Mycobacterium tuberculosis elleni hatóanyag-jelöltek vizsgálata egyrétegő membrán modell segítségével

Átírás

1 Tudományos Diákköri Dolgozat PÉNZES CSANÁD BOTOND Mycobacterium tuberculosis elleni hatóanyag-jelöltek vizsgálata egyrétegő membrán modell segítségével Témavezetı: dr. Kiss Éva Konzulens: Hill Katalin ELTE Kémiai Intézet, Fizikai Kémiai Tanszék Határfelületi- és Nanoszerkezetek Laboratóriuma Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2007

2 Tartalomjegyzék 1. BEVEZETÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS MYCOBACTERIUMOK MEMBRÁN MODELLEK LANGMUIR-FILMEK KITEKINTÉS A MONORÉTEG TECHNIKÁT HASZNÁLÓ KUTATÁSOK IRÁNYÁBA CÉLKITŐZÉS KÍSÉRLETI RÉSZ FELHASZNÁLT ANYAGOK (A KÍSÉRLETEINK SORÁN) MÓDSZEREK Mérések Langmuir-mérleggel Megoszlási hányados meghatározása Felületi feszültség mérés EREDMÉNYEK ÉS ÉRTELMEZÉSÜK A HATÓANYAGOK ÉS HATÓANYAG JELÖLT MOLEKULÁK FELÜLETAKTIVITÁSA A HATÓANYAG JELÖLT MOLEKULÁK OKTANOL/VÍZ RENDSZEREN VALÓ MEGOSZLÁSA LANGMUIR-MÉRLEGES MÉRÉSEK INH hatóanyag és annak konjugátuma: INH-redSer Új hatóanyag jelöltek Ligandum 3, 44, ÖSSZEGZÉS IRODALOM... 29

3 1. Bevezetés A Mycobacterium tuberculosis okozta fertızés eredményeképp leggyakrabban kialakuló gümıkór az emberiség egész történelmét végigkísérte. Biológusok a Mycobacterium DNS-ének vizsgálatával arra következtetnek, hogy a bacilus mintegy 3 millió évvel ezelıtt már létezett, valamint az ókori Egyiptomból fennmaradt múmiák között megtalálták már egykori, gümıkorban szenvedı betegekét is. [Gutierrez,2005]. A betegség terjedését a népvándorlások és az elhúzódó, nagy területre kiható háborúk is segítették, de igazi járványok csak a késı középkorban alakultak ki. A helyzet az 1920-as évekig nem javult jelentıs mértékben, amikor is bevezették a BCG (Bacille Calmette-Guerin) oltást, ami nagyfokú védettséget jelent a gyerekkori TBC ellen. A két világháborúban ennek ellenére növekedett a megbetegedések száma [Shisha,2005]. A II. Világháború után a súlyos általános gazdasági helyzet ellenére Magyarországon például komoly közegészségügyi problémaként kezelték a betegséget. Ennek eredményeként a 60-as évek végére kiépült a lakossági szőrıvizsgálati rendszer, amelynek 170 tüdıgondozó és több mint fekvıbeteg intézeti ágy képezte a gerincét. A rendszer fontos építıköve az évenkénti kötelezı szőrıvizsgálat. Ennek köszönhetıen az új betegek megközelítıleg 30 %-át a mai napig ilyen mellkasi röntgen alapján diagnosztizálják. Ennek ellenére az igazi áttörést az addig gyógyíthatatlan és mindig halálos meningitis basilaris ellen, mely a betegség egyik megjelenési formája, a streptomycin hozta. Az elsı antituberkulotikumot követte a többi, így az 50-es években megjelent az INH (isoniazid), mely a mai napig is a leghatásosabb gyógyszer. A javuló járványügyi statisztikákon felbuzdulva az országok pillanatnyi vezetıi úgy gondolták, hogy a kórt megfékezve már csak szórványos megbetegedésekre kell számítani [Pataki,2005][Hutás,1999]. Ennek ellenére a politikai, gazdasági és társadalmi változások miatt, között az új megbetegedések száma rohamosan nıtt (1. ábra) [WHO Report, 2007], és mindemellett megjelentek új, ún. multirezisztens baktériumok is. Ennek tükrében megfigyelhetı az 1. ábrán, hogy Magyarország szomszédai közül Romániában és Ukrajnában ez a növekedés a mai napig tart. A multirezisztencia sajnálatos módon kialakulhat a gyógyszeres kezeléshez való bakteriális alkalmazkodás vagy a megszakított kezelés miatt. Az elsı lehetıségét az orvosok úgy csökkentik, hogy az antituberkulotikumokat egymással kombinálva adagolják a betegeknek. Ennél fogva a baktériumnak kisebb a lehetısége adott gyógyszerhez hozzászokni és védekezı mechanizmust kialakítani. Ami ennél is fontosabb, hogy folyamatosan, 3

4 megszakítás nélkül, legalább 6 hónapig kezelés alatt álljon a páciens. Ennek biztosítására Amerikában és Nyugat-Európában megalkották a DOT-ot (directly observed therapy), vagyis a direkt ellenırzött gyógyszerszedést, amely esetében a beteg az orvos vagy a nıvér jelenlétében veszi be a gyógyszert. 1. ábra. Az évek múlása a tuberculosis-os betegek számának fıre kivetített értékének függvényében a Kárpát-medence országaiban és Ausztriában. Az Egészségügyi Világszervezet adatai szerint, a Föld lakosságának egyharmada fertızött (2. ábra) [EuroTB. 2007]. Az elırejelzéseik alapján 2000 és 2020 között világszerte közel 1 milliárd ember válik újonnan fertızötté, közülük várhatóan 200 millió egyénben ez a fertızés klinikai megbetegedéshez vezet majd. Európa helyzete sem sokkal jobb, hiszen habár az Európai Unió országaiban eleve alacsony szinten lévı megbetegedések száma lassan csökken, ám ennek a csökkenésnek a mértékét jócskán túlszárnyalva növekszik Kelet-Európában (3. ábra) [EuroTB. 2007]. 4

5 2. ábra. Bejelentett TBC-s esetek (új és visszaesı) száma lakosra nézve 3. ábra. A TBC-s esetek száma, Európa országainak különbözı csoportosítása mellett lakosra nézve 5

6 2. Irodalmi áttekintés 2.1. Mycobacteriumok A Mycobacteriumok aerob, pálcika alakú (0.4x3 µm), spórával szaporodó, csillóval nem rendelkezı baktériumok. Gram-féle festéssel nem osztályozhatók, vagyis nagy kémiai rezisztenciával rendelkeznek. Ziehl-Neelsen saválló festéssel viszont kimutathatók, hiszen a felvett festéket savas-alkoholos kezelésre sem adják le, vagyis saválló baktériumok (4. ábra). A több, mint 50 fajt számláló nemzetségben három patogén faj létezik, ezek a Mycobacterium tuberculosis (TBC), leprae (lepra) és a bovis (bél-, miliáris TBC). Gram-negatív Gram-pozitív Komplex (Saválló) Építı egységek 4. ábra. Baktériumok festéses eljárással megkülönböztetett három csoportjának membrán szerkezete A tuberculosis bakteriális támadáskor a szervezet immunválasza azzal kezdıdik, hogy a baktériumokat a tüdıben található makrofágok bekebelezik. Eközben a T-sejtek felismerik a Mycobacterium antigént és mozgósítják a mono- és limfocitákat. Ezek a kölcsönhatás helyén Langerhans óriás- és epitheloid sejtekké alakulnak át. A Mycobacterium izolálása és részleges elpusztítása közben egy kompakt szerkezető cella, a granuloma jön létre. Ezt a folyamatot sajtosodásnak nevezzük (5. ábra). A tuberkulózis terápiájában ma elsı helyen a gyógyszeres kezelés áll [Tripathi,2005]. A már említett INH és streptomycin mellett pirazinamidot is használnak. Az immunválasz megismerésével és a tervezett molekulaépítéssel lehetıség nyílt a klasszikus, empirikus úton megismert hatóanyagok módosítása. A módosítás célja, hogy a sajtosodásban résztvevı makrofágokat megcélozva a bennük lévı életképes baktériumokat elpusztítsák. A másik 6

7 lehetıség az új hatóanyagok keresése, mely módszer a baktérium sejten belüli túléléséhez elengedhetetlen enzimek gátlásán alapul [Nagy][Póder][Vértessy, 2007]. 5. ábra. A szervezet immunreakciója a Mycobacterium tuberculosis támadásakor 2.2. Membrán modellek A hatóanyagoknak több membránon át kell jutniuk ahhoz, hogy a fertızött célsejthez elérjenek, így a kutatások egyik fontos eleme az, hogy megvizsgáljuk a membrán-hatóanyag kölcsönhatást, a hatóanyag membránhoz való affinitását. A többféle membrán modell között két csoportot lehet megkülönböztetni [McRitchie]: a membrán-mimetikus modelleket és a monorétegeket. A membrán-mimetikus csoportból számunkra kiemelkedı jelentıséggel bír az, amely foszfolipid kettısrétegbıl épül fel. Ezt liposzómás rendszernek nevezzük és fontos modellje a sejteknek, a biomembránoknak. Oldott anyag transzport, hatóanyag szállítás és sejtdiffúziós vizsgálatoknál használják. A monoréteg modellek használatának elınye a határfelületi folyamatok vizsgálatában, hogy a molekulák csaknem tetszılegesen megválaszthatóak és elrendezhetıek, valamint a határfelületen általuk elfoglalt terület szabályozható. Ezáltal lehetıvé válik, hogy különbözı tulajdonságokat pontosan meghatározott, kétdimenziós koncentráció függvényében mérjünk, ilyen például a vizes fázisban oldott komponens penetrációs képessége. Monorétegő membránok a Langmuir-technikával elıállított lipid filmek [McRitchie]. A Langmuirmérlegben a levegı/víz határfelületen olyan rendszer alakul ki, mely jól definiált, monorétegő, rendezett, speciálisan irányított lipid film. Igen fontos, hogy a kapott mérési adatok alapján a membrán-hatóanyag kölcsönhatásról kvantitatív információkat kapunk. Mindemellett a rendszer nagyfokú szabadságot biztosít a mérési körülmények megválasztásában, hiszen a szubfázis összetétele, ph-ja, oldott ionjai, a kétdimenziós felületi réteg összetétele, a molekulák sőrősége szabadon változtatható. Ezeken felül lehetıség van a film szilárd hordozóra történı átvitelére (Langmuir-Blodgett technika), aminek következtében 7

8 egyéb vizsgálati módszerhez (XPS, AFM, stb.) tudunk mintát készíteni a vizsgált filmbıl. Ezek ismeretében választottuk vizsgálatainkhoz ezt a modellt [Kiss,2006] Langmuir-filmek A folyadék felszínén a monomolekulás filmréteg kétféle módon alakulhat ki. Az egyik eljárás, amikor a tömbfázisban oldott felületaktív anyag molekulái a folyadék/gáz felületen adszorbeálódnak. A másik, az un. terítéses eljárás, amikor a filmet alkotó amfipatikus molekulákat egy a szubfázissal nem elegyedı, gyorsan párolgó oldószerrel hordjuk a folyadék felszínére. Az oldat szétterülése és az oldószer elpárolgása után kialakul a monoréteg. A szubfázis, általában víz felszínén kialakított, oldhatatlan, monomolekulás, rendezett felületi filmeket nevezzük Langmuir-filmeknek. A Langmuir-filmek vizsgálatánál a kialakult monomolekulás film felületi feszültségét mérjük, aminek segítségével az oldalnyomás értékét határozhatjuk meg. π = γ 0 γ, ahol π az oldalnyomás, γ 0 a tiszta szubfázis felületi feszültsége és γ a film jelenlétében mért felületi feszültség. Az oldalnyomás közvetlen mérése az automatizált Langmuir-mérleggel végezhetı el. A mérési módszer lényege, hogy az ismert területő filmet, meghatározott sebességgel komprimáljuk, majd expandáljuk és mindeközben rögzítjük az oldalnyomás értékének változását. Mivel ismerjük a felületre juttatott molekulák számát, az oldalnyomást a molekulák által elfoglalt terület függvényében ábrázolhatjuk, mely az oldalnyomás (π ) terület ( A ) izotermát adja [Kiss,2006] Kitekintés a monoréteg technikát használó kutatások irányába A monoréteg technika az utóbbi két évtizedben igen elterjedt lett, mivel egyszerő eszköz alkalmazásával értékes információt szolgáltat a molekuláris kölcsönhatásokról [Maget-Dana, 1999]. Egyre több közlemény jelenik meg különbözı hatóanyagok, gyógyszerjelölt molekulák biológiai membránhoz való affinitásának tanulmányozásáról. Az ilyen vizsgálatok gyógyszerészeti, gyógyászati jelentısége nagy, mivel hozzájárulnak ahhoz, hogy a hatóanyag hatásmechanizmusát fel tudjuk deríteni, illetve megfelelı gyógyszerhordozó rendszereket fejleszthessünk. 8

9 A lipid molekulák víz/levegı határfelületen kialakított rendezett rétege, a Langmuirfilm a biológiai membrán legegyszerőbb modelljének tekinthetı [McRitchie][Maget- Dana,1999]. Mint ahogy a terjedelmes irodalomból kiragadott néhány példa a továbbiakban mutatja, ezzel az egyszerő, egyrétegő membránmodellel is értékes információk nyerhetıek az egyes hatóanyagok membránszerkezetére, permeábilitására gyakorolt hatásáról, a hatóanyag penetrációjáról, a lipidrétegbe való behatolás és beépülés módjáról. A keverékfilmek kvantitatív analízisébıl pedig megállapítható a lipidfilm kompresszibilitására, stabilitására gyakorolt hatás jellege. Jablonowska és munkatársai dipalmitoil-foszfatidilkolin (DPPC) monoréteg modellen ibuprofén hatóanyag koncentrációfüggı hatását vizsgálták [Jabłonowska,2007]. Megállapították, hogy a hatóanyag kis koncentrációban kondenzálja a lipidréteget; míg nagyobb koncentrációban alkalmazva a hatás ellentétes, a lipidréteg szerkezetét fellazítja, megbontja. Ezeknek a változásoknak fontos szerepe lehet a membránfunkcióban. Hasonló következtetésre jutottak Ronkart és munkatársai egy antibiotikum (azitromicin) membránnal való kölcsönhatását tanulmányozva [Fa,2006]. A molekula beépülése a lipid monorétegbe, a hidrofób láncok közé, szélesítette a fázisátmeneti tartományt, és entalpiáját lényegesen csökkentette. A membránalkotó molekulák rendezettségének és fluiditásának ilyen változása a permeabilitást növeli, ami összefüggésben van az azitromicin endocitózisra gyakorolt befolyásával. A kísérleti munkák mellett molekuladinamikai szimulációról is beszámolnak, ami szintén a rendezett lipidréteg és a hatóanyag molekula kölcsönhatásának megismerésére irányul [Pickholz,2007]. Eszerint a hatóanyag, töltésállapotától függıen a lipidréteg felszínén, vagy az alkilláncok között helyezkedett el. Az eredményekbıl számított paraméterek a lipidfilm rendezettségének csökkenésére mutattak. A Langmuir-réteges módszerben a membrán összetétele az egykomponenső lipid filmhez képest tetszılegesen módosítható, miáltal a biológiai membrán összetételét közelítı modellrendszerhez jutunk. Zhao és Feng az egyik legelterjedtebben használt rákellenes szer, a placlitaxel DPPC monoréteggel való kölcsönhatását vizsgálta, annak függvényében, hogy a lipidfilm mennyi koleszterint tartalmazott [Zhao,2006]. A Langmuir-mérleges eredményekbıl megállapították, majd AFM és FTIR vizsgálatokkal is alátámasztották, hogy a koleszterinnek kondenzáló hatása van, ami gátolja a hatóanyag behatolást, és ennek klinikai következményei vannak. Ezzel összhangban van Banerjee értékes tapasztalata, ami ugyancsak a paclitaxel membránpenetrációjára vonatkozott [Preetha,2006]. Az egészséges és rákos sejtek membránját eltérı összetételő monoréteggel modellezve arra a megállapításra jutott, hogy a hatóanyagbehatolás jelentısen kisebb a beteg sejteknek megfelelı monorétegbe, mint az 9

10 egészséges sejt lipidfilmjébe. Ezt a különbséget a membrán összetételével, a beteg sejtmembrán nagyobb koleszterin és szfingomilelin tartalmával hozta összefüggésbe. A membrán modell komponenseinek megfelelı megválasztásával a szelektív kötıdés is meghatározható. Erre példa egy gombaelleni hatóanyag hatásmechanizmusának felderítése, amelyben a toxikus, és kevésbé toxikus származékok összehasonlításában fontos információt szolgáltatott a monoréteges technika [Hąc-Wydro,2005]. Annak tanulmányozása, hogy a hatóanyag hogyan épül be a lipidfilmbe, abból a szempontól is fontos lehet, hogy megfelelı stabilitású, liposzómás gyógyszerhordozót tudjunk kialakítani. A miltefozin (rákellenes hatóanyag) orális terápiája súlyos mellékhatásokkal jár. Mivel az állatkísérletek alapján a hatóanyag liposzómás alkalmazása biztató eredményeket mutat, részletesen foglalkoztak a miltefozin, lipid, koleszterin monoréteges keverékrendszerek analízisével [Miñones Jr.,2006]. A keverékizotermák analízise segítségével megállapították azt az összetételt, amelynél a legnagyobb stabilitás várható. A gyógyszerek jobb hatásának elérése érdekében a hatóanyag molekula kémiai módosítása, illetve speciális szerepő molekulával való kapcsolása is ígéretes eljárás [Manea,2005]. Pignatello és munkatársai egy modell hatóanyagot kétféle olyan molekularészlettel kapcsoltak, amelyek várhatóan megnövelik a membránhoz való affinitását [Pignatello,2006]. A módosítás hatását monoréteges, valamint liposzómás rendszerekben, továbbá differenciál szkenning kalorimetriás módszerrel követték. A konjugátumok viselkedésének összehasonlítása azt mutatta, hogy nem egyszerően a lipofilitás növelés, hanem az amfipatikus jelleg fokozása az, ami elısegíti a membránnal való kölcsönhatást. A tüdı mőködéséhez nélkülözhetetlen, tüdı felületaktív anyagnak nevezett keverék egyik fı komponense is lipid, a DPPC. Emellett más fontos, fehérjetípusú komponenseket is tartalmaz. Ezek hatását, és a tüdıfunkciót befolyásoló, segítı és gátló mechanizmusokat részletesen tanulmányozták Perez-Gil és munkatársai [Serrano,2006]. A DPPC tüdıbeli jelenlétébıl adódik a következtetés, hogy a tuberkulózis kezelésére alkalmas hatóanyagot DPPC-s liposzómás gyógyszerhordozóval célszerő a szervezetbe juttatni. Ehhez végezett monoréteges modell kísérleteket Banerjee és munkatársa a monorétegek dinamikus vizsgálatával [Chimote,2005]. A DPPC INH hatóanyaggal kevert monorétegeit olyan sebességgel komprimálták, amely a tüdımőködés során tapasztalható. Megállapították, hogy az INH, valamint rifampicin és etánbutol hatóanyagok olyan módon változtatják a lipid film dinamikus paramétereit, ami hasznosítható lehet a liposzómás tuberkulózis terápiában. 10

11 3. Célkitőzés A statisztikákat megfigyelve látszik, hogy milyen fontos egy ilyen, jelen pillanatban nehezen gyógyítható, rohamosan terjedı fertızı betegséget jobban megismerni és az ismereteinket arra fordítani, hogy gyorsabban és hatékonyabban tudjunk reagálni a baktérium szervezetre mért támadására. A baktérium elpusztításához szükséges gyógyszerek hatóanyag molekuláinak a szervezetben több sejtmembránon kell átjutniuk, hogy kifejtsék a hatásukat. Ennek a szervezetben történı, célzott mozgásnak a lehetı legjobb hatékonysággal kell lezajlania, hiszen ez jelentısen befolyásolhatja azt, hogy milyen mennyiségben kell alkalmazni a hatóanyagot. Így a szervezetre mért terhelés csökkenthetı lehet. Ezért célomul tőztem ki a Mycobacterium tuberculosis elleni hatóanyag-jelöltek membránhoz való affinitásának vizsgálatát. Ehhez olyan membrán modell kiválasztása szükséges, mely egyszerő és lehetıvé teszi a molekuláris kölcsönhatások vizsgálatát. Ez az egyrétegő membránmodell, mely a valódi sejtmembrán fı alkotó részébıl, lipidbıl álló, egyetlen, rendezett molekularéteg. Ez víz/levegı határfelületen, Langmuir-mérlegben alakítható ki. A vizsgálatok, a molekulák tulajdonságaihoz mérten két csoportba oszthatóak. Így az elsı esetben a keverék izoterma meghatározása, második esetben lipidfilmbe való penetráció mérése lehet a kérdéseim megválaszolásához szükséges mérési technika. Kiegészítı mérésként célom a hatóanyag-jelölt molekula felületi és polaritási tulajdonságaik jellemzése. A vízben jól oldodó hatóanyag molekulák felületaktivitását felületi feszültség méréssel szeretném meghatározni, míg a polaritás jellemzésére a gyógyszerhatóanyagok esetében alapvetı paramétert, az oktanol/víz megoszlási hányadost kívánom használni. Az így kapott eredmények segítséget jelenthetnek a hatóanyagjelölt molekulák összehasonlításában, annak megítélésben, hogy az egyes hatóanyagok, hatóanyagkonjugátumok és hatóanyag-jelöltek milyen affinitással rendelkeznek a membrán felületéhez való kötıdés, illetve a membránba való behatolás tekintetében. Ez szelekciós lehetıséget kínál a további vizsgálatokhoz. 11

12 4. Kísérleti rész 4.1. Felhasznált anyagok (a kísérleteink során) a lipid membrán kialakításához disztearoil- és dipalmitoil-foszfatidilkolin 85:15-os keveréke (Phospholipon, Nattermann GmBH) vizsgált hatóanyagaink izoniazid (INH) és ennek peptiddel alkotott konjugátuma (INH-redSer), valamint három újonnan azonosított bakteriális enzimgátló vegyület Ligandum3, 44 és 69-es jelő terítıoldatként kloroform (Fisher Scientific)/metanol (Reanal) 3:1 arányú szennyezıdés mentes elegye Lipofilitás vizsgálathoz oktanol (a.r., Reanal) szubfázisként bidesztvíz, melynek felületi feszültségét (71,8 mn/m, 23 C) minden mérés elıtt ellenıriztem 4.2. Módszerek Mérések Langmuir-mérleggel A Langmuir-mérleges mérések elsı típusa (I.) a keverék-filmek izotermáinak meghatározása (6.ábra) A másik mérésben (II.) a vízben oldott komponens penetrációját határoztuk meg (7.ábra). Ezeket a méréseket két, különálló Wilhelmy-lemezes ( ±0,05 mn/m pontosságú) felületi feszültségmérıvel felszerelt, automatizált Langmuir-mérleggel végeztük, 23,0 ± 0,5 C-os hımérsékleti intervallumban. Wilhelmy-lemez elektromérleg 1 mozgó gát elektromérleg Wilhelmy-lemez víz 6. ábra. A Langmuir-mérleg sematikus ábrája és az izoterma felvételéhez szükséges mérési elrendezés. Az 1. jelzéső fecskendıbıl tiszta lipid-, tiszta hatóanyag-, vagy keverék-oldat került a szubfázis felszínére. 12

13 A megfelelı monoréteg kialakításához a kísérletek során a lipidnek és a keverék oldatoknak (c lipid = 0,1 g/l) két különbözı mennyiségét alkalmaztuk (V = 30 és 50 µl) a terítési eljárás során. A keverék oldatok esetén 5:1 volt a lipid/hatóanyag mólaránya. Ennél a módszernél (I. mérés) Hamilton mikrofecskendıvel cseppenként juttattuk a vizsgált anyag kloroformos oldatát a szubfázis felszínére. Az oldószer elpárolgására 5 percet hagytunk, mely után a gát mozgatásával felvettük az izotermát. Minden mérésnél háromszor ismételtük meg a komprimálási/expandálási ciklust, állandó sebességgel mozgó gáttal, majd nagyobb sebességgel vettük fel a 4. és az 5. izotermát. A kezdeti kb. 104 cm 2 -es felületi réteget 1-3. izoterma felvétele során 1000 relatív sebességgel (25,60 cm 2 /min), míg a 4-5. izoterma esetén 2900 relatív sebességgel (88,03 cm 2 /min) mozgatott gáttal, teljes komprimáció esetén kb. 21 cm 2 -ig nyomtuk össze, majd a komprimációhoz használt sebességgel hagytuk a filmet expandálni. A molekulák filmen belüli legkedvezıbb elhelyezkedésének lehetıséget biztosítva, az elsı izotermát nem használtuk a kiértékelés során, mert azt a molekulák elırendezéseként hajtottuk végre. Ezt a lépést nemcsak az izotermák felvételénél, hanem más mérések elıtt is el kellett végezni. A penetrációs vizsgálatok (II. mérés) során az elkészített, adott felületi koncentrációjú és irányított elhelyezkedéső molekulákból felépülı lipid filmet készítünk. Ezt az I. mérési típusnál látott módon tesszük, annyi különbséggel, hogy a második kompressziós/ expanziós ciklus során a kívánt oldalnyomás értéknél megállítjuk a gát mozgását. Ezután a szubfázisba injektáljuk a hatóanyag-jelölt vizes oldatát ( c = 80µ M, V = 2ml ). Az így kialakult szubfázisbeli koncentráció 2 µ M. Wilhelmy-lemez elektromérleg 1 elektromérleg Wilhelmy-lemez mozgó gát 2 víz hatóanyag drug 7. ábra. A Langmuir-mérleg sematikus ábrája és a penetráció vizsgálathoz szükséges mérési elrendezés. Az 1. jelzéső fecskendıbıl a lipid kloroformos oldata került a szubfázis felszínére, míg a 2. jelzéső fecskendıbıl a hatóanyag vizes oldatát juttattuk a szubfázisba. 13

14 A penetráció meghatározásához 1 órán keresztül győjtöttem az adatokat, majd ennek a folyamatnak a végén a gátat, a komprimáláskor használt sebességgel, de azzal ellentétes irányba mozgatva, expandáltattam a filmet. Az eredményeimet, az izotermák és penetrációs vizsgálatok, többször reprodukált adatsoraiból állítottam össze Megoszlási hányados meghatározása A hatóanyagok lipofilitásának jellemzése céljából megmértem a megoszlási hányadosukat, hiszen a gyógyszerek szervezetbeli sorsát (felszívódását, eloszlását, raktározódását stb.) alapvetıen meghatározó lipofilitás számszerő jellemzésére a gyógyszerkémiában az oktanol/víz rendszerre vonatkozó megoszlási hányados logaritmusa (log P) használatos [Novák, 2005]. Ez az oldószerrendszer a biológiai megoszlás jó prediktorának bizonyult, mert az oktanol amfifil jellegénél fogva valamelyest modellezni képes a gyógyszer és a membrán lipid kettıs rétegével és a fehérjéivel létrejövı kölcsönhatásokat. A nernsti definíció szerint a valódi megoszlási hányados (log P) a mindkét megosztó fázisban azonos molekuláris állapotban lévı (nemionizált, monomer) részecske koncentráció arányát fejezi ki. Mivel a mi hatóanyagaink ilyenek, így [ hatóanyag] O [ hatóanyag] V P =, így a lipofilitás = log P. A méréseimet a referenciaként használt rázótölcséres módszerrel végeztem el [Leo, 1971]. Az elıkészületek során 12 órán keresztül rázógépen rázattam az azonos térfogatú oktanolból és vízbıl álló rendszert, majd a beálló egyensúly után elválasztottam a fázisokat. Ezek után elkészítettem az oktanollal telített vízbıl és a hatóanyagból a kalibrációs görbe felvételéhez szükséges megfelelı koncentrációjú oldatokat és azonos térfogatú, vízzel telített oktanolt mértem hozzá. Ezután 25 C-on, 1 órán keresztül rázógépben rázattam. Az idı elteltével a fázisokat szétválasztottam, majd spektrofotométerrel [Spektromom 195, MOM, Budapest] felvettem elıször egy teljes spektrumot, majd a többi koncentráció esetében a kiválasztott csúcs(ok) környezetében mértem az extinkciót. A kalibrációs görbe felhasználásával kiválasztottam azt a koncentráció tartományt, mely elegendıen nagy ahhoz, hogy a megoszlás utáni értéket is detektálni tudjam. Az oldat elkészítés, majd vízzel telített oktanollal való összemérés után azonos körülmények között elvégeztem a rázatást, elválasztást és a spektrofotometriás mérést. 14

15 Felületi feszültség mérés A vizes hatóanyag és hatóanyag-jelölt oldatok felületi feszültségét tengelyszimmetrikus csepp-profil analízissel, OCA 15+ készülék használatával (Dataphysics, Germany), 0,1 mn m pontossággal határoztuk meg. Minden mérést háromszor hajtottunk végre minden adott anyagon, 23± 0, 1 C -on. A felületi feszültség értékeit kevesebb, mint ± 0,5mN * m szórással reprodukáltuk. A kapilláris felszín profilját a függıcsepp alakjának analízisével kaptuk CCD kamera és hozzákapcsolt videokép-profil digitalizáló segítségével, ami PC-hez kapcsolódik (8.ábra). A vizes oldat cseppjét egy Hamilton fecskendı PTFEbevonatú tőjének hegyén alakítottuk ki, 2 µ l s sebességgel. A tő hegye és a függıcsepp vízgızzel telített üvegküvettába nyúlt. A méréseket elvégeztük. 2 µ M és 80µ M -os koncentráción is 8. Ábra. OCA 15+ készülék összeállítása 15

16 5. Eredmények és értelmezésük 5.1. A hatóanyagok és hatóanyag jelölt molekulák felületaktivitása A vizsgált hatóanyagok közül az INH, a ligandum 3 és ligandum 44 vizes oldatának felületi feszültségét a függıcsepp-profil meghatározására alapuló módszerrel végeztük. A koncentrációt az adott vegyület vízoldhatósága, valamint az szabta meg, hogy milyen koncentrációnál tudtunk penetrációs mérést végezni a Langmuir-mérlegben. Ezek alapján a megfelelı koncentrációjú vizes oldatok statikus felületi feszültségét mértük. Ebben a koncentráció tartományban egyik komponens sem mutatott a kétszer desztillált vízétıl eltérı felületi feszültséget, tehát az adott kísérleti módszerrel nem kaptunk észlelhetı felületaktivitást sem az INH-ra, sem a két ligandumra. Így e mérés alapján nem tudtunk következtetni a polaritásukra, a víz/levegı határfelületen való adszorpciójuk mértékére A hatóanyag jelölt molekulák oktanol/víz rendszeren való megoszlása A három ligandum molekula UV és látható hullámhossz tartományba esı spektrumát a 9., 10., 11. ábrák mutatják. Az ábrákon megjelöltük a méréshez használt hullámhosszakat is. Abszorbancia 1,50 1,25 1, µm Ligand 44 spektrum Abszrbancia max = 1,38 Hullámhossz = 398 nm 0,75 0,50 0,25 0, λ / nm 9. ábra. Ligandum 44 spektruma 16

17 Abszorbancia 2,25 2,00 1,75 1,50 1,25 1, µm Ligand 3 spektrum Abszorbancia max1 = 2,10 Hullámhossz 1 = 227 nm Abszorbancia max2 = 0,578 Hullámhossz 2 = 275 nm 0,75 0,50 0,25 0, λ / nm 10. ábra. Ligandum 3 spektruma Abszorbancia 0,30 0,25 0,20 100µM Ligand 69 spektrum Abszorbancia max = 0,279 Hullámhossz = 352 nm 0,15 0,10 0,05 0, λ / nm 11. ábra. Ligandum 69 spektruma Ligandum 44 Ligandum 3 Ligandum 69 Számított logp 2,10 3,20 - Mért logp 0,94 ± 0,05 0,89 ± 0,05 0,61 ± 0,05 1. táblázat. A három ligandum molekulának a számított és mért logp értéke 17

18 A lipofilitás jellemzésére szolgáló logp-re a mért adatok alapján, a Ligandum vegyületek sorrendjét fel tudjuk állítani, melyet a 1. táblázat foglal össze. A táblázat tartalmazza a három ligandumra meghatározott megoszlási hányadosok logaritmusának értékét, valamint két vegyültre a számított logp értékeket is [Irwin, 2005]. A ligandumok membránnal való kölcsönhatásának értelmezéséhez az általunk mért kísérleti értékeket használtuk, mivel a számított értékeknek éppen az adott tartományban nagy, ±1,5 egység a bizonytalansága [ZINC] Langmuir-mérleges mérések INH hatóanyag és annak konjugátuma: INH-redSer A Langmuir-mérleges mérések eredményeinek kiértékelését kezdjük az izoterma vizsgálattal! Ennél a mérési típusnál az adott, tiszta vagy keverék anyag felületi monorétege által létrehozott oldalnyomás növekedést mérjük, miközben a felületi sőrőséget növeljük, majd ugyanolyan sebességgel csökkentjük. π / mn*m INH red-ser 2,3,5. Izoterma V=30 µl, c=0,1 mg/ml, RelSeb=1000, 2900, T=23,5 C 2. izoterma π(1) max = 8,306 mn/m Helyigény: 362,27 Å 2 3. izoterma π(1) max = 7,461 mn/m Helyigény: 342,12 Å 2 5. izoterma π(1) max = 6,338 mn/m Helyigény: 318,70 Å A / (Å 2 /molekula) 12. ábra. INH-redSer izotermái, c = 0,1 mg/ml, V = 30 µl terítı oldatot használva 18

19 π / mn*m INH red-ser 2,3,5. Izoterma V=50 µl, c=0,1 mg/ml, RelSeb=1000, 2900, T=23,5 C 2. izoterma π(1) max = 13,654 mn/m Helyigény: 333,94 Å 2 3. izoterma π(1) max = 13,351 mn/m Helyigény: 315,88 Å 2 5. izoterma π(1) max = 14,775 mn/m Helyigény: 239,53 Å A / (Å 2 /molekula) 13. ábra. INH-redSer izotermái, c = 0,1 mg/ml, V = 50 µl terítı oldatot használva A 12. és 13. ábra az INH-redSer izotermáit tünteti fel. Látható, hogy egy stabil, terített, felületi film hozható létre, mely többszöri komprimációs/expanziós ciklus hatására sem változik meg jelentısen. π / mn*m INH red-ser + phospholipon 2,3,5. Izoterma V=30 µl, c=0,1 mg/ml, RelSeb=1000, 2900, T=23,5 C 2. izoterma π(1) max = 27,625 mn/m Helyigény: 134,95 Å 2 3. izoterma π(1) max = 29,558 mn/m Helyigény: 126,87 Å 2 5. izoterma π(1) max = 28,958 mn/m Helyigény: 128,29 Å A / (Å 2 /molekula) 14. ábra. Lipid + INH-redSer keverék izotermái, c = 0,1 mg/ml, V = 30 µl terítı oldatot használva 19

20 π / mn*m INH red-ser + phospholipon 2,3,5. Izoterma V=50 µl, c=0,1 mg/ml, RelSeb=1000, 2900, T=23,5 C 2. izoterma π(1) max = 49,262 mn/m Helyigény: 100,44 Å 2 3. izoterma π(1) max = 48,300 mn/m Helyigény: 92,47 Å 2 5. izoterma π(1) max = 45,226 mn/m Helyigény: 89,23 Å A / (Å 2 /molekula) 15. ábra. Lipid + INH-redSer keverékfilm izotermái, c = 0,1 mg/ml, V = 50 µl terítı oldatot használva A 14. és a 15. ábra a lipid + INH-redSer keverékfilm izotermáit tünteti fel. A keverékfilm izotermája azt mutatja, hogy a lipid mellett az INH-redSer is jelen van a felületi rétegben. Az izotermák a komprimációs/expanziós ciklus ismétlésekor kis mértékben tolódnak az oldalnyomás tengely felé, ami a lipidbe adagolt hatóanyag komponensnek a filmbıl való részleges kiszorulása okoz, illetve a nagyobb peptidláncot tartalmazó molekula esetén a konformáció változásával is magyarázható. Az izotermák összehasonlításával megfigyelhetjük, hogy az azonos körülmények között nagyobb komprimációs sebességnek nincs jelentıs hatása. A 16. ábra a lipid film, lipid + INH, lipid + INH-redSer keverékfilmek izotermáit tünteti fel. A három izoterma összevetésekor megállapíthatjuk, hogy az izotermák eltolódnak az egy molekulára esı nagyobb területigény irányába, valamint az INH-redSer izotermájának a jellege is megváltozott, hiszen megjelenik egy plató szakasz is. Ezek az eredmények azt támasztják alá, hogy a lipiddel együtt terített hatóanyag a lipid molekulákkal való kölcsönhatás következtében a lipidrétegben marad. Még a többszöri komprimálás során sem szorul ki a rétegbıl. 20

21 π / mn*m Lipid, INH és INH-redSer keverékfilmek 2.izotermái V=30 µl, c=0,1 mg/ml, RelSeb=1000 T=23,5 C lipid lipid+inh lipid+inh-red-ser A / (Å 2 /molekula) 16. ábra. Lipid és a keverék izotermák komprimációs szakaszának összehasonlítása 30 µl felvitele esetén. A lipid + hatóanyag keverékfilmek esetén, hogyha önálló izotermájukat is meg tudjuk határozni, akkor megvizsgálhatjuk a hatóanyag keveredését vagy kompatibilitását a lipidfilmen. Egy egyszerő, kétkomponenső keverékfilmben, adott oldalnyomáson, ideális esetben a monomerek által elfoglalt átlagos terület ( A id = A x +, 1 1 A2 x2 A id ) az alábbi összefüggéssel adható meg: ahol x 1 és x 2 a monomerek móltörtjei a keverékben, A 1 és A 2 pedig a monomerek átlagos helyigénye a tiszta filmekben. Az izoterma felvétele során két lehetséges állapot jöhet létre a hatóanyag és a lipid kölcsönhatásától függıen. Ha a lipid izoterma és a keverék oldat izotermája egybeesik, akkor a vizsgált anyag nem épült be a filmbe, vagy ideális keveréket hoztak létre, vagyis a monomerek aktuálisan elfoglalt átlagos terület ( A 12 ) meg fog egyezni az ideális esetre számolt ( A id ) értékkel. Ha különbözik, a lipid és a hatóanyag közösen alkotják a felületi filmet. Ekkor a komponensek között fellépı intermolekuláris kölcsönhatásnak köszönhetıen az ideális helyigénytıl el fog térni a kísérletileg meghatározott ( A= A Aid 12 ) (17.ábra). 21

22 π / mn*m lipid+inh-redser keverék film additivitás görbéi mért adatok (keverékfilm) számolt adatok, ideális eset A / (Å 2 /molekula) 17. ábra. Additivitás ábrázolása INH-redSer hatóanyag esetén A 17. ábra a lipid + INH-redSer keverékfilm számolt, illetve mért additivitási görbéit tünteti fel. Mivel a mért érték széles tartományban kisebb az ideális esetre számoltnál, a molekuláris keveredés igazolt, és a molekulák közötti vonzó kölcsönhatásra következtethetünk, vagyis az INH-redSer kompatibilis a lipid molekulákkal. A Langmuir-mérleges mérések eredményeinek kiértékelését folytassuk a penetráció vizsgálattal! Ennél a mérési típusnál az INH és az INH-redSer hatóanyag molekuláinak adott felületi sőrőségő lipidfilmbe történı beépülését mérjük. A penetrációs görbék az idı függvényében azt az oldalnyomás változást ábrázolják, amely a lipidfilmhez kötıdı vagy abba behatoló hatóanyagnak a többleteként mérhetı. 22

23 π / mn*m -1 5,5 INH és konjugátuma - penetráció 1. 5,0 4,5 4,0 3,5 INH-redSer INH 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, t / sec 18. ábra. INH és INH-redSer penetrációja π = 15mN m oldalnyomású lipid-filmbe π / mn*m -1 5,5 INH és konjugátuma - penetráció 2. 5,0 4,5 4,0 INH-redSer INH 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, t / sec 19. ábra. INH és INH-redSer penetrációja π = 20mN m oldalnyomású lipid-filmbe A 18. és a 19. ábra a hatóanyagok különbözı felületi sőrőségő lipidfilmbe való beépülését tüntetik fel. A természetes membránok oldalnyomása π = 20mN m érték körüliek [Preetha,2006], ezért kétféle oldalnyomású lipidfilmbe való hatóanyag beépülést 23

24 vizsgáltunk. Az egyik a π = 20mN m, a másik az ennél kisebb, π = 15mN m oldalnyomású lipid film felhasználásával készült mérés sorozat. Az ábrák alapján megállapíthatjuk, hogy penetrációt a hatóanyag-konjugátum esetén tapasztaltunk, mely olyan nagy mértékő beépülést mutat a lipid filmbe, hogy a vizsgált idıtartam alatt folyamatosan növekedett. INH-redSer π = 15mN m π = 20mN m π max 4,9 2,5 2. Táblázat. A hatóanyag-konjugátum kétféle oldalnyomású lipid filmbe való beépülésekor kialakuló oldalnyomáskülönbség maximumok Mivel az INH esetén egyáltalán nem tapasztaltunk penetrációt, így megállapítható, hogy a konjugálás növelte az INH membrán affinitását Új hatóanyag jelöltek Ligandum 3, 44, 69 Az INH hatóanyag és annak konjugátumának vizsgálatánál megismert módon a ligandum vegyületekkel is elvégeztük a penetrációs vizsgálatot. π / mn*m -1 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 Ligand vegyületek - penetrációja 1. Ligand 44 Ligand 3 Ligand 69 0, t / sec 20. ábra. A ligandum vegyületek penetrációja π = 15mN m oldalnyomású lipid filmen 24

25 π / mn*m -1 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 Ligand vegyületek - penetrációja 2. Ligand 44 Ligand 3 Ligand 69 0, t / sec 21. ábra. A ligandum vegyületek penetrációja π = 20mN m oldalnyomású lipid filmen A 20. és a 21. ábra a ligandum vegyületek penetrációját tüntetik fel π = 15mN m és π = 20mN m oldalnyomású lipidfilmen. A penetrációs görbék megvizsgálása során láthatjuk, hogy szignifikáns, stabil beépülésnek lehetünk tanúi. Érdemes megfigyelni a görbéken a kb 300. másodperc környékén lévı maximumot, ami az injektálásnak, a mérési adatokban megfelelı jele. Ekkor ugyanis nagy koncentráció gradiens lép fel a szubfázisban, ami nyilvánvalóan a határfelületet is érinti. Viszont a koncentráció kiegyenlítıdés közben ez a csúcs csökken, majd beáll a valódi penetrációs értékre. A lipid film tömörségének jelentıs befolyása van a szubfázisból történı beépülésre. Ennek táblázatos összefoglalóját a 3. táblázatban tüntettük fel. Ligandum 44 Ligandum3 Ligandum69 π max 4,9 3,6 0,5 π stab 2,9 3,1 0,1 3. táblázat. A ligandum vegyületek π = 15mN m oldalnyomású lipidfilmbe való beépülésekor kialakuló oldalnyomáskülönbség maximumok és a kialakuló stabil értékek 25

26 Ligandum 44 Ligandum3 Ligandum69 π max 2,5 1,2 0,3 π közép 2,0 0,1 0,0 4. táblázat. A ligandum vegyületek π = 20mN m oldalnyomású lipidfilmbe való beépülésekor kialakuló oldalnyomáskülönbség maximumok és a kialakuló stabil értékek 26

27 6. Összegzés Munkánkban a Mycobacterium tuberculosis elleni hatóanyag, hatóanyag-konjugátum és hatóanyag-jelölt molekulák membránhoz való affinitását vizsgáltuk. Célunk az volt, hogy információt nyerjünk az INH és konjugátuma, valamint az új hatóanyag-jelölt molekulák membránba épülésérıl, melyhez egyrétegő membrán modellt használtunk. Langmuir-mérleg segítségével a membránalkotó lipidbıl, valamint a hatóanyagkonjugátumból keverékfilmet hoztunk létre víz/levegı felületen, valamint a hatóanyag-jelölt molekulák penetrációs vizsgálatait végeztük el. Vizsgáltuk a keverékfilmek esetében az oldalnyomás-terület izotermákat a tiszta komponensekéhez képest, valamint a penetrációs vizsgálatok esetében az oldalnyomás-idı izotermákat. Elemzésükbıl megállapítottuk, hogy a hatóanyagok beépülnek a lipidrétegbe (kivéve a Ligandum 69), kompatibilisek a lipiddel, mivel molekuláris keveréket képeznek. Kiegészítı mérésként a hatóanyag-jelölt molekulák statikus felületi feszültségét függıcsepp-profil analízissel tanulmányoztuk polaritásuknak jellemzése érdekében. Mivel ezzel a kísérleti módszerrel nem mértünk észlelhetı felületaktivitást, nem tudtunk következtetni a víz/levegı határfelületen való adszorpciójuk mértékére. Meghatároztuk a hatóanyag-jelölt molekulák oktanol/víz rendszerben való megoszlását. Ennek a módszernek az eredményei összhangban vannak a penetrációs kísérletek eredményeivel. A hatóanyag-konjugátum és a három gyógyszerjelölt közül kettınek a lipiddel való kedvezı kölcsönhatása arra utal, hogy affinitását mutatnak a membránhoz, valószínősítve a membránon való áthatolást, ami kívánatos a fokozott hatóanyagtranszport szempontjából. 27

28 Köszönetnyilvánítás Köszönöm a kutatási lehetıséget az ELTE TTK Fizikai Kémiai Tanszékének. Köszönetemet szeretném kinyilvánítani témavezetımnek, Dr. Kiss Éva egyetemi docensnek és Hill Katalin PhD hallgatónak az érdekes és újszerő kutatási téma kijelöléséért, a munkám figyelemmel kíséréséért és támogatásáért. Szeretném megköszönni Bısze Szilvia tudományos fımunkatársnak és Horváti Kata PhD hallgatónak, tudományos segédmunkatársnak az együttmőködés lehetıségét és a munkánkhoz szükséges kísérleti anyagok biztosítását. Végezetül köszönöm Hórvölgyi Zoltánnénak a kísérletek során nyújtott segítségét. 28

29 7. Irodalom 1. G. Chimote, R. Banerjee: Respiratory Physiology & Neurobiology 2005, 145, E. Jabłonowska, R. Bilewicz: Thin Solid Films 2007, 515, N. Fa, S. Ronkart, A. Schanck, M. Deleu, A. Gaigneaux, E. Goormaghtigh, M.-P. Mingeot-Leclercq: Chemistry and Physics of Lipids 2006, 144, Global tuberculosis control WHO Report MC. Gutierrez, S. Brisse, R. Brosch, M. Fabre, B. Omais, M. Marmiesse, P. Supply, V. Vincent: PLoS Pathog, 2005, 1(1), K. Hąc-Wydro, P. Dynarowicz-Łątka, J. Grzybowska, E. Borowski: Biophysical Chemistry 2005, 116, I. Hutás: Hippocrates, 1999, 1, J. J. Irwin, B. K. Shoichet: J. Chem. Inf. Model. 2005, 45, É. Kiss: A kémia újabb eredményei 95, Akadémiai Kiadó, Budapest, 2006, A. Leo, C. Hansch, D. Elkins: Chem. Rev. 1971, 71, F. MacRitchie: Chemistry at Interfaces, Academic Press, San Diego, 1990, M. Manea, F. Hudecz, M. Przybylski, G. Mezı: Bioconjugate Chem., 2005, 16 (4), J. Miñones Jr., I. Rey. Gómez-Serranillos, O. Conde, P. Dynarowicz-Łątka, J. Miñones Trillo: Journal of Colloid and Interface Science 2006, 301, K. Nagy: Mycobaktériumok Nocardia Actinomyces G. Pataki: Hippocrates, 2005, 1, M. Pickholz, O. N. Oliveira Jr., M. S. Skaf: Biophysical Chemistry 2007, 125, R. Pignatello, S. Guccione, F. Castelli, M. G. Sarpietro, L. Giurato, M. Lombardo, G. Puglisi, I. Toth: International Journal of Pharmaceutics 2006, 310, A. Preetha, N. Huilgol, R. Banerjee: Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 2006, 53, Gy. Póder: Pneumóniák gyermekkorban R. Maget-Dana: Biochimica et Biophysica Acta 1999, 1462, Report on tuberculosis cases notified in EuroTB A. G. Serrano, J. Pérez-Gil: Chemistry and Physics of Lipids 2006, 141(1-2),

30 23. T. Shisha, K. Köllı, S. Kiss, Gy. Szıke: Osteologiai Közlemények, 2005, 4, K. Takácsné Novák, G. Völgyi: Magyar Kémiai Folyóirat, 2005, 4, R. P. Tripathi, N. Tewari, N. Dwivedi, V. K. Tiwari: Medicinal Resarch Reviews, 2005, 25(1), B. Vértessy, B. Varga, Z. Szabadka, V. Grolmusz: A scrin-silico projekt: Mycobacterium tuberculosis elleni ígéretes új gyógyszerjelölt molekulák azonosítása nem-konvencionális multidiszciplináris protokoll útján Az MTA Peptidkémiai Munkabizottságának tudományos ülése Balatonszemes június L. Zhao, S. Feng: Journal of Colloid and Interface Science 2006, 300, ZINC database: 30