Szignifikáns fertőzés-/kontamináció-változás Vírusok Baktérium/protozoonok/gombák Paraziták Immunkompetens Immundeficiens. Higiénés kategória

Átírás

1 Az állatkísérletek munkahigiénés rendszabályai jegyzet az Állatkísérletek elmélete és gyakorlata B szint kurzus hallgatói számára Dr. Vezér Tünde egyetemi docens A környezeti tényezők, a genetikai faktorok és ezek interakciója nagymértékben meghatározza az állatok kísérleti célú alkalmazhatóságát, a mikrobiológiai státusz pedig kritikusan befolyásolhatja az állati jóllétet valamint a kutatási eredmények validitását és reprodukálhatóságát. Ezért fontos a tenyésztő és vizsgálóhelyeken a mikrobiológiai egységek (pl. egy barrierezett létesítmény 1 szobával, egy berendezés, egy izolátor, egy ketrec, mikroizolátor ketrecek egy csoportja, stb.) megfelelő higiénés fokozatának biztosítása, fenntartása, ellenőrzése és ezek céljából a minőségbiztosítási rendszer részét képező higiénésés egészség-monitoring program kialakítása. A FELASA a higiénés szintek fenntartására különböző módszereket ajánl útmutatóiban ( A FELASA laboratóiumi állatokra egér, patkány, hörcsög, tengerimalac, nyúl, stb. kidolgozott, többször felülvizsgált és (nemzetközileg tervezés, mintavétel, monitor, jelentés, interpretálás szintjén harmonizált) egészség monitoring guideline-ja legutóbb 2014 évben került publikálásra (Laboratory Animals Vol. 48(3): , 2014.). A mikrobiológiai kontroll függ a felhasználói és/vagy kísérleti céloktól. A monitorozás célja lehet: adekvát információszerzés a barrier rendszerekről, a mikrobiológiai egységek adott keretek közt történő működésének meghatározása, a kísérleti állatokból nyert információk és a referencia adott összevethetőségének dokumentálása, valamint korai információ nyerés a higiénés határértékek túllépéséről illetve a megelőzésükre irányuló intézkedések eredményességéről. A higiénés státusz kontrollja kiterjed a laboratóriumi állatokra, a szállítási és tartási körülményekre, (SPF állatház esetén) a barrierekre, a kiszolgáló/járulékos helyiségekre/terekre, a környezetre, a berendezésekre/műszerekre és a személyzetre. A monitorhoz alkalmazható elektronikus regisztráló és riasztó készülékek/berendezések, valamint biológiai, patológiai és klinikai tesztek. A hatékonyság és nyomonkövethetőség érdekében az adatoknak kellően széles körűnek és mélységűnek, az eredményeknek pedig pontosnak és megbízhatónak kell lenni. Mintavételnél fontos szempont a statisztikai szignifikancia. Megbízható és alkalmas mikrobiológiai monitoring program kialakításához körültekintően kell megválasztani a szűrendő (infektív) ágenseket, a minták és vizsgálandó állatok számát és faj(táj)át valamint a mintavétel gyakoriságát. A szűrendő ágens kiválasztása számos tényező, így az orvosbiológiai kutatások (pl. kutatási eredményeket zavaró fiziológiai moduláció); a higiénés státusz; a kórokozó fajspecificitása, zoonotikus potenciálja, prevenciája; a gazda-faktorok (különösen az immunstátusz, egészségi állapot); a mikrobiológiai státusz és a történelmi kontaminációs ráta függvénye. Az egyes laboratóriumi állatfajok monitorizálandó infektív ágenseinek listáját az aktualizált FELASA ajánlások tartalmazzák. A mintaszám meghatározáshoz több formula (pl. ILAR-formula ) ismert, melyekben a mintázandó állatok számát a teszt validitásának és prediktivitásának, továbbá a fertőzések prevalenciájának függvényében határozzák meg. A 100 egyedszámú állományban a standard binominális eloszlás formula alapján 30% infekció/fertőző ágens prevalenciát feltételezve 8-10 állatot szükséges tesztelni ahhoz, hogy közülük egy 95%-os valószínűséggel pozitív eredményt mutasson, de 99%-os valószínűség esetén már 13 állatot kell szűrni. Ugyanezen mikrobiológiai ágens 10% prevalenciája esetén állat tesztelése szükséges. A FELASA mikrobiológiai egységenként általában 10 állat szűrését javasolja, de alacsonyabb prevalencia ráta esetén ennél több teszt végzendő, speciális esetekben pedig kevesebb állattal, de gyakoribb monitoring alkalmazandó.

2 A mintavétel gyakoriságát befolyásolják az infektív ágens biológiai jellemzői és az infektív ágens/infekció prevalenciája. Nagy fertőzőképesség és magas (lokális) fertőzés prevalencia esetén gyakran kell monitorozni. A pevalencia függ a törzstől, az egyedek immunstátuszától, életkorától, nemétől, a mikrobiológiai egységek állapotától, nemétől, a mikrobiológiai egységek állapotától nyitott vagy (mikro)izolált ketrec, az állat vizsgálóhelyen belül és azok közötti mozgásának intenzitása, továbbá a dolgozók munka-rutinjától. Az állományokban az egyes kórokozókra vonatkozó minimum teszt gyakoriságot a évi FELASA ajánlás szerint (pl. egér herpes vírus, MHV; egér rotavírus, MRV; egér és patkány esetén Helicobacter ssp., endo és ektoparaziták; patkány parvovírus, stb. esetén) 3 havonta, illetve (pl. patkány Salmonella ssp., Streptobacillus moniliformis, Pneumocystis ssp; egér Mycoplasma pulmonis, S pneumoniae, LCMV, stb. esetén) évente kell elvégezni. Gyakoribb monitoring szükséges sűrűbb állat/biológiai anyag beszállítás/vételezés, a többcélú egységekben különböző kísérlettípusok lefolytatása, a kutató személyzet gyakori belépése vagy gyakori dolgozó csere esetén. Nemkívánatos ágensek behurcolásának kockázatával járó faktorok: 1. Magas kockázatú tényezők: - gyakori/sűrű állat betelepítés (>1x/hónap) - különböző mikrobiológiai státuszú egységek egymás közelében - különböző tenyészkolóniákból való állatok behozatala - rovarok, vadon élő vagy elvadult rágcsálók állattartó vagy takarmány-, alomtároló helyiségekbe jutása - multifunkciós berendezések és különböző kísérleti típusok - (az állatgondozó személyzeten kívül) a kutató személyzet gyakori belépése az egységbe - az állatok ellátását végző személyzet gyakori forgalma az egységben - közös (pl. képalkotó, magatartás, stb.) vizsgálati műszerek/berendezések, melyeket nehéz megfelelően fertőtleníteni, stb. 2. alacsony kockázatú tényezők: - zárt tenyészkolóniák - all in-all out rendszer - időnkénti/alkalmi állat betelepítés - 1 vagy néhány kísérleti típus A tesztek gyakoriságát a fent említettek mellett az állatállomány egészségi állapotát jelentősen befolyásoló infektív ágenssel való történelmi kontaminációs rátához is szükséges igazítani. A fertőzés-/kontamináció-változás függ az állattenyésztési/-tartási módtól, az állatok mikrobiológiai kategóriájától, a fertőző ágens típusától és a gazda(állatok) immunstátuszától. 1 ábra A mikrobiológiai státusz, az állattartási körülmények, az állatok immunállapotának hatása az infektív ágensek szignifikáns kontaminációváltozása (Forrás: Wisbroth S.H., Peters R., Riley L.K., Shek W.: Microbiological assessment of laboratory rats and mice. ILAR, 39(4): , 1998) Higiénés kategória Tartási mód Gnotobiota Izolátor Mikroizolátor Szignifikáns fertőzés-/kontamináció-változás Vírusok Baktérium/protozoonok/gombák Paraziták Immunkompetens Immundeficiens

3 ketrec SPF Izolátor Mikroizolátor ketrec Nyitott ketrec-berrier Nyitott nembarrier ketrec Jelmagyarázat: fehér: ritka, rács: nem gyakori, szürke: alkalmi, fekete: átlagos, csíkozott: nem alkalmazható A laboratóriumi állatok új és újonnan felbukkanó potenciális patogénjeinek azonosításában és felismerésében szerepet játszó tényezők: a laboratóriumi diagnosztikai metodika (RT-PCR) és a (gyakran aberráns immunrendszerű) transzgén és knockout állat törzsek kialakításának robbanásszerű fejlődése, valamint a laboratóriumi állatok embertől (vizsgáló vagy állatgondozó személyzettől) történő fertőződése. A higiénés státusz fenntartásában fontos alapelv a kísérleti egységek kontaminációjának kizárása. Ennek érdekében az oda belépők/belépések számát a lehető legkisebbre kell csökkenteni. Az állandó személyzeten kívül csak a legindokoltabb esetben a legszükségesebb számban lehet tartózkodni a higiénés egységekben/terekben, ahol érvényes, megfelelő egészségügyi és munka alkalmassági vizsgálati eredmények birtokában csak egészséges személyzet tevékenykedhet. Vendégdolgozó 3 hétig nem dolgozhat a saját állatházában és nem érintheti az otthoni állatait (rágcsáló, nyúl) sem. Az előírt munkaruházaton kívül az egyes beavatkozásokhoz, műveletekhez egyéni védőeszközök (egyszer használatos orr-/szájmaszk, részecskeszűrő félálarc, overall, saválló és harapásbiztos kesztyű, lábzsák, hajvédő, vízhatlan kötény stb.) használata szükséges. Lényeges a higiéne szabályainak oktatása és helyes gyakorlatának betartatása. Fontos a terek, berendezések felületének napi rendszerességgel (és/vagy soron kívül) történő tisztítása, fertőtlenítő takarítása, illetve a vizsgálatok befejezését követő zárófertőtlenítése; az eszközök, műszerek, ketrecek, ketrectetők, itatópalackok szükség szerinti (1-2 hetenkénti) fertőtlenítő mosogatása; továbbá a hulladékkezelés (gyűjtés, tárolás, elszállítás) szabályainak betartása. Elengedhetetlen a személyzet 1-2 óránkénti alkarra és kézre kiterjedő megelőző jellegű helyes kézhigiénés dekontaminációja és a fertőtlenítőszerek fél évenkénti cseréje. A táp/takarmány és alom garantált mikrobiológiai és beltartalmi értékeinek megőrzése céljából lényeges a zárt tárolás és az előírt környezeti paraméterek biztosítása. A mikrobiológiai monitoring (kontroll) A mikrobiológia vizsgálatok célja lehet az SPF terekben a rutinellenőrzés, monitorozás, járványügyi érdek, visszaellenőrzés, stb. A barrier rendszer rutinellenőrzése a nem-kívánatos mikroorganizmusok detektálására vagy a mikrobiológiai környezet változásának és a rutin takarítási folyamatok értékelésének dokumentálására szolgál. Ez utóbbi a műszerek szekunder ellenőrzése és működtetési managementje. A vizsgálatok kiterjednek a táp-, alom, itatóvíz, levegő, a tárgyak, eszközök/berendezések, műszerek, felületek, a fertőtlenítőszerek, a személyzet mikrobiológiai kontrolljára. Lényeges a helyes hulladékkezelés (gyűjtés, tárolás, szállás) körülményeinek monitorozása. Fontos, hogy a mintavételezés valamennyi esetben akkreditált módszerrel, valamint a vizsgálatok/kiértékelések akkreditált laboratóriumban történjenek. 1.) A táp, alom, itatóvíz monitorozása

4 A takarmány/táp és alom mikrobiológiai minőségének ellenőrzését rendszeresen (SPF térben negyedéves gyakorisággal, CV térben legalább évente) szükséges elvégezni az MSZ sz. szabvány szerint úgy, hogy a részminták száma mindkét esetben a bevételezett zsákok 10%-a legyen. Táp- és alom vizsgálat esetén az aerob mezofil baktérium flóra, penész-szám és -flóra, Enterobacteiaceae, Salmonella, szulfitredukáló Clostridium monitorozását végzik. Értékük a hatályos jogszabály szerinti határértékeket nem lépheti át. A vizsgálatokban használt víz (mikrobiológiai és kémiai) minősítő ellenőrzése EU szabványokkal harmonizált MSZ szabványok szerint 3 havonta végzendő. A vízminőség mikrobiológiai jellemzői az E. coli, Enrerococcus, Pseudomonas aeroginosa és a telepszám (22 és 37 C o -on) kontrollra terjednek ki, melyek értéke nem haladhatja meg a hatályos jogszabályban rögzített határértékeket. A táp, alom sterilizálása, a víz filteres szűrése SPF terekben és abszolút (mikro)izolátorban szükséges. 2.) A vizsgálóhely, tárgyak, eszközök, berendezések felületének monitorozása A zárt terek (helyiségek, izolátorok) levegőjének aerob és anaerob kórokozókra történő rendszeres mikrobiológiai vizsgálata (folyamatos működés esetén félévente) végzendő. A helyiség felületeinek (padozat, lábazat, mennyezet), továbbá az állványzat, a ketrecek, berendezési tárgyak, műszerek, eszközök fertőzöttségi vizsgálatát hasonló gyakorisággal kell biztosítani. Követelmény a Gram negatív kórokozóktól (különösen a Pseudomonas ssp) mentesség, azonban a spórás és hőrezisztens nempatogén csíraszám alkalmanként alacsony határértéken megengedhető. Az itatópalackok rendszeres (hetenkénti) fertőtlenítő mosogatása és meghatározott időközönkénti sterilizálása szükséges. 3.) Az állatok monitorozása A csoportosan tartott laboratóriumi állatok mikrobiológiai státuszára fokozott figyelmet kell fordítani. Az SPF állomány mikrobiológiai státuszát hitelesített (negyed illetve egy évig érvényes) minőségi bizonylat garantálja. A higiénés fokozat megőrzése/fenntartása a (szűrőbetétes, zárt dobozban történő) szállítás, a karantén, az 5 napos akklimatizáció és a kísérlet alatt is elengedhetetlen. A karantén, stabilizáció és elkülönítés: A karantén az újonnan érkező állatok elkülönítése azoktól a létesítményben már elhelyezett állatoktól, addig, míg megállapítjuk/meghatározzuk az új állomány egészségügyi vagy mikrobiológiai státuszát. A hatékony karantén minimalizálja a patogének behurcolását az állományba és a személyzet zoonotikus potenciálú kórokozókkal történő fertőzési lehetőségét is. Időtartama laboratóriumi kisállatok esetén 1 hét, nagyállatoknál (kutya, macska, majom, stb.) 6 hét. A felhasználás előtt a karantén időtartamától függetlenül időt kell biztosítani az újonnan érkezett állatoknak az élettani, a pszichés és táplálkozási stabilizációra. A stabilizációs (akklimatizációs) idő hossza függ a szállítás tartamától és típusától, az állatfajtól és annak tervezett felhasználásától. Az állatok fajonkénti fizikai elkülönítése a fajok közti betegségek átvitelének megelőzése, a szorongás kiküszöbölése valamint az esetleges élettani- és magatartásváltozások miatt bekövetkező fajok közti konfliktusok kiküszöbölése céljából ajánlott. A különböző fajok elkülönítése külön szobában szükséges, azonban elfogadható megoldás elosztószekrényben, lamináris áramlású bokszokban, szűrt vagy szeparált ventillációjú ketrecekben vagy izolátorokban történő elhelyezés is. Bizonyos esetekben elfogadható különböző fajok egy szobában történő elkülönítése, ha pl. két fajnak hasonló a patogén státusza és a viselkedése kompatibilis. Állatok leölését nem igénylő monitoring Nem-kívánatos kórokozók mikrobiológiai (bakteriológiai, virológiai, parazitológiai, stb.) tenyésztése a testnyílásokból vett (pl. orr- és garat) váladékból vagy bélsárból; ellenanyag titer

5 meghatározása (szerológiai monitor) pl. szemzug vagy farok vénás vérből történhet. A használat után 48 óra múlva végzett itatópalack kultúra prezentálja a víz P. aeruginosa oralis kontaminációját. Állatok leölését igénylő monitoring Definiált mikrobiológiai flórával asszociált állatok nekropsziát követő szerv-, szövet mintáiból mikrobiológiai, szerológiai vagy hisztopatológiai vizsgálat végezhető. Pl. a nasopharingeális mosófolyadékból S. pneumoniae, Pseudomonas pneumotropica, M. pulmonis, stb. (FELASA guideline lista szerinti) kimutatása lehetséges. A vizsgálatokhoz és mintavételezéshez használt állatok 1.) Rezidens ( állandó lakos, a vizsgálatban résztvevő állatok Fogékonyságuk függvényében a mikrobiológiai egység különböző részeiről és ketreceiből vett valamennyi korú és nemű állatot szükséges mintázni. Legalább 100 azonos fajú, nyitott ketrecben, konvencionális körülmények közt tartott állat mintanagyság becsléséhez alkalmazható az ILAR formula. A formula alapján a mintázandó állatszám = log 0,05 (95%-os konfidencia intervallum esetén) / log N (N=egészséges állatok %-a, pl. 30% infekció prevalencia esetén N= 70%). Azonban kis számú állat izolátorban, IVC-ben vagy más ketrecszintű barrier esetén az ILAR-formula használata nem megfelelő a minta nagyságának meghatározásához. 2.) Szentinel (őrszem) állatok Általában a vizsgált (rezidens) állat populációval azonos fajú és fajtájú, teljesen vagy közel azonos korú állatok, melyeket úgy helyeznek el illetve olyan körülmények közt tartanak, hogy a fertőzés lehetőségének fokozottan legyenek kitéve. Az őrszem állatok alacsony fertőzés prevalenciájú ketrec-szintű elkülönített tartást tesznek lehetővé, mert jelzik a prevalencia fokozódást. Lehetnek direkt (a rezidenssel azonos ketrecbe helyezett) és indirekt (a rezidensek által szennyezett anyagokkal alom, víz vagy táp exponált) szentinelek. A szennyezett szentinel alomnak legalább 50%-nak kell lenni és azt hetente szükséges cserélni. Nem mindegyik mikrobiológiai ágens vihető át könnyen szennyezett anyagokkal (pl. LCMV, Sendai vírus, Pasturella pneumotropica), vagy a kilélegzett levegővel (pl. Helicobacter spp, egér rota- és parvovírus), ezért bizonyos körülmények között a szentinelek a monitorozott állatokkal direkt kontaktusban (azokkal egy ketrecbe helyezve) tarthatók. Ekkor a szentinelek a vizsgálat előtt legalább 6 héttel szükséges a rezidensekkel azonos egységben elhelyezni. Bizonyos ágensekkel (pl. M. pulmonis, P. pneumotropica) való infekcióhoz, ill.szerokonverzióhoz azonban hosszabb (10-12 hetes) expozíciós periódusra van szükség. Új szentinelek elhelyezése az egységben negyedévente szükséges. Általában IVC esetén egy szentinel ketrecet kell elhelyezni, melyben az állatok száma 2-5 lehet. Az egységenkénti számukat befolyásolja a tartás típusa, a fertőzés akvirálásának kockázata, az észlelés módszere. Az indirekt szentinel módszerrel önmagában nem lehet megbízhatóan detektálni minden fertőző ágenst, de direkt szentinel használat vagy rezidens állat mintavétel nem mindig lehetséges. Mikor ketrec-szintű elszigetelt tartást (pl. IVC) alkalmaznak, nehéz teljes áttekintést kapni az egészség fertőző ágens státuszáról. Ezért az optimális HM programhoz a higiénés teendők komplex alkalmazása szükséges. 4.) A személyzet mikrobiológiai kontrollja A személyi higiéne helyes gyakorlatának ellenőrzése a kéz felületének sterilitási vizsgálatával féléves gyakorisággal szükséges. 5.) A fertőtlenítőszerek sterilitási vizsgálata

6 Az alkalmazott fertőtlenítőszereket 6 havonta érdemes cserélni, sterilitásukat pedig hasonló gyakorisággal kell elvégezni. Forrásanyagok: Companion Guide to Infectious Diseases of Mice and Rats Biosafety and Biotechnology Unit. Biosafety in laboratory animal facilities. A practical approach. Ed.: Peeters J. Brussels, Belgium, Guide for the care and use of laboratory animals (Eighth Edition). Committeefor the update of the guidelinefor the care and use of laboratory animals. The National Academies Press, Washington, D.C., USA, Howard B., Herck H., Guillen J., Bacon B., Joffe R., Ritskes-Hoitinga M.: Laboratory Animals. Report of the FELASA Workong Group on evaluation of quality systems for animal units. 1 Apr DOI: / ( ILAR. Committee in long-term holding of laboratory rodents. Long-term holding of laboratory rodents. ILAR News 19:1-25, ILAR. Internationa harmonization of health monitoring. ILAR, 49(3): , 2008 Johnson B.: Animal bytes. Applied Biosafety 16(2): , Kísérleti állatok állatkísérletek. PhD EAB kurzus válogatott előadásai.ed.: Anderlik P., Torday F. Semmelweis Kiadó, Budapest, Lowry T., Smith SA.: Aquatic zoonoses associated with food, bait, ornamental and tropical fish. Zoonosis update. Vet Med Today 231 (6): , Mahler M., Berard M., Feinstein R., Gallagher A., Illgen-Wilcke B., Pritchett-Corning K., Raspa M.: FELASA Working Group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of the mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. 4 February DOI: / ( Neil D., McKay D.: Guidelines on laboratory animal facilities characteristics, design and development. Canadian Council on Animal Care, Ottawa, ISBN: Office of research compliance: Occupational safety fact sheet working with aquatic species. Texas State University OIE. Chapter 1.4. Terrestrial Animal Health Code. Animal health surveillance. Article pp.:1-13, 2010 Pathology of laboratory rodentsand rabbits (Third Edition) Ed.: Percy DH. and Bathold SW. Veterinary Book from C.H.I.P.S. Iowa State University Press, 2007.

7 Percy DH.: Zoonoses in laboratory animals. Can Vet 28: , Weigler BJ., Di Giacomo RF., Alexander S.: A national survey of laboratory animal workers concerning occupational risks for zoonotic diseases. Comp Med. 55(2): , Weisbroth SH., Peters R., Riley LK., Shek W.: Microbiological assessment of laboratory rats and mice. ILAR, 39(4): , Zoonotic diseases of laboratory, agricultural and wildlife animals. Ed.: Rand MS. University Animal Care University of Arizona, 2007.