrel it. vagy subcutan (sc.). Az EM2 antiszérumot koinjektáltuk, az opioid antagonistákat subcutan adtuk, a naloxont (NX) 10, a naltrexont 15 perccel az it. injekció előtt. Az it injekciót követően 5, 15, 30 és 60 perccel megmértük mindkét talp nyomásérzékenységét. Az intrathecalis vildagliptin esetében egyszer megmértük a 120 perc utáni értéket is, subcutan vildagliptin esetén 15, 30, 60 és 120 percnél mértük a hatást. A különböző dózisban alkalmazott i.t. Ile-Pro-Ile hatásának összehasonlítására meghatároztunk a 30 perces időpontban egy százalékos antihiperalgéziás hatást = (ipsilaterális érzékenység hiperalgéziás alapérték) / (contralaterális érzékenység hiperalgéziás alapérték) x 100%. A különböző küszöb érték időpont görbék összehasonlítására kétszempontos ANOVÁ-t és Bonferroni post hoc tesztet alkalmaztunk. Akut nociceptiv tesztek Az akut antinociceptiv hatás vizsgálatához radiant heat tail flick tesztet használtunk. A kísérlet kezdetén megmértük az összes állat kontroll latenciáját. A hatóanyagot ezután adagoltuk, majd a hatóanyagok adása után 5, 15, 30 (a morfin esetében 20) perccel mértük a hatást (latenciát). A cut off idő a szöveti sérülések elkerülése végett 8 s volt. A hatást maximum possible effect (MPE) % formájában fejeztük ([Mért Latencia - Kontroll Latencia]/[Cut off - Kontroll Latencia] x100%). Az ED 50 értékek meghatározásához a dózis-hatás görbéket nem lineáris regresszióval határoztuk meg. 5

6 Eredmények Izolált hátsó gyöki ganglionon végzett vizsgálatok eredményei: Próba kísérlet Jelentős EM2 immunreaktivitás csak 10-3 M Exogén Tyr-Pro jelenlétében volt mérhető a fürdőfolyadékban, de a bazális felszabadulás depolarizációval nem volt fokozható. A szöveti tartalmak alatta maradtak a szervfürdőben mérhetőknek. Alacsony, de mérhető fürdő-tartalmak fordultak elő Tyr-Pro-Ser(O-glukóz) jelenlétében - amely egy prodrug, C-terminálisán fokozott plazmamembrán penetrációt lehetővé tevő függelékkel - a szöveti tartalom itt is alacsony volt. Immunreaktív SP jobbára a szövetkivonatokban volt mérhető (8 alkalommal 12- ből) és csak elvétve a fürdőfolyadékban (3 alkalommal 24-ből). Fő kísérlet 1. ábra: EM2 tartalmak a fő kísérletben * 15 EM 2 IR (pg/mg WTW) (Kontroll) (n=4) ) (n=4) -3 Tyr-Pro (10-4 Ile-Pro-Ile (10 ) (n=4) Tyr-Pro + Ile-Pro-Ile (n=4) * p<0,05 Felszabadulás 3 mm K + Felszabadulás 30 mm K + Szöveti tartalom A fő kísérletben csak a próba kísérlet eredményeit figyelembe véve csak a Tyr-Pro-t vizsgáltuk, a DPP IV hidrolitikus funkcióját gátló Ile-Pro-Ile-vel kiegészítve. Ekkor, részint kényszerből, csak az EM2 immunreaktivitást mértük. Hogy növeljük a detektálás valószínűségét növeltük a ganglionok számát, a minta mennyiségét és fokoztuk a tisztítás hatékonyságát. A próba kísérlethez hasonlóan, EM2 immunreaktivitás a nagy koncentrációjú Tyr-Pro- jelenlétében volt mérhető, a fürdőben mérhető mennyiség ismét meghaladta a szövet kivonatban mérhető. Szintén hasonlóan nem volt stimulálható a nyugalmi felszabadulás depolarizációval. Önmagában adott IPI esetében az immunreaktivitás csaknem detektálhatatlan mértékre csökkent mind a fürdő folyadékban, mind a szövetekben. Tyr-Pro és IPI kombinációja esetén, a nyugalmi állapotban is megnövekedett EM2 immunreaktivitás volt mérhető a folyadékban, ami depolarizáció hatására mintegy nyolcszorosára fokozódott, a szöveti tartalom emellett továbbra is alacsony maradt, mintegy tizenötöde a stimulált tartalomnak a szervfürdőben. (lásd 1. ábra) 6

7 In vivo vizsgálatok Antihiperalgéziás vizsgálatok Ahogy azt a feltételeztük az intraplantaris carrageenannel kiváltott tartós gyulladás okozta hiperalgézia teljes mértékben visszafordítható volt it injektált IPI-vel (2. ábra). A kontralaterális oldalon a nociceptiv küszöbérték IPI jelenlétében sem változott. További fontos megállapítás, hogy az antihiperalgéziás hatás kiváltásához nem volt szükség exogén szubsztrát(ok) adására. Az IPI antihiperalgéziás hatása dózis függőnek bizonyult, a dózis-hatás görbén sajátos törés volt megfigyelhető a 3 és 10 nmol / patkány dózisok között. (3. és 4. ábra) A szelektívebb nem peptid DPP IV inhibitor vildagliptin némileg hatékonyabbnak és szignifikánsan hosszabb hatásúnak bizonyult (2. ábra). Mindkét DPP IV inhibitor hatása antagonizálható volt koinjektált EM2 Antiszérummal (AS) és sc. adott opioid receptor antagonistával. (5. és 6. ábra) Nociceptiv küszöb (g) 2. ábra Az Ile-Pro-Ile és a vildagliptin antihiperalgéziás hatása *** *** *** *** Idő (min) * Fiz. só old. (n=5) Vildagliptin 3nmol (n=9) IPI 3 nmol (n=15) *** Vildagliptin vs. Fiz. só old. p<0,001 * Vildagliptin vs. Fiz. só old. p<0, Vildagliptin vs. IPI p<0,001 + Vildagliptin vs. IPI p<0,05 Nociceptive threshold (g) 3. ábra Az IPIkülönböző dózisainak antihiperalgéziás hatása *** *** *** Time (min) Saline (n=10) 1 nmol IPI (n=7) *** 3 nmol IPI vs. Saline p<0,001 ** 3 nmol IPI vs. Saline p<0,01 3 nmol IPI (n=15) nmol IPI vs. 30 nmol IPI p<0, nmol IPI (n=18) ++ 3 nmol IPI vs. 30 nmol IPI p<0,01 30nmol IPI (n=9) ** Antihiperalgéziás MPE (%) 4. ábra Az IPI dózis-hatás összefüggése (30. percben mért csúcsértéknél) Log 10 [nmol] 7

8 5. ábra Az IPI antihiperalgéziás hatásának antagonizmus koinjektált EM AS-mal és sc. NX-nal Nociceptiv küszöb (g) Idő (min) 30 nmol IPI it. 30 nmol IPI + EM2 AS it. 30 nmol IPI +1mg NX sc. Fiz. só old. 6. ábra A vildagliptin antihiperalgéziás hat. antagonizmusa koinjektált EM2 AS-mal és sc. NTX-nal 100 Nociceptiv küszöb (g) Idő (min) Vildagliptin 3 nmol Vildagliptin + EM2 AS Vildagliptin + 0,5mg/kg NTX sc Fiz. só old. Az egyedül adott EM2 antiszérum és az opioid receptor antagonisták nem befolyásolták sem a hiperalgéziás alapértéket, sem a kontralaterális lábon mérhető nociceptiv küszöbértéket Akut antinociceptiv vizsgálatok A direkt µ receptor agonisták akut nociceptiv teszten is hatékonyaknak bizonyultak (A kapott ED 50 értékeket lásd a táblázatban), addig a DPP IV inhibitorok teljesen hatástalannak bizonyultak 30 nmol / patkány dózisban adva Hatóanyag ED 50 (nmol/állat) Endomorphin 1 Endomorphin 2 DAMGO Morfin 6,8 (3,85-11,0; DF=15) 13,3 (8,04-22,1; DF=21) 0,0059 (0,0035-0,0104; DF=23) 0,11 (0,067-0,17; DF=26) 8

9 Diszkusszió Megállapítható volt, hogy patkány L4 és L5 hátsó gyöki ganglionon az immunreaktív EM2 megszintetizálódhat, ha nagy koncentrációban Tyr-Pro dipeptidet adunk mint prekurzort, amely másfelől az EM2 DPP IV enzim által létrehozott hidrolitikus szubsztrátja is. Ile-Pro-Ile, amely az enzimnek lassan bomló hidrolitikus szubsztrát típusú inhibibitora, önmagában adva inkább csökkentette az EM2 képződést. Ebből következik, hogy egyrészt az Ile-Pro-Ile nem ad keresztreakciót EM2 antiszérummal, másrészt a bazális EM2 képződés Tyr-Pro prekurzor hiányában alacsony kell, hogy legyen. A Tyr-Pro és az Ile-Pro- Ile szimultán alkalmazása esetén az EM2 képződés depolarizáció érzékennyé vált (és nyolcszorosára fokozódott), míg a szöveti tartalom mintegy huszada volt a stimulált felszabadulásnak. Bár a direkt bizonyíték még hiányzik, de ha az EM2 DPP IV általi biodegradációjával foglalkozó kvantitatív vizsgálatok eredményeit figyelembe vesszük, miszerint az endomorphinok lassan bomlanak (több mint 20 perces féléletidő mindkét endomorphin esetén), valamint a in vitro peptidszintetikus kémia eredményeit (lásd a Bevezetésben), nagy valószínűséggel kijelenthető, hogy a DPP IV ténylegesen részt vesz az EM2 bioszintézisben, tehát képes speciális körülmények között szintetizálni. A miáltalunk javasolt bioszintetikus modell szerint (lásd 6. ábra) az EM2 extracellulárisan képződik a membrán kötött ektoenzim DPP IV közreműködésével. A bioszintézist a nagy koncentrációban adott Tyr-Pro prekuzor indítja be. Az Ile-Pro-Ile, ami a DPP IV hidrolitikus funkciójának inhibitora, a DPP IV szintetikus funkciójának induktoraként szolgálhat. Az általában nehezen elképzelhető váltást alátámaszthatja, hogy a membrán kötött aktív DPP IV dimerként funkcionál. Végezetül a depolarizáció stimulált bioszintézis folyományaként alakítottuk ki azt a hipotézist, hogy a tartós gyulladás által okozott C-rost aktiváció kísérletesen hasonló körülményeket teremt a gerincvelő hátsó szarvában in vivo. 7. ábra Az EM2 de-novo bioszintetikus modellje A carrageenan indukálta hiperalgéziában intrathecalisan injektált DPP IV inhibitorok (Ile-Pro-Ile, vildagliptin) a bioszintetikus prekurzor adagolása nélkül antihiperalgéziás hatást fejtett ki. Mindkét inhibitor antihiperalgéziás hatása 9

10 gátolható volt koinjektált EM2 antiszérummal vagy opioid receptor antagonistával (naloxon, naltrexon) történő subcutan előkezeléssel. Egyedül adva sem az antiszérum, sem az opioid antagonisták nem befolyásolták a hiperalgéziás alapértéket a carrageenan injektált ipsilaterális oldalon, sem a contralaterális oldalon mért küszöbértéket. Az értekezés végső megállapításai 1. Az endomorphin 2 prekurzornak tartott Tyr-Pro dipeptid hozzáadásával immunreaktív endomorphin 2 képződhet de novo bioszintetikus úton izolált hátsó gyöki ganglionon. 2. A mi in vitro kísérleti rendszerünkben a bioszintézis extracellulárisan megy végbe. 3. Bár a direkt bizonyíték hiányzik, az indirekt bizonyítékok alapján valószínűsíthető, hogy a dipeptidil peptidáz IV ténylegesen részt vesz a bioszintézisben mint szintáz. 4. Az it. injektált DPP IV inhibitorok, az Ile-Pro-Ile és a vildagliptin antihiperalgéziás hatásúak patkányon tartós gyulladásos okozta hiperalgéziás modellen. 5. Mindkét inhibitor antihiperalgéziás hatása gátolható volt koinjektált EM2 antiszérummal vagy opioid receptor antagonistával (naloxon, naltrexon) történő subcutan előkezeléssel. 6. Ezáltal mindkettő hatását opioid receptorok közvetítik és endomorphin 2 képződésnek tulajdonítható. 7. Mivel nem volt szükség exogén prekurzor fragmensek adására, azok valószínűleg endogénen megképződnek. 8. Akut nociceptív modellen, amilyen a tail flick teszt, a DPP IV inhibítorok hatástalanok. Ilyen kísérletben még a Tyr-Pro pótlása esetén sem értünk el érdemi antinoceptiv hatást. 9. Emiatt az endomorphin 2 képződé szerepe eltérő kell, hogy legyen az akut és a nem-akut nociceptiv információ feldolgozásában. 10

11 Köszönetnyilvánítás SE, Farmakológiai és Farmakoterápiás Intézet Dr. Rónai András Dr. Riba Pál Prof. Gyires Klára Prof. Fürst Zsuzsanna Dr. Friedmann Tamás Dr. Szebeni Andrea Dr. Szentirmay Apolka Szalai Istvánné, Judit Balogh Jenő Gulyás Antal Serfőző Zsuzsanna És minden kedves munkatársamnak az Intézetben MTA, Kísérletes Orvostudományi Kutatóintézet Dr. Barna István Till Ibolya MTA, Szegedi Biológiai Kutatóközpont, Biokémiai Intézet, Neurobiológiai Egység Dr. Tóth Géza Dr. Szemenyei Erzsébet Dr. Darula Zsuzsuzsa SE, III. sz. Belgyógyászati Klinika MTA, Metabolizmus és Atherosclerosis Kutatócsoport Dr. Prohászka Zoltán SE, Anatómiai, Szövet- és Fejlődéstani Intézet Dr. Puskár Zita Dr. Kozsurek Márk Lukácsi Erika Gyimesi Klára Laboratory of Medical Biochemistry, University of Antwerp, Wilrijk, Belgium Anne-Marie Lambeir Medical School, K.U.Leuven, Belgium Walter Luyten SE, I. sz. Gyermekgyógyászati Klinika Dr. Szalay Balázs Valamint, de nem utolsósorban családomnak, akik támogattak a munkám során. Elsősorban feleségemnek, Orsinak, aki átolvasta a dolgozatot, és kijavította számtalan helyesírási hibámat. 11

12 Saját publikációk A disszertáció alapjául szolgáló közlemények 1. Király K, Lambeir AM, Szalai J, Szentirmay A, Luyten W, Barna I, Puskár Z, Kozsurek M, Rónai AZ. The dipeptidyl peptidase IV (CD26, EC ) inhibitor vildagliptin is a potent antihyperalgesic in rats by promoting endomorphin-2 generation in the spinal cord. Eur J Pharmacol Jan 10;650(1): Király K, Szalay B, Szalai J, Barna I, Gyires K, Verbeken M, Rónai AZ. Intrathecally injected Ile-Pro-Ile, an inhibitor of membrane ectoenzyme dipeptidyl peptidase IV, is antihyperalgesic in rats by switching the enzyme from hydrolase to synthase functional mode to generate endomorphin 2. Eur J Pharmacol Oct 12;620(1-3): Rónai AZ, Király K, Szebeni A, Szemenyei E, Prohászka Z, Darula Z, Tóth G, Till I, Szalay B, Kató E, Barna I. Immunoreactive endomorphin 2 is generated extracellularly in rat isolated L4,5 dorsal root ganglia by DPP-IV. Regul Pept Oct 9;157(1-3):1-2. Egyéb impakfaktoros nemzetközi folyóiratban megjelent közlemények 1. Spetea M, Windisch P, Guo Y, Bileviciute-Ljungar I, Schütz J, Asim MF, Berzetei-Gurske IP, Riba P, Kiraly K, Fürst S, Al-Khrasani M, Schmidhammer H. Synthesis and Pharmacological Activities of 6-Glycine Substituted 14- Phenylpropoxymorphinans, a Novel Class of Opioids with High Opioid Receptor Affinities and Antinociceptive Potencies ( ). J Med Chem Jan Sobor M, Timár J, Riba P, Friedmann T, Király KP, Gyarmati S, Al-Khrasani M, Fürst S. Effects of opioid agonist and antagonist in dams exposed to morphine during the perinatal period. Brain Res Bull Jan 15;84(1): Sobor M, Timár J, Riba P, Király KP, Gyarmati S, Al-Khrasani M, Fürst S. Does the effect of morphine challenge change on maternal behaviour of dams chronically treated with morphine during gestation and further on during lactation? Pharmacol Biochem Behav May;95(3): Timár J, Sobor M, Király KP, Gyarmati S, Riba P, Al-Khrasani M, Fürst S. Peri, pre and postnatal morphine exposure: exposure-induced effects and sex differences in the behavioural consequences in rat offspring. Behav Pharmacol Feb;21(1): Riba P, Friedmann T, Király KP, Al-Khrasani M, Sobor M, Asim MF, Spetea M, Schmidhammer H, Furst S. Novel approach to demonstrate high efficacy of mu 12

13 opioids in the rat vas deferens: a simple model of predictive value. Brain Res Bull Jan 15;81(1): Zádori ZS, Shujaa N, Köles L, Király KP, Tekes K, Gyires K. Nocistatin and nociceptin given centrally induce opioid-mediated gastric mucosal protection. Peptides Dec;29(12): Al-Khrasani M, Spetea M, Friedmann T, Riba P, Király K, Schmidhammer H, Furst S. DAMGO and 6beta-glycine substituted 14-O-methyloxymorphone but not morphine show peripheral, preemptive antinociception after systemic administration in a mouse visceral pain model and high intrinsic efficacy in the isolated rat vas deferens. Brain Res Bull Oct 19;74(5): Király KP, Riba P, D'Addario C, Di Benedetto M, Landuzzi D, Candeletti S, Romualdi P, Furst S. Alterations in prodynorphin gene expression and dynorphin levels in different brain regions after chronic administration of 14-methoxymetopon and oxycodone-6-oxime. Brain Res Bull Jul 31;70(3):