DNS alapú biológiai dozimetria kiterjesztése széles spektrumú UV hatásra

Átírás

1 Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Elméleti Orvostudományok Program: I/3. Ionizáló és nem ionizáló sugárzások biológiai hatásai DNS alapú biológiai dozimetria kiterjesztése széles spektrumú UV hatásra Doktori értekezés tézisei Készítette: dr. Hegedüs Márton Témavezető: Dr. Fekete Andrea Programvezető: Prof. Dr. Rontó Györgyi Készült: Semmelweis Egyetem Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet Intézetvezető: Prof. Dr. Fidy Judit Budapest, 2006

2 1. Bevezetés Napjainkban az emberi tevékenység nyomán változó sugárzási környezetben élünk, amibe beletartozik az ultraibolya tartomány egyre szélesebb spektruma is. Ipari szennyezés miatt vékonyodik az ózonréteg, divatossá vált a napozás és terjed a mester-séges források felhasználása (pl.: szoláriumok, orvosi és ipari célú alkalmazások). Az ultraibolya sugárzás káros hatásaival nem csak az összdózis növekedésének következményeként, hanem a spektrum minőségi változása miatt is számolnunk kell. Fokozódnak olyan nagy energiájú, az UV tartományba eső sugárzás hatásai (UVB: nm), ami a légkör szűrő hatása miatt korábban nem képezte részét az élőlények természetes környezetének, és amely más hullámhosszaknál (UVA: nm) biológiai szempontból veszélyesebb. Extrém környezetben, például a világűrben a Nap UV sugárzásának extraterresztriális komponensei (UVC: nm) is érvényre jutnak. Az ultraibolya sugárzás spektruma mellett az élő szervezetek egyes energiákra jellemző, hullámhosszanként különböző érzékenységétől is függ az, hogy a környezetünkben történő változások milyen következményekkel járnak. Az emberi egészségre és az ökoszisztémára kifejtett biológiai hatások felmérése és előrejelzése ezért rendkívül össszetett feladat. A megoldást biológiai doziméterek használata jelentheti, amik a különböző hullámhosszakon abszorbeált energiát annak biológiai hatásossága szerint súlyozva integrálják. Az élő szervezetek sugárkárosodásában a fehérjékkel kölcsönhatásban álló nukleinsav kitüntetett szerepet játszik, ráadásul jelentős elnyelése miatt a nagy energiájú ultraibolya tartományra (UVB, UVC) fokozottan érzékeny. A DNS-ben kialakuló mutációknak többek között a sejthalál és a bőrrákok kialakulásában alapvető szerepe van, ami az ultraibolya sugárzást a leggyakoribb környezeti rákkeltő ágenssé teszi. Mivel az UV sugárzás legtöbb biológiai hatása elsődlegesen a DNS változatos sérüléseire vezethető vissza, ezért célszerű magát a célmolekulát használni biológiai doziméterként. Mindezen folyamatok szükségessé teszik a DNS alapú biológiai dozimetria kiterjesztését széles spektrumú UV hatásra. Az ultraibolya sugárzás célmolekuláit tartalmazó egyszerűbb organizmusok (baktériumok, spórák, vírusok) jól használhatók biológiai doziméterként. Ezek közé tartozik a T7 bakteriofág is, ami a DNS sérülések tanulmányozásához

3 ideális modell rendszer, mert a fág izolált DNS-e mellett a kromoszóma modelljének tekintett intakt fágban a fehérjékkel való kölcsönhatás következményei is vizsgálhatóak. A fág felépítése ismert, laboratóriumi felhasználásának módszerei letisztultak, alkalmas fizikai és kémiai vizsgálatokra, emellett azonban gazdasejteken biológiai aktivitása is mérhető. Az ultraibolya sugárzás nem csak a földi élet jelenére nyomja rá bélyegét, hanem annak kialakulását is erősen befolyásolhatta. Az egyszerű biomolekulák létrejöttének egyik ma feltételezett színtere a bolygóközi tér porszemcséinek felszíne, ahol az akkoriban még ózonréteg védelme nélküli Földhöz hasonlóan erős elektromágneses sugárzás érvényesült. A biomolekulák, DNS bolygók közti átvitelének lehetősége is elképzelhető, amiben a régmúltban meteorit kőzetdaraboknak lehetett szerepe. Ma az űrjárművek fedélzetét szennyező mikroorganizmusok jelentenek veszélyt a világűr mikrobiológiai biztonságára. Ebből a szempontból a DNS és nukleoprotein komplexek világűrbeli sorsa sarkalatos kérdés. A problémával foglalkozó exobiológiai kutatásokra ad lehetőséget a Nemzetközi Űrállomásra kifejlesztett EXPOSE egység. Az Európai Űrügynökség által támogatott kísérletek között szerepelnek a PUR (Phage and Uracil Response) program T7 fág, fág-dns és uracil vékonyrétegei. 2. Célkitűzések Korábban a biológiai dózist a T7 fágok E. coli gazdasejten mutatott tarfoltképző képességének csökkenése alapján definiálták. A molekuláris biológiai technikák fejlődésével a DNS UV fotosérüléseinek detektálásában emellett új utak is megnyíltak, amik lehetővé teszik a biológiai dózis gyorsabb és egyszerűbb meghatározását. Munkánk során célul tűztük ki: I.1. I.2. I.3. I.4. Polimeráz láncreakció (PCR) kifejlesztését a fág-dns sérüléseinek detektálására; A polimeráz láncreakció kvantitatív kiértékelésének kidolgozását; PCR optimalizálását különböző dózistartományokban használható fragmensek esetére; UVB, UVC és polikromatikus források hatásának tanulmányozását;

4 I.5. I.6. I.7. A T7 fág biológiai dózismérő hitelesítését; Különböző DNS konformációk UV sérülést befolyásoló hatásának vizsgálatát; A fág-fehérjék szerepének tisztázását a DNS UV sérüléseiben.

5 Az ultraibolya sugárzás DNS-t károsító hatása a vákuummal együtt a világűrben az élet szempontjából a legfontosabb limitáló tényező. A T7 fág és DNS vékony-rétegekkel a Nemzetközi Űrállomáson végzendő kísérleteket földi előkészítő mérések előzik meg. Az EVT-k (Experiment Verification Test) kapcsán más módszerekkel kiegészítve a gyakorlatban alkalmaztuk a DNS sérülések detektálására kifejlesztett új eljárást (QPCR). A vékonyrétegek űrszimulációs kezelésének kapcsán vizsgáltuk: II.1. II.2. II.3. II.4. II.5. II.6. II.7. Az EXPOSE-on használandó fág és DNS vékonyrétegek minőségét; A szimulált űrbeli vákuum hatását; A hőmérséklet-ingadozás hatását; Szimulált extraterresztriális sugárzás (monokromatikus UVC és napszimulátor) hatását; A DNS sérülések teljes számát és egyes típusainak megoszlását; A kombinált (vákuum + UV) kezelések következményeit; A vékonyrétegek vastagságának árnyékoló hatását és a hatás korrekciós számításba vételének lehetőségeit. 3. Módszerek Kísérleteinkhez a T7 bakteriofágokat E. coli B gazdasejteken szaporítottuk, CsCl gradiens centrifugálással dúsítottuk, majd dialízis oszlopon tisztítottuk a Semmelweis Egyetem Biofizikai és Sugárbiológiai Intézetében korábban kidolgozott módszerek szerint. A fág fehérje kapszidba csomagolt kettősszálú, lineáris DNS-t tartalmaz, mely 90%-ban esszenciális génekből áll, ezért bármilyen sérülése letálisnak tekinthető. A fág oldatok élőszámát bouillon-agarra szélesztett E. coli B tenyészetek fertőzésével, klasszikus Gratia-titrálással határoztuk meg. Definíció szerint a T7 biológiai dózis egységnyi, ha a fágok eredeti tarfoltképző képessége (N 0 ) a kezelés után (N) e-ed részére csökken: H T7 = - ln (N/N 0 ). A hagyományos módszerrel meghatározott egységnyi biológiai dózis közvetve megfelel 1 detektált sérülésnek, ami 2 UV által indukált lézióval ér fel gazdasejt reparáció (β 0,5) előtt.

6 A DNS sérülések közvetlen meghatározásához polimeráz láncreakción alapuló kvantitatív módszert (QPCR) dolgoztunk ki. A reakció során a Taq DNSpolimeráz minden ciklusban másolatot készít a meglévő DNS szálak oligonukleotid primerek közötti szakaszáról, ezért a DNS mennyisége exponenciálisan növekszik. A másolást a minta DNS (foto)sérülései megakasztják, ezért a termék mennyiségének csökkenéséből a hibahelyek számára lehet következtetni. A sérülésekre rendkívül érzékeny módszer műtermékektől mentes kiindulási DNS-t igényel, ezért a DNS fehérjéktől való izolálását a hagyományos fenol kloro-formos technika helyett 5%-os Na-dodecil-szulfát (SDS) és KCl segítségével végeztük. A QPCR-hoz internetes adatbázis felhasználásával választottunk primereket. Ezek közül két pár volt jól alkalmazható, melyek a fág genomjának egy 555 és egy 3826 bázispár hosszúságú fragmensét amplifikálták. A reakcióelegyben optimalizáltuk a primerek, a DNS, a nukleotidok, a MgCl 2 és az AmpliTaq Gold polimeráz koncentrációját. Meghatároztuk a ciklusszám, az egyes lépések hőmérsékletének és idejének legkedvezőbb értékeit. A PCR eredményét 2%-os agaróz gélen futattuk. Standardként kilobázisos vagy λ Hind III DNS fragmenseket és ismert koncentrációjú DNS oldatot alkalmaztunk. A DNS mennyiségével arányos etídium-bromid fluoreszcenciát a gélről UV átvilágító felett készített felvételek számítógépes feldolgozása alapján kvantifikáltuk. Az exponenciális amplifikáció tartományában a szálankénti átlagos sérülésszám (s) a valószínűségszámításból ismert Poisson-egyenlettel becsülhető: s = - ln (A/A 0 ), ahol A a besugárzott, A 0 a kontroll DNS PCR terméke. A polimeráz láncreakció segítségével meghatároztuk az UV besugárzás következ-tében kialakult DNS sérülések számát az UVA B C tartományt felölelő öt különböző sugárforrás (Nap, napszimulátor, FS20 lámpa, TL01 lámpa, germicid lámpa). meghatározott biológiai dózisai esetében. Az egyes források által emittált effektív hullámhossz-tartományt spektroradiométerrel mértük meg. Annak vizsgálatára, hogy a proteinekkel való kölcsönhatás hogyan befolyásolja a DNS fotosérüléseinek kialakulását, méréseket végeztünk fágon belüli és fehérjéktől izolált DNS mellett fűtött fág -on is, ahol 65 C-os hőkezeléssel elértük, hogy a DNS a fehérje burokból kiszabaduljon, de azzal ne veszítse el teljesen a kapcsolatot.

7 A DNS konformációnak a sérülések keletkezésére kifejtett hatását A, B, C és rendezetlen (D) konformációban vizsgáltuk. A térszerkezetet a DNS hidráltsága jelentősen befolyásolja. Az egyes konformációkat oldatokban etanol hozzáadásával (vagy hődenaturálással), vékonyrétegeken pedig a relatív páratartalom és a NaCl / LiCl koncentráció befolyásolásával tudtuk kialakítani. Mivel a világűrben a folyadékokkal való munka nehezen kivitelezhető, és mert a dehidráció hatásait is vizsgálni kívántuk, a kutatócsoport fág és DNS vékonyréteg készítési eljárást dolgozott ki, melynek során a réteg vastagságát meghatározó fág/dns koncentrációt NaCl vagy LiCl oldatban állítottuk be. Az oldatokhoz emelkedő koncentrációban etanolt mérve a kicsapódó részecskéket centrifugálással kvarc korongokra ülepítettük. A filmek homogenitását és egyenletes fedettségét polarizációs és fáziskontraszt mikroszkóppal és a Rayleigh-Mie formula (E = kλ -n ) segítségével meghatározott fényszórás alapján ellenőriztük. Az űrszimulációs kezelésekre a Deutsches Zentrum für Luft- und Raumfahrt kölni, és az Osztrák Tudományos Akadémia grazi űrszimulátorában került sor az EXPOSE egységre kifejlesztett, légmentesen záródó mintatartó szelencékben. A vákuum hatását egy hétig Pa nyomáson, nyitott szelencéken vizsgáltuk. Ezzel párhuzamosan két profil szerinti hőmérséklet-ingadozás hatásait is tanulmányoztuk: 1V2 (1 hét 40 ºC, 1 nap 60 ºC, 1 hét 40 ºC) és 2V1 (1 óra +20 ºC, 1 óra -20 ºC, 1 héten keresztül). Az extraterresztriális UV sugárzást 254 nmen emittáló germicid lámpa és nm között sugárzó napszimulátor (SOL 2000) segítségével szimuláltuk. A vékonyrétegeken található DNS nukleotid bázisainak elrendeződésére a stacking kölcsönhatást tükröző, fényszórásra korrigált abszorpciós spektrumok alapján következtettünk, majd a további kiértékeléshez a vékonyrétegeket oldatba vittük. A QPCR-ral meghatározott teljes sérülésszám mellett kettős szálú lánctörések kvantifikálására semleges, az egyszálúakéra a szálak NaOH-dal történt szétválasztása után lúgos gélelektroforézist alkalmaztunk, a gélről meghatározott átlagos fragmens-hosszak alapján. Ezekkel a módszerekkel specifikus enzimatikus emésztést kombináltunk egyes sérülés típusok meghatározására. Az endonukleáz V. a ciklobután-pirimidin-dimerek (CPD), az endonukleáz IV. az apurinezett/apirimidinezett léziók szomszédságában hasítja a DNS szálat. Az így létrejött száltöréseket 1%-os agaróz gélelektroforézis segítségével mutattuk ki. A DNS fehérje keresztkötések mennyiségé-re a fágból SDS-sel izolálható DNS mennyiségének csökkenéséből következtettünk.

8 4. Eredmények és következtetések A T7 bakteriofág biológiai doziméterként való felhasználásával kapcsolatban az alábbi eredményekre jutottam: I.1. A fág sérülések élőszám-csökkenésre alapozott, közvetett meghatározása helyett a fág-dns sérülésének közvetlen mérésére alkalmas módszert, kvantitatív polimeráz láncreakciót (QPCR) fejlesztettem ki. A QPCR optimalizálásával elértem, hogy a termék szempontjából reakcióról reakcióra a sértetlen kiindulási DNS mennyisége legyen az egyetlen limitáló tényező. A termék mennyisége ezért szigorúan arányos a kiindulási DNSével, ahol a korrelációs együttható 0,9998 volt. A DNS-ben bárhol kialakuló sérülés gátolja a Taq-polimerázt, ezért a polimeráz láncreakcióban szintetizált DNS mennyiségének a kontrolhoz viszonyított csökkenéséből a kiindulási DNS mintában lévő sérült molekulák arányára tudtam következtetni. A kvantitatív polimeráz láncreakció gyakorlatilag valamennyi DNS sérülés detektálására képes, ezért különböző örökítőanyagot károsító hatások következményeinek mérésére is alkalmas. Ezek közé tartozik a széles spektrumú UV hatás, de a gyakorlati alkalmazás más területeken is lehetséges, például genotoxikus vegyületek vagy ionizáló sugárzás hatásainak vizsgálatánál. A reakció annyira stabil, hogy a DNS megtisztítását nem igényli, a teljes fágon való közvetlen mérés lehetősége a munkafolyamat egyszerűsödése miatt a gyakorlati alkalmazást is megkönnyíti. I.2. Az eljárás kvantitatív kiértékelése lehetővé teszi a sérülésszám pontos meghatározását. A kezelt és kezeletlen nukleinsav PCR termékének arányából a mintában található ép és sérült DNS láncok mennyiségére következtettem. A léziók véletlenszerű kialakulását feltételezve a sérülésszám a populáción belül Poisson-eloszlást követ. A sértetlen molekulák kísérletesen meghatározott mennyiségéből nulladrendű Poissonösszefüggés alapján számoltam a vizsgált fragmensre eső átlagos sérülésszámot. A DNS-ben kialakult teljes sérülésszámot ennek ismeretében kaptam. Az így született eredményeket a hagyományos mikrobiológiai módszerek (biológiai aktivitás csökkenése) alapján számított értékekkel is alá tudtam támasztani.

9 I.3. A polimeráz láncreakció az exponenciális amplifikáció miatt megfelelően hosszú fragmensek esetén a DNS sérülések rendkívül érzékeny meghatározására alkalmas. Rövidebb fragmensekben azonos sérülésszám kialakításához jóval nagyobb dózisra van szükség. A T7 fág 555 bp-os fragmensénél 7-szer hosszabb, 3826 bp-os fragmens esetén a polimeráz gátlása 6,5-szeres volt, ami azt mutatja, hogy az átlagos sérülésszám és a fragmenshossz egymással egyenesen arányos. Ennek alapján megállapítottam, hogy a két reakció esetében a teljes genomra számított sérülésszám közel azonos. A QPCR-ral kiértékelt fág/dns biológiai dózismérő különböző fragmenshosszak esetében eltérő dózistartományokban használható. A hosszabb fragmens rövid expozícióra, a rövidebb pedig hosszú expozícióra alkalmas. A fág/dns doziméter használható, mint rövid-, közép- és hosszútávú doziméter természetes napfény monitorozásakor, és kis, közepes és nagy dózisok mérésére mesterséges sugárforrások esetén. Ezért a T7 fág DNS-én végzett QPCR segítségével szemben más dózismérőkkel a teljes biológiailag releváns dózistartomány vizsgálható. I.4. Öt különböző sugárforrás felhasználásával kísérleteinkben felöleltük az UVA UVB UVC tartományt. Azonos biológiai dózis hatására a polimeráz láncreakcióval meghatározott sérülésszám a különböző sugárforrások esetében nem változott. Bizonyos egyedi sérülések (CPD-k és 6-4 PD-k) kialakulásában munkacsoportunk korábban erős hullámhossz-függést tudott kimutatni a kezelések azonos biológiai hatása ellenére is. Ebből arra következtettem, hogy a QPCR nagy előnye, hogy a sugárzás összetételétől függetlenül a DNS-ben kiváltott fotosérülések többségét tekintet nélkül azok természetére detektálni tudja. I.5. Hitelesítettem a T7 fág biológiai dózismérőt a QPCR alapján. A T7 fág biológiai doziméterben a biológiai dózis egységét a definíciónak megfelelően az élőszám-csökkenés alapján határozzák meg. Az élőszámcsökkenésből számítható elméleti sérülésszám β 0,5 gazdasejt reparáció nélkül H T7 =8 UV dózisnál 16 sérülés/fág, és a két fragmentumban QPCR-

10 ral kísérletileg mérhető teljes sérülésszám ezzel jó egyezést mutatott. A két fragmentum alapján meghatározott sérülésszám között nincs szignifikáns eltérés. Ezzel lényegében igazoltam, hogy a T7 fágban igen nagyszámú sérthető hely található és ezek közül már egynek a sérülése is a fág inaktivációját okozza, a sérülések valóban véletlenszerűen, Poisson-eloszlás szerint történnek. I.6. A DNS ultraibolya sugárzás által okozott sérüléseinek kialakulásában általában szerepet játszik az, hogy az örökítőanyagot felépítő bázisok mennyire vannak kedvező helyzetben fotoproduktumok kialakítására. QPCR segítségével megállapítottam, hogy a DNS különböző térszerkezetű állapotaiban (A-, B-, C- és D-konformációban) nincs szignifikáns különbség az UV sugárzás által okozott léziók keletkezésében, vagyis a DNS általános térszerkezete nem játszik döntő szerepet a sérülések kialakulásában. I.7. Fágon belüli, izolált DNS és fűtött fág felhasználásával vizsgáltam a fágfehérjék szerepét a DNS UV sugárzás által előidézett fotosérüléseinek létrejöttében. A várakozások szerint a fehérjék örökítőanyagot stabilizáló és az UV sugárzás gyengítésére való képessége miatt a proteinek védő hatása volt feltételezhető. Ezzel ellentétben a fágon belüli DNS-ben a különböző UV források esetében izolált DNS-hez és fűtött fág -hoz képest rendre 3,5-szer és 2,5-szer több sérülés keletkezett. A DNS konformáció szerepét előzőleg kizártam az eltérő sérülésszámok kialakulásában. Ezért valószínűsíthető, hogy a fágon belüli fokozott DNS sérülékenység oka, hogy a proteinekhez való kötődés környezetében kitekeredő pirimidinek kettős kötései egymással fedésbe kerülnek és UV sérülésre esendőbbekké válnak. Emellett a fehérje kötődése meggátolhatja a DNS-ben az elnyelt gerjesztési energia eloszlását is a szál gerince mentén.

11 A fentiekben vázolt eredmények alapján a T7 fág biológiai dozimétert és a kiértékeléshez használt polimeráz láncreakciót alkalmasnak tartom bármilyen eredetű DNS sérülés tanulmányozására, beleértve szélsőséges UV sugárzási viszonyok, ionizáló sugárzások, extrém környezeti paraméterek vagy genotoxikus vegyületek hatásainak vizsgálatát. Az új eljárás gyakorlati alkalmazhatóságára extraterresztriális körülmények DNS-re és T7 fágra kifejtett hatásainak vizsgálatával mutattam példát. Az EXPOSE-ra tervezett mérések előfutáraként végzett űrszimulációs kísérletsorozat eredményeként az alábbi megállapításokra jutottam: II.1. A munkacsoport által kifejlesztett mintatartó szelencék és fág/dns vékonyrétegek az űrszimulációs kezelésre alkalmasak. A centrifugális ülepítéssel készített T7 fág/dns vékonyrétegek jó minőségűek, a mikroszkópos felvételek és spektrofotometriás mérések tanúsága szerint egyenletes fedettségűek. Utóbbi mérések eredményeként azt is megállapítottam, hogy a mintákon tapasztalható fényszórás a vártnál (n 4) kisebb (n 1,5 2,8) mértékű és ez a vékonyrétegek homogén szerkezetével magyarázható. A vizsgált filmek a hordozó anyagra erősen adszorbeálódnak és a világűr vákuumát szimuláló alacsony nyomáson is stabilak. II.2. A vákuumkezelés ( Pa) következményei alapján megállapítottam, hogy a fág és DNS vékonyrétegek viszonylag jól viselik ezt a szélsőséget. A vákuum a vékonyrétegeken vízvesztést okoz, az örökítőanyag konformációjának változását eredményezi, amit a stacking kölcsönhatást tükröző abszorpciós spketrumokkal tudtam követni. A 0% relatív páratartalom mellett kialakuló D-konformáció 260 nm-nél ugyanúgy 30%-os hyperkromiát okoz, mint a vákuumkezelés; magasabb páratartalomban történt ekvilibráció után az abszorpciós spektrum felveszi eredeti OD-ját és alakját. Eredményeim szerint az erőteljes dehidráció a DNS részleges denaturációját okozza, de a vékonyrétegeken beszáradt, rögzült szerkezet miatt ez a változás rehidráció során reverzibilis. A maradandó sérülések száma nem volt jelentős, köztük elsősorban száltöréseket és DNS fehérje keresztkötéseket találtam. II.3. Az űrállomás környezetében várható hőmérséklet-ingadozások esetén a minták stabilak. A vizsgált hőkezelés kedvez a DNS denaturációjának, de csak elvétve okoz száltöréseket.

12 II.4. Monokromatikus UVC (254 nm) sugárzás hatására az oldatokban is domináló dimer fotoproduktumok (CPD és 6-4 PD) kialakulásának abszorbanciát csökkentő hatása ellenére a vékonyrétegek spektrumában hyperkrom effektus lépett fel, ami a fág/dns filmeken egyéb, denaturáló jellegű fotosérülések (keresztkötések, száltörések, spóra fotoproduktumok) megjelenésére utal. A QPCR-ral meghatározott teljes sérülésszámban nagy, kj/m 2 feletti UVC dózisoknál telítés mutatkozik mind a fág, mind a DNS vékonyrétegekben. Ennek hátterében a sérülések kialakulása és fotoreverziója közötti egyensúly feltételezhető annak köszönhetően, hogy a fotoreverzió kvantumhatásfoka több mint egy nagyság-renddel nagyobb a sérülések kialakulásáénál. A sérülések száma egy idő után nem emelkedik tovább, ami lehetővé teheti igen nagy elszenvedett dózisok ellenére is a fágok vagy DNS molekulák egy részének épségben maradását. Vékonyrétegekben a fágok UV sérülésre való izolált DNS-énél lényegesen nagyobb érzékenysége az oldatokéhoz képest csökken, mert valószínűleg a filmeken jelenlévő sókristályok a DNS stabilizálásában szerepet játszanak. II.5. A monokromatikus UVC forrás (254 nm) és a széles tartományban emittáló SOL 2000 napszimulátor ( nm) által okozott egyes sérülések típusai közötti megoszlás alapján megállapítottam, hogy míg előző esetben a ciklobután-pirimidin-dimer (CPD) fotoproduktumok dominálnak ( 61%), addig más hullámhosszak jelenlétében (polikromatikus UV) ez a dominancia csökken ( 18%) és egyéb, köztük vékonyrétegekre jellegzetes sérülések kerülnek előtérbe. Ide tartoznak többek között a DNS fehérje keresztkötések ( 57%), valamint az egyszeres és kétszeres száltörések ( 11%), amiknek kialakulásában a vékonyrétegeken jellemző szoros rétegződés is szerepet játszhat. A meghatározott léziók összességükben a teljes sérülésszám 85%-át adják, a fennmaradó részt nem vizsgált sérülések, irodalmi adatok alapján várhatóan jelentős arányban spóra fotoproduktumok teszik ki. II.6. Együttesen alkalmazott vákuum és UV besugárzás során a két hatás közötti szinergizmust tapasztaltam mind spektroszkópiai mérések, mind a QPCR alapján. A kombinált kezelés a komponensek izolált hatásához képest a vártnál nagyobb sérülésszámot okozott, ami nem adódott egyszerűen az egyes részfolyamatok összegeként. Ez felhívja a figyelmet arra, hogy a

13 valóságos viszonyok szimulációjakor nem elég az egyes paraméterek hatását izoláltan vizsgálni, hanem tekintettel kell lenni a köztük kialakuló esetleges kölcsönhatásokra is. A nagy energiájú UV sugárzás nem-additív hatására utal a fotosérülést kiváltó és revertáló fotoreakció. Míg a Föld felszínét elérő napsugárzásban az egyes hullámhosszak hatását additív módon lehet figyelembe venni, addig a világűr viszonyai között ez az egyszerűsítés elveszítheti létjogosultságát. II.7. Megállapítottam, hogy vastagabb fág és DNS vékonyrétegeken a felsőbb rétegek az alattuk lévőket leárnyékolják. Ennek a védelemnek az eredményeképpen a vastagabb rétegekben kevesebb sérülés keletkezik. Például 60 kj/m 2 -es UVC (254 nm) besugárzás után a QPCR termék mennyiségének csökkenése mintegy 70%-os volt OD 260 =0,1 réteg esetében, míg OD 260 =0,5 esetében csak 30%-os. A védő hatás a réteg vastagságával arányos. A QPCR adatok alapján a dózis hatás görbék kezdeti meredekségének reciproka felhasználásával kidolgoztam egy korrekciós faktor számítását, aminek segítségével a minta felszínét érő dózisból kiindulva a vastagság ismeretében a vékonyrétegen eső átlagos dózis meghatározható. A rétegvastagság védő hatása más protektív faktorokkal együtt a fágok világűrbeli túlélését segítő jelentős tényező. RÖVIDÍTÉSEK 6-4 PD 6-4 fotodimer β gazdasejt reparáció hatásfoka CPD ciklobután-pirimidin-dimer DNS dezoxiribonukleinsav EVT Experiment Verification Test H T7 T7 egyenérték dózis ISS International Space Station

14 OD optikai denzitás Q / PCR quantitative / polymerase chain reaction SDS sodium-dodecyl-sulfate UV ultraibolya UVA nm UVB nm UVC nm

15 5. Összefoglalás Napjainkban az emberi tevékenység nyomán változó sugárzási környezetben élünk, amibe beletartozik az ultraibolya tartomány egyre szélesebb spektruma is. A biológiai rendszerek az egyes hullámhosszakra különböző érzékenységgel reagálnak. Az ultraibolya sugárzás fő támadáspontja az élő szervezetekben az örökítőanyag, ezért hatásainak tanulmányozásához célszerű magát a DNS-t használni biológiai doziméterként. A DNS sérüléseknek alapvető szerepe van a bőrrákok kialakulásában, ami az ultraibolya sugárzást a leggyakoribb környezeti rákkeltő ágenssé teszi. Munkám során széles UV spektrum ( nm) által kiváltott DNS sérülések számszerű meghatározásának módszerét dolgoztam ki és alkalmaztam. Erre a célra T7 bakteriofág DNS-ének két fragmensére polimeráz láncreakciót optimalizáltam (QPCR). A termék mennyisége alapján Poisson-egyenlet segítségével kvantitatíven meg tudtam határozni az átlagos sérülésszámot. A reakció teljes fágban is működik, és érzékenysége a célszekvencia hosszától függ, ami a gyakorlatban az 555 bp-os fragmenst nagyobb, a 3826 bp-osat kisebb dózisok meghatározására teszi alkalmassá. Az UVA B C tartományt felölelő öt sugárforrás esetében a fág biológiai aktivitásának csökkenése alapján számítható és a PCR-ral meghatározott sérülésszám között jó egyezést találtam. Ez arra utal, hogy a QPCR valamennyi UV sérülés detektálására képes, és a T7 fág biológiai dózismérő hitelesítésére alkalmas. Izolált és fágon belüli DNS sérülésének összehasonlítása alapján megállapítottam, hogy a fehérjékhez való kötődés jelentősen fokozza a DNS sérülékenységét, és ebben nem a DNS konformációjának van szerepe. Az ultraibolya sugárzás a világűrben is a biomolekulák sorsát meghatározó egyik döntő tényező. Az ISS EXPOSE egységére küldendő T7 fág / izolált DNS vékonyrétegek az űrszimulációs kísérletekre alkalmasnak bizonyultak. A vákuum dehidráló hatása és a várható hőmérséklet-ingadozás viszonylag alacsony sérülésszámokat eredményezett. UVC sugárzás hatására a sérülések keletkezésében telítődés mutatkozik, aminek hátterében a fő fotoproduktumok, a dimerek fotoreverziója állhat. Szélesebb extraterresztriális spektrum hatására a vékonyrétegekre jellemző egyéb fotoproduktumok is előtérbe kerülnek. Vákuummal kombinált UVC kezelés szinergista hatású. A sérülések ellen azonban a vastag rétegeken jelentkező árnyékolás például ásványi anyagok protektív hatásával kiegészülve számottevő védelmet jelenthet.

16

17 6. Summary Extension of DNA based dosimetry to broad-band UV radiation Human activity is leading to a changing radiation environment, including the broadening spectrum of ultraviolet radiation. The main target of ultraviolet rays in the living organisms is the genetic material, therefore it seems reasonable to use the DNA itself as a biological dosimeter. The DNA damage in skin cancer makes UV radiation the most ubiquitous environmental carcinogenic agent. The aim of this work was the development and application of a method for the quantitative determination of DNA damages caused by a wide spectrum of UV radiation by polymerase chain reaction (QPCR). QPCR was optimized for two fragments of bacteriophage T7 DNA. Based on the amount of the PCR product Poisson-equation was used to calculate the average lesion frequency. The QPCR works also on intact phages and its sensitivity depends on the fragment length used. Routine use of the 555 bp fragment is possible for the determination of large doses, while the 3826 bp fragment is suited for smaller ones. In the case of five various sources of UVA B C radiation a good agreement was found between the lesion frequencies determined by QPCR and calculated from biological activity data. This indicates that the QPCR method is capable of detecting practically all UV photoproducts and it can be used for the validation of the phage T7 biological dosimeter. The comparison of total lesion frequencies in intact phage and isolated DNA led to the conclusion that protein binding to DNA can increase its UV sensitivity due to local structural changes, where protein binding is the decisive factor and not DNA conformation. High-energy ultraviolet radiation is also one of the deleterious parameters in the space survival of biomolecules. Our T7 phage / DNA thin layers to be sent to the EXPOSE unit of ISS proved to be suitable for space simulation experiments. The dehydrating effect of vacuum and on-board temperature fluctuation resulted in low phage / DNA lesion frequencies. Interestingly UVC irradiation led to a saturation tendency in lesion formation both in phage T7 and DNA, which can be explained by the photoreversion of dimer photoproducts. A broader spectrum of extraterrestrial radiaton caused a significant amount of other photoproducts as well. UVC radiation combined with vacuum treatment showed a synergistic effect. However, shielding by thicker layers and e.g. mineral material may result in substantial protection of phage / DNA from extraterrestrial damages.

18

19 7. Saját publikációk jegyzéke CIKKEK 1. Fekete A., Módos K., Hegedüs M., Rontó Gy., Kovács G., Bérces A., Lammer H., Kargl G., Kömle N. I.: Study of the effect of simulated space environment on nucleoprotein and DNA thin films, Proceedings of the 2nd European Workshop on Exo/Astrobiology, Graz, Austria, September 16-19, 2002, ESA-SP-518, Fekete A., Földvári I., Hegedüs M., Módos K., Rontó Gy., Kovács G., Bérces A., Péter Á.: Study of the effect of simulated space environment on phage T7 and isolated T7 DNA thin films, Journal of Luminescence, 2003, , IF: 1, Hegedüs M., Módos K., Rontó Gy., Fekete A.: Validation of phage T7 biological dosimeter by quantitative polymerase chain reaction using short and long segments of phage T7 DNA, Photochemistry and Photobiology, 2003, 78, IF: 1, Kovács G., Fekete A., Módos K., Hegedüs M., Rontó Gy., Panitz C., Lammer H.: Experiments of the effects of space environmental factors on DNA and nucleoproteins, Proceedings of the III. European Workshop on Exo/Astrobiology, Mars: the search for life, Madrid, Spain, November 2003, ESA-SP-545, Fekete A., Rontó Gy., Hegedüs M., Módos K., Bérces A., Kovács G., Lammer H., Panitz C.: Simulation experiments of the effect of space environmnet on bacteriophage and DNA thin films, Advances in Space Research, 2004, 33, IF: 0, Fekete A., Módos K., Hegedüs M., Kovács G., Rontó Gy., Péter Á., Lammer H., Panitz C.: DNA damage under simulated extraterrestrial conditions in bacteriophage T7, Advances in Space Research, 2005, 36/2,

20 IF: 0, Hegedüs M., Kovács G., Módos K., Rontó Gy., Lammer H., Panitz C., Fekete A.: Exposure of phage T7 to simulated space environment: The effect of vacuum and UV-C radiation, Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 2006, 82/2, IF: 1, Hegedüs M., Fekete A., Módos K., Kovács G., Rontó Gy., Lammer H., Panitz C.: Response of bacteriophage T7 biological dosimeter to dehydration and extraterrestrial solar UV radiation, Acta Astronautica, 2006, doi: /j.actaastro IF: 0,209 ELŐADÁSOK ÉS POSZTEREK 1. Hegedüs M., Módos K., Fekete A.: DNS sérülések detektálása PCR-ral DNS-ben és nukloproteidekben, Magyar Biofizikai Társaság XX. Kongresszusa, Budapest, Földvári I., Fekete A., Hegedüs M., Rontó Gy., Kovács G., Péter Á.: Study of the effect of simulated space environment on phage T7 and isolated T7 DNA thin films, International Conference on Luminescence and Optical Spectroscopy of Condensed Matter (ICL '02), Budapest, Hegedüs M., Fekete A.: DNS sérülések detektálása polimeráz láncreakcióval, Semmelweis Egyetem, Orvos- és Gyógyszerésztudományi Diákköri Konferencia, Budapest, Fekete A., Módos K., Hegedüs M., Rontó Gy., Kovács G., Bérces A., Lammer H., Kargl G., Kömle N. I.: Study of the effect of simulated space environment on nucleo-protein and DNA thin films, 2nd European Workshop on Exo/Astrobiology, Graz, Fekete A., Rontó Gy., Hegedüs M., Módos K., Bérces A., Kovács G., Lammer H.: Simulation experiments of the effect of space environment on bacteriophage and DNA thin films, 34th Cospar Congress, Houston, 2002

21 6. Hegedüs M., Módos K., Rontó Gy., Fekete A.: Szimulált világűr hatása T7 bakteriofág DNS-ére, Magyar Biofizikai Társaság XXI. Kongresszusa, Szeged, Fekete A., Hegedüs M., Módos K., Rontó Gy., Csík G.: Validation of phage T7 biological dosimeter by quantitative chain reaction using short and long segments of phage T7 DNA, 10th Congress of the European Society for Photobiology, Bécs, Hegedüs M., Fekete A.: A világűrben uralkodó viszonyok hatása a DNS-re, Semmelweis Egyetem, Orvos- és Gyógyszerésztudományi Diákköri Konferencia, Budapest, Hegedüs M., Fekete A.: A világűrben uralkodó viszonyok hatása a DNS-re, XXVI. Országos Tudományos Diákköri Konferencia, Orvostud. Szekció, Debrecen, Kovács G., Fekete A., Módos K., Hegedüs M., Rontó Gy., Panitz C., Lammer H.: Experiments of the effects of space environmental factors on DNA and nucleoproteins, III. European Workshop on Exo/Astrobiology, Madrid, Fekete A., Kovács G., Hegedüs M., Módos K., Rontó Gy., Lammer H., Panitz C.: DNA damage under simulated extraterrestrial conditions in bacteriophage T7, 35th Cospar Scientific Assembly, Párizs, Fekete A., Módos K., Hegedüs M., Kovács G., Rontó Gy., Lammer H., Panitz C.: The effect of simulated extraterrestrial conditions on bacteriophage and DNA thin films, 33rd European Radiation Research, Budapest, Hegedüs M., Módos K., Kovács G., Rontó Gy., Fekete A.: Világűrbeli ultraibolya sugárzás és vákuum hatása T7 baktriofág biológiai dózismérőre, VII. Ph.D. Tudományos Napok, SE Doktori Iskola, Budapest, Hegedüs M., Fekete A., Módos K., Kovács G., Rontó Gy., Lammer H., Panitz C.: Response of bacteriophage T7 biological dosimeter to dehydration and extraterrestrial solar UV radiation, 15th Humans in Space Symposium, Graz, 2005

22 15. Rontó Gy., Bérces A., Kovács G., Fekete A., Hegedüs M., Panitz C., Lammer H.: Solar UV radiation and the life on Earth and other planets, 15th Humans in Space Symposium, Graz, Hegedüs M., Módos K., Kovács G., Rontó Gy., Fekete A.: Világűrbeli ultraibolya sugárzás és vákuum hatása T7 bakteriofág biológiai dózismérőre, Magyar Biofizikai Társaság XXII. Kongresszusa, Debrecen, Hegedüs M., Fekete A., Módos K., Kovács G., Rontó Gy., Lammer H., Panitz C.: Exposure of phage T7 to simulated space environment The effect of vacuum and simulated solar UV radiation, Joint European and National Astronomy Meeting, Liége, Hegedüs M., Fekete A., Módos K., Kovács G., Rontó Gy., Lammer H. Panitz C.: Chance of nucleic acid molecules to survive the extraterrestrial UV radiation, 5th European Workshop on Astrobiology, Budapest, Hegedüs M., Módos K., Kovács G., Rontó Gy., Fekete A.: T7 fág károsodása szimulált extraterresztriális körülmények hatására, VIII. Ph.D. Tudományos Napok, SE Doktori Iskola, Budapest, 2006 ISMERETTERJESZTŐ TEVÉKENYSÉG 1. Hegedüs M.: UV-sugárzás hatása a bakteriofágokra mi történik a DNS-sel a világűrben? (ISS-EXPOSE előkísérletek kiértékelése alapján), MŰI Ifjúsági Fórum, Budapest, Hegedüs M.: Ultraibolya az űrben, Semmelweis Egyetem, 2005, 6/2, Hegedüs M.: QPCR of T7 DNA in UVC From where we come and where we go?, Science Essay and Communication Competition of the School of Ph.D. Studies, Semmelweis University and the British Council, 2005, Hegedüs M.: Mi van az ibolyán túl? Barát vagy ellenség?, Biztonságos napozás A Magyar Vöröskereszt egészségvédő programja, Budapest, Köszönetnyilvánítás

23 Szeretnék köszönetet mondani mindazoknak, akik segítségemre voltak a munkámban és a doktori dolgozat elkészítésében. Köszönöm Dr. Fekete Andreának, hogy már egyetemi hallgatói éveim alatt, tudományos diákkörösként bevezetett a laborban folyó elméleti és gyakorlati munkába. Később, a doktori képzés során témavezetőmként a közös kutatás minden részletére kiterjedő maximális segítségére számíthattam. Dr. Rontó Györgyi professzor asszonynak, programvezetőmnek köszönöm a téma iránti lelkesedését, hasznos tanácsait és mindazt az odafigyelést, amivel végigkísérte munkámat. Köszönöm Dr. Fidy Judit és Dr. Rontó Györgyi professzor asszonyoknak, hogy a Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet jelenlegi és volt igazgatóiként lehetővé tették számomra, hogy az Intézetben dolgozhassak. Köszönettel tartozom Dr. Módos Károlynak az eredmények kiértékelésében nyújtott segítségéért, Dr. Bérces Attila és Kovács Gáspár kollégáimnak, valamint német és osztrák partnereinknek a vékonyrétegekkel folytatott kísérletekért. Köszönetem fejezem ki Komárné Drabbant Mónika és Völgyi Edit asszisztenseinknek, továbbá többi munkatársamnak, akik az Intézetben folytatott kísérletek kivitelezésében segítettek.