Állatkísérletek Elmélete és Gyakorlata- B szint

Átírás

1 Szegedi Tudományegyetem ÁOK Sebészeti Műtéttani Intézet december 06-december 15. Referencia szám: AA1.0/2015; AB1.0/2015 Állatkísérletek Elmélete és Gyakorlata- B szint Core modul 3.1/3 A zebrahalak jelentősége a kutatásban. Szabó Emília Rita ELI, Sugárbiológiai Kutató csoport I. szemeszter

2 A zebradánió (Danio rerio) mint modellállat a kutatásban világszerte népszerű modell fajjá vált az orvos biológiai, toxikológiai, genetikai és tumorbiológiai kutatásokban Humán betegségek állati szervezeten történő modellezése első klónozott fajok közé tartozik kísérleti célból az űrbe is felvittek figyelemre méltó a regeneratív képességük génmódosítás, transzgenikus vonalak teljes genomja ismert

3 az embriók használata kap egyre nagyobb figyelmet, mivel azok helyettesítő módszerként tekinthetők az állatkísérletekben a sejtvonalakkal végzett kísérletek egy adott sejttípusra vonatkoznak, és hiányzik a komplex organizmus sejt-közötti állománya, illetve a különböző szövetek, egymásra-hatásából, a szervek működéséből származó hatás több végpont vizsgálata 2010/63 / EU európai parlamenti és tanácsi irányelv szerint: a korai élet-szakaszban a Zebradánió nem tartozik a védett kategóriába míg elúszásra (úszóhólyag levegővel még nem telítődik) és önálló táplálkozásra képtelenek (5 nap a megtermékenyítés után)

4 A Zebradánió mint kutatási modell, népszerűsítése az as évben kezdődött, amikor Streisinger György és kollégái, az oregoni Egyetem munkatársai felismertek és közzétettek számos olyan tulajdonságát, melyek alapján e szervezet hatalmas potenciális lehetőségeket, nyújt a fejlődésbiológiai és genetikai kutatásokban ezt követően a zebrahal modellt, szinte minden tudományág széleskörűen alkalmazza biológiai és orvos-biológiai kutatásokban való alkalmazása kimagaslóan megnövekedett, nagyobb népszerűségnek örvend, mint bármely más gerinces modell

5 a muslicákhoz és férgekhez hasonlóan egy újabb egyszerű modell szervezet, viszont ellentétben velük gerinces faj. van gerincük, agy és gerincvelő, valamint számos más szervekkel rendelkeznek, beleértve a szív, a máj és a hasnyálmirigy, a vesék, a csontok és a porcok, ezáltal jobban hasonlítanak az emberekre, és alkalmasabbak a perklinikai kutatásokra.

6 Zebradánió előnyei és hátrányai az egérrel szemben

7 Származása, elterjedése Rend: Pontyalakúak (Cypriniformes) Család: Pontyfélék (Cyprinidae) Alcsalád: Danioninae trópusi, édesvízi hal Indiában őshonos: Banglades, Nepál, Burma, Gangesz régió Patakok, csatornák, árkok, tavak és lassan mozgó, állóvizek, rizsföldek Nem: Danio Faj: Danio rerio The natural habitat of the zebrafish Photo credit: R. Spence, University of St Andrews

8 Megjelenése, felépítése négy egységes, pigmentált, horizontális, kék csíkok megléte oldalán, a test egész hosszán végighúzódnak és kiterjednek a farok úszó végéig hím nőstény karcsú, arany (narancssárga) csíkokkal a kék csíkok között nagyobb, fehéres hassal rajtuk ezüst csíkok figyelhetők meg, teltebb, színei kevésbé élénkek

9 Általános jellemzői a teljesen kifejlett egyed 6 cm hosszúságura nőhet, élettartamuk mintegy 2-3 év, viszont ennek ellenére, ideális körülmények között való tartásuk során életkoruk kiterjedhet 5 évre az ivarérettkor elérésének hozzávetőleges ideje három hónap a hát olajbarna, az oldalak és a has alapszíne sárgásfehér törzsén a kopoltyúfedőtől a farokúszó végéig, négy sötét acélkék csík húzódik a hátuszó alapszíne sárgás barna, kék szegéllyel, valamint kívül fehérrel szegélyezett. A kopoltyúfedő kék-fehér foltokkal farok és a has úszói fátyolszerűen megnyúlhatnak, melyek akár a testhossz egyharmadát is kitehetik

10 Előnyei kis méret: embriók ~ 1 mm, kifejlett egyedek ~ 6 cm könnyen tenyészthetőek laboratóriumban gyors fejlődés, bőséges szaporodás embriók, korai felnőtt egyedek optikailag átlátszóak számos kulcsfontosságú génnel rendelkeznek, génállományuk feltűnően hasonlít az emberi génállományra- 70% embriógenezis genetikai manipuláció

11 Mikroinjektálás

12 a fluorescens festéket termelő transzgénikus (ér és idegjelölt) típusok is ígéretesnek bizonyulnak, esetükben is könnyen detektálható egyes szervek fejlődése tumor endothelsejtek zölddel jelölve, eritrociták pirossal jelölve konfokális mikroszkóp felvétel

13 Genetikai manipulációk eredményeként egy fluoreszkáló fajtát (úgynevezett Glofish) is létrehoztak Specifikus gén kiütéssel létrehozták a transzparens ( nem csíkos) változatát is a zebradániónak, az úgynevezett Casper halat, (nevét a rajzfilmben szereplő szellem után kapta), ami megkönnyítette a tumorok viselkedésének, növekedésének napi megfigyelését, a testük teljes átlátszósága miatt.

14 Laboratóriumi tartásuk csoportos hal 20 literes akváriumokban legfeljebb 25 egyed tartható hőmérséklet a víz optimális hőmérséklete 28,5 ºC lehet, ha meghaladja ezt az értéket pl. 31 ºC, illetve 25 ºC alá csökken szaporodási zavarok állnak be kísérlet eredményessége melegebb hőmérsékleten nagyobb a betegségek előfordulása ill. eltolódhat az állomány ivararánya a víz ph- értéke kiemelkedő 7-8 között a víz oldott iontartalma és összetétele mely befolyásolja a petefészek működését, ivarsejtek termelődését µs között van, ezt az értéket nitrát és foszformentes tengeri só adagolásával érik el oxigénigény kevés adat, recirkulációs rendszer

15 Laboratóriumi tartásuk

16 Táplálkozás mindenevők, állati és növényi eleséget a tápok különféle húsokból, májból, ikrákból, rákokból, algákból, lisztekből készülnek, számos ásványi anyaggal és vitaminnal kiegészítve alkalmanként kiegészítő csemegeként tubifexet, szárított szúnyoglárvát adva a változatosság kedvéért ajánlott ez viszont kellő elővigyázatosság híján, alkalmat nyújt vírus, de főként parazitafertőzésre etetésenként csak annyi tápot szabad adni, amennyit a halak max.5 perc alatt maradéktalanul elfogyasztanak halivadékok táplálása apró szemcsés ivadéktáppal valamint keltetett artémiával (sórákkal) történik, melyet nagy előszeretettel fogyasztanak a kifejlett egyedek is

17 Szaporodás egy-egy párzás alkalmával minden páros képes megtermékenyített petét lerakni minden héten általában hetente egyszer, bőséges táplálkozás mellett kéthetente háromszor párzanak hetes korban már ivarérettek, de maximális embrió termelésre csak a 7-18 hónapos korban lehet számítani

18 Szaporodás a halakat szaporítást megelőző napon délután szaporító edényekbe kell kiválogatni a kifejlett egyedek erősen ikrafalóak (fehérje pótlás miatt), ezért az ivató edénybe rácsos elem kerül, mely alá az ikrák letudnak süllyedni, de a felnőttek számára hozzáférhetetlenek edénybe a válaszfal, egyik oldalára 1-2 nőstényt, másik oldalára 2-3 hímet helyezünk ívás a kora reggeli órákban történik

19 Az embrió fejlődése A zebradánió embriógenezisében 7 nagy periódust különíthetünk el: 1. zigóta periódus - 1 sejtes állapot -az ikra megtermékenyülésétől számítjuk, az első sejtosztódás bekövetkezéséig a zigóta körülbelül 0,7 mm átmérőjű 2. barázdálódás - barázdálódás stádiuma alatt a blasztomérák (barázdálódó sejtek) első 6 osztódása következik 15 percenként

20 3. hólyagcsíra periódus ebben a periódusban a marginális blasztóma átalakul, az embrió elkezd midblaszt állapotba fejlődni. A mélyen fekvő sejtek erőteljes osztódásba kezdenek, a balsztomert burkoló réteg egyrétegű epitheliális réteggé alakul. A mitózis hullámszerűen megy végbe.

21 4. gastruláció A fejlődés szakaszán egyes területek átrendeződése következik be, sejtek vándorolnak, más területek növekedésnek indulnak. Kialakul a germ ring, amely övszerűen körbefogja az embriót.

22 5. Szegnemtáció - során erős morfológiai változások indulnak meg. Megjelennek az ősszelvények, amiből kialakulnak az első szervkezdemények, és feltűnnek az első testrészek is. Megszűnik a farok egyoldalú növekedése. Innentől kezdve a többi testrész hosszanti növekedése együtt zajlik le a farok növekedésével.

23 6. pharyngula stádium Ez a periódus a zsigerívek kialakulásának stádiumát jelenti. Ez a halembrió fejlődésének 1/3- át öleli fel. A farok úszó növekedése tovább folytatódik, megjelennek a mellúszók, és az első pigment sejtek, megindul a vérkeringés. A mozgás kezd rendezetté válni, vagyis megjelennek az első úszást imitáló mozgások. A szegmentációs periódusban a fej és a farki vég ventrális (hasi) oldala rásimul a szikre. Ebben a periódusban kezdetét veszi a kiegyenesedés.

24 7. kikelési periódus Az embriók fejlődésének utolsó periódusa. Az embriók hosszanti növekedése a sejtek differenciálódása folytatódik, megjelennek a mellúszók sugarai, a bélrendszer, kopoltyúívek, valamint megindul az állkapocs fejlődése.

25 A zebradánió legfontosabb betegségei a pontyfélékre jellemző megbetegedéstípus megfigyelhető kizárólag zebradánió-specifikus vírust nem izoláltak eddig, a pisztrangok pancreasnecrosisát (IPN) és a pisztrángok vérképző szöveteinek elhalását (IHN) okozó vírusok szaporodnak zebradánió eredetű sejttenyészeteken, de a halakat nem betegítik meg a zebradánió két leggyakoribb betegsége a bársonykór és a haltuberkolózis (mycobacteriosis), ami az ember bőrére való ráterjedés lehetősége miatt fontos zoonozis

26 Felhasználásuk az emlősökhöz hasonló reakciókat mutatnak, ezért alkalmasak például az öregedés folyamatainak vizsgálatára, tumor biológiával kapcsolatos kísérletekre, szervi rendellenességek genetikai hátterének értelmezésére, tanulmányozására humán tumorokból származó rákos sejtek Zebradánióba való átültetése során vizsgálható a tumor térfogatának növekedése, terjedése, kezelés rákkutatás széles körben használják a fejlődésbiológiai kérdések megválaszolására, számos jelenlegi kutatás az emberi egészséget javító vizsgálatokra irányul gyógyszerek kifejlesztésében, különböző vegyszerek, kis és nagymolekulák szűrésére, tesztelésére

27 A zebradánió egyéb laboratóriumi felhasználása Melanoma Leukémia Hasnyálmirigy rák Hepatocelluláris karcinóma Véralvadás Erek kiakakulása Szívelégtelenség Veleszületett szív és vese megbetegedések Akut gyulladás Retina sérülések Fejlődési rendellenességek Mezőgazdasági kutatás Biotechnológiai kutatás Környezetvédelmi kutatás Toxikológia vizsgálatok Farmakológiai kutatás Genetikai módosítás Sugárbiológiai vizsgálatok

28 Sugárbiológia 20x20 mező 2 cm plexi lap APPA

29 - mivel a korai felnőtt egyedek optikailag átlátszóak, ez a jellegzetességük megkönnyíti a toxikus anyagok, illetve a vizsgálatok során kialakult, rendellenességek belső szervekre kifejtett hatásának közvetlen megfigyelését.

30 LD50 meghatározás, morfológiai rendellenessége detektálása Commet assay Ko 1,25 Gy 2 Gy -ɣ H2AX festés- DNS szálltörés vizsgálat - apoptózis vizsgálat

31 Szövettani vizsgálatuk is kivitelezhető, viszont a parafinba ágyazásuk valamint a metszetek készítése nagy precízitást és odafigyelést igényel a kis és törékeny méretük miatt

32 Köszönöm a figyelmet!