Sebészeti Műtéttani Intézet SZEGEDI TUDOMÁNYEGYETEM ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR SEBÉSZETI MŰTÉTTANI INTÉZET

Átírás

1 Szegedi Tudományegyetem Orvostudományi Kar Sebészeti Műtéttani Intézet SZEGEDI TUDOMÁNYEGYETEM ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR SEBÉSZETI MŰTÉTTANI INTÉZET Az állatkísérletek elmélete és gyakorlata Gyakorlati jegyzet Szeged, 2015.

2 Tartalomjegyzék 1. Core modul 3.2/1: Magatartást vizsgáló módszerek - viselkedés biológia a gyakorlatban Core modul 3.2/2: Zebrahalak biológiája és kísérletes gyakorlata; a zebradánió (Danio Rerio) mint kísérletes modell állat Function specific modul 3.2/3: Kísérleti állatok megfogása, mozgáskorlátozása és ivar felismerése (Handling and restraint exercises with laboratory animals) Core modul 4/5: A konvencionális állatház felépítése és működése állatház látogatás (Set up and operation of an conventional Animal house) Function specific modul 7-8: Minimálisan invazív beavatkozások altatás nélkül: Injekciózás fantomokon (sc; im; iv, ip). Gyógyszerek orális és nem-orális bevitele a gyakorlatban (gavage); /1. Additional Task specific modul 20: Az altatószerek dózisának kiszámítása különböző fajok esetén Anesztéziai lehetőségek kisállat modellekben (Possibilities of small animal (rodent) anaesthesia) 33 6/2. Additional Task specific modul 20: Rágcsálók inhalációs altatása (Inhalation anaesthesia of rodents) Additional Task specific modul 22/2: Műtői gyakorlat I: Aseptikus technikák, bemosakodásbeöltözés, műtéti terület izolálása A steril körülmények között végzett munka (Work under sterile circumstances) Additional Task specific modul 22/2: Műtői gyakorlat II: Alapvető sebészi technikák (Basic surgical procedures), sebészi csomózás és varrat technikák fantomokon Additional Task specific modul 22/2: Sebellátás gyakorlat (Wound management) Additional Task specific modul 22/3 Alapvető sebészi eljárások alkalmazása rágcsálókon; (Surgical interventions) Function specific modul 11/4: Primer szívizom sejtkultúra készítés (Preparation of primary cardiac myocyte cultures) Function specific modul 11/4: Ex vivo izolált Langendorff szívperfúzió (Ex vivo isolated heart perfusion according to Langendorff)

3 1. Core modul 3.2/1: Magatartást vizsgáló módszerek - viselkedés biológia a gyakorlatban Molnár Máté Ph.D. hallgató, Martos Diána Ph.D. hallgató Dél-Alföldi Neurobiológiai Tudásközpont, Magatartáskutató Laboratórium A vizsgálatok célja: A magatartásvizsgálatok célja információgyűjtés élő állatokról, real-time. E módszerekkel számos kiegészítő információt kaphatunk vizsgálatunk tárgyáról (pl. farmakonok, műtéti eljárások, fertőzések stb.) már az előtt, hogy az állatokat további biológiai minták (szövettani, biokémiai, stb. minták) előállítása céljából feláldoznánk. Típusai: A rágcsáló magatartásának 3 fő aspektusa vizsgálható: motoros teljesítmény, kognitív teljesítmény, pszichés állapot. I. Kognitív tesztek monitoring of cognitive performance A rágcsálók kognitív funkciói olyan labirintusokban vizsgálhatók, melyekben az állatok munkamemóriájuk, referenciamemóriájuk és téri memóriájuk alapján tájékozódhatnak. A vizsgálatok előtt legtöbbször tréningezni is szükséges az állatokat. A tréningek a vizsgáló módszertől függően sokfélék lehetnek. 1. (Sugárlabirintus teszt) Radial Arm Maze Task (Olton & Samuelson, 1976) A radial arm maze egy átlátszó falú labirintus, melynek karjai egy központi kamrából sugárirányban helyezkednek el. Az állatok a labirintusban olyan vizuális referenciapontok alapján tájékozódnak, melyek a vizsgáló helyiségben vannak elhelyezve. A módszerrel elsősorban rágcsálók téri memóriájának működése vizsgálható. A vizsgálatot hosszas (több hetes) tréningezés előzi meg, melynek során bizonyos karokban következetesen jutalmat helyezünk el (pl. enyhén éheztetett állatok számára élelmet). Az állatok idővel megtanulják, mely karokban találhatják meg a jutalmakat (tájékozódás a vizuális ingerek alapján). Méréskor a korábban jutalmazott karokban nem helyezünk el jutalmat. A vizsgálat várható eredménye az, hogy minél jobban emlékszik az állat a tréningre, (1) annál rövidebb időn belül keresi fel az összes, korábban jutalmazott kart és (2) annál kevesebbszer megy be olyan karokba, amelyekben soha nem volt jutalom. A protokoll tanulási sebesség mérésére is alkalmas. Ekkor már a tréning során regisztráljuk az állatok aktivitását. Fontos, hogy a mérési idő ne legyen túl hosszú, mert az emlékképek alapján történő keresést a jutalmak hiányában hamar helyettesíti a szisztematikus keresés, mely a mérést értékelhetetlenné teheti. Vázlatosan: térmegjegyző memória, b) referenciamemória, c) munkamemória hajtóerő: enyhe éheztetés egyes karok végében elhelyeze6 takarmány felkutatása tréningezés: 1-6 héten át naponta kiszemelt karok következetes jutalmazásával megfigyelt mutatók (térmegjegyző és referenciamemória vizsgálatakor): az első n belépés találati aránya (n = jutalmazott karok száma) 3

4 a jutalmazott karokban mért aktivitás aránya (idő, út, belépések) a feladat nehézsége (~ a teszt érzékenysége) változtatható a karok számának beállításával Figyelem! A mérés mindig jutalom nélkül történik. A mérési idő növelésével a találati arány / aktivitási arány csökken. Ezért fontos a helyes tréning- és mérési idő beállítása. 2. Y-maze teszt Y maze test (Olton, 1979) A Y maze labirintus egy Y betű alaprajzú, átlátszó oldalfalakkal határolt eszköz, melyet elsősorban rágcsálók referenciamemória funkcióinak vizsgálatára alkalmaznak. A labirintus falaihoz közel olyan vizuális ingerek vannak elhelyezve, melyeket az állatok képesek megkülönböztetni (pl. csíkos vs. sakktáblamintás tapéta). A vizsgálat rövid tréninget igényel, melynek során az állatot a labirintusba helyezik úgy, hogy az Y 2 rövidebb karja közül az egyik le van zárva, és abba belátni sem lehet. Egyegy állatot mindössze 1-2 percre elég behelyezni. A tréninget követően 20 perccel (rövidtávú) vagy 24 órával (hosszú távú) az állatot visszahelyezzük a labirintusba, melynek ezúttal nincs lezárt karja. Az állat, ha emlékszik, akkor várhatóan a számára új kart részesíti majd előnyben: több időt tölt el és nagyobb utat tesz meg itt. A mérés ideálisan rövid, szintén 1-2 perces. A mérési idő hosszításával a 2 rövid kar látogatottsági aránya a 0,5 (50%) felé tendál. Az állatok explorációs aktivitásának hátterében a labirintusból való kiút keresése állhat. Vázlatosan: a) munkamemória, b) referenciamemória hajtóerő: kiút keresése egyszerű, ún. 2-session protokoll: session a labirintus felderítése, 1 kar lezárva session a labirintus újra bejárása, a korábban lezárt kar is nyitva megfigyelt mutatók: az újonnan kinyitott karban mért aktivitás aránya (idő, út, belépések) a nem emlékezők teljesítményaránya = új tér / ismert tér = ~0,5 (50%) Figyelem! A mérési idő növelésével az aktivitási arány a 0,5-höz közelít. Ezért fontos a helyes mérési idő beállítása. II. Pszichés tesztek Monitoring of Psychic State 1. (Emelt keresztlabirintus teszt) Elevated Plus Maze Test (Pellow et al., 1985) Az elevated plus maze teszt egy a padlótól cm magasra emelt kereszt alapú labirintus, melynek 2 db falakkal határolt és 2 db falakkal nem határolt karja van. A labirintus nyílt és világos részei (nyílt karok és központi zóna) a rágcsálókban szorongást idéznek elő, ezért az eszköz szorongásoldók vizsgálatára alkalmas. A vizsgálat egyszeri mérésből áll, melyet nem előz meg tréning. Az állatok várhatóan a mérési idő nagy részét a zárt karokban töltik (életmódjuknak megfelelőbb környezet), elmenekülve a világos, nyílt és mély környezetből. A labirintus előidézte szorongásos állapot szorongásoldókkal (pl. Xanax-szal) csökkenthető. A szorongásoldókkal kezelt állatok nagyobb arányban (időarány) látogatnak a nyílt karra, mint kezeletlen társaik. Vázlatosan: szorongás hajtóerő: averzív (világos, nyílt, magas) környezet elkerülése, thigmotaxis = nyílt tér elkerülése 4

5 5 perces natív vizsgálat (az ismételt vizsgálat más eredményt hoz!) megfigyelt mutatók: zárt karban mért aktivitás aránya (idő, út, belépések) validálás: szorongásoldókkal (pl. benzodiazepinek) a fenti arány csökken 2. Tail Suspension Test (Steru et al., 1985) E vizsgálat során az egereket (patkányokat nem!) felfüggesztik a farkuknál fogva úgy, hogy a rögzítés ne okozzon nekik fájdalmat. Így egy rendkívül kényelmetlen testhelyzetbe kényszerítik az állatokat, melyből azok szabadulni igyekezvén ficánkolnak. Bizonyos idő elteltével, amikor az állat már egy ideje sikertelenül próbálkozik a szabadulással, kevésbé próbálkozik azzal. Ez olyan magatartási periódusokban nyilvánul meg, melyekben az egér teljesen mozdulatlanná válik, megmerevedik. Ez az ún. tanult tehetetlenség vagy tanult kiúttalanság. A viselkedésforma megnyilvánulásának gyakorisága és az egyes események hossza antidepresszáns farmakonokkal csökkenthető. A tanult tehetetlenség a depresszióban szenvedő humán pácienseknél is megfigyelhető. A tail suspension test antidepresszáns hatású farmakonok tesztelésére alkalmas. Vázlatosan: depresszív magatartás: ún. tanult tehetetlenség hajtóerő: kényelmetlen testhelyzet elkerülése ált. 3 perces natív vizsgálat megfigyelt mutatók: a teljes mozdulatlanságban töltött időtartam (kumulált) validálás: antidepresszánsokkal (pl. SSRI-k) Rágcsálók motoros funkciójának és szorongó magatartásának vizsgálata Monitoring Motor function and Anxiety-related behaviors of Rodents III. Motoros funkciót vizsgáló teszt Monitoring of Motor function 1. (RotaRod teszt) RotaRod Test (Jones & Roberts, 1968) A vizsgálat és az azt megelőző procedúra 1. nap: 1. lépés: Az egeret helyezzük rá a rúdra! A rúd nem forog, így maradjon rajta az egér 5 percen keresztül, ha leesik, tegyük vissza, majd 5 perc elteltével helyezzük vissza az állatot a ketrecébe; 30 perc pihenőidő jár neki! 2. lépés: Az egeret helyezzük a rúdra! Indítsuk el a beállított programot (lásd később; 5 rpm, 5 perc), ha leesik az egér, tegyük vissza a forgó rúdra (mivel eközben a program folytatódik, a rúd forog tovább). A program lejártával (5 perc elteltével ) visszatesszük az egeret a ketrecébe, újabb 30 perc pihenőidő következik. 3. lépés: Ugyanaz, mint a 2. lépés. A program lejártával (5 perc elteltével) az egeret tedd vissza ketrecébe (számára másnap folytatódik a tanulás)! Tehát: 5 perc/0 rpm 30 perc pihenő 5 perc/5 rpm 30 perc pihenő 5 perc/5 rpm mára vége 2. nap: A teendők ugyanazok, mint az 1. napon, azonban már az 1. lépéstől kezdve 10 rpm 5

6 forgási sebességet kell alkalmazni (ugyanúgy 5 percen át)! Tehát: 5 perc/10 rpm 30 perc pihenő 5 perc/10 rpm 30 perc pihenő 5 perc/10 rpm mára vége 3. nap: Helyezzük az egeret a rúdra és indítsuk el a beállított programot. Ha leesik az egér, akkor a mérést a program automatikusan terminálja, ekkor kivesszük az egeret a berendezésből (annak padlózatáról ) és visszahelyezzük a ketrecébe. A következő mérési etapig pihen. Ha az egér a mérés végéig fenn maradt a rúdon, akkor a program a mérési idő lejártával terminálja a mérést. Ekkor tehát vegyük le az egeret a rúdról és tegyük vissza ketrecébe. rpm= rotation per minute, fordulatszám per perc (a rúd forgási sebességének megadására) motoros készség, b) mozgás koordináció, c) motoros tanulás a feladat nehézsége (~ a teszt érzékenysége) változtatható a rúd percenkénti fordulatszámának beállításával hajtóerő: "kikényszerített" járás a forgó rúdon való egyensúlyozó mozgás/leeséstől való "félelem" tréningezés: 2 napon át/naponta 3 egymást követő alkalom naponta növelt rpm (revolutions per minute/fordulatszám per perc) fokozattal megfigyelt mutatók (motoros tanulás illetve motoros készség esetén): o a mérés kezdetétől a leesésig eltelt idő (sec) o a forgási sebesség (rpm), amelynél az állat leesett (változó sebességprofil esetén van értelme) o az állat által a rúdon megtett út (cm) IV. Szorongó magatartást vizsgáló teszt Monitoring of anxiety-related behavior test 1. (Nyitott mező teszt) Open-field test (Calvin S. Hall, 1932) Minden kísérlet előtt egy órával be kell vinni ketrecestől a kísérleti állatokat abba a helyiségbe ahol a vizsgálat történni fog, annak érdekében, hogy az állatok akklimatizálódjanak a fény és hőmérsékleti viszonyokhoz. Csak ezt követően kezdődhet a kísérlet. A spontán lokomotoros aktivitás mérésére Open-field tesztet alkalmazhatunk. Az állatokat egy a program beállításaitól függően egyenlő részre osztott, felülről nyitott dobozba helyezzük, majd a kísérletet a doboz belső oldalában található mozgás érzékelő LED sor és/vagy videokamerával detektáljuk a következő paramétereket: az egy helyben, mozgással vagy mosakodással eltöltött időt, érintett mezők és ágaskodások számát, illetve a doboz közepén töltött időt. Krónikus fájdalom jelenlétében fokozódik a szorongás, mellyel fordítottan arányos a mozgással és a doboz középén töltött idő, továbbá az időegység alatt érintett mezők száma, míg a mosakodás, ágaskodás, és a sarokban töltött idő azzal egyenesen arányos. A vizsgálatokat követően minden állatot visszateszünk a ketrecébe és kitakarítjuk a dobozt minden detektálás előtt. Ezt követően a program által mentett adatokat statisztikai program segítségével feldolgozzuk. 6

7 spontán lokomotoros aktivitás, b) exploráció c) szorongás hajtóerő: kíváncsiság egyszerű protokoll: szoftver segítségével beállítjuk a megfelelő paramétereket, majd betesszük az állatokat 15 percre a dobozba és kamera, valamint az érzékelők segítségével detektáljuk az állatok viselkedését. Megfigyelt mutatók: Helyváltoztató mozgással töltött idő (sec) pl.: nekiiramodás A mérés alatt megtett út (cm) Helyzetváltoztató mozgások száma (db) pl.: ágaskodás mosakodás V. Általános szabályok General Formulae Vegyük figyelembe, hogy a rágcsálók éjszakai állatok! A vizsgálatokat kézhez szoktatott állatokkal végezzük! Ellenkező esetben az állatok számára az emberi közeledés és érintés hatalmas stresszor (prédaállatok). (A vizsgálatok előtt és azok közben) Minimalizáljuk a külső befolyásoló tényezők, stresszorok jelenlétét! Kerüljük az erős ingerek gerjesztését (pl. erős parfüm és dezodor, ételszag, erős zajok, hangos beszéd stb.)! Mindig tartsuk szem előtt, hogy a kísérletet végző (az állatokkal kapcsolatba kerülő) személy hangulata az állatokra, így a vizsgálatok eredményére is nagymértékben hat! A berendezéseket minden egyes állat vizsgálatát követően szennyeződés- és szagmentesre kell tisztítani (pl. 70%-os etanollal). A berendezésben hagyott vizelet (és széklet és egyéb) nagymértékben befolyásolja a vizsgált állat viselkedését. 7

8 2. Core modul 3.2/2: Zebrahalak biológiája és kísérletes gyakorlata; a zebradánió (Danio Rerio) mint kísérletes modell állat Általános ismeretek a zebradánióról Szabó Emília Rita biológus Onkológiai Klinika, Sugárbiológiai Kutatócsoport A zebrahal világszerte népszerű modell fajjá vált az orvosbiológiai és (öko) toxikológiai kutatásokban. Különösen az embriók használata kap egyre nagyobb figyelmet, mivel azok helyettesítő módszerként tekinthetők az állatkísérletekben. Mivel napjainkban nő az igény, hogy az élő állatokon végzett kísérleteket in vitro modellek és metodikák váltsák fel, így a zebradánió halembrió népszerű gerinces modellfajjá vált az utóbbi időben a preklinikai kutatásokban, köztes lépést biztosítva a sejttenyészet alapú vizsgálatok és a humán klinikai vizsgálatok között. Míg a sejtvonalakkal végzett kísérletek csak egy adott sejttípusra vonatkoznak, és hiányzik a komplex organizmus sejt-közötti állománya, illetve a különböző szövetek, egymásra-hatásából, a szervek működéséből származó hatás. Zebradánió embriók alkalmasak, a több végpont vizsgálatára, kezdve az akut és fejlődési, valamint a toxicitás meghatározásához a komplex funkcionális, genetikai és élettani vizsgálatokra. Az állatok tudományos célokra való felhasználásának védelméről az 2010/63 / EU európai parlamenti és tanácsi irányelv szerint, a korai élet-szakaszban a zebradánió nem védett, nem tartoznak a védett kategóriába, mint az állatok. A zebradánió halembriók valamint a fejlődés korai szakaszában levő fiatal egyedek mindaddig, míg elúszásra és önálló táplálkozásra képtelenek (168 óra ill, 7 nap a megtermékenyítés után), nem tartoznak bele a szabályozási keretbe. Az elmúlt 20 évben a zebrahal modellt, szinte minden tudományág széleskörűen alkalmazza, biológiai és orvos biológiai kutatásokban való alkalmazása kimagaslóan megnövekedett, nagyobb népszerűségnek örvend, mint bármely más gerinces modell. A zebradánió mint kutatási modell, népszerűsítése az 1980-as évben kezdődött, amikor George Streisinger és kollégái, az oregoni Egyetem munkatársai felismertek és közzétettek számos olyan tulajdonságát melyek alapján e szervezet hatalmas potenciális lehetőségeket, nyújt a fejlődésbiológiai és genetikai kutatásokban. A muslicákhoz és férgekhez hasonlóan egy újabb egyszerű modell szervezet, viszont ellentétben velük gerinces faj. Van gerincük, agy és a gerincvelő, valamint számos más szervekkel rendelkeznek, beleértve a szív, a máj és a hasnyálmirigy, a vesék, a csontok és a porcok, ezáltal jobban hasonlítanak az emberekre, és alkalmasabbak a perklinikai kutatásokra. 8

9 A zebradánió, más néven Danio rerio, egy trópusi, édesvízi hal mely a pontyfélék családjába tartozik, Himalája délkeleti régiójában őshonos, de megtalálható India számos részein, Pakisztán, Banglades, Nepál és Burma területein. A faj felbukkant már a Gangesz régióban, Kelet-Indiában, gyakran él patakok, csatornák, árkok, tavak, és lassan mozgó vagy állóvizeken, beleértve a rizsföldeket. A zebrahal nevét a jellegzetességéről kapta, az öt egységes, pigmentált, horizontális, kék csíkok meglétéről, melyek az oldalán, a test egész hosszán végighúzódnak és kiterjednek egészen a farok úszó végéig. A hím vékony, torpedó alakú, arany csíkokkal a kék csíkok között, míg a nőstény egyed nagyobb, fehéres hassal és ezüst csíkos az arany helyett. A teljesen kifejlett egyed 6,4 cm hosszúságura nőhet, nagyon ritkán nő nagyobbra, mint 4 cm-es. Az élettartamuk mintegy két-három év, viszont ennek ellenére, ideális körülmények között való tartásuk során életkoruk kiterjedhet öt évre. Az ivarérettkor elérésének hozzávetőleges ideje három hónap. A zebrahal, egy kis gerinces faj, mely könnyen fenntartható, tenyészthető laboratóriumokban, gyorsan és bőségesen szaporodik, minden páros képes megtermékenyített petét lerakni minden héten. Az egyedfejlődés az anya testén kívül történik, ez biztosítja a páratlan lehetőségeket a kutatók számára, hogy megvizsgálhassák a részleteket, az embrionális fejlődést illetően egy gerinces modellben, anélkül, hogy kifejlett egyed életét oltanánk ki. Ezen túlmenően, a zebrahal embriók és a korai felnőtt egyedek optikailag átlátszóak, ez a jellegzetességük megkönnyíti a mérgező, toxikus anyagok belső szervekre kifejtett hatásának közvetlen megfigyelését. 1-2 mm-es embriók átlátszók, a szervi elváltozások, illetve egyes szervek fejlődése a fluorescens festéket termelő transzgénikus típusoknál könnyen detektálható. 9

10 A kis méret nagy térbeli felbontást nyújt, a teljes organizmus nagyszámú egyedeinek vizsgálata megbízható adatokat eredményez. Zebradánió embriók teljes fejlődése három nap alatt végbemegy. A legtöbb szerv, mint például a szem, agy, szív, máj, izmok, csontok valamint a gyomorbél rendszer gyors embrionális fejlődésen mennek keresztül. Szintén a gyors fejlődés következményeként, egyszerűbben illetve könnyebben megfigyelhető a transzkripciós szabályozás. A gyors fejlődés elősegíti a kutatást. Ezen túlmenően, a zebrahal embriók és a korai felnőtt egyedek optikailag átlátszóak, ez a jellegzetességük megkönnyíti a toxikus anyagok, illetve az vizsgálatok során kialakult, okozott rendellenességek belső szervekre kifejtett hatásának közvetlen megfigyelését. A zebradánió számos kulcsfontosságú génnel rendelkezik, amelyek fontos szerepet töltenek be a fejlődés folyamataiban, a sejtciklus, a prolliferáció, valamint a differnciálódás során, és ezek a gének megfelelnek a humán DNS szakaszoknak, jól konzerváltak a két faj között. Az embriógenezis a szervezeten kívül történik, tehát genetikai manipulációt könnyen lehet végezni (morfolino technika), és ex utero nyomon követhető. A különböző zebradánió, vad típus és transzgenikus (ér, és idegjelölt valamint a transzparens Casper) vonalak használata ígéretesnek bizonyul a preklinikai vizsgálatokban. Egy-két sejtes állapotban, mikor a peteburok még nem keményedett meg teljesen az embriók könnyen mikro-injektálhatóak, genetikailag módosíthatóak, melyek aztán továbbadódnak öröklődnek a következő nemzedéknek. A Nature-ben megjelent közlemény alapján a zebrahal, egér és az ember 12,712 génje közös, ez alapján az emberi gének 70%-a megtalálható a zebrahalban. De még ennél is figyelemre méltóbb az a megállapítás, hogy az emberi betegségeket okozó géneknek 84% megtalálható a zebradánióban. Ezáltal nem meglepő, hogy e gének zebradánió embrióba való befecskendezése a növekvő állatokban azonos betegségeket váltanak ki. A zebrahalakat széles körben használják a fejlődésbiológiai kérdések megválaszolására, számos jelenlegi kutatás az emberi egészséget javító vizsgálatokra irányul. Ez különösen igaz a rákkutatásokra, ahol a rákot okozó gének (onkogének) kifejeződését irányítani lehet a specifikus szervekben, gyakorlatilag tetszés szerint. Ezek a párhuzamok ösztönözték a kutatókat, arra hogy széles körben használják zebradánió halembriókat gyógyszerek kifejlesztésében, különböző vegyszerek, kis és nagymolekulák szűrésére, tesztelésére. A daganatokat hordozó egyedek tesztelni kívánt szerbe való helyezése után, könnyen megfigyelhető a tumor csökkenése valamint növekedése. Ezáltal a gyógyszerek széles skáláját rövid időn belül számos egyed használatával szűrni lehet, és viszonylag gyorsan meghatározható a szer rákellenes hatékonysága. A kutatók humán tumorokból származó rákos sejtek zebradánióba való átültetése során vizsgálhatják a tumor térfogatának növekedését, terjedését. Létrehozták a transzparens (nem csíkos) változatát is a zebradániónak, az úgynevezett Casper halat, (nevét a rajzfilmben szereplő szellem után kapta), ami könnyítette a tumorok viselkedésének, növekedésének napi megfigyelését, a testük teljes átlátszósága miatt. Zebrahalak kísérletes gyakorlata A gyakorlat helyszíne: Kisoktatási épület, Sugárbiológiai Kutatócsoport zebrahal labor 10

11 Gyakorlatvezető: Szabó Emília Rita Gyakorlat célja: Átfogó ismeretek elsajátítása a zebrahal labor fenntartásáról, halak szaporításáról, embriók kísérletben való alkalmazásáról Gyakorlat típusa: Laborlátogatás, mikroszkópizálás Eszköz és állatigény: Zebrahal, zebrahal embriók, mikroszkóp Gyakorlat során végzendő feladatok: 1. Ivar meghatározás- az előkészített halak nemének meghatározása az elméleti órán felsorolt bélyegek alapján 2. Embriók fejlettségi állapotának meghatározása Különböző posztfertilizációs korban levő embriók mikroszkópos megfigyelése. Embriókat 96 lyukú platebe pipettázva pasteur pipettával, majd a plateket inverz mikroszkóp alá helyezve, látomezőt élesre állítva az embrió befokuszálása után az embriók fejlettségi állapotának meghatározása. A Szegedi Tudományegyetem Orvosi Fizikai és Orvosi Informatikai Intézete ad otthont, a Sugárbiológiai munkacsoporthoz tartozó Zebrahalas labornak, mely tenyésztői és felhasználói engedéllyel egyaránt rendelkezik. A laborban vad illetve transzgenikus Zebradánió vonalak vannak fenntartva. Működési szabályzat: A laborba való bemenetel előtt ajánlott az ajtó előtt elhelyezett fertőtlenítővel átitatott szivacsba belelépni, és csak ezt követően bemenni. Munkaruha, köpeny illetve kesztyű használata is kötelező. 11

12 Az időzített világítás gyakori ellenőrzése heti egy alkalommal Az akváriumokban levő víz hőmérsékletének ellenőrzése Külső hősugárzó készülék beállítása Minden akváriumba kötelező módon külön az akváriumhoz tartózó hálóval nyulunk bele Az állatok tartása: A halak tenyésztése, fenntartása során maximális figyelmet kell fordítani a halak jólétére, a megfelelő minőségű vízmennyiség, a szükséges fényviszonyok, zajszint, hőmérséklet valamint az oxigén, nitrogénvegyületek, ph, sótartalom optimális fenntartására, a megfelelő állománysűrűség és tápanyagellátásra. 20 literes akváriumokban legfeljebb 25 egyed tartható, a víz hőmérséklete 28,5 C lehet, ha a víz hőmérséklete meghaladja ezt az értéket, illetve 25 C alá csökken, a halak nemzőképtelenekké válnak, valamint fejlődési rendellenességek figyelhetőek meg rajtuk. Heti két alkalommal az akváriumok vízének 1/3-át szükségszerű cserélni, azonban ha túletetés történik, és a táp az aljzaton marad, azt leszívással el kell távolítani. A vizet felhasználás előtt tartályokban kell tárolni, és a vízcsere előtt tesztelni kell a vízminőséget. A víz ph-ja 6,2 és 7,5 között mozoghat. A laborba időzítővel ellátott világítás szüksége a fotoperiodicitás optimális kialakításához, 14 óra világos és 10 óra sötét periódusok megteremtése szükségszerű. A zebradániók mindenevők, táplálékai többnyire zooplanktonok, rovarok és fitoplanktonok. Laboratóriumi-, és vagy akváriumi körülmények között a kifejlett egyedek etetése napi két alkalommal történik, száraz haltáppal illetve élő táplálékként, keltetett artémia rákkal etethetőek. Csakis kizárólag annyi ételt szabad adni, amit pár perc alatt képesek elfogyasztani, a maradék táp eltávolítása ajánlott a második etetés után. A zebradánió szaporítása, ikrák nyerése: A kísérletben használni kívánt embriók nyeréséhez speciális ivató dobozt használunk. A halak szaporítást megelőző napon délután szaporító edényekbe kell kiválogatni. Ivató edény Megelőzendő, hogy az ikrák mellé ürülék kerüljön, ami a válogatásukat nehezíti, ezért a szaporítást megelőző napon az ikrázó halak táplálékának megvonása ajánlott. Mivel a kifejlett egyedek erősen 12

13 ikrafalók, és szaporodás után gyorsan elfogyasztják az embriókat, ezért az ivató edénybe rácsos elem is kerül, mely alá az ikrák könnyen le tudnak süllyedni, de a felnőtt halak számára hozzáférhetetlenné válnak. Az előkészített, rendszer vizel feltöltött edényekbe eltávolítható válaszfalat helyezünk, ezt követően 1-2 nőstény a válaszfal egyik oldalára, és 2-3 hím a válaszfal másik oldalára kerül. A válaszfalat a kihelyezést követő napon villanykapcsolás után perccel eltávolítjuk. Az ekkor összeeresztett halak 2 órán keresztül ikráznak. Ezt követően a halakat eltávolítjuk az ivató edényből, az embriókat Petri-csészébe metilén-kékkel kezelt vízbe helyezzük, a válogatás idejére. A metilén-kék segít a bakteriális és gombás fertőzések megelőzésében. Ezt követően az embriókat többször át kell mosni a metilén-kék oldat eltávolítása végett. Az embriók minőségét mikroszkóp alatt ellenőrizzük, és az esetlegesen nem termékenyült egyedeket eltávolítjuk. Nemek közti különbségek: A hím vékony, torpedó alakú, arany csíkokkal a kék csíkok között, míg a nőstény egyed nagyobb, fehéres hassal és ezüst csíkos az arany helyett. A teljesen kifejlett egyed 6,4 cm hosszúságura nőhet, nagyon ritkán nő nagyobbra, mint 4 cm-es. Az élettartamuk mintegy két-három év. hím nőstény A zebradánió embrió fejlődése: A zebradánió embriógenezisébenn 7 nagy periódust különíthetünk el: 1. zigóta periódus (0-3/4 óra) 1 sejtes állapot 1-cell (0.2 h) 2-cell (0.75 h) 13

14 Ezt a szakaszt az ikra megtermékenyülésétől számítjuk, az első sejtosztódáss bekövetkezéséig. A megtermékenyüléskor a zigóta körülbelül 0,7 mm átmérőjű. 2. barázdálódás (3/4-2¼ óra) Barázdálódás stádiuma alatt a blasztomérák (barázdálódó sejtek) első 6 osztódása következik 15 percenként. A megtermékenyültt petesejt csupán egy része osztódik. A 6 osztódás során 6 állapotot különböztetünk meg, melyek a következők: 2 sejtes állapot (3/4 h) 4 sejtes állapot (1 h) 8 sejtes állapot (1 ¼ h) 16 sejtes állapot (1 ½ h) 32 sejtes állapot (1 ¾ h) 64 sejtes állapot (2 h) 4-cell 8-cell 16-cell 32-cell 64-cell (1 h) (1.25 h) (1.5 h) (1.75 h) (2 h) 3. hólyagcsíra periódus (2 ¼-5 ¼ óra) Ebben a periódusban a marginális blasztóma átalakul, az embrió elkezd midblaszt állapotba fejlődni. A mélyen fekvő sejtek erőteljes osztódásba kezdenek, a balsztomert burkoló réteg egyrétegű epitheliális réteggé alakul. A mitózis hullámszerűen megy végbe. 128 sejtes állapot (2 ¼ h) 256 sejtes állapot (2 ½ h) 512 sejtes állapot (2 ¾ h) 1000 sejtes állapot (3 h) High stage (3 1/3 h) Oblong stage (32/3 h) Sphere stage (4 h) Domage stage (41/3 h) 30 %- os epibólia állapot (4 2/3 h) 14

15 128-cell 256-cell 512-cell 1k-cell highh (2.25 h) (2.5 h) (2.75 h) (3 h) (3.33 h) oblong spheree dome 30%-epiboly 50% epiboly (3.7 h) (4 h) (4.3 h) (4.7 h) (5.3 h) 4. gastruláció(5 ¼-10 h) A fejlődés szakaszán egyes területek átrendeződése következik be, sejtek vándorolnak, más területek növekedésnek indulnak. Kialakull a germ ring, amely övszerűen körbefogja az embriót. 50% -os epibólia állapot (5 ¼ h) Germ-ring állapot (52/3 h) Shield állapot (6 h) 75% epibólia állapot (8 h) 90% epibólia állapot (9 h) Bud állapot (10 h) 15

16 50% epiboly germ ring shield 75% epiboly 90% epiboly bud (5.3 h) (5.7 h) (6 h) (8 h) (9 h) (10 h) 5. szegnemtáció A szegmentáció során erős morfológiai változások indulnak meg. Megjelennek az ősszelvények, amiből kialakulnak az első szervkezdemények, és feltűnnek az első testrészek is. Megszűnik a farok egyoldalú növekedése. Innentől kezdve a többi testrész hosszanti növekedése együtt zajlik le a farok növekedésével. 1 szomitás állapot (10 1/3 h) 5 szomitás állapot (11 2/3 h) 14 szomitás állapot (16 h) 20 szomitás állapot (19 h) 26 szomitás állapot (22 h) 3-somite 6-somite 10-somite 14-somite 18-somite (11 h) (12 h) (14 h) (16 h) (18 h) 16

17 21-somite (19.5 h) 26-somite (22 h) 6. pharyngula stádium (24/48 h) Ez a periódus a zsigerívek kialakulásának stádiumát jelenti. Ez a periódus a halembrió fejlődésének 1/3- át öleli fel. A farok úszó növekedése tovább folytatódik, megjelennek a mellúszók, és az első pigment sejtek megindul a vérkeringés. A mozgás kezd rendezetté válni, vagyis megjelennek az első úszást imitáló mozgások. A szegmentációs periódusban a fej és a farki vég ventrális (hasi) oldala rásimul a szikre. Ebben a periódusban kezdetét veszi a kiegyenesedés. Állapotai: Prim 5 állapot (24 h) Prim 15 állapot (30 h) Prim 25 állapot (36 h) High-pec állapot (42 h) Prim-6 Prim-16 Prim-22 High-pec (25 h) (31 h) (35 h) (42 h) 7. kikelési periódus (48-72 h) 17

18 Az embriók fejlődésnek utolsó periódusa. Az embriók hosszanti növekedése a sejtek differenciálódása folytatódik, megjelennek a mellúszók sugarai, a bélrendszer, kopoltyúívek, valamint megindul az állkapocs fejlődése. Kelési periódus szakaszai: Long-pec állapot (48 h) Pec-fin állapot (60 h) Előreugró száj megjelenésének stádiuma (72 h) long-pec (48 h) pec-fin (60 h) protruding mouth (72 h) A megtermékenyített ikrák fejlődése gyors, már 3 nap után kikelnek. A 7 periódus az embriófejlődésre vonatkozik, ugyanis ekkor megy végbe a legnagyobb változás a hal életében. Az embriófejlődést az ikra megtermékenyítésétől az embrióból kifejlődött lárva kikeléséig számítjuk. 18

19 3. Function specific modul 3.2/3: Kísérleti állatok megfogása, mozgáskorlátozása és ivar felismerése (Handling and restraint exercises with laboratory animals) Dr. Varga Gabriella egyetemi tanársegéd SZTE ÁOK Sebészeti Műtéttani Intézet I. Patkányok - Rats (30 min) Kötelező feladatok Obligatory practice 1. Az állatok rövid ideig tartó megragadása - Restraint for shorter time Megragadás az állatok farkának segítségével - Restraint at the tail Szükséges anyagok: vizsgáló kesztyűk Helyes kivitelezés: az állatokat a ketrecben a farok tövének közelében fogjuk meg, majd emeljük meg, ezt követően szilárd felületre (másik ketrec, vagy ketrecrács) helyezzük. Nem szabad a farok végét megfogni, mert a farok végén a bőr megsérülhet, sőt teljes mértékben leválhat, leszakadhat! A beavatkozás alkalmazhatósága: ezt az eljárást csak az állatok rövid ideig tartó megragadására, például áthelyezésük (egyik ketrecből a másikba, vagy kalodába helyezés, súlymérés, esetleg egy másik beavatkozás előkészítése) céljából használjuk. Kaloda alkalmazása az állatok áthelyezésére Using a restrainer Szükséges anyagok: vizsgáló kesztyűk, kaloda Helyes kivitelezés: Az állatok elé helyezzük a henger alakú kalodát, majd kezünkkel az állat fejét a kaloda nyitott bejárata fele irányítjuk. Mivel a rágcsálók kedvelik a rejtőzködő életmódot, belebújnak a kalodába. A kalodát megemelve áthelyezzük őket egy másik ketrecbe. A beavatkozás alkalmazhatósága: ennek segítségével az állat alkalmas lehet pl. másik ketrecbe való áthelyezésre, súlymérésre Megfogás nyitott kéz technikával - Grasping with open hand technique Szükséges anyagok: vizsgáló kesztyűk Helyes kivitelezés: az állatokat a mellkasuk alatt fogjuk meg úgy, hogy másik kezünkkel is az állat alá nyúlunk és megtartjuk a hátsó testfelet is. A beavatkozás alkalmazhatósága: ezt az eljárást csak az állatok rövid ideig tartó megragadására, például áthelyezésük céljából használjuk. 2. Az állatok megragadás és megtartása - Restraint for longer time Megragadása a hát bőrénél a kétkezes technikával (kevéssé javasolt nagyobb állatok esetében) Restraint of rats using the two hand scuff restraint procedure (less recommended) Szükséges anyagok: vizsgáló kesztyűk és a domináns kezünkre harapás-biztos kesztyű 19

20 Helyes kivitelezés: Az állatokat a farkuk tövénél megragadjuk a nem domináns kezünkkel és vízszintes felszínre vagy ketrecük rácsára helyezzük őket és a farokra enyhe húzást gyakorolunk, minek következtében az állat kapaszkodni kezd a mellső lábaival. Ezt követően a domináns kezünkkel az állatok válla alatt a hátuk laza bőrét a gerinc mellett mindkét oldalról megragadjuk. A hüvelyk és mutató ujjat a fej stabilizálására használjuk, a maradék 3 ujj pedig a törzset stabilizálja. Vigyázzunk, hogy a megfogás szorossága ne zavarja az állatok légzését. Meg kell említeni továbbá, hogy szemben más rágcsálókkal (egér, hörcsög) a patkányok erősen ellenkeznek ez ellen a megragadási mód ellen. A beavatkozás alkalmazhatósága: ennek segítségével az állat alkalmas lehet pl. szondázás/gavage alkalmazására éber állapotban. Megragadása a törzsük hátulról történő átfogásával - Grasping of rats around the thorax Szükséges anyagok: vizsgáló kesztyűk és a domináns kezünkre harapás-biztos kesztyű Helyes kivitelezés: Az állatokat a farkuk tövénél megragadjuk a nem domináns kezünkkel és vízszintes felszínre vagy ketrecük rácsára helyezzük őket és a farokra enyhe húzást gyakorolunk, minek következtében az állat kapaszkodni kezd a mellső lábaival. Ezt követően a domináns kezünkkel az állatok válla alatt a törzset megragadjuk és az állatot óvatosan elemeljük a felszínről. Tanácsos a mellső lábakat keresztezni, hiszen ekkor kisebb az esélye annak, hogy az állat harap. Hibás és veszélyes kivitelezésnek minősül, ha az állatot a váll felett, azaz a nyaknál ragadjuk meg, hiszen ekkor az állat könnyen haraphat. A beavatkozás alkalmazhatósága: ennek segítségével az állat alkalmas lehet pl. injekció beadására éber állapotban. 3. Hím és nőnemű egyedek megkülönböztetése - Sexing Szükséges anyagok: vizsgáló kesztyűk A fenti módszerek (1-3) egyikével az állatot a hátára fordítjuk, majd az urogenitális nyílások távolságát vizsgáljuk meg. Ha ezek távolsága nagy, hím egyedet, míg ha kicsi, nőstény egyedet látunk. Bemutató - Presentation Kaloda alkalmazásának bemutatása az állatok megtartására Usage of restrainer for a complex intervention Szükséges anyagok: vizsgáló kesztyűk, kaloda Helyes kivitelezés: Az állatokat a farkuk tövénél megragadjuk egyik kézzel, és az aljzatról felemeljük. Ezt követően az állat fejét a kaloda nyitott bejárata felé irányítjuk. Mivel a rágcsálók kedvelik a rejtőzködő életmódot, belebújnak a kalodába. A rögzítő dugattyúval rögzítjük az állatot. A beavatkozás alkalmazhatósága: ennek segítségével az állat alkalmas lehet pl. farokba történő injekció beadására éber állapotban. Textíliába csomagolás az állatok mozgásának korlátozására Usage of textile Szükséges anyagok: vizsgáló kesztyűk, textília Helyes kivitelezés: az állatokat megragadjuk a farok tövének közelében, majd egy kúp alakra meghajtogatott textíliába vezetjük be. Mivel kedvelik a sötétséget és a textília puha, szívesen bújnak be ide az állatok. 20

21 A beavatkozás alkalmazhatósága: ezt az eljárást csak az állatok rövid ideig tartó megragadására, például ip szúrás kivitelezésére használjuk. II. Egerek - Mice (30 min) Kötelező feladatok Obligatory practice 1. Az állatok rövid ideig tartó megragadása - Restraint for shorter time Megragadás az állatok farkának segítségével - Restraint at the tail Szükséges anyagok: vizsgáló kesztyűk Helyes kivitelezés: az állatokat a ketrecben a farok tövének közelében fogjuk meg, majd emeljük meg, ezt követően szilárd felületre (másik ketrec, vagy ketrecrács) helyezzük. Nem szabad a farok végét megfogni, mert a farok végén a bőr megsérülhet, sőt teljes mértékben leválhat, leszakadhat! A beavatkozás alkalmazhatósága: ezt az eljárást csak az állatok rövid ideig tartó megragadására, például áthelyezésük (egyik ketrecből a másikba, vagy kalodába helyezés, súlymérés, esetleg egy másik beavatkozás előkészítése) céljából használjuk. Kaloda alkalmazása az állatok áthelyezésére Use of a restrainer Szükséges anyagok: vizsgáló kesztyűk, kaloda Helyes kivitelezés: Az állatok elé helyezzük a henger alakú kalodát, majd kezünkkel az állat fejét a kaloda nyitott bejárata fele irányítjuk. Mivel a rágcsálók kedvelik a rejtőzködő életmódot, belebújnak a kalodába. A kalodát megemelve áthelyezzük őket egy másik ketrecbe. A beavatkozás alkalmazhatósága: ennek segítségével az állat alkalmas lehet pl. másik ketrecbe való áthelyezésre, súlymérésre Megfogás csészefogással Grasping with cup handling technique Szükséges anyagok: vizsgáló kesztyűk Helyes kivitelezés: az állatokat a mellkasuk alatt fogjuk meg úgy, hogy másik kezünkkel is az állat alá nyúlunk, majd mindkét kezünkkel csészét formázunk. A beavatkozás alkalmazhatósága: ezt az eljárást csak az állatok rövid ideig tartó megragadására, például áthelyezésük céljából használjuk. 2. Az állatok megragadása és megtartása - Restraint for longer time Megragadása a hát bőrénél a kétkezes technikával - Restraint of rats using the two hand scuff restraint procedure Szükséges anyagok: vizsgáló kesztyűk Helyes kivitelezés: Az állatokat a farkuk tövénél megragadjuk egyik kézzel, majd rácsra helyezve hagyjuk, hogy mellső lábaikkal megkapaszkodjanak a rácsban. Másik kezünk első három ujjának segítségével a hátuk laza bőrét a gerinc mellett mindkét oldalról megragadjuk, majd az állatot az aljzatról felemeljük és a hátára fordítjuk. A beavatkozás alkalmazhatósága: ennek segítségével az állat alkalmas lehet pl. injekció beadására éber állapotban. 21

22 Megragadása a hát bőrénél a egykezes technikával - Restraint of rats using the one hand scuff restraint procedure Szükséges anyagok: vizsgáló kesztyűk Helyes kivitelezés: Az állatokat a farkuk tövénél megragadjuk egyik kézzel, majd a farkat az azonos kéz 4. és 5. ujjába rakva ragadjuk meg. Az így felszabadult első három ujjunk segítségével a hátuk laza bőrét a gerinc mellett mindkét oldalról megragadjuk, majd az állatot az aljzatról felemeljük és a hátára fordítjuk. Ezt a módszert az állatok nagyobb mérete miatt nem alkalmazzuk patkánynál. A beavatkozás alkalmazhatósága: ennek segítségével az állat alkalmas lehet pl. injekció beadására éber állapotban. 3. Hím és nőnemű egyedek megkülönböztetése - Sexing Szükséges anyagok: vizsgáló kesztyűk A fenti módszerek (1-3) egyikével az állatot a hátára fordítjuk, majd az urogenitális nyílások távolságát vizsgáljuk meg. Ha ezek távolsága nagy, hím egyedet, míg ha kicsi, nőstény egyedet látunk. III. Bemutató - Presentation 1. Kaloda alkalmazásának bemutatása az állatok megtartására Usage of restrainer for a complex inervention Szükséges anyagok: vizsgáló kesztyűk, kaloda Helyes kivitelezés: Az állatokat a farkuk tövénél megragadjuk egyik kézzel, és az aljzatról felemeljük. Ezt követően az állat fejét a kaloda nyitott bejárata fele irányítjuk. A bemutatjuk, hogy a hengeres kaloda bemetszésein hogyan tudjuk kivezetni az adott beavatkozáshoz szükséges testrészt (farok, elülső- hátsó végtagok) A beavatkozás alkalmazhatósága: ezt az eljárást az állatokon történő enyhébb beavatkozások során alkalmazzuk (pl.: ip, vagy im injekciózás). IV. Nyúl, tengerimalac Rabbit, guinea pig (15 min) Kötelező feladatok Obligatory practice 1. Az állatok rövid ideig tartó megragadása - Restraint for shorter time Megragadása a hát bőrénél a kétkezes technikával (nyúl, tengerimalac)- Restraint of animals using the two hand scuff restraint procedure (rabbit, guinea pig) Szükséges anyagok: vizsgáló kesztyűk Helyes kivitelezés: Az állatokat a nyakuk alatt a hát bőrénél fogva megemeljük, miközben másik kezünkkel az állat alsó testfelét alátámasztjuk. A beavatkozás alkalmazhatósága: ezt az eljárást csak az állatok rövid ideig tartó megragadására, például áthelyezésük (egyik ketrecből a másikba, vagy kalodába helyezés, súlymérés, esetleg egy másik beavatkozás előkészítése) céljából használjuk. Megfogás nyitott kéz technikával (tengerimalac) - Grasping with open hand technique (guinea pig) Szükséges anyagok: vizsgáló kesztyűk 22

23 Helyes kivitelezés: az állatokat a mellkasuk alatt fogjuk meg úgy, hogy másik kezünkkel is az állat alá nyúlunk és megtartjuk a hátsó testfelet is. A beavatkozás alkalmazhatósága: ezt az eljárást csak az állatok rövid ideig tartó megragadására, például áthelyezésük céljából használjuk. 2. Az állatok megragadása és megtartása - Restraint for longer time Megragadása a törzsük hátulról történő átfogásával (csak tengerimalac) - Grasping of animals around the thorax (guinea pig) Szükséges anyagok: vizsgáló kesztyűk és a domináns kezünkre harapás-biztos kesztyű Helyes kivitelezés: A domináns kezünkkel az állatok válla alatt a törzset megragadjuk, a mellső lábakat keresztezzük, miközben másik kezünkkel megragadjuk, tartjuk és rögzítjük a hátsó testfelet. A beavatkozás alkalmazhatósága: ennek segítségével az állat alkalmas lehet pl. injekció beadására éber állapotban. 3. Hím és nőnemű egyedek megkülönböztetése - Sexing Szükséges anyagok: vizsgáló kesztyűk A fenti módszerek egyikével az állatot a hátára fordítjuk, majd az urogenitális nyílások távolságát vizsgáljuk meg. Ha ezek távolsága nagy, hím egyedet, míg ha kicsi, nőstény egyedet látunk. V. Bemutató Presentation 1. Az állatok megragadása és megtartása - Restraint for longer time Megragadás a hát bőrénél a kétkezes technikával II, majd rögzítése (nyúl)- Grasping using the two hand scuff restraint procedure and restraint (rabbit) Szükséges anyagok: vizsgáló kesztyűk Helyes kivitelezés: Az állatokat a nyakuk alatt a hát bőrénél fogva megemeljük, miközben másik kezünkkel az állat alsó testfelét alátámasztjuk. Ezt követően szilárd felületre helyezzük az állatokat, majd hátsó végtagjaikat megragadva rögzítjük őket. A beavatkozás alkalmazhatósága: ennek segítségével az állat alkalmas lehet pl. injekció beadására éber állapotban 2. Textíliába csomagolás az állatok mozgásának korlátozására (nyúl) - Usage of textile (rabbit) Szükséges anyagok: vizsgáló kesztyűk, textília Helyes kivitelezés: az állatokat megragadjuk a farok tövének közelében, majd egy kúp alakra meghajtogatott textíliába vezetjük be. Mivel kedvelik a sötétséget és a textília puha, szívesen bújnak be ide az állatok. A beavatkozás alkalmazhatósága: ezt az eljárást csak az állatok rövid ideig tartó megragadására, például ip szúrás kivitelezésére használjuk. VI. Állattartó ketrecek tisztítása, előkészítése. Az állatok áthelyezése tiszta ketrecbe Cage cleaning, littering (15 min) 23

24 A gyakorlat célja: Megismertetni a hallgatókkal az állattartó ketrecek tisztításának folyamatát és az ehhez szükséges munkaszervezést. Szükséges anyagok: gumikesztyűk állattartó ketrec szennyezett alommal kaparó mosogatáshoz 3 kád (detergens oldat, tiszta csapvíz, 2%-os Terrarin oldat) kézi permetező palack Terrarin 2% oldat tiszta alomanyag (zsákban) tiszta ketrecek tiszta itatóedények tiszta ketrecfedelek táp (zsákban) mérőedények állattartó ketrecek egy-egy patkánnyal Szennyezett ketrec tisztítása (bemutatás): Első lépésként a szennyezett alom eltávolítása történik. Amennyiben rendelkezésre áll, ajánlott az alomelszívó használata. Ennek hiányában arcmaszk használata kötelező! A következő lépés a ketrec falához tapadt szennyeződések mechanikai eltávolítása kaparóeszköz segítségével. A fizikai szennyeződések eltávolítását a kémiai tisztítás és fertőtlenítés követi. A ketreceket először a detergenst tartalmazó mosogató medencében kell megtisztítani. Ebben a lépésben mosogató kefe használható. A második kádban a ketrecek tiszta vízzel történő öblítése történik, majd harmadik lépésként a 2%-os Terrarin fertőtlenítőszeres oldatba merítés következik. Az utóbbi két lépés során kefe nem használható! A fertőtlenítőszeres oldatot nem töröljük le, hagyjuk a ketrecre rászáradni! Tiszta ketrecek előkészítése, összeállítása, állatok áthelyezése A tiszta ketrecek az előzőleg ismertetett tisztítási folyamaton estek át. Előkészítésük során kézi permetező palackból Terrarin oldatot juttatunk a belső felszínére. Ennek száradását követően mérőedény segítségével megfelelő mennyiségű (kb. 1,5-2 cm egyenletes vastagságban) alomanyagot terítünk a ketrec aljára. Az így előkészített ketreceket a patkányok által használt ketrecek mellé készítjük, utóbbiakból eltávolítjuk az itatóedényeket és leemeljük a ketrec fedelét és az állatokat a tiszta ketrecbe, a korábbi gyakorlatokon megismert megfogási technikák valamelyikével helyezzük át. A ketrecekre tiszta fedelet rakunk, majd a csapnál megtöltött, tiszta itatóedényt adunk az állatoknak és mérőedény használatával a szükséges mennyiségű táppal is ellátjuk őket. Végezetül a használt ketreceket félrerakjuk. Kötelező feladat Obligatory practice Tiszta ketrec önálló összeállítása (forgács, táp, ivóvíz és környezetgazdagító játék behelyezése), majd a tanultak alapján egy állat önálló áthelyezése a tiszta ketrecbe. 24

25 4. Core modul 4/5: A konvencionális állatház felépítése és működése állatház látogatás (Set up and operation of an conventional Animal house) Dr. Seres Adrienn egyetemi tanársegéd SZTE Gyógyszerésztudományi Kar Gyógyszerhatástani és Biofarmáciai Intézet Helyszín: A Gyógyszerhatástani és Biofarmáciai Intézet Kísérleti Állatháza A Szegedi Tudományegyetem Gyógyszerhatástani és Biofarmáciai Intézetének Kísérleti Állatháza tenyésztői és felhasználói engedéllyel egyaránt rendelkezik, az Állatházban egerek (Mus musculus), patkányok (Rattus norvegicus), tengerimalacok (Cavia porcellus), valamint nyulak (Oryctolagus cuniculus) tartása ill. szaporítása engedélyezett. A kísérleti állatok tartása megfelel az állatok védelméről és kíméletéről szóló évi XXVIII. törvénynek, ill. az állatkísérletekről szóló 40/2013. Kormányrendelet vonatkozó előírásainak. Az Állatház négy különálló helyiségből áll, melyeket a folyosó helyiség köt össze. Az 1. és 2. helyiségben GLP vizsgálatokhoz szükséges állatkísérletek lebonyolítására van lehetőség. Ezen helyiségek rendelkeznek egy kisebb, zsilipként szolgáló előtéri helyiséggel. Itt nyílik lehetőség a külső, szennyezett ruhák tiszta ruházatra történő cseréjére. Az 1. helyiségben, elválasztva az állatok tárolására használt helyiségtől, található a tiszta ketrectároló. A 2. helyiség három kisebb egységből épül fel: mosogató helyiség, alom- és takarmány raktár, ill. kezelő helyiség. A 3. helyiségben tartjuk a saját felhasználásra tenyésztett állatainkat, míg a 4. helyiségben történik maga a tenyésztés. Működési Szabályzat (Szabványműveleti Előírások) - Operational Regulation Az Állatház a Gyógyszerhatástani és Biofarmáciai Intézet mindenre kiterjedő Szabványműveleti Előírásainak megfelelően működik. Ilyen Szabványműveleti Előírások a teljesség igénye nélkül a következők: Munkaruha, védőfelszerelés használata az állatházban Állatházi klíma kezelése, karbantartása Kísérleti állatok tartáskörülményei Állattartási körülmények regisztrálása A kezelők rendje Az állatok fogadása, betelepítése, karantén, akklimatizálás Az állattartó helyiségek előkészítése az állatfogadására Az állatok etetése, itatása, tápfelhasználás, tápraktározás, vízellátás Almozás gyaluforgács alommal Állattartó ketrecek fertőtlenítése Mikrobiológiai kontrollvizsgálatok Az állatorvos feladatköre Az Állatházban munkaruha (köpeny, nadrág, intézeti lábbeli vagy lábzsák) védőfelszerelés viselése kötelező (szájmaszk, gumikesztyű, fertőtlenítés esetén: védősapka, védőszemüveg, gumicsizma). Környezeti tényezők - Factors in the macroenvironment 25

26 Az Állatistálló helyiségeiben az állatok állandó hőmérsékleten tartása érdekében, a központi klíma egység mellett egy rásegítő hűtő-fűtő működik. A megfelelő levegő biztosítására óránként szor teljes légcsere történik. A tenyésztő helyiségben, mindezeken túl, egy párásító készülék is elhelyezésre került annak érdekében, hogy a növendék állatainknak a legoptimálisabb körülményeket biztosíthassuk. Az Állatház hőmérsékletének, páratartalmának regisztrálása napi szinten történik. Karanténezés - Quarantine Az adott vizsgálathoz szükséges állatigényt a vizsgálat vezetője határozza meg, majd az Állatház vezetőjével történő egyeztetést követően az Állatház vezetője megrendeli a kívánt állatokat és a tartásukhoz szükséges alomanyagot, ill. tápot. Az állatfogadás napjának ismeretében a betelepítés előtti fertőtlenítést az állatgondozó végzi el, majd ellenőrzi a megfelelő klímaviszonyokat (hőmérséklet, páratartalom, légcsere, világítási program). Az újonnan beérkezett állatokat elkülönítve helyezzük el, az állatok karanténba kerülnek, melynek ideje 5 nap. Az állatok egészségügyi állapotát a beérkezésük napján a vizsgálatvezető vagy az általa kijelölt személy és az állatgondozó szemrevételezi (szem, fül, száj, szőrzet, bőr, hasi tájék, külső nemi szervek, végbélnyílás, végtagok, körmök, járás, viselkedés, légzés). Amennyiben az állatok beszállítását végző cég garantálja az állatok egészséges állapotát, további vizsgálat nem szükséges. Amennyiben betegségre utaló tünetek merülnek fel, állatorvosi vizsgálat szükséges. A karantén befejeztével jegyzőkönyvben kell igazolni, hogy az állatok kísérletre alkalmasak. Az állatok ellátása - Care of animals Az állataink almozása, etetése és itatása napi szinten történik ad libitum. Minden almozás alkalmával ketreccserét végzünk. Amennyiben a vizsgálatra vonatkozó protokoll előírja, tápfogyási, ill. tápfelhasználási jegyzőkönyvet kell vezetni. Környezetgazdagítási stratégiánk részeként az állatoknak szemes kukoricát is adunk, zenehallgatásra van lehetőségük, valamint a tenyészállatoknak nagyobb mennyiségű almot teszünk a ketrecekbe, hogy a fészeképítési ösztönüket kiélhessék. Fertőtlenítés - Disinfection A kezelők higiénés státuszának fenntartása érdekében napi rendszerességgel történik a padozat, a kezelő asztalok, a berendezési tárgyak lemosása és fertőtlenítése. Minden új állomány érkezése előtt a kezelő teljes fertőtlenítése (beleértve a falakat és nyílászárókat) megkövetelt. A tisztító- és fertőtlenítő szereket a mindenkori használati utasításnak megfelelően kell használni. A rezisztencia elkerülése érdekében célszerű ezeket a tisztítószereket évente váltani. Amennyiben a vizsgálat megköveteli, mikrobiológiai kontrollvizsgálatokat (minősített táp- és alomanyag alkalmazása, ivóvíz minősítése) végeztetünk az állatok beérkeztetése előtt. 26

27 5. Function specific modul 7-8: Minimálisan invazív beavatkozások altatás nélkül: Injekciózás fantomokon (sc; im; iv, ip). Gyógyszerek orális és nem-orális bevitele a gyakorlatban (gavage); Dr. Varga Gabriella egyetemi tanársegéd, Dr. Szűcs Szilárd Ph.D. hallgató SZTE ÁOK Sebészeti Műtéttani Intézet I. Injekciózás Gyógyszeres kezelést injekció formájában akkor alkalmazunk, ha 1/ a gyógyszert szájon át nem lehet beadni, 2/ a hatóanyag a bélben elbomlik, vagy onnan nem szívódik fel, és 3/ gyors hatást akarunk elérni. Az injekció beadása fertőzésveszéllyel járhat, ezért a sterilitás szabályainak betartása mellett kell végezni. Injekciózás kellékei: fecskendők, tűk. 1. Fecskendő- és tűválasztás Selection of the syringe and the needle Fecskendők Syringes Részei Parts: henger (alsó beszűkülő része a kónusz, ide csatlakozik a tű), dugattyú. Injekciós tűk Needles Rozsdamentes acélból készülnek. Típusai Types: o Rekord: üveg+fém (nehezen tisztítható), üveg (könnyen tisztítható, magas hőn is sterilezhető, törékeny). Mindkettőt már csak ritkán használják. o Műanyag (Luer): ma már többnyire ezt használják, egyszerhasználatos, gyárilag sterilizált. o Köbtartalom alapján: 1 (Tuberkulin, 0,01 ml-s beosztással), 2, 5, 10, 20, 25, 50, 60 ml- es. Rekord tű: fém dróttal (mandrin). Szérumtű: hosszú (5 cm), vastagsága számozással: 1-6, 1 a legvastagabb. A Rekord tű csak a Rekord fecskendőhöz csatlakoztatható. Egyszerhasználatos (Luer) tű: fém+műanyag kónusz, steril, nemzetközileg elfogadott színkód jelzi a méretet (G=gauge, a tű külső átmérőjét jelzi). A műanyag (Luer) fecskendőhöz csatlakoztatható. Ic., sc., im. tű vékonyabb, rövidebb. Számozásuk 1-30, 30 a legvékonyabb. Szárnyas tű (+kanül): flexibilis, jól rögzíthető műanyag szárnyakkal. 27

28 Branül: tű+katéter kombináció. Részei: műanyag katéter rögzítő szárnyakkal, a katéternél hosszabb fémtű, szelepes injekciós port zárható fedőkupakkal, vérgyűjtő kamra. Az injekciós port szelepe lehetővé teszi az iv. injekciók beadását, ugyanakkor meggátolja a folyadék visszaszivárgását ill. beszívódását. Használat után a szelep automatikusan záródik. Állatkísérletes felhasználásuk Usage in animal experiments A laborállatok injekciózásánál általában az embernél is alkalmazott eszközöket használjuk. A lehető legvékonyabb tűt válasszuk, hogy elkerüljük a felesleges fájdalmat injekciózás során. A feladatra még alkalmas legkisebb tű használataa biztosítja a legnagyobb pontosságot. Ha veszélyes, vagy viszkózus anyagokkal dolgozunk, használjunk olyan fecskendőt, amely lehetővé teszi a tű rögzítését. A kisebb laborállatok számára (egér, nyúl, hörcsög, tengeri malac) általában elég az alábbi 3 tűméret: Sárga tű (25 gauge-es), kék tű (23 gauge-es), zöld tű (21 gauge-es). Az utóbbit elsősorban viszkózus oldatokkal való immunizálásra és folyadék leszívásra használjuk. A fent említetteken kívül kis állatok esetén jól használható az inzulinos fecskendő, amely 0,5-1 ml térfogatú és 29 gauge-es tűvel van ellátva. 2. Az injekció típusai, felszívása Injection types and aspiration Injekciós gyógyszer típusai: oldat, por. Types of injected drugs: solution, powder Injekciós oldat Injection solutions Az ampulla felnyitása után a gyógyszer rövid időn belül be kell adni a sterilitás csökkenése, és a gyógyszer bomlása miatt. Az ampulla nyakát ampullareszelővel átreszeljük, majd az ampulla nyakát letörjük. A gyógyszer felszívásakor a tű nem érintheti az ampulla külsejét. Gumidugós üvegnél először az oldatnak megfelelő mennyiségű levegőt nyomunk az üvegbe a fecskendőből, majd az üveget felfelé fordítva kiszívjuk a gyógyszert. Porampulla Powder ampoule Por alakban azokat a gyógyszereket hozzák forgalomba, melyek oldott állapotban könnyen elbomlanak. Üvegampulla: az oldószer desztillált víz, vagy fiziológiás sóoldat. Gumidugós üveg: befecskendezzük az oldószert az üveg oldalára (egyenletesebb oldódás, csomómentesség), majd az oldatot összerázzuk és felszívjuk. Légtelenítés Air discharge Az injekció beadása előtt a fecskendőbe került levegőt eltávolítjuk: a fecskendőt felfelé tartjuk és a tűn keresztül a levegőt kinyomjuk. Dózisszámítás Calculation of dosage 1%-os oldat 10 mg/ml hatóanyagot tartalmaz, 0,1%-os oldat tehát 1 mg/ml-t, 28

29 10%-os oldat pedig 100 mg/ml-t Példa Example: Egy 300 g-os patkánynak 25 mg/ttkg mebumalt (rövid hatású barbiturát) akarunk beadni. Az 0,3 kg x 25 mg mebumal = 7,5 mg aktív hatóanyag. Ha a mebumal 100 mg/ml (10%) koncentrációjú oldatban van, akkor a patkánynak 7,5 mg/100 ml = 0,075 ml mebumalt kell kapnia. 3. Az injekció beadás formái Injection techniques Intracutan Intracutaneous A bőr rétegei közé adjuk (többnyire bőrpróbák allergia kimutatására, pl. tuberkulin próba, gyógyszerallergiák). Tuberkulin fecskendő (1 ml-es), vékony (25-27G), 1 cm hosszú tű, kis mennyiségű anyag (max. 0,5 ml). A bőrt zsírtalanítjuk, fertőtlenítjük (benzin, jód). Megfeszítjük és a fecskendőt kis szögben (10-20 ) tartva a tűt a bőrbe szúrjuk. A szúrás helyét száraz vattával enyhén letöröljük. Subcutan Subcutaneous Kis mennyiségű gyógyszer bőr alá juttatása. A bőrt hüvelyk- és mutatóujjunkkal összenyomva megemeljük és a tűt (1-1,5 cm hosszú tű) os szögben beszúrjuk a bőr alatti kötőszövetbe. Ha a fecskendő visszaszívása után nincs vér a fecskendőbe, befecskendezzük a gyógyszert. A szúrás helyét száraz vattával fedjük. 29

30 Intramuscularis Intramuscular Nagyobb mennyiségű oldatok és olajos injekciók beadására, a gyors hatás elérése érdekében alkalmazzuk. A bőrt kissé megemeljük, megfeszítjük, és a fecskendőt merőlegesen tartva, a tűt (1,5-2,5 cm hosszú tű) derékszögben gyors mozdulattal az izomba szúrjuk. A szúrás helyét masszírozzuk meg, ezzel segítve a gyógyszer felszívódását. Általában subcutan injekció előnyben részesítendő az intramuscularissal szemben, mivel a legfontosabb laborállat fajoknál a subcutan injekció hatása épp olyan gyors, mint az intramuscularisé, vagy intraperitonelaisé. Továbbá néhány század milliliternél nagyobb mennyiségű folyadék intramuscularis beadása súlyos lokális izomkárosodást okoz. Ez alól a szabály alól kivételt képez néhány gyógyszer, amely nem adható subcutan formában. Például a barbiturátok, amelyek lokális irritatív tulajdonsággal rendelkeznek és hatásuk nem alakul ki teljesen. Intravénás Intravenous Iv. injekciót akkor adunk, ha gyors hatást akarunk elérni, vagy a gyógyszer másképp nem adható be (pl. izgatja a szöveteket). Közvetlenül a keringésbe csak vizes oldatot adhatunk, olajos gyógyszert nem. A vénától centrálisan lévő részt leszorítjuk, hogy a visszafolyást megakadályozzuk. A véna telődéséhez lokális hőt alkalmazunk, vagy gyengén ütögetjük a véna területét. A tűt a véna lefutásának megfelelően, a tű metszlapjával felfelé, os szögben beszúrjuk. Ha a dugattyú visszahúzásakor vér jön, lassan beadjuk a gyógyszert, közben megszüntetjük a leszorítást. A szúrás helyére steril száraz vattát szorítunk és kihúzzuk a tűt. 30

31 Intraperitonealis Intraperitoneal Az intraperitonealis (röviden ip.) injekció különböző anyagok hasüregbe való bejuttatását jelenti. Az ip. injekciózást szinte kizárólag állatokon alkalmazzák, állatorvosi és kísérletes célokból. Általában nagy mennyiségű folyadék beadására használják vérvolumen pótlásakor, ha az alacsony vérnyomás, vagy egyéb okok miatt nem lehetséges megfelelő perifériás véna biztosítása iv. injekciózáshoz. Emellett alkalmas gyógyszerek szisztémás bejuttatására, mivel kivitelezése egyszerűbb, mint a többi injekciós technika. II. Gyógyszerek orális bevitele a gyakorlatban (gavage) A gyakorlat célja: A szájon keresztül történő kezelési, hatóanyag beviteli technika elsajátítása éber rágcsálókban. Helyszín: SZTE ÁOK Sebészeti Műtéttani Intézet A szájon át adagolandó folyadékok bejuttatására alkalmazzuk a "gavage" vagy más néven nyeletés technikáját. Fontos a megfelelő eszköz kiválasztása, valamint a megfelelő méret használata (külső átmérő patkány esetében: 2,5-3 mm; egérnél: 1,5-2 mm), nehogy felsértsük az állat nyelőcsövét. A gyomorszonda anyaga lehetőleg puha katéter (szilasztik vagy gumi), vagy rigid (általában fém vagy műanyag) gömb végű cső lehet; a hegyes katéterek alkalmazását el kell kerülni. A szükséges eszközök: kesztyű, gyomorszonda, a beadandó folyadék Kivitelezés: Előkészítjük a gyomorszondát, megmérjük a térfogatát és feltöltjük a beadandó folyadékkal. Megmérjük, a szájnyílás és gyomor távolságot és megjelöljük a kanülön. Patkány esetében ez 4-5 cm. Az éber patkányt megmarkoljuk a hát bőrénél fogva a vállak magasságában, úgy hogy a fejét is rögzítjük a két fülénél fogva. Kissé lenyomjuk a testét a ketrec aljához, és várunk pár másodpercet, amíg az állat megnyugszik. Ekkor megemeljük és meggyőződünk arról, hogy megfelelően fogjuk az állatot (feszesen kell fogni úgy, hogy a szája kissé nyitva legyen). Oldalról, a fogak elkerülésével bevezetjük a kanült a szájába, figyelve, hogy a nyelvét nehogy hátratoljuk. Majd a gyomorszondát gyors mozdulatokkal levezetjük a gyomorba és beadjuk az anyagot. Patkány esetében a bevihető folyadék volumene maximum 5 ml lehet (testsúlytól függően), míg egér esetében maximum 2 ml folyadék adható be (testsúlytól függően). A nyeletést mindig éber állaton végezzük el, mert altatott állatban könnyen a tracheába juthat a kanül. 31

32 Hibalehetőségek: nem vezetjük elég mélyre a katétert; nem történik meg a szonda feltöltése, így az anyag beadása nem lesz teljes; rossz helyen vezetjük be a flexibilis, puha katétert és elharapja azt az állat; nyelvét hátra toljuk és ezzel fulladást idézünk elő; nem fogjuk elég szorosan a tarkóbőrt és ezzel a fejét el tudja mozdítani az állat; túl szorosan fogjuk a bőrét és a száj nem nyílik ki, vagy fulladást idézünk elő. 1. ábra: Gömb végű egér gyomorszonda; különböző méretek Forrás: gical+instruments&products=feeding+needles; 2. ábra: A megfelelő méretű szonda kiválasztása Forrás: A B C 3. ábra: (A, B) Egér és patkány helyes tartása; (C) a gyomorszonda helyes levezetése Forrás: 32

33 6/1. Additional Task specific modul 20: Az altatószerek dózisának kiszámítása különböző fajok esetén Anesztéziai lehetőségek kisállat modellekben (Possibilities of small animal (rodent) anaesthesia) Dr. Varga Gabriella egyetemi tanársegéd, Dr. Érces Dániel egyetemi tanársegéd SZTE ÁOK Sebészeti Műtéttani Intézet A gyakorlat célja Aim of the practice: Megismerni és összehasonlítani az injekciós és inhalációs aneszteziológiai lehetőségeket Anesztézia injekciós technikával Injekció beadási módok gyakorlása fantomon Practicing injections on phantom: Kivitelezés: injekciós gyakorló párnába adnak be a résztvevők intravénás és szubkután injekciót (a beadás technikai leírását lásd: Injekciózás Injection című fejezet). Az injekciózás során a beadandó szer felszívása erre szolgáló felszívó tűvel történik, majd a beadás előtt tűcserét végeznek a résztvevők, majd légtelenítik a fecskendőt. A bőr fertőtlenítését követően kerül sor az oldat befecskendezésére az adott injekciózási módnak megfelelő szabályok betartásával (lásd: Injekciózás Injection című fejezet) Az állatok tömegének meghatározása Measurement of the bodyweight of the animals: A résztvevőket három csoportban dolgoznak. Minden csoport 2-2 db patkány tömegét méri meg. A mérlegelés során alkalmazzák a Kísérleti állatok megfogása és korlátozása Handling and restraint exercises with laboratory animals című gyakorlat során az állatok megragadásáról és áthelyezéséről tanultakat. A mérést követően az állatokat megjelölik (farokra alkoholos filccel rajzolt sávok) és feljegyzik a tömegüket. Dózis számítás Dose calculation: A mért tömegek alapján kiszámolják a patkányok altatásához szükséges ketamin-xylazin és pentobarbitál dózisát. A pentobarbitál esetében a túlaltatáshoz szükséges dózist is meghatározzák. Patkány altatás Na-pentobarbitállal (számolási feladat) Rat anaesthesia with Na-pentobarbital (calculation task) Ismereteink: állat súlya: ip. altatás dózisa 45 mg/ttkg 10 x-es higítású altató kb. fél órás altatást biztosít Törzsoldat koncentrációja: 60 mg/ml (higítani kell!) Patkány altatás ketamin+xylazin kombinációval (számolási feladat) Rat anaesthesia with Ketamin+Xylazin combination (calculation task) Ismereteink: 33

34 állat súlya: ip. altatás dózisa (ketamin): 50 mg/ttkg ip. altatás dózisa (xylazin): 10 mg/ttkg Ketamin koncentráció: 10% (100 mg/ml) Xylazin koncentráció: 2% (20 mg/ml) Intraperitonealis altatás kivitelezése Implementation of intraperitoneal anaesthesia: Az altatószerekből szükséges dózisok kiszámolását követően a résztvevők elvégzik az állataik altatását. Szükséges anyagok: Fecskendők Injekciós tűk kesztyű altatószer: ketamin+xylazin, Na-pentobarbital Állat: patkány Ip. altatás Na-pentobarbitállal és Ketamin+xylazin keverékkel A megfelelő mennyiségű altatószer előkészítése (oldása, higítása), majd felszívása fecskendőbe. Az egyik résztvevő megfogja az állatot, amíg a társa a has bőrét elhúzva megfeszíti azt, és a tűt a has alsó harmadába beszúrva befecskendezi az altatószert a hasüregbe. Az állatok altatását követően a résztvevők megfigyelik az altatószerek hatásait. Megfigyelik a narkózis szakaszait és ezek időtartamát és az ébredés folyamatát (ketamin+xylazin). Alkalmazzák az altatás mélységének ellenőrzésére alkalmas módszereket: lábreflex bajuszreflex megfordulási reflex farokcsípési reflex fülcsípési reflex Ellenőrzik a vitális paramétereket: légzés frekvenciája, testhőmérséklet mérése, cyanosis Amennyiben szükséges, a testhőmérséklet csökkenése esetén bekapcsolják a fűtőpárnát. Megfigyelik a ketamin + xylazin altatáskor jellemző retrobulbáris ödéma kialakulását (α2 adrenerg agonista hatás): szem nedvesítése! Az állatok szemének védelme Eye protection during the anaesthesia Figyelmet kell fordítani az állatok szemének védelmére is! Az altatás során egyes védekező reflexek megszűnhetnek, köztük a pislogási reflex is, emiatt, hogy nedvesen tartsuk a corneát. az állatok szemhéját csukott helyzetben ragtapasszal rögzíteni kell, vagy szemészeti kenőcsöt kell alkalmazni. Infúziós pumpa bemutatása Setting up an infusion pump (demonstration) 34

35 folyamatos intravénás altatást tesz lehetővé (propofol, nagyállatok altatása). Szükséges anyagok: Braun Perfusor C 20 ml-es fecskendő hosszabbító sóoldat (fecskendő feltöltéshez) Kivitelezés: A fecskendő feltöltését követően az infúziós pumpát bekapcsoljuk. A fecskendő behelyezését követően beállítjuk a beadási sebességet. Amennyiben szükséges, bólus funkció használatával légtelenítjük a hosszabbító toldatot. Fontos: az állatba történő bekötés előtt mindig légtelenítsük a csapot vagy a braunül végét! ( cseppet a csepphez ) 35

36 6/2. Additional Task specific modul 20: Rágcsálók inhalációs altatása (Inhalation anaesthesia of rodents) Dr. Seres Adrienn egyetemi tanársegéd SZTE Gyógyszerésztudományi Kar, Gyógyszerhatástani és Biofarmáciai Intézet A FLUOVAC altatórendszer - Anaesthetic device and agent for inhalative technique: A FLUOVAC segítségével kivitelezet izoflurán altatás - Inhalative anaesthesia with isoflurane gas applying FLUOVAC equipment: Az állatok altató kamrába való helyezése, az altatógáz bejuttatása és a felesleges gáz eltávolítása egy gázlekötő eszközzel (Fluosorber) Az altatás indikciója után az állatot eltávolítjuk a kamrából és az altatást egy az altatógéphez kapcsolt maszk segítségével tartjuk fent. 36

37 37

38 Izoflurán - isoflurane inhalációs narkotikum Hatásai - effects: kardiovaszkuláris rendszer: vérnyomás, szapora pulzus légzést deprimálja harántcsíkolt izmokat elernyeszti malignus hipertermia (ritkán) urogenitális traktus: uterust relaxálja vércukorszintet Nem alkalmazható limitations: vérnyomásméréskor uterusz vizsgálata során (pl.: koraszülés vizsgálata) vércukorszint mérésekor Technikai tanácsok Technical considerations Hosszú műtétek során célszerű az állatot melegíteni (lámpa nem alkalmas kiszáradás veszélye miatt) A maszk megfelelő elhelyezkedésére figyelni (pl.: alhasi műtéteknél ne húzódjon ki az állat feje a maszkból). Légzésre figyelni, főleg idősebb állatoknál (O2 gomb!) 38

39 7. Additional Task specific modul 22/2: Műtői gyakorlat I: Aseptikus technikák, bemosakodás-beöltözés, műtéti terület izolálása. A steril körülmények között végzett munka (Work under sterile circumstances) Dr. Erős Gábor egyetemi adjunktus SZTE ÁOK Sebészeti Műtéttani Intézet A kísérlet sikere szempontjából sokszor követelmény, hogy a beavatkozások steril körülmények között történjenek. A sterilitás definíciója: az életképes mikroorganizmusok hiánya, a teljes csíramentesség, amelyet különböző fizikai és kémiai behatásokkal, módszerekkel, eszközökkel lehet elérni. A fertőzések elkerülése érdekében a felhasznált eszközöknek sterileknek kell lenniük, a kísérletezőnek pedig figyelmet kell fordítania az aszepszis és antiszepszis szabályainak betartására. Az aszepszis olyan ténykedések és eljárások összessége, melyek célja a kontamináció megelőzése. Az antiszepszis alatt pedig olyan eljárásokat értünk, melyek célja a tárgyakon, bőrön, sebben már fennálló, meglévő kontamináció leküzdése fertőtlenítéssel, dezinfekcióval. Napjainkra az aszepszis már részletesen kidolgozott rutin eljárássá vált. A beavatkozás előtt bemosakodást, kézfertőtlenítést kell végezni A beavatkozás közben steril műtősköpenyt és gumikesztyűt kell viselni (A bemosakodás nem teszi a kéz bőrét sterillé!) Az állat bőrét fertőtleníteni kell A műtéti területet izolálni kell A bemosakodás lépései - Steps of scrubbing: Átöltözés (bemosakodó ruha és műtői cipő vagy lábzsák) Sapka és maszk felvétele (a maszknak szorosan illeszkednie kell az arcra és az orra) Az órát, gyűrűt, karkötőt levesszük Higiénés kézmosás szappannal Öblítés A körmök tisztítása szappanos körömkefével (Körömkefével csak a körmöket szabad tisztítani!) Öblítés A kéz és az alkar szappanos tisztítása Öblítés A kezek és az alkar szárazra törlése Az adagolóból egy adag dezinficiens oldatot pumpálunk a tenyerünkbe, és azt a kéz és az alkar bőrébe dörzsöljük (A bedörzsölést egy harántujjnyival a könyök alatt fejezzük be.) A bedörzsölés ideje: 1 perc A bedörzsölést még négyszer megismételjük (4x1 perc). A második alkalommal a könyök alatt három harántujjal, a harmadiknál az alkar közepén fejezzük be. A negyedik adaggal a kezet és a csuklót dörzsöljük be, az ötödikkel csak a csuklót 39

40 A steril köpeny felvétele - The gowning procedure: A dobozból kivesszük a hozzánk legközelebb eső köpenyt, a másik kezünkkel visszatartjuk a többit Hátrébb lépünk a doboztól; a köpeny ne érjen nem steril felszínhez! A köpeny nyaki részét megfogjuk, és magunktól eltartva hagyjuk kibomlani A köpenyt széthajtjuk úgy, hogy a belső felszíne felénk nézzen A köpenyt a nyakrészénél fogva kissé feldobjuk a levegőbe, és mindkét kezünket egyszerre, határozott mozdulattal a nyílásba vezetjük A mögöttünk álló asszisztens a köpenyt a karunkra és a vállunkra húzza, a helyére igazítja, és a hátsó szalagok segítségével rögzíti A műtősköpeny bizonyos részei nem tekinthetők sterilnek felvétel után: A háta és a hónalja Az axillaris vonaltól oldalra eső terület A derék alatti rész A ruha ujja válltól a könyék felett 10 cm-ig A gumikesztyű felvétele - Gloving: A műtősnő először a balkezes kesztyűt tartja elénk. Jobb kezünk mutatóujját a nyílásba belülről beakasztva a nyílást nagyobbra tágítjuk, és bal kezünket határozott mozdulattal a kesztyűbe dugjuk A jobbkezes kesztyűt az előzőhöz hasonlóan tartja felénk a műtősnő, ekkor bal kezünk kesztyűs mutatóujjával kívülről, a visszahajtott mandzsetta alá nyúlva tágítjuk ki a kesztyű nyílását, és jobb kezünket a kesztyűbe dugjuk A műtéti terület lemosása - Scrubbing of the operating area: A lemosást a bemosakodás után, de a steril köpeny felvétele előtt végezzük A lemosást magfogóba fogott steril gézgombócokkal ( bucikkal ) végezzük, és povidonjodidot vagy alkoholos lemosószert használunk Aszeptikus beavatkozásnál a tervezett metszéstől indulva a periféria felé haladunk, a tervezett metszésvonallal párhuzamosan A műtéti terület izolálása - Isolation of the operating area: A lemosott területet steril textíliával vagy vízhatlan papírral el kell különíteni a nem fertőtlenített területektől Az izoláláshoz négy darab izolálókendőt vagy lepedőt használunk A kendőket a felhelyezés után a műtéti terület felé már nem mozgathatjuk, csak a periféria felé 40

41 8. Additional Task specific modul 22/2: Műtői gyakorlat II: Alapvető sebészi technikák (Basic surgical procedures), sebészi csomózás és varrat technikák fantomokon Dr. Varga Gabriella egyetemi tanársegéd, Dr. Érces Dániel egyetemi tanársegéd SZTE ÁOK Sebészeti Műtéttani Intézet 1. Sebészi csomózás Surgical knotting A sebészetben a varratokhoz vagy lekötésekhez használt fonalak végeit sebészi csomókkal egyesítjük. Alapok, követelmények Basic principles, rules Alapvető követelmény a sebészi csomóval szemben: gyors, szilárdan tartó, és megbízható legyen. A nem szabályosan megkötött csomó súlyos posztoperatív komplikációkat okozhat; a laza csomó nagyobb heg képződéséhez vezet, a szorosan megkötött csomó a vérkeringés csökkenése miatt lassítja a sebgyógyulást. A csomó lehetőleg olyan kicsi legyen, mely felszívódó fonál esetén nem okoz szöveti reakciót, nem felszívódónál, mint idegentest minimális szöveti választ idéz elő. A csomózás végén a fonalakat közvetlenül a csomó felett kell levágni (kivéve a bőrvarratoknál, ahol a varratkiszedés megkönnyítésére hosszabb fonalat hagyunk). Sebészi csomózási típusok Types of knots A csomók elkészítésének többféle módja, technikája van. A női csomó vagy kofa csomóban, a mindennapi életben használt két egyszerű csomót kötünk egymás fölé: a második csomóban a fonalak végének iránya azonos az alapcsomóéval. Mivel ez a csomó könnyen kibomlik, a sebészi gyakorlatban nem szabad használni. A sebészetben legalább két egymás fölött elhelyezett csomót ( félcsomó ) tekintünk egy csomónak: az első az alapcsomó, a második, a befejező csomó, mely ellentétes irányú az előzővel, ez rögzíti a helyzetet. A csomózás előtt a fonalvégeket mindig keresztezni kell. A csomók száma a sebészi varrófonal típusától függ, szintetikus monofil fonalakból 5-6 csomót kell kötni a biztonságos rögzítéshez. A sebészetben használatos csomózási technikák: kétkezes csomózás, egykezes csomózás (az egyik kéz csomóz, a másik a fonalvéget tartja, de a csomó meghúzásában mindkét kéz részt vesz), műszeres csomózás. Kétkezes csomózás Two-handed knotting A kétkezes csomózási technika kivitelezése könnyű, a csomózásban mindkét kéz egyformán aktívan vesz részt. Főleg feszülés alatt álló szöveteken alkalmazzuk. Tengerész vagy hajóscsomó. Sebészcsomó. A csomózás technikája azonos a tengerészcsomóéval, de az első csomó végén kétszer vezetjük be a fonalat a hurokba, majd ezt a helyzetet egy másik, ellenkező irányú csomó rögzíti (a tengerészcsomóhoz hasonlóan). Elsősorban feszülő szöveteknél (bőr, fascia) használják. 41

42 Bécsi csomó. Hasonló csomót ad, de más technikával. Gyorsabb, elegánsabb, jól alkalmazható kevésbé feszülő szöveteknél (bőr). Műszeres csomózás Knotting with an instrument Akkor használjuk, ha mélyen fekvő szövetben kell csomózni, vagy ha a fonalak egyik vége rövid (ezzel a technikával fonalat takarítunk meg), vagy ha atraumatikus varróanyaggal dolgozunk. Végezhetjük tűfogóval (leggyakoribb), érfogóval (Péannal), vagy egyéb fogó eszközzel. 2. Szövetegyesítő lehetőségek, varrás, kapcsok Wound closure with stitches and clips A műtét befejezésekor a szöveteket varratokkal vagy kapcsokkal egyesítjük. A varratokban a szöveteket öltésekkel egyesítsük, majd a fonalakat megcsomózzuk. A sebgyógyulás alapvető feltételei: a szövetegyesítés pontos és feszülésmentes legyen, holttér ne keletkezzen, és biztosítsuk a seb optimális vérellátását. Olyan kevés öltést alkalmazzunk, amennyire lehetséges, és csak annyit, amennyi szükséges. Suturát használhatunk vérzéscsillapítás céljából is. Varrattípusok Types of sutures Rétegszám szerint: egyrétegű (csak egyfajta réteget öltünk), két- vagy többrétegű (mindent átöltő). Mélység alapján: egy- és kétsoros (ritkán többsoros). Hosszanti sorrend alapján: egyes (csomós vagy megszakított) és tovafutó. A réteges szövetegyesítés szempontjai Principles of suturing: ne helyezzük túl közel a sebszélhez, hogy a fonal a szöveteket ne szakítsa át. a sebszéltől kb. ½-1 cm-re öltünk be és a másik bőrszélen ugyanilyen távolságra öltünk ki (általában magunk felé öltünk). öltések egymástól egyenlő távolságra legyenek (kb. 1 cm-re). a csomók ne a sebszélek fölé, hanem a sebvonaltól oldalra kerüljenek. egymással szemben öltsünk, így nem keletkeznek ráncok, ill. rések. öltés során csuklónkkal kövessük a tű görbületét. a sebszélek everzióban legyenek (invertált sebszél vastag heggel gyógyul). felületes sebeknél a seb alapjáig öltünk le, így nem marad holttér, melyben a vér, sebváladék könnyen összegyűlhet (sebfertőzés, szövődmények). a fonalat ne húzzuk meg túl erősen, hogy elkerüljük a szövetek ischaemiáját. mély sebet több rétegben zárunk. bőröltésnél több szövetet öltünk át a seb mélyén, mint a felszíni rétegben: 42

43 Varratok elkészítéséhez szükséges eszközök Tools of suturing Sebészi varrótű, sebészi varróanyag, tűfogó, horgas csipesz, kapcsok, kapocsrakó/szedő műszer, illetve különböző varrógépek, szövetragasztók. Tűfogó helyes tartása Handling of a needle holder: Csomós varrat: egyszerű (bőr, fascia, izom) Minden öltés után csomózunk. Vigyázni kell, hogy minden varrat azonos feszüléss alatt álljon. 43

44 Előnye: ha a sutura kilbomlik, a többi varrat még megfelelő tartást biztosít; eltávolítható anélkül, hogy az egész seb szétnyílna. Hátránya: hosszadalmas, mert minden öltést csomóval kell befejezni. Csomós varrat: vertikális matracöltés (Donáti)(bőr) Donati stitch Dupla öltés: oda (mélyen) vissza (felületesen a bőrszélbe). Donati-típusú bőrvarrat készítése A bőrt legtöbbször Donati típusú csomós varrattal egyesítjük. A suturához 40-es lenfonalat v. nylon fonalat és bőrtűt (háromélű vágótű, görbülete kisebb, mint az izomtűé) használunk. A varrat készítése során a seb mélyebb és felületesebb rétegébe külön-külön öltünk be, ezáltal a sebszélek pontosan illeszkednek. A tőlünk távolabbi bőrszélt horgas csipesszel megfogjuk és a sebszéltől kb. 1 cm-re öltünk a bőrbe, mintegy ráhúzva a tűre a sebszélt. Majd a közelebbi sebszélbe öltünk, bentről kifelé haladva. A tűt kihúzzuk a bőrből és megfordítjuk, a tűfogónk helyzete eközben nem változik. Újra befogjuk a tűt a tűfogóba. A bőrszélt megfogjuk horgas csipesszel és beöltünk a bőrszélbe, kb. 1 mm mélyen, a cutis-subcutis határán. A felületes visszaöltéssel pontosan egyesítjük a sebszéleket és megakadályozzuk, hogy a bőrszélek ki, illetve beforduljanak. A tőlünk távolabbi sebszélen belülről öltünk kifelé, ismét a cutis-subcutis határán, kb 1 mm mélyen. Kihúzzuk a tűt, a fonalat megcsomózzuk, nem túl erősen, hogy elkerüljük a csomó alatti terület ischaemiáját. A varrat elkészítése után 0,5-1 cm-s fonalat hagyva a csomók felett. A sebkörnyéket jóddal kezeljük, fedőkötéssel látjuk el. Tovafutó varrat (nem feszülő szövetek, belső szervek fala, gyomor, bélrendszer, nyálkahártya) Continuous suture Előnye: gyorsan kivitelezhető, csak a varratsor elején és végén csomózunk (nem húzzuk át a fonalat teljesen, hanem önmagával csomózzuk), a feszülés egyenletesen oszlik el a seb teljes hosszában. Az öltés során az asszisztens feladata a fonal folyamatos tartása és vezetése (kézzel vagy csipesszel), hogy megakadályozzuk a fonal kilazulását. 44

45 Varrat eltávolítása Removal of stitches A varrat eltávolítás ideje (ált napon belül) függ a varrat helyétől (feszülés alatt lévő területről később távolítjuk el a varratot), a műtéti terület vérellátásától (jobb vérellátású területről hamarabb távolítható el a varrat) és a kísérleti állat általános állapotától. A pofán 3-5 nap, a fejbőrön, és hasfalon 7-10 nap, a törzsön, végtagokon nap múlva történik varratkiszedés. Egyszerű csomós öltés eltávolításakor a bőr dezinficiálása után a fonalat anatómiás csipesszel megfogjuk, kissé megemeljük, és úgy vágjuk át a fonalat a bőr felett, hogy a bőr felszínén lévő részt ne húzzuk át a seben, így elkerüljük a fertőzés kialakulását. Kapcsok eltávolítása a Michel-féle kapocsrakó/szedő műszerrel történik. A kapocs eltávolításakor horgas csipesszel megfogjuk a kapocs száránál lévő gyűrűt. A kapocsszedő élét a sebvonal és a kapocs közé a kapocs hajlatába csúsztatjuk, a műszert összezárjuk, így a kapocs szétnyílik, és a tartóhorgok kicsúsznak a bőrből. 45

46 9. Additional Task specific modul 22/2: Sebellátás gyakorlat (Wound management) Dr. Hartamnn Petra egyetemi adjunktus SZTE ÁOK Sebészeti Műtéttani Intézet 1. Varrat-eltávolítás, steril kötéscsere Removal of stitches and of covering bandage Eszközök: steril csipesz, olló, povidon-jodid oldat, steril törlés (buci) és kötszer Lépések Sebész (steril kesztyűt visel) Csipesz és olló segítségével eltávolítja a varratokat Asszisztens (nem steril kesztyűt visel) Eltávolítja a régi kötést Sebfertőtlenítést végez povidon-jodid oldattal A seb fedése steril kötszerrel Előkészíti a povidon-jodid oldatot és ráönti a sebész által tartott bucira Rögzíti a kötést 2. Nyitott sebkezelés Open wound management Eszközök: steril csipesz, Hidrogén peroxid (2 %), fiziológiás só- és povidonjodid oldat, steril fecskendők, bucik és kötszer. Sebész (steril kesztyűt visel) Asszisztens (nem steril kesztyűt visel) Eltávolítja a régi kötést Óvatosan kiöblíti a sebet sóoldattal Fertőtlenít a sebszélek mentén povidon-jodid oldattal A seb fedése steril kötszerrel Előkészíti a sóoldatot Előkészíti a povidon-jodid oldatot és ráönti a sebész által tartott bucira Rögzíti a kötést 3. Fedő-, és retenciós kötés Covering and retention bandages 46

47 A gyakorlaton alkalmazott kötéstípusok a tapadó-, fedő-, pára-, nyomó-, szorító-, kompressziós- és rögzítő/retenciós kötések. A fedőkötéseket sérülések és sebészi varratok ideiglenes védelmére használjuk. Eszközök: steril csipesz, mull lapok, géz és sebtapasz Lépések, rétegek A sebbel közvetlenül érintkező réteg felhelyezése (mull lap, impregnált lap). Felszívó réteg (vér és excretumok elszívására; több rétegnyi géz). Rögzítő réteg. Fedőkötés: Robert-Jones-féle kompressziós kötés: 47

48 Kompresziós kötés felhelyezése: Schroeder-Thomas-féle retenciós kötés 48

49 10. Additional Task specific modul 22/3 Alapvető sebészi eljárások alkalmazása rágcsálókon; (Surgical interventions) Dr. Varga Gabriella egyetemi tanársegéd, Dr. Érces Dániel egyetemi tanársegéd SZTE ÁOK Sebészeti Műtéttani Intézet A gyakorlat célja Aim of practice alapvető sebészi beavatkozások tanulmányozása kisemlősön (patkány). Beavatkozások - Interventions Trachea kanülálás Véna kanülálás Artéria kanülálás A gyakorlat menete - Schedule of the practice 1. Az eszközök előkészítése - Preparation of instruments szükséges eszközök: olló, anatómiás csipesz és 2 db szemészeti csipesz, finom moszkitó peán, aneurizma klip, fonal a lekötésekhez, kanül a tracheostomiához és kanülök az érpreparáláshoz (artériás, vénás), csapok, heparinos fiziológiás sóoldat feladat: készítsük ki a preparáláshoz szükséges eszközöket, a kanülökre tegyünk csapokat, majd töltsük fel heparinos fiziológiás sóoldattal heparinos fizológiás sóoldat készítése: 0,4 ml heparint adjunk 500 ml fiziológiás sóoldathoz 2. A patkányok előkészítése - Preparation of a rat szükséges eszközök: gumikesztyű, harapásvédő kesztyű, mérleg, injekciós tű és fecskendő, borotva és betadinszappanos víz a borotváláshoz feladat: mérjük meg az állatok súlyát és számítsuk ki a megfelelő altató mennyiséget (Napentobarbitál, 45 mg/kg, ip, 10-szeres hígításban). Szívjuk fel fecskendőbe az altatót és adjuk be az állat hasüregébe a teljes mennyiséget. Az alvó állat nyakát finoman megborotváljuk. 3. Preparálási technikák Surgical procedures in details Az állatot helyezzük az előkészítés után fűtőpárnára hanyattfekvő helyzetben úgy, hogy a feje a mi irányunkba legyen. a./ Trachea preparálása - Tracheostomy Domináns kezünkbe fogjunk ollót, a másikba pedig anatómiás csipeszt. A csipesszel ragadjuk meg a nyak bőrét, majd az ollóval ejtsünk hosszanti bőrmetszést a nyakon. Ekkor láthatóvá válik a páros nyálmirigy. A csipesz segítségével finoman fogjuk meg, majd az ollóval hosszanti irányban finoman válasszuk szét. Ehhez az ollót tartsuk függőlegesen, majd zárt állásban nyomjuk középen a szövetekhez és nyissuk szét a hegyét. Ezzel a módszerrel vérzés mentesen tudjuk elérni a tracheát. A 49

50 nyálmirigyek szétválasztása után válasszuk szét a hosszanti nyakizomrostokat, szintén középen, tompán. Ekkor láthatóvá válik a trachea. Ezt követően az ollót kicseréljük moszkitó peánra. A csipesz segítségével eltartjuk a hosszanti nyakizmot, majd a peán segítségével finoman körbepreparáljuk a tracheát. A megtisztított trachea alá vékony, dupla fonalat vezetünk. A fonalat kettévágjuk és lengőcsomót teszünk mind a proximális, mind a disztális fonalra. Ezt követően a disztális fonalat megfeszítjük és a domináns kezünkbe ollót fogunk és az ollóval megnyitjuk a tracheát (~ 45 fokos szögben tartva). Az így kialakított nyílásba behelyezzük a trachea kanült. A disztális oldalon a fonallal lekötjük a tracheát, majd mindkét fonallal rögzítjük a kanült. b./ Véna jugularis preparálása - Cannulation of the jugular vein A véna juguláris externát a trachea és a clavicula között (félúton) találjuk meg. Legkényelmesebb preparálni a nyálmirigy alsó része alatt a clavicula irányába. Fogjunk mindkét kezünkben finom szemészcsipeszt. Preparáljuk fel a nyálmirigy alsó részét, tompán válasszuk szét a szöveteket egészen addig, amíg egy kéklő területet nem látunk. Ekkor finom preparálással, szintén tompán haladjunk tovább és preparáljuk fel a véna jugularist. A tompa preparálási technika csipesz használata esetén: zárt heggyel gyakoroljunk nyomást a szövetekre, majd finoman nyissuk szét a csipeszt. A körbepreparált ér alá vékony fonalat vezetünk, amelyre lengő csomót teszünk. A fonalat megfogva és megemeljük az eret, ami lehetővé teszi, hogy tovább tudjunk preparálni proximális irányba. Akkor jó a preparálásunk, ha a juguláriszt a clavicula irányába háromszögszerűen kiszélesedő részénél preparáltuk ki. Az így előkészített ér alá vezetjük a proximális fonalat, amelyre szintén lengő csomót teszünk. A disztális fonalat megfeszítve fixáljuk a juguláriszt, majd az olló segítségével a legszélesebb részen (proximálisan) megnyitjuk. A nyílásba behelyezzük a fiziológiás sóoldattal feltöltött (behelyezés előtt ellenőrizni) kanült, metsz lappal felfele, az érben 1-1,5 cm hosszan vezetjük fel. Az eret disztálisan lezárjuk, majd mindkét fonallal az érhez rögzítjük a kanült. A behelyezés és rögzítést követően kipróbáljuk az átjárhatóságát; visszaszívunk egy kevés vért fecskendő segítségével, majd beöblítjük heparinos fizsóval, hogy nehogy bealvadjon. c./ Artéria carotis preparálása - Cannulation of the carotid artery Az artéria carotis communist a trachea és a hosszanti nyakizom között mélyen találjuk meg. A preparáláshoz mindkét kezünkben szemészcsipeszt tartunk. Az egyik csipesszel eltartjuk a hosszanti nyakizom rostokat, a másik csipesszel pedig a mélyből előemeljük kicsit kötegesen az artériát. Tisztán előemelni soha nem sikerül, a nervus vagus rostjai mindig rajta vannak. Ezektől a leggyorsabban és a legfinomabban kell leválasztani a carotist. Ennek technikája a következő. A domináns kezünkben lévő szemészcsipeszt úgy tartjuk, hogy a görbülete lefele nézzen. A másik csipeszt alávezetjük a carotiszos kötegnek, majd a domináns kezünk csipeszével finoman választjuk le a vágus rostokat (vigyázzunk, ne szakítsuk el a rostokat és ne is húzzuk meg nagy erővel, mert az állatok légzését nagyban ronthatjuk). Akkor tiszta az artéria, ha rugalmasan tudjuk húzni. Dupla szálú, vékony fonalat vezetünk az ér alá. Kettévágjuk a fonalat, mindkettőre lengőcsomót teszünk. A disztális fonallal úgy kötjük le az artériát, hogy a lekötés a lehető legdisztálisabb pontra essen. Ezt úgy tudjuk elérni, hogy az egyik szemészcsipeszt behelyezzük az ér alá, ezzel megemelve azt és biztosítva, hogy hozzáférjünk a diszális részéhez. Proximális irányba feltesszük az atraumatikus klippet úgy, hogy a proximális fonalunk a klipp előtt legyen. Ezt követően megemeljük a disztális fonalnál fogva az artériát és az ollónkkal egy apró bemetszést ejtünk az éren, egészen disztálisan. Ezen a nyíláson keresztül bevezetjük a fiziológiás sóoldattal feltöltött kanült (metsz lappal fölfele), majd az érben felvezetjük egészen a klippig. A bevezetést követően először a proximális fonallal, majd a disztálissal is rögzítjük a kanült az érhez. 50

51 Amikor mindkét ponton rögzítettük a kanült, levesszük a klippet. Ekkor lüktetve megjelenik az artériás vér a kanül végén, amelyet heparinos fizsóval beöblítünk, ellenőrizve azt is, hogy nincs levegő a kanülben. 4. Méréstechnika (hemodinamikai és vérgáz) - Measurements (haemodynamic and blood gas) A kipreparált állatok alkalmasak hemodinamikai mérésre és vérminta levételére. A mérőrendszerünket állítsuk és kalibráljuk be (BPR-02 transducer; Experimetria Ltd). Az artériás kanül végén lévő csapot csatlakoztassuk a haemodinamikai mérőrendszer mérőfejéhez. Figyeljünk oda, hogy a mérőfej fel legyen töltve fiziológiás sóoldattal. Mielőtt megnyitnánk a csapot a mérőfej és a kanül között légtelenítsünk. Nyissuk meg a csapot az állat és a mérőrendszer között és a haemodinamikai paramétereket a számítógép monitorról le tudjuk olvasni (szisztolés, diasztolés és közép vérnyomás, szívfrekvencia). Az artériás vérvételhez vegyük le a csapot az artériás kanülről. Az artériás vér azonnal feltölti a kanült és kimossa belőle a fiziológiás sóoldatot. Az első pár csepp vért engedjük ki, hogy valóban tiszta, teljes vért tudjunk venni. A kanül kónuszához csatlakoztassunk egy 1 ml-es fecskendőt, amelybe előzőleg 20 µl heparint tettünk, majd 1,5 ml vért szívjunk ki vérgáz analízisre. A fecskendő eltávolítása után a csapot azonnal helyezzük vissza a kanülre és mossuk be a vért heparinos fiziológiás sóoldattal. 51

52 11. Function specific modul 11/4: Primer szívizom sejtkultúra készítés (Preparation of primary cardiac myocyte cultures) Dr. Csont Tamás egyetemi docens, Dr. Görbe Anikó egyetemi adjunktus SZTE ÁOK Biokémiai Intézet Vizsgálatainkat a Csongrád Megyei Kormányhivatal Élelmiszerlánc-biztonsági és Állategészségügyi Igazgatóság jóváhagyása mellet végezzük. Az újszülött Wistar patkányokat (n=20) 70% etanollal dezinficiáljuk, majd cervicális diszlokációt követően a szíveket eltávolítotjuk és foszfát-puffer oldatban (PBS) tesszük. Majd a szívkamrákat elkülönítetjük és 37 C-on percig 0,25% tripszin oldatban megemésztetjük. Az így kapott sejtszupszpenziót 15 percig centrifugáljuk (2000 rpm) 4 C-on. Felülúszót eltávolítva a sejteket növesztő médiumba (glükóz és glutamin gazdag, Dulbecco módosított Eagle médium /DMEM, Sigma/, 10% fetal bovin szérum, 0.1% glutamin and 50 µg/ml gentamicin) reszuszpendáljuk. A disszociált sejteket 6 well- plate-re visszük fel 37 C-on 90 percig, hogy elkülönítsük a fibroblasztokat a CM-tól. Ezután a felülúszóban található CM-kat Bürker-kamrával számolva átpipettázzuk egy új 24 well plate-re (1x105sejt/well 1 ml növesztő médiumba) és 37 C-on inkibáltuk 5% CO 2 inkubátorban. 24 óra múlva a növesztő médiumot cseréljük. A CM-kat a plate-re helyezés után 72 óra múlva felhasználjuk a normoxiás, illetve szimulált iszkémia/reoxigenizációs kísérleteinkhez. szívek izolálása pitvarok eltávolítása tripszines emésztés centrifugálás Növesztő médiummal kiültetés Elő-kiültetés 1. Neonatális szívizomsejtek tenyésztése; normoxia és hipoxia alkalmazása - Harvesting of neonatal cardiac myocytes /application of normoxia and hypoxia A szívizomsejtket az izolálás után 3 napig normoxiás körülmények között tartjuk. A sejteken 24 órás tenyésztést követően médiumcserét hajtunk végre 1% FBS-t tartalmazó médiummal. Ezután két csoportot hozunk létre. Az egyik csoportban normoxiás oldat és normoxiás körülmények vannak. Viszont a másik csoportnál szimulált iszkémiát hozunk létre, hipoxiás oldat és hipoxiás kamra segítségével 4 órán át. A normoxia során normoxiás oldattal fedjük a sejteket, melynek összetétele: 15 mm glükóz, 2,5 mm karnitin, 5 mm taurin, 125 mm NaCl, 5,4 mm KCl, 1,2 mm NaH 2 PO 4, 0,5 mm 52

53 MgCl 2, 1 mm CaCl 2, 20 mm HEPES, 0,1% BSA, 310 mosm/l, ph-ja 7,4. A reoxigenizáció előtt a normoxiás oldatot médiumra cseréljük. Mind a normoxiás kezelés, mind a reoxigenizáció során normoxiás inkubátorba helyeztük a sejteket, melyben a gázelegy 95% levegőt és 5% CO 2 -t tartalmazott. Más csoportok 240 perc szimulált iszkémiának (SI) és 120 perc reoxigenizációnak vannak kitéve. A SI során hipoxiás oldatban (119 mm NaCl, 5,4 mm KCl, 1,2 mm NaHPO 4, 1,3 mm MgSO 4, 0,5 mm MgCl 2, 5 mm HEPES, 0,9 mm CaCl 2, 0,1% BSA, 20 mm Na-laktát, 310 mosm/l, ph=6,4) és hipoxiás kamrában tartjuk a sejteket, melyben a gázelegy 95% N 2 -t és 5% CO 2 -t tartalmazott. A reoxigenizáció a normoxiás csoportokhoz hasonlóan zajlik. A protokoll végén megvizsgáljuk a sejtek viabilitását, hogy lássuk miként változott az egyes csoportok túlélése a szimulált iszkémia/ reoxigenizációt követően. Normoxiás csoport Szimulált I/R csoport 3 nap 4 óra Normoxia Szimulált I/R 2 óra Reoxigenáció Normoxia + médium kezelés 95% levegő, 5% CO 2 + normoxiás oldat 95% N 2, 5% CO 2 + hipoxiás oldat Viabilitás vizsgálat 2. Viabilitás vizsgálat - Viability assay 2.1 Tripánkék viabilitás teszt - Trypan blue exclusion assay Az inkubálás után a sejteket 0,25 %-os tripszin oldattal 3-5 percig inkubáltuk, felszuszpendáltuk majd Eppendorf-csövekben 2000 rpm-mel 4 C-on 15 percig centrifugáltuk. A felülúszót leszívtuk és a pelleteket 100 µl PBS-ben reszuszpendáltuk, majd 50 µl sejtszuszpenzióhoz 50 µl tripán kéket adtunk és 5 percig inkubáltuk. Ezután Bürker-kamra segítségével megszámoltuk külön a megfestett sejtek és külön az összes sejt mennyiségét, majd a sejtelhalás százalékos értékeit grafikusan ábrázoltuk. 53

54 Csoport Össz sejt Kék Arány (%) Össz Kék sejt Arány (%) Átlag (%) sejt sejt hipoxiás #### #### ### #### #### ### #### #### ### #### #### ### #### #### ### #### #### ### #### #### ### ### AVE ### STDEV ### SEM 2.2 Fluoreszcens viabilitás tesztek - Fluorescent viability assay A 2 órás reoxigenizációs szakasz követően a viabilitás vizsgálathoz két fluoreszcens festést használunk. Először az élő sejtek festéséhez calcein acetomethoxit (AM) használunk melyet az élő sejtek aktívan felvesznek. Sejten belül a működő észterázok lehasítják az AM csoportot, így bent tartva a calceint. PBS lemosás követően megmérjük a fluoreszcencia intenzitásokat. Ezután az össz sejtszám meghatározásához propidium jodidot (PI) alkalmazunk, mely a sérült membránon keresztül képes bejutni a sejtekbe. Ehhez a PI előtt egy párperces digitonin előkezelést alkalmazunk, mely egy membrán pórusképző anyag. Végül a mért intenzitás értékek feldolgozása alapján meghatározzuk a sejtek viabilitását. Majd a szimulált iszkémiás kontrollban túlélt sejtek mennyiségét 100%-nak véve hasonlítottuk össze az inhibitorok hatására megnövekedett viabilitás értékeket. 54

55 Fluoreszcencia intenzitás Calcein AM Propidium Jodid 55

56 12. Function specific modul 11/4: Ex vivo izolált Langendorff szívperfúzió (Ex vivo isolated heart perfusion according to Langendorff) Dr. Csonka Csaba egyetemi adjunktus SZTE ÁOK Biokémiai Intézet 1. Kísérleti állatok altatása Anesthesia of rats Vizsgálatainkat a Csongrád Megyei Kormányhivatal Élelmiszerlánc-biztonsági és Állategészségügyi Igazgatóság érvényes engedélye mellett végezzük. Wistar patkányt ( g) Euthasol-lal intraperitoneálisan oltunk. Az Euthasol 40% injekció kék színű oldat, amely barbiturát származék pentobarbital-na-t tartalmaz hatóanyagként. A pentobarbital gyógyszerészetileg az eutanáziára alkalmas hatóanyagok olyan csoportjába tartozik, melyek fájdalommentes halált biztosítanak, megkímélve az állatot a felesleges stressztől és félelemtől, gyorsan és melléktünetek nélkül kómához vezet, valamint a központi légzési és a vérkeringési központok leállásához. A készítmény alkalmazásakor kerülni kell a bőrrel való kontaktust. Ajánlott használat közben védőkesztyűt viselni. Ha az állat esetleges védekezése során az oldat a kezelő személy sebébe, vagy tűvel a bőr alá kerül, az érintett területet azonnal folyó vízzel ki kell mosni és a sebet erősen ki kell nyomkodni. Véletlen öninjekciózás esetén haladéktalanul orvoshoz kell fordulni, bemutatva a készítmény használati utasítását vagy címkéjét. 2. Szív izolálás Harvesting of the heart Az állatokat 5 perc elteltével megvizsgáljuk, és megfelelő anesztézia esetén a szív izolációjára felkészülünk. Előzetesen a comb mediális felszínéről a bőrt eltávolítjuk, és az állatokat a v. femoralison keresztül 500 IU/kg heparin kezelésben részesítjük a véralvadás meggátlása céljából. A szív izolációjához az állatok mellkasát a processus xiphoideus felől megnyitjuk, a diafragma átvágásával a mellkas oldalán két hosszanti vágással a szegycsontot felhajtjuk. Ezek után a szívet óvatosan előemeljük, és határozott vágásokkal, mélyen, a tüdőkkel együtt azokat az állatokból izoláljuk. Az izolált szervet azonnal 4 C-os Krebs oldatba tesszük a biokémiai folyamatok csökkentése érdekében, a szívet a perfúziós rendszerhez visszük. 3. A szív Langendorff szerinti kanülálása Cannulation of heart according to Langendorff A szívet a Krebs oldatból kiemeljük. Megkeressük rajta az aortaívet, és azt az első artéria eredése előtt haránt irányban elvágjuk. A csonkot (vigyázat, levegő ne menjen bele!) az aorta kanülre húzzuk, bulldog csipesszel rögzítjük, és a perfúziós folyadékot áramlását megnyitjuk. A szívet sebészi cérnával a kanülhöz rögzítjük, és a preparátumról a felesleges szöveti részeket (tüdő, tímusz, erek, perikardium stb) óvatosan eltávolítjuk. 56

57 A Langenforff perfúziót működtetve részletesen megismerkedünk a rendszerrel Equipment termosztáló részek Krebs oldat edényei oxigenizáció Gyakorló kísérletként a következő feladatok elvégzésére nyílik lehetőség Parameters to be examined: koronária átáramlás mérése szívfrekvencia meghatározása aorta nyomásgörbe felvétele, annak elemzése infarktus előidézése a koronáriakeringés megszakításával reperfúzió 5 perc iszkémia után 57