Alkalmazott transzgénikus állattechnológiák

Átírás

1 Alkalmazott transzgénikus állattechnológiák TRANSZGENIKUS NYÚL ELŐÁLLITÁSA HUMÁN BETEGSÉGMODELL CÉLJÁBÓL BŐSZE ZSUZSANNA NAIK-MBK 2016

2 MIÉRT JELENT A NYÚL MINT MODELLÁLLAT VALÓS ALTENATÍVÁT AZ EGÉRHEZ KÉPEST? A NYÚL-FŐEMLŐS FILOGENETIKAI TÁVOLSÁG AZONOS A RÁGCSÁLÓ- FŐEMLŐSSEL A RÁGCSÁLÓ SZEKVENCIÁK EVOLÚCIÓJA GYORSABB EZÉRT A NYÚL GÉNEK KÖZELEBB ÁLLNAK A HUMÁNHOZ A NYÚL LÉNYEGESEN KÖZELEBB ÁLL AZ EMBERHEZ MINT BÁRMELY MÁS HÁZIÁLLAT

3 GÉN SZABÁLYOZÁS Transzlációs kutatások, gyógyszerkutatás

4 TR NYÚL MINT HUMÁN BETEGSÉGEK MODELLÁLLATA I. LIPID ANYAGCSERE, ÉRELMESZESEDÉS RÉGÓTA ISMERT HOGY A KOLESZTERIN GAZDAG DIÉTA SULYOS HIPERKOLESZTERIMÉNIÁT ÉS GYORSAN KIFEJLŐDŐ ÉRELMESZESEDÉST OKOZ ÚJZÉLANDI FEHÉR NYULAKBAN- LABORATÓRIUMI EGÉRTÖRZSEKBEN NEM TÖBB OLYAN SPONTÁN MUTÁCIÓT HORDOZÓ NYÚLTÖRZSET IRTAK LE ÉS TARTANAK FENN, AMELYEK KÜLÖNBÖZŐ HUMÁN LIPID ANYAGCSERE BETEGSÉGEK MODELLJEI WATANABE ÖRÖKLŐDŐEN HIPERLIPIDÉMIÁS NYULAK: CSALÁDI HIPERKOLESZTEROLÉMIA MODELLJEI- AZ ILYEN NYULAK SZÍVINFARKTUST KAPNAK 2 ÉVES KORIG EMBEREKNÉL A BETEGSÉG KIALAKULÁSÁÉRT FELELŐS HOMOZIGÓTA MUTÁNS GÉNT HORDOZÓ GYEREKEK A NORMÁLISNÁL 3-7X MAGASABB KOLESZTEROL SZINTŰEK ÉS GYAKRAN INFARKUST KAPNAK MÉG TINÉDZSER KORUKBAN

5 Normal Normál Normal Mérsékelt WHHL Súlyos

6 HUMÁN BETEGSÉG MODELLÁLLATA II. LIPID ANYAGCSERE, ÉRELMESZESEDÉS A NYÚL LIPID ANYAGCSERÉJE, ENZIMJEI, A LIPOPROTEINEK KÉMIAI ÖSSZETÉTELE NAGYMÉRTÉKBEN HASONLÓ AZ EMBERÉHEZ, MÍG AZ EGÉRÉ KÜLÖNBÖZIK ATTÓL NAGY SZÁMÚ TRANSZGENIKUS NYÚLTÖRZSET ÁLLITOTTAK ELŐ, MELYEKET EGYMÁSSAL ILLETVE A MUTÁNS NYÚLTÖRZSEKKEL KERESZTEZVE VIZSGÁLHATÓAK A LIPIDANYAGCSERE FEHÉRJE- FEHÉRJE KÖLCSÖNHATÁSAI

7 MAGAS KOLESZTERIN TARTALMÚ DIÉTÁVAL KIVÁLTOTT ATHEROSZKELRÓZIS HUMAN apo(a) TRANSZGENIKUS NYULAKBAN / Fan and Watanabe 2003/ Lipid festés az aortában Koronáriák csökkent átmérője transzgenikus nyulakban

8 HUMÁN BETEGSÉG MODELLÁLLATA SZIVIZOM SZERKEZET- MŰKÖDÉS, SZÍVNAGYOBBODÁSSAL JÁRÓ KÓRESETEK A NYÚL SZÍV- SZEMBEN AZ EGÉRÉVEL - MÉRETÉNÉL ÉS FEHÉRJE ÖSSZETÉTELÉNÉL FOGVA IS JOBBAN HASONLÓ AZ EMBERÉHEZ, EZÉRT KÖNNYEN ADAPTÁLHATÓAK A HUMÁN CÉLRA KIFEJLESZTETT MŰSZEREK A SZÍVIZOM ÖSSZEHÚZÓDÁSOK IDŐTARTAMA KÖZELEBB ÁLL AZ EMBERÉHEZ

9 SZIVIZOM SZERKEZET- MŰKÖDÉS, SZÍVNAGYOBBODÁSSAL JÁRÓ KÓRESETEK A SZÍVKAMRA FAL FELÉPÍTÉSÉBEN EMBERBEN ÉS NYÚLBAN -MIOZIN NEHÉZ LÁNC VAN TÖBBSÉGBEN, MÍG AZ EGÉRBEN -MIOZIN A -MIOZIN MUTÁCIÓJA EMBERBEN ÖRÖKLŐDŐ SZÍVNAGYOBBODÁST OKOZ- MELYNEK MODELLEZÉSÉRE TRANSZGENIKUS NYULAKAT ÁLLÍTOTTAK ELŐ A MUTÁNS -MIOZINT HORDOZÓ TRANSZGENIKUS NYULAK FENOTÍPUSA NAGYMÉRTÉKBEN AZONOS AZ EMBERÉVEL, EZÉRT ALKALMAS KLINIKAI VIZSGÁLATOKRA, PL. DOPPLER ANALIZIS A SZIVIZOMÖSSZEHÚZÓDÁSOK VIZSGÁLATÁRA, GYÓGYSZERKIPRÓBÁLÁSRA

10 EGY PÉLDA SZÍVIZOMSZERKEZET MEGVÁLTOZATÁSÁRA: MUTÁNS HUMÁN TROPONIN1- T TERMELŐ TRANSZGENIKUS NYULAK ELŐÁLLÍTÁSA Familiar hypertrophic cardiomyopathy (FHC)- modell Mutáns troponin 1 (arg/gly csere) megnövekedett Ca2+ érzékenységet okoz emberben, majd kamrai tachykardia, fibrilláció, hirtelen szívhalál Transzgénben: nyúl béta miozin promóter: szívkamra specifikus, kópiaszám függő expresszió Egy tr vonal a normál troponin1-el Három tr vonal a mutánssal Sanbe et al. Circulation

11 MUTÁNS HUMÁN TROPONIN1- T TERMELŐ TRANSZGENIKUS NYULAK SZÍVIZOMSZERKEZETE Sanbe et al. Circulation Magas tr kópiaszám = 40-50%-nál nagyobb mutáns fehérje arány = egy hetes kor körüli elhalálozás szívműködési zavar következtében! Alacsony kópiaszám /2/ = 28% mutáns fehérje, fiatalon tünetmentes Másfél kétéves korban fokális fibrózis, izomsejtek random elrendeződése, kamra fal megvastagodás A normál troponin 1 túltermeltetése tünetmentes!

12 TRANSZGENIKUS NYÚLMODELLEK SZÍVRITMUS ZAVAROKRA ÉS HIRTELEN HALÁLRA AZ EGÉR SZÍV 10x GYORSABBAN VER MINT AZ EMBER A NYÚL SZÍVBEN Ca 2+ ÁRAMOK KONTRAKCIÓKOR HASONLATOSABBAK AZ EMBERÉHEZ HUMÁN ÉS FELNŐTT NYÚL PITVAR ALFA MIOZIN NEHÉZ LÁNCOT, MÍG A KAMRA BÉTA MIOZIN NEHÉZ LÁNCOT TERMEL, AZ EGÉRBAN CSAK ALFA MIOZIN VAN VERSUS A SZÍVRITMUS ZAVAROK ÉS TACHYKARDIÁK MELYEK GYAKRAN HIRTELEN SZÍVHALÁLHOZ VEZETNEK TR EGÉRMODELLEKEN NEM TAPASZTALHATÓAK

13 SZÍVRITMUS ZAVAROK ÉS HIRTELEN SZÍVHALÁL A HOSSZÚ QT SZINDRÓMÁVAL RENDELKEZŐ TRANSZGENIKUS NYULAKBAN Brunner et al. J. Clinical. Investigation LONG QT SZINDRÓMA: ÖRÖKLŐDŐ BEETEGSÉG, MELYET AZ ECG QT INTERVALLUM MEGHOSSZABBODÁSA, KAMRAI TACHYKARDIA ÉS FIATAL KORI HIRTELEN SZÍVHALÁL JELLEMEZ A REPOLARIZÁCIÓBAN RÉSZT VEVŐ K+ CSATORNA ALKOTÓ FEHÉRJÉK MUTÁCIÓI OKOZZÁK LQT 1 ÉS LQT 2 TIPUSÚ BETEGSÉGEKET MODELLEZTEK TR NYULAKBAN

14 SZÍVRITMUS ZAVAROK ÉS HIRTELEN SZÍVHALÁL A HOSSZÚ QT SZINDRÓMÁVAL RENDELKEZŐ TRANSZGENIKUS NYULAKBAN Brunner et al. J. Clinical. Investigation TRANSZGÉN: NYÚL BÉTA MIOZIN PROMÓTER ÉS MUTÁNS HUMÁN CSATORNAFEHÉRJE cdns-e

15 SZÍVRITMUS ZAVAROK ÉS HIRTELEN SZÍVHALÁL A HOSSZÚ QT SZINDRÓMÁVAL RENDELKEZŐ TRANSZGENIKUS NYULAKBAN Brunner et al. J. Clinical. Investigation Extrasystole in LQT2 rabbit Kamrai tachykardia LQT2 Normál nyúl kamrai tachykardia

16 Az LQT egy speciális esete: a reporalizációs tartalék csökkenése A reporalizációs tartalék: az ioncsatornák egymást helyettesítő képessége Oka: öröklött v. szerzett (gyógyszer szedés következménye) A gyógyszerkísérleteket érintetlen reporalizációs tartalékkal rendelkező alanyokon végzik Olyan aritmiát előrejelző tesztre lenne szükség,ahol mérhető különbséget okoz a repolarizációs tartalék megváltozása, ehhez új állatmodell kell

17 1. HOSSZABBODÁS MÉRTÉKE alapján ARITMIA ELŐREJELZÉS Pl: 70% -val több aritmiát előre jelezhet 10%-os QT megnyúlás Vagy 67%os QT variabilitás 2. HOSSZ VÁLTOZATOSSÁGA alapján

18 KÉSŐI EGYENIRÁNYÍTÓI KÁLIUM CSATORNA LASSÚ KOMPONENSE (IKS) A platófázisban 2. fázisában kapcsol be Alfa alegység: pórust alkotó fehérjék Béta alegység: a pórust SZABÁLYOZÓ: KCNE1 fehérje a l e g y s é g : pórust alkotó fehérjék TRANSZMEMBRÁN FEHÉRJE A PÓLUS AKTIVITÁSÁÉRT INAKTIVITÁSÁÉRT FELEL

19 TRANSZGÉN -MHC promoter KCNE1 pa 4533 bp Nyúl, béta miozin promóter 407 bp humán Kamra specifikus expresszió G52R (James et al., 2000)

20 A létrehozott KCNE1 mutáció tesztelése CHO sejtvonalban G52R KCNE1 (mutáns) KCNE1 60 mv 40 mv 20 mv K. Odening Univ Clinic Freiburg 0mV A CHO sejteket transzfektáltak: alfa alegységgel és a G52R-KCNE1 vagy a KCNE1-vel, mivel a rendszerben NEM VOLT másik ioncsatorna. Így jól látszik mutáció okozta hatás.

21 + HAR.I. + SIMA I. + PITVAR + KAMRA + AGY +Humán EXPRESSZIÓ: DNS ÜLTETETT EMBRIÓK: 466 db EXPRESSZIÓ: RNS (RT-PCR) SZÍVKAMRA SPECIFIKUS EXPRESSZIÓ 4 alapító 1 vonal Tg. endogén

22 RELATIVE BAND INTENSITY EXPRESSZIÓ: FEHÉRJE Western blot 600 IZOELEKTROMOS FÓKUSZÁLÁS (simple western, Nanopro 1000) nyúl KCNE1 humán G52R -KCNE1 25kDa 300 1, ,5 0 Tg nyúl szív pi 0 minta pi terület % nyúl KCNE1 4, (Ellenanyag: (Abcam: 1:2000) (human-kcne1) humán mutáns 0,00 0,0 nyúl KCNE1 4,88 37,49 humán mutáns 5,13 62,51

23 ÉLETTANI HATÁS: QT variabilitás kontroll G52R-KCNE1 Szűkült repol. tartalék A 2. ioncsatorna gátolt (IKr+IKs) gyógyszer nélkül + gyógyszer (ioncsatorna gátló) 1 ioncsatorna gátolt (IKs) gyógyszer nélkül + gyógyszer (ioncsatorna gátló) 1. Gyógyszer nélkül is nagyobb a QT variabilitása 2. Gyógyszer (másik ioncsatornát elcsendesít) növeli QT variabilitást

24 ÉLETTANI HATÁS Q-T HOSSZ NÖVEKEDÉS ARITMIÁK gyakorisága Q T

25 Transzgenikus nyúl mint a retina degeneráció modellje Kondo és mtsai A retina pálcikák és csapok progressziv degenerációja 1:4000 gyakoriság Számos gén mutációja okozhatja, leggyakoribb a rodopszin domináns negatív mutációja (25-40%) A nyúl nagy szeme fontos a kezelések kifejlesztésében

26 150 kb hosszú BAC klón,az 5. exonban mutáció Red/ET BAC rekombinációval

27 BAC klón tisztítása PFGE-vel és Southern analízis az alapítók detektálására

28 Immunhisztológia a pálcikák és csapok kimutatására A 48 hetes transzgenikus nyulak retinájából hiányoznak a pálcikák

29 GFP NYÚL A ZÖLD FLUORESZCENS FEHÉRJÉT MINDEN SEJTJÜKBEN TERMELŐ NYULAK UV FÉNNYEL MEGVILÁGÍTVA ZÖLDEK (Boulanger et al. 2002) A GFP NYULAKAT EGYEBEK KÖZÖTT RECEHÁRTYA ÁTÜLTETÉS KÍSÉRLETEKBEN HASZNÁLJÁK A GFP NYÚL /ALBA/ MŰVÉSZI TELJESÍTMÉNYEKRE ÖSZTÖNZÖTT SZÁMOS MŰVÉSZT HATÁSÁRA SZÉLESKÖRŰ VITA BONTAKOZOTT KI FRANCIAORSZÁGBAN A GMO ÁLLATOK SZEREPÉRŐL ÉS ELFOGADOTTSÁGÁRÓL

30

31

32 Fényképalbum szerző: Bősze Zsuzsa