Az L-[metil- 11 C]metionin hatóanyag-tartalmú radiogyógyszer minőségellenőrzése

Átírás

1 Az L-[metil- 11 C]metionin hatóanyag-tartalmú radiogyógyszer minőségellenőrzése Oktatási segédanyag a Radioaktív gyógyszerek előállítása és minőségellenőrzése (TKML0435) gyakorlathoz radiokémikus szakirányú vegyész MSc hallgatók számára Összeállította: Dr. Jószai István Debreceni Egyetem Nukleáris Medicina Intézet Radiokémiai Központ Debrecen 2014

2 Tartalomjegyzék 1. A gyakorlat célja Elméleti áttekintés Pozitronemissziós tomográfia (PET) L-[metil- 11 C]metionin Általános információ Előállítás Minőségellenőrzés Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia Gázkromatográfia Félvezető detektoros gamma-spektrometria A gyakorlaton alkalmazott HPLC rendszer leírása A gyakorlaton alkalmazott Clarus 500 GC gázkromatográf leírása A gyakorlaton alkalmazott Canberra gamma spektrométer összetevői A gyakorlaton elvégzendő feladatok Kérdések önálló felkészüléshez Felhasznált és ajánlott irodalom

3 1. A gyakorlat célja Az L-[metil- 11 C]metionin tartalmú radiogyógyszer részleges minőségellenőrzése. Az injekciós készítmény enantiomer tisztaságának vizsgálata radio-hplc módszerrel. A készítmény etanol tartalmának meghatározása gázkromatográfiás eljárással. A gyógyszer minta radionuklidos azonosítása és tisztaság vizsgálata gamma spektrométer segítségével. 2. Elméleti áttekintés 2.1. Pozitronemissziós tomográfia (PET) A PET az egyik legmodernebb funkcionális képalkotó eljárás a gyógyászatban. Műtéti beavatkozást nem igénylő (non-invazív) eljárás, melynek segítségével háromdimenziós képet nyerhetünk a test egy adott területéről. A CT-vel kombinált PET berendezés jelenti ma a képalkotó diagnosztika egyik legfejlettebb technikáját. A PET és más hagyományos képalkotó eljárások (pl. fmri, SPECT) sajátossága, hogy nem az anatómiai viszonyokat, hanem a szervek, szövetek különböző funkcionális jellemzőjét (pl. véráramlás, anyagcsere) jelenítik meg egy adott pillanatban. Mivel a betegség kialakulása először a szervek, szövetek funkcionális jellemzőiben okoz elváltozást, és ezt általában másodlagosan kíséri az anatómiai megváltozás, így érthető, hogy a funkcionális képalkotó eljárások jóval hamarabb, még az anatómiai elváltozások kialakulása előtt képesek jelezni a betegséget, azaz a betegség nagyon korai stádiumában nyújtanak hasznos információt. A pozitronemissziós tomográfia működése azon alapul, hogy pozitront sugárzó izotópokkal jelölt molekulák segítésével képes a szervezet biokémiai folyamatait ábrázolni. Ma már a PET-kamerát CT-készülékkel egybe is tudják építeni, így teremtve meg a lehetőségét annak, hogy a PET-tel nyert funkcionális képek és a CT morfológiai információkat azonos anatómiai szeletekben, egymásra tudják vetíteni. A PET/CT kombinációs technológia forradalmi változásokat hozott az onkológiai, kardiológiai és neurológiai diagnosztikában. Az eljárás lényege, hogy a vizsgált szervbe pozitron kibocsátással bomló radioaktív izotópot tartalmazó molekulát juttatnak (a leggyakrabban használt izotópok: 18 F, 15 O, 13 N, 11 C). A különböző radiofarmakonokkal különböző funkciók működése mérhető fel, attól függően, hogy az illető molekula a szervezeten belül milyen folyamatokban vesz részt. Elméletileg az élő szervezet anyagcseréjében résztvevő bármilyen szerves molekula jelölhető PET izotóppal, és a módszer segítségével szinte mindegyik biokémiai, élettani folyamat leképezhető, illetve aktivitása mérhető. A leggyakrabban használt radiofarmakon a [ 18 F]FDG, ami a fokozott glükózmetabolizmusú sejtekben (agy, szívizomzat, rosszindulatú tumorok, aktivált granulociták és limfociták) halmozódik fel, s mivel nem metabolizálódik, ezért ugyanebben a formában a vesén keresztül a vizeletbe választódik ki (ellentétben a glükózzal). A szervezetbe juttatott marker szöveti eloszlását a PET kamera (egy gyűrű alakú detektor) segítségével lehet detektálni a pozitron-kibocsátást kísérő gamma sugárzás észlelésén keresztül. A vizsgálat során nyert adatokból számítógép segítségével történik a képek rekonstruálása. A vizsgálattal elsődlegesen a test hossztengelyére merőleges szeletek nyerhetők (a CT-hez hasonlóan), akár az egész testről. Később a szeletekből tetszőleges irányú, akár háromdimenziós képek állíthatók elő. A bejuttatott radiofarmakon szöveti eloszlása a különböző (fiziológiás, illetve kóros) funkcionális állapotokban egymástól jelentős mértékben eltér, így ennek alapján a kóros folyamatok felismerhetők és lokalizálhatók. A PET izotópok jellemzője, hogy fizikai felezési idejük nagyon rövid (2-110 perc), 90 perccel a 3

4 beadást követően az injektált aktivitás 40%-a már távozott a vizelettel, így alkalmazásuk a beteg számára kisebb sugárterheléssel jár. Emellett nagy hátránya az eljárásnak, hogy a használt radioaktív izotópok olyan gyorsan elbomlanak, hogy közvetlenül a vizsgálat előtt, a helyszínen kell őket előállítani, ami jelentősen növeli a berendezés árát. [1] Tipikus PET/CT kamera PET felvétel az emberi agyról 2.2. L-[metil- 11 C]metionin Általános információ Kémiai név: L-[metil- 11 C]metionin Struktúra: Molekulaképlet: C 5 H 11 NO 2 S Molekulatömeg: 148,21 g/mol A [ 18 F] radionuklid fizikai jellemzői: felezési idő: 20,4 perc a bomlás pozitron kibocsátásával (p + =97%) vagy elektronbefogással (ec=3%) megy végbe A γ-sugárzás energiája: 511 kev (p + -részecske energiája: 635 kev) 4

5 Előállítás A Nukleáris Medicina Intézet Radiokémiai Központjában rutinszerűen gyártott L-[metil- 11 C]metionin előállítási, tisztítási lépéseit, illetve a minőségellenőrzést az alábbiak tartalmazzák. 11 C radionuklid előállítása A 11 C radionuklid a GE PETtrace típusú ciklotron segítségével kapható nitrogén (6.0)/ oxigén (0,2%, 5.0) gázkeverék protonokkal történő besugárzásával. A 11 C izotóp a 14 N(p,α) 11 C magreakcióban keletkezik. A gázkeverékben lévő oxigén azt biztosítja, hogy a keletkező 11 C 11 CO 2 formában álljon elő a besugárzás végén. Az előállítás paramétereit az alábbi táblázat tartalmazza. Műveleti paraméterek: Ciklotron PETTRACE Nyaláb energia 16,4 MeV Nyalábáram µa Besugárzási idő A besugárzandó nitrogén/oxigén gáz térfogata és nyomása perc 70 ml 10 bar A céltárgy specifikációja: paraméter GE C-11 Target térfogata 70 cm 3 Targettest anyaga Targetablak összetétele alumínium Havar fólia (25 µm) A hatóanyag szintézise és tisztítása A besugárzott target gázból a MeI szintézis rendszer [ 11 C]metiljodidot állít elő teljesen automatikusan. Az automatikus program a szintézist az alábbi fontosabb lépéseknek megfelelően hajtja végre: - A targetből kiáramló gáz 11 CO 2 tartalmát molekuláris szűrő köti meg. - A megkötött 11 CO 2 hidrogén gáz hozzákeverése után nikkel katalizátor jelenlétében 360 o C-on 11 CH 4 -ná alakul. 5

6 - A következő lépésben a 11 CH 4 egy 720 o C hőmérsékletű kemencében elemi jóddal reagál és [ 11 C]metiljodid keletkezik, amely egy másik molekuláris szűrőn (Porapak N) kötődik meg. (A metán többször áthalad a jódos oszlopon a jobb konverzió érdekében) - A folyamat végén a MeI szintézis panel a molekuláris szűrő hevítésével felszabadítja a [ 11 C]metiljodidot, ami bekerül a metionin panel 2,5 ml-es fecskendőjébe, amelyben a 2 mg prekurzor (L-homocisztein) 1 ml abszolút etanolos oldata és 20 mg alumínium- oxidra felvitt kálium-fluorid katalizátor van. - A [ 11 C]metiljodid átbuborékol a prekurzor oldaton 2 perc alatt, majd további 1 perc várakozás után ezt az oldatot a 12 ml fiziológiás sóoldatot tartalmazó 20 ml-es fecskendőbe juttatjuk át. - Innen a tisztító oszlopokon át a terméket gyűjtő üvegedénybe juttatjuk. N 2 + 0,2% O 2 Besugárzás 14 N(p +, ) 11 C 11 CO GE PETtrace ciklotron 11 CO 2 elválasztása a target gázból GE MeI Microlab Waste1 H 2 11 CO 2 átalakítása 11 CH 4 -ná He, I 2 He 0,9 % NaCl oldat A 11 CH 4 konvertálása 11 CH 3 I-dá He A 11 CH 3 I reagáltatása az L-homociszteinnel He A 11 C-metionin tisztítása (Sep Pak patronok) Waste2 Metionin panel Waste3 He A 11 C-metionin steril szűrése és letöltése Osztóberendezés 6

7 Minőségellenőrzés Az injekciós készítmény enantiomer tisztaságának meghatározása radio-hplc módszerrel Szükséges eszközök, anyagok System-1 HPLC rendszer (Lásd a rendszer összetevőinek leírását a Minőségellenőrző laboratóriumban) Eluens: 30 mm nátrium-acetát, 17 mm L-prolin, 8 mm réz(ii)-acetát vizes oldata Hulladéktároló edény ólomvédelem mögött µl-es digitális pipetta Kromatográfiás körülmények Kolonna: Merck Lichrospher 100 RP-18, 5 um, 250x4 mm Térfogat-áramlási sebesség: 2,0 ml/perc, izokratikus elúció Kolonnatér hőmérséklete: szobahőmérséklet Injektált térfogat: 20 µl Detektorok: RA detektor Vizsgálati idő: 15 perc Minta előkészítés A radiokémiai- és a kémiai tisztaság meghatározásához 20 µl mintát injektálunk az oszlopra. Kiértékelés Kromatográfiás vizsgálat adatgyűjtése és kiintegrálása ChromPass szoftverrel történik. A vizsgálat megkezdése előtt ki kell választani a megfelelő rendszert (System-1), majd a Enant.METH módszert kell megadni. A kromatográfiás mérés indításakor a mérési fájl nevet meg kell adni. A kromatogram kiintegrálásának alapértékei a kromatográfiás módszer részét képezik. Amennyiben az automatikus integrálás nem megfelelő, úgy azt manuálisan kell módosítani. (ChromPass Manual Set) A kromatográfiás módszer az L-[metil- 11 C]metionin hatóanyag és a D-[metil- 11 C]metionin szennyező forma kimutatására alkalmas. Az L-[metil- 11 C]metionint és a D-[metil- 11 C]metionint tartalmazó minta RA detektoron mért kromatogramját az alábbi ábra tartalmazza. 7

8 Tájékoztató retenciós idők: D-[metil- 11 C]metionin L-[metil- 11 C]metionin T R =5,5 perc T R =11 perc Az enantiomer tisztaság meghatározásához a radioaktivitás detektoron kapott kromatogramot használjuk. A készítmény enantiomer tisztaságát az alábbi képlettel számítjuk ki: % E 100 A = A + A L L D % ahol, E% a készítmény enantiomer tisztasága A L az L-[metil- 11 C]metionin hatóanyag csúcsához tartozó, a 11 C bomlásával korrigált csúcsalatti terület A D a szennyező D-[metil- 11 C]metionin csúcsához tartozó csúcsalatti terület A készítmény enantiomer tisztasága megfelelő, ha %E 90%! Az injekciós készítmény etanol tartalmának meghatározása GC eljárással Szükséges eszközök, anyagok Clarus 500 GC rendszer (Lásd a rendszer összetevőinek leírását a Minőségellenőrző laboratóriumban) 5-50 µl-es Hamilton-fecskendő, adagolóval ellátva, amely lehetővé teszi 1 µl minta injektálását Pipetta µl és 0,5-10 µl Sűrített levegő, égést tápláló gázként alkalmazzuk H 2 gáz, égést biztosító gáz He gáz, vivőgázként használjuk Metanol 30 mg/ml koncentrációjú vizes oldata (belső standard). Kromatográfiás körülmények Kolonna: Porabond U., 25 m, belső átmérő: 0,32 mm, filmvastagság: 7 µm Detektor: FID Injektor hőmérséklete: 250 C Detektor hőmérséklete: 250 C Vivőgáz nyomása: 10 psi Split arány: 250 Levegő áramlási sebessége: 450 ml/perc Hidrogén áramlási sebessége: 45 ml/perc Injektált térfogat: 1 µl Kolonnatér hőmérséklete: 150 C Vizsgálati idő: 3 perc Minta előkészítés A kapott vizsgálati minta 50 µl térfogatához 50 µl belső standardot adunk, majd az új elegy 1 µl-nyi térfogatát injektáljuk a kapilláris kolonnára. 8

9 Kiértékelés Kromatográfiás vizsgálat adatgyűjtése és kiintegrálása TotalChrom szoftverrel történik. Az etanol tartalmat belső standard módszerrel határozzuk meg. Az oldószerek tájékoztató retenciós idői: Elúciós Retenciós idő (T Oldószer R ), sorrend (perc) 1 Metanol 1,5 2 Etanol 2,0 Referencia kromatogram az alábbi ábrán látható: A kromatográfiás szoftver a felvett kalibrációs görbéből automatikusan kiszámítják az etanol koncentrációt az etanol-istd terület arány ismeretében. Az elfogadott etanol koncentráció-tartomány mg/ml! Az injekciós készítmény radionuklidos azonosítása és radionuklidos tisztaságának, felezési idejének meghatározása gamma-spektrometriás eljárással Szükséges eszközök és anyagok A Nukleáris Medicina Intézet Radiokémiai Központjának 001. laboratóriumaiban telepített Canberra gamma spektrométer 0,5-10,0 µl digitális pipetta, 9

10 radioaktív forrás készítéséhez szűrőpapír korong, 152 Eu hitelesítő sugárforrás. A minta radionuklidos azonosítása és radionuklidos tisztaságának meghatározása A vizsgálatot a 152 Eu etalonforrás (10 kbq-100 kbq) spektrumának felvételével kezdjük. Mérési idő 600 sec (10 perc). A spektrum felvételét követően energiakalibrációt végzünk a 152 Eu izotóp 1. táblázatban szereplő, legintenzívebb γ-vonalai alapján. A γ-vonalak azonosítása az egyes vonalakhoz tartozó energiák és intenzitások alapján végezhető. Az L-[metil- 11 C]metionin tartalmú minta spektrumának felvételéhez először a háttérspektrumot vesszük fel, mérési idő 600 sec (10 perc). Ezt követően a minőségellenőrzésre szánt ampullából 100 kbq-nek megfelelő térfogatú mintát veszünk és egy szűrőpapírkorong közepére cseppentjük. A mérést ugyanolyan geometriai elrendezés mellett végezzük, mint az etalonforrás esetében. A spektrum felvétele előtt a memóriát töröljük, de az energiakalibrációt meghagyjuk. A spektrum felvételének idejét 600 sec (10 perc) értékre állítjuk. A felvétel után csúcskeresést végzünk, majd az értékeket jelentés formájában kinyomtatjuk. 1. táblázat Izotóp γ -energia, (kev) γ -emittálási hatásfok, (%) 152 Eu 121,8* 244,7 344,3* 411,1 778,9* 964,1* 1085,8 1112,1* 30,72 7,74 27,24 2,25 12,75 14,36 10,11 13, ,1* 20,77 11 C ,0 Az energiakalibrációt a *-gal jelölt γ-vonalak alapján végezzük. A minta spektrumában kev energiatartományban meg kell találjuk a 11 C izotóp annihilációs γ -vonalát. Ezt követően szoftveresen kivonjuk a hátteret a felvett spektrumból. Amennyiben ezektől eltérő energiáknál is ismeretlen csúcsok találhatók, úgy a minta spektrumát ebben az esetben mennyiségileg is kiértékeljük, a fotocsúcsok ROI értékeit figyelembe véve. Követelmény: a 11 C izotóphoz tartozó ROI százalékos terület aránya 99%! 10

11 Felezési idő mérése A felezési idő méréséhez hat alkalommal felvesszük az L-[metil- 11 C]metionin tartalmú minta gamma spektrumát 600 sec (10 perc) mérési idővel. A spektrumokból kapott fotocsúcsok ROI területeinek természetes alapú logaritmus értékeit és a mérések közötti idők percben kifejezett értékének függvényében grafikusan ábrázoljuk. A kapott pontokra egyenest illesztünk, amely meredekségéből az alábbi képlet segítségével meghatározzuk a csúcshoz tartozó radionuklid felezési idejét: T 1/2 = ln2/meredekség A mérés alapján számított felezési időnek 19,9 és 20,9 perc közé kell esnie! 2.3. Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia A műszeres analízis kromatográfiás módszereinek feladata, hogy a minta komponenseit legtöbbször szerves vegyületeket egymástól elválassza. A módszer működésének alapja az, hogy a mozgófázisba (amely gáz vagy folyadék lehet) kevert mintaelegyet szoros kontaktusba hozzuk egy azzal nem elegyedő másik fázissal, amelyet állófázisnak hívunk (egy lapra felvitt, vagy cső belsejében rögzített folyadék vagy szilárd halmazállapotú anyag). A mozgófázist (eluens) állandóan mozgásban tartva a mintaelegy komponensei az állófázissal való kölcsönhatásuk különböző mértéke miatt megfelelő kontaktidő után elkülönülnek egymástól. Amennyiben a rendszerben egy detektort helyezünk el, amely a mintakomponenseket képes megkülönböztetni a minta oldószerétől, akkor a detektorjel idő függvényében való ábrázolásakor a mintakomponenseket reprezentáló csúcssorozatot fogunk észlelni. Ezt a grafikont hívjuk kromatogramnak, a berendezést pedig kromatográfnak. [2] A nagynyomású (vagy nagy teljesítményű/hatékonyságú) folyadékkromatográfiát, amely mintegy 30 éve ismert, a jelzett vegyületek tisztítása szempontjából az egyik legértékesebb elválasztási eljárásának tartjuk. Előnyei közé tartozik, hogy a méréseket szobahőmérsékleten vagy annak közelében végezhetjük, így akár termikusan érzékeny anyagok is vizsgálhatók vele, megfelelő szerkezeti anyagok felhasználásával pedig biológiai eredetű minták is közvetlenül analizálhatók. A kromatográfiás körülmények (kolonna töltetanyaga, eluens minősége, stb.) megfelelő megválasztásával szinte minden vegyületcsalád és minta vizsgálatára alkalmas, sőt esetenként összetett reakcióelegyek komponenseinek üzemi léptékű szétválasztására is alkalmazzák. Hozzáértő kromatográfus kezében a HPLC olyan eszköz, amellyel a gyógyszerekkel, szerves kémiai vagy biológiai eredetű mintákkal kapcsolatos legtöbb analitikai jellegű probléma nagy pontossággal és nagy megbízhatósággal megoldható. Előnyei mellett nem szabad megfeledkeznünk arról, hogy még alap kiépítettség mellett is egy HPLC készülék meglehetősen drága, folyamatos üzemeltetése pedig szintén nagy anyagi terheket jelent. A legutóbbi években elterjedőben vannak azok a nagyon kis belső átmérőjű kolonnák, amelyekkel a felhasznált eluens mennyisége az analitikai felbontóképesség megtartása, sőt esetenként növekedése mellett a korábbi mennyiség töredékére csökkenthető (gyors kromatográfia, Ultranagyhatékonyságú folyadékkromatográfia - UPLC). A legelterjedtebb, általános célokra szolgáló kolonnák mellett ma már számos, célzottan csak egy bizonyos vizsgálatra kifejlesztett kolonna is hozzáférhető, amelyekkel nagy számú mintát gyorsan elemezhetünk. [3] 11

12 A HPLC rendszer a következő alkotórészekből áll: a kromatográfiás töltetet (állófázist) tartalmazó oszlopból (kolonnából), a mobil fázist (mozgó fázist, eluenst) az oszlopon átnyomó pumpából valamint a molekulák retenciós (visszatartási) idejét jelző detektorból. Kolonna Szoftver Injektor Eluens Pumpa Detektor Hulladék A HPLC technika nagy hatékonyságú és igen gyors analíziseket tesz lehetővé: akár tucatnyi komponens is elválasztható egy perc alatt. A hatékonyság növelését a speciális megosztófázisok alkalmazása mellett igen apró szemcseméretű és így nagy fajlagos felületű töltetek készítésével érték el. Az apró töltetszemcsék azonban igen tömören helyezkednek el a kolonnában, ami jelentősen megnöveli annak áramlási ellenállását. Ennek következtében a mozgófázis áramoltatása csak nagy ( bar, vagyis 10 7 Pa nagyságrendű) nyomással, különleges szerkezeti anyagból készülő és kémiailag ellenálló, költséges dugattyús folyadékpumpákkal lehetséges. A kromatográfiás gyakorlatban nagyon sok fajta töltetanyaggal találkozhatunk. A legegyszerűbb szorbens a szokásos szilikagél (normál fázis), amelynek a felületét különböző reagensekkel reagáltatva hosszabb-rövidebb szénlánccal (fordított fázis), vagy funkciós csoportokkal szubsztituált szénlánccal borítják be. A kémiailag kötött bevonat a későbbiekben már nem távolítható el. A bevonat alapvetően megváltoztatja a szilikagél tulajdonságait, például alkilcsoportokkal (C 8, C 18 ) bevonva az addig erősen poláris felületű szilikagél felülete apolárissá válik, illetve poláris csoportokkal (CN, NH 2 ) homogénebbé és kevésbé aktívvá változtatható a szilikagél felület. Megfelelően megválasztott felületi csoportokkal teljesen új tulajdonságú töltetanyagok állíthatók elő. Nemcsak a porózus felépítésű szilikagél lehet a hordozója a felületi rétegeknek, hanem mikroszkopikus méretű üveg- vagy műanyaggyöngyök is. A szilikagélen alapuló töltetanyagok csak olyan ph-n használhatók, ahol nem oldódik fel a hordozó szilikátváz, azaz az oldat nem lehet bázisos, sem pedig erősen savas. Véglezárással a ph-tartomány kissé kibővíthető, de semmiképpen sem lehet ph = 9 fölött dolgozni velük. A használható ph-tartomány problémáját úgy oldották meg, hogy a felületi rétegeket nem szilikagélhez, hanem mikroszkopikus üveggyöngyökhöz (nem porózus szerkezetű), kemény polisztirol-szemcsékhez, vagy más polimer hordozókhoz kötötték. A polimer hordozós töltetek a mechanikai igénybevételekkel szemben kevésbé ellenállóak, az oldószerváltás, ph-változás hatására duzzadhatnak vagy zsugorodhatnak, a hirtelen nyomásváltozásokat pedig nem viselik el, de izokratikus elúció esetén jól használhatónak bizonyultak. A HPLC kolonnák többnyire 1-4 mm belső átmérőjű, cm hosszúságú acélcsövek, amelynek töltete apró szemcséjű (2-40 µm) porózus hordozóból és annak felületén kötött megosztófolyadékból áll. Azt, hogy az elkészült kolonna milyen komponensek hatékony elválasztására lesz alkalmas, a kapcsolt megosztófolyadék kémiai tulajdonságai döntik el: pl. fenilcsoportok aromás vegyületek elválasztására, királis funkciós csoportok az optikailag aktív komponensek elválasztására alkalmas különösen. Az igen elterjedt ún. C 18 kolonnákban a hordozó felületéhez oktadecil-csoportok kapcsolódnak. 12

13 Természetesen az eluens összetétel is nagyban befolyásolja az elválasztás eredményességét (mozgófázis szelektivitás). Normálfázisú kromatográfiánál az állófázis poláros, míg a mozgófázis apoláros jellegű; ilyenkor a poláros komponensek jobban kötődnek az állófázishoz, vagyis nagyobb retenciós idejű csúcsokat fognak produkálni, ez az összeállítás tehát a poláros komponensek elválasztásának kedvez. Fordított fázisú kromatográfia esetében ez éppen fordítva van, az állófázis apoláros (pl. C 18 csoportokat tartalmaz) és a mozgófázis poláros (pl. víz-metanol elegy); ilyen körülmények mellett az apoláros komponensek, pl. aromás szénhidrogének választhatók el jól. A nagy nyomáson való működés további követelményeket támaszt a felhasznált folyadékokkal és a mintaadagolóval szemben is. Az eluens és a minta sem oldott gázokat, sem apró szemcsés szennyeződéseket nem tartalmazhat; az előbbiek a detektorban felszabadulva a jel pulzálását idézhetik elő, míg az utóbbiak a töltetszemcsék közötti, mikrométernél kisebb járatokat eltömítik. Így az eluenseket és a mintát 0,2-0,45 µm-es pórusméretű szűrőn való vákuumszűréssel és az eluens esetében még ultrahangos kirázással szokás előkészíteni a használatra. A HPLC vizsgálatokhoz használt oldószereket nagyon gondosan meg kell szabadítani a bennük oldott gázoktól. Nagy gáztartalmú oldószert használva a kolonnában buborékok képződnek, amelyek eredményeképpen az elválasztás jelentősen romlik, a sávok kiszélesednek, alakjuk torzul, a kolonnán mérhető nyomás, az oldószeráramlás sebessége ingadozik. A detektorban keletkező nagyobb buborékok álcsúcsokat, a fotometriás detektorcella falára feltapadó, egyre növekvő méretű buborékok az alapvonal emelkedését. élesen kiugró tüskéket eredményeznek, természetesen ezen jelenségek egyike sem reprodukálható. Egy-egy álcsúcs adott esetben jelentősen megkeserítheti a kromatográfus életét, hiszen sok munkát kell arra fordítani, hogy bebizonyítsuk, az ál -ként azonosított csúcs valóban álcsúcs volt. A radioaktív izotópokat tartalmazó vegyületek HPLC elválasztása során megfelelő típusú radioaktivitás detektorokat alkalmaznak. Ezek általában átfolyós detektoroknak tekinthetők, amelyek tulajdonképpen egy ólomárnyékolással ellátott a megfelelő ionizáló részecskékre érzékeny detektor (mérő) fejből és a hozzá csatlakoztatott elektronikai kiszolgáló egységekből áll. A kromatográfiás oszlopról távozó un. aktív komponensek pedig a mérőfej előtt elhaladó csőszakaszba jutva kerülnek a detektor látómezejébe. A detektorjel nagysága értelemszerűen függ a minta radioaktivitásának nagyságától. A mérőfej általában olyan vegyületet rejt, amely érzékeny az adott ionizáló részecskére. A kölcsönhatás eredményeképpen fotonok keletkeznek, amit az elektronikai kiszolgáló egységek jelként értelmeznek és továbbítanak az adatgyűjtő szoftver felé Gázkromatográfia A gázkromatográfia mozgófázisa gáz, az állófázisa vagy felületen (legtöbbször kolonna belső felületén) kötött folyadék vagy szilárd anyag. A mintát, amely lehet bármilyen halmazállapotú, de leggyakrabban gáz vagy folyadék, gáz halmazállapotban juttatjuk a kolonnára a folyadék vagy szilárd halmazállapotú mintákat tehát a mintabevitel során el kell párologtatni. Ebből következik, hogy a kolonnát és a detektort is olyan hőmérsékleten kell tartanunk ( C), hogy a minta az analízis egész ideje alatt gáz halmazállapotú legyen. A gázkromatográfia tehát bomlás nélkül gázzá alakítható vegyületek elválasztására alkalmas. Megfelelő állófázis megválasztásával gyors, hatékony elválasztást biztosít 13

14 mindazon vegyületek esetében, amelyek megfelelnek az előbbi feltételnek. A gázkromatográfok felépítésének általános sémáját az alábbi ábra mutatja. [2] Az eluenst, amelyet itt vivőgáznak nevezünk, rendszerint egy nagynyomású gázpalackból vesszük. A vivőgáz megválasztása leginkább a detektor függvénye: lángionizációs detektorhoz nitrogén vagy argon, hővezetőképességi detektorhoz leginkább hidrogén- vagy héliumgáz használatos. A gáz nyomáscsökkentő után, az áramlási sebesség folyamatos mérése mellett jut a kolonnára. A vivőgáz általában: H 2, He, (N 2, Ar). A vivőgáz oxigén, vízés szénhidrogénmentes legyen, 99,999% vagy annál nagyobb tisztaságú. A hidrogén gőz és robbanásveszélyes, palackból csak indokolt esetben célszerű használni, ma már a hélium az általánosan elterjedt vivőgáz. A gázok hagyományos gázpalackokból, vagy azok egy részének kiváltására szolgáló gázgenerátorokból vehetők ki. (bemeneti nyomások: kb. 4-6 bar). A kolonnatér egy hűthető és fűthető, tipikusan C tartományban működő légtermosztát, a hőmérséklet változtatása általában 3-7 lépésben programozható. Nagy stabilitás, gyors működés a követelmény, maximális felfűtési sebesség kb C/perc. [3] A mintaadagolás több okból is kritikus pontja a gázkromatográfiának. Egyfelől nem könnyű megoldani, hogy a minta elpárologtatása pillanatszerűen játszódjék le márpedig a hatékony elválasztás alapfeltétele, hogy a minta egyszerre, minél gyorsabban kerüljön be az eluens áramlásba. Másfelől l a kis térfogatú minták kezelése, reprodukálható adagolása is nagy körültekintést igényel. Ennek megfelelően en többféle mintaadagoló rendszert is kidolgoztak. Ezek közül a legegyszerűbb megoldást az alábbi ábra mutatja be.

15 Itt a minta beadagolása közvetlenül a kolonna bemenetére szerelt, fűtött mintakamrába történik oly módon, hogy a kamra tetejét lezáró, gumiból készült zárókupakot (szeptum) átszúrjuk a precíziós, teflon dugattyús mintaadagoló fecskendővel. A szeptum feladata a fecskendő kihúzásakor újból lezárni a kamrát. Az elválasztást végző kolonna acél- vagy üvegcsőből készül. Külső megjelenését tekintve kétféle lehet: 2-6 mm belső átmérőjű, töltetet tartalmazó ún. töltetes kolonna, vagy 0,2-0,5 mm átmérőjű, a megosztó fázist belső falán vékony filmként felhordottan tartalmazó kapilláris kolonna. A töltetes oszlopok hordozó töltete megfelelő mechanikai szilárdságú, nagy fajlagos felületű és kémiailag inert anyag (diatómaföld, polimerek, stb.) ), amelynek a felületén egyenletes filmet képezve jól tapad a megosztófolyadék. A megosztófolyadékot alkalmas oldószerben feloldják, az oldatba belekeverik a szilárd hordozót, majd lassan elpárologtatják az oldószert. Az ily módon előkészített állófázissal töltik meg a kolonnát. Készíthető még töltetes kolonna szilárd adszorbenssel (pl. aktív szén, alumínium-oxid, szilikagél) való megtöltés útján is. A töltetes kolonnák az előállítás nehézkessége miatt viszonylag rövidek (1-5 m), ellenállásuk a vivőgázáramlással szemben viszonylag nagy, azonban kapacitásuk nagy, ezért nagyobb (pár µl) mintamennyiséggel dolgozhatunk velük. A kapilláris kolonnákban nincs hordozó, a megosztófolyadékot közvetlenül a csőő belső falára viszik fel. Az egyszerűbb, de kevésbé tartós eljárás során a folyadékot oldószerben oldják, majd nyomás alatt átpréselik a m hosszú kapillárison. A modern kapilláris kolonnákban a megosztófolyadékot valamilyen kémiai kötéssel (gyakran szilanizálással) rögzítik a cső belső falához, ezzel megakadályozva annak lehordását (a vivőgázzal való lassú kiürülését), ami a kolonna élettartamát megrövidítené. A kapilláris kolonnák hosszúsága nagy, így elméleti tányérszámuk kimagasló, is lehet. Használatukat megnehezíti azonban, hogy kapacitásuk kicsi, ezért igen kis mintamennyiség (a µl törtrésze) adagolható rájuk. Kapilláris kolonnák: 0,10 0,,53 mm külső átmérő, m hosszúság, 0,1-5 mikron filmbevonat. Töltött kolonnák: 2-6 mm külső átmérő, 0,02-3 mm szemcseméret, vastagabb film bevonat. Előnyök és hátrányok: Kapilláris: nagy csúcsfelbontás, kis terhelhetőség, nagyobb kémiai érzékenység, kis gázáram, bő méretbeli és fázisválaszték, néhány detektorhoz nem előnyös.

16 Töltött: kis csúcsfelbontás, nagy terhelhetőség, nagy gázfogyasztás, házilag tölthető, a fázis házilag módosítható, nagy érzékenységű detektorokhoz csak gázszétosztással csatlakoztatható. A megosztó folyadékot az elválasztó komponensek anyagi minőségi, kémiai jellemzői alapján választjuk meg. Poláros mintakomponensekhez pl. szintén poláros polietilén-glikolok (Carbowax, DB-WAX, stb.), míg apoláris komponensekhez pl. polipropilén használható. Fontos szempont kiválasztásukkor, hogy az analízis során szükséges kolonna hőmérsékleten kevéssé párologjanak. A kolonnán elválasztott komponenseket a vivőgáz a detektorba juttatja, amely a komponensek vivőgázbeli koncentrációjával arányos elektromos jelet ad. Sokféle, a mintakomponensek különböző kémiai és fizikai jellemzőjének mérésén alapuló detektort fejlesztettek ki ezek közül az alábbiakban csak a két legelterjedtebbről lesz szó. A hővezetőképességi detektor (TCD, katarométer) érzékelője egy kis térfogatú cellában elhelyezett, elektromosan fűtött fémszál. A fűtött fémszál ellenállása hőmérsékletével arányos, hőmérséklete azonbann a körülötte áramló gáz hővezetőképességétől függ. Tiszta vivőgáz (hidrogén vagy hélium) áramlásakor, az analízis kezdetén egy adott ellenállásértéket mér a hozzákapcsolt elektromos műszer, azonban rosszabb hővezetőképességű gáz vagyis a mintakomponensekk gőzének detektorba jutásakor a szál kevésbé hűl le, így ellenállása nő. A hővezetőképességi detektor univerzális, a vivőgázon kívül mindent mérni képes detektor (vagyis nem szelektív), amely 3-5 koncentráció nagyságrenden keresztül lineáris válaszjelet ad. Kimutatási képessége ugyanakkor nem kiemelkedő; kb. 1 µg. A lángionizációs detektor egy másik, igen elterjedten alkalmazott gázkromatográfiás detektortípus. Ez tulajdonképpen egy kisméretű hidrogén/levegő gázeleggyell táplált láng, amely fölé elektródpárt helyeznek el. Ezen két elektród közé olyan feszültséget kapcsolnak, amelyen még nem keletkezik szikrakisülés az igen nehezen ionizálható vivőgázáramlásban (nitrogén vagy argon). A kolonnát elhagyó szerves komponensek a lángban oxigén közreműködésével ionizálódnak. Az ionok képződése hatására a két elektród között gyenge áram folyik, amely erősítés után mérhető, és a mintakompoens koncentrációjával arányos nagyságú lesz. Ez a detektor igen érzékeny, mintegy g anyag kimutatására alkalmas, linearitása valamivel jobb, mint a hővezetőképességi detektoré.

17 2.5. Félvezető detektoros gamma-spektrometria A gamma-sugárzó nuklidok kimutatásához a legérzékenyebb módszer a félvezetős gammaspektrometria. A gamma-sugárzás energiája meghatározott érték (a spektruma tehát vonalas), jellemző az őt kibocsátó atommagra a gamma-sugárzás tehát nuklid specifikus. A gamma-spektrometria a gamma-sugárzó nuklidok gamma-energiájának meghatározása alapján a nuklid minőségi meghatározását teszi lehetővé megfelelő nuklidkönyvtár segítségével. A minőségi analízis mellett a gamma-sektrum teljesenergia csúcsainak intenzitásaiból (csúcs alatti terület) megfelelő hatásfok ismeretében az aktivitás, a radioizotóp mennyisége határozható meg. A félvezetőkben a sugárzásból elnyelt energia hatására elektron-lyuk párok jönnek létre. Geban egy elektron-lyuk pár létrehozásához szükséges energia viszonylag kicsi (2.9 ev 77 K hőmérsékleten). Ez az érték kb. 100-szor kisebb, mint pl. a NaI (Tl) szcintillációs detektorok megfelelő jellemzője, az egy fotoelektron létrehozásához szükséges energia. Azonos energialeadás esetén tehát két nagyságrenddel több töltéshordozó keletkezik Ge-ban, mint a szcintillációs detektorban. A töltéshordozók számának relatív statisztikus ingadozása így lényegesen kisebb lesz, ami a detektor sokkal jobb energiafelbontását eredményezi. A töltéshordozók száma arányos a leadott energiával (azaz teljes energialeadás esetén a gammafoton energiájával). Ez a kapcsolat lineáris az egész energiatartományban. Az összegyűjtött töltésnek megfelelő feszültségimpulzus amplitúdója arányos a gamma-sugárzásból elnyelt energiával. Az energiaszelektív detektor jeleinek feldolgozásához sokcsatornás analizátor szükséges. Működésének az a lényege, hogy az elnyelt energiával arányos feszültségimpulzusok szétválogatásához és megszámlálásához a vizsgálandó impulzusmagasság tartomány a csatornaszámnak megfelelő részre van osztva. Az erősítőből érkező impulzusok nagyságát megfelelő elektronika értékeli ki és az adott impulzusmagasságnak megfelelő csatorna tartalma minden analizált impulzussal, eggyel nő. A detektort folyamatosan cseppfolyós nitrogénnel kell hűteni. A felvett spektrumok kiértékeléséhez az energia és hatásfok kalibráció szükséges. A kalibrációkhoz olyan ismert összetételű sugárforrásra van szükség, amely legalább 3, egymástól jól elkülönülő gamma-vonalat ad és amelyeknek pontosan ismerjük az aktivitásait. Az energiakalibrációhoz leggyakrabban használt radioizotópok: Co-60 Cs-137 Na és kev kev és 511 kev K kev Cs-134 Ba és kev 356 kev Y és kev Az energia-kalibráció lényege, hogy a csatornákhoz (feszültségtartományokhoz) energiákat rendelünk adott nagyfeszültségnél és erősítésnél. Az energia-kalibrációnak azt az energiatartományt kell lefednie, amelyben a vizsgálandó radioizotópok előfordulhatnak. Az 17

18 energia-kalibráció lineáris. Ha van energia-kalibrációnk, segítségével a mintánkban levő radioizotópokat tudjuk meghatározni. Ha ezek mennyiségét is tudni szeretnénk, hatásfokkalibrációt is kell végeznünk. A hatásfok-kalibráció függ a környezeti minta mérésénél alkalmazott geometriától: a minta lehet szilárd (pl. talaj, kőzet stb.) vagy folyadék (pl. ivóvíz, folyóvíz, tej stb.), a minták tömege különböző adott halmazállapotnál is (pl. néhány grammos porminta, nagyobb darab kőzetminta, vagy a vízminta lehet 50 ml, vagy 250 ml stb.). Tehát az adott energiakalibráció mellett minden alkalmazott geometriánál el kell végezni a hatásfok- kalibrációt, amennyiben a mintában a radionuklid aktivitását is meg akarjuk határozni. Ehhez a környezeti minta mérésénél alkalmazott geometriájú, ismert összetételű és aktivitású sugárforrásra van szükség. Fordítva: amilyen geometriájú kalibrációt tudunk elvégezni, olyan geometriában mérhetjük a mintáinkat! 3. A gyakorlaton alkalmazott System-1 HPLC rendszer leírása A HPLC rendszer jellemzése A System-1 HPLC rendszer a Nukleáris Medicina Intézet Radiokémiai Központjának Minőségellenőrző laboratóriumában van elhelyezve (25. szoba). A rendszer egységeit és tartozékait az alábbi táblázat és ábra mutatja be. Egység Típus Gyártó Forgalmazó Szériaszám Funkció HPLC pumpa PU-2080 (Intelligent HPLC pump) JASCO ABL&E-JASCO Magyarország Kft. B Eluens szállítás Gázmentesít ő egység DG (4-line degasser) JASCO ABL&E-JASCO Magyarország Kft. B Eluens gázmentesítés Kvaterner szelep rendszer LG (Quaternary gradient unit) JASCO ABL&E-JASCO Magyarország Kft. C Euens kiválasztás Drain AD (Auto drain unit) JASCO ABL&E-JASCO Magyarország Kft. A Injektor hulladék elszívás Injektor AS (Intelligent sampler) JASCO ABL&E-JASCO Magyarország Kft. D Mintaadagolás Oszlopváltó Switching valve 1 (váltószelep) Switching valve 2 (váltószelep) Knauer LAB-COMP Kft Knauer LAB-COMP Kft Kolonna kiválasztás 18

19 Egység Típus Gyártó Forgalmazó Szériaszám Funkció Radioaktivit ás (RA) detektor Photosensor module with PMT tube plasztik szcintillátorral Hamamatsu Hamamatsu Radioaktív anyagok detektálása Tápegység NMI NMI TE-1 UV/VIS detektor UV-2077 (4-λ Intelligent UV/VIS detector) JASCO ABL&E-JASCO Magyarország Kft. B UV aktív anyagok detektálása Interfész LC-Net II/ADC JASCO ABL&E-JASCO Magyarország Kft. B Adatgyűjtésés adattovábbítás Szoftver ChromPass Ver JASCO ABL&E-JASCO Magyarország Kft Vezérlő- és kiértékelő szoftver Számítógép DELL Dell Inc. Dell Inc. GW2SV4J Rendszer- vezérlés Nyomtató HP Laserjet M1120n MFP Hewlett- Packard Hewlett-Packard CND8832R5 S Nyomtatás LCNet PC Elektromos csatlakozások HP Eluens csatlakozások Degasser Gradient unit Pumpa Injektor Oszlop váltó UV/Vis RA Eluens tartály Drain Hulladék tároló 19

20 A készülék működtetése Ellenőrizzük, hogy az eluenstartályban van-e elegendő eluens, és a megfelelő csővel van-e a szivattyúhoz csatlakoztatva. Győződjünk meg róla, hogy az adott vizsgálathoz szükséges oszlop van-e kiválasztva az oszlopváltón: a 3 pozícióban lévő kolonna használatos; a 6 pozíció a mosóág. Az utolsó detektor kimenetéhez tegyünk ólomárnyékolással ellátott hulladékgyűjtő edényt. A mérések végeztével a rendszert vízzel mossuk át! A pumpát a főkapcsoló bekapcsolása után a rajta lévő `PUMP` gomb megnyomásával lehet elindítani. Az áramlási sebességet a `FLOW` gombbal tudjuk szabályozni úgy, hogy a pumpa kijelzőjén aktiválódott sebességet a kívánt értékre állítjuk. A `PUMP` gomb ismételt megnyomásával pedig az áramlást tudjuk megállítani. A maximum és minimum nyomásokat értelemszerűen megadható a megfelelő `P. max` és a `P. min` gombok megnyomásával. A pumpa folyamatos működtetése közben figyeljük meg, buborékmentes-e az eluensáram a csövekben, illetve nem ingadozik-e a rendszer nyomása nagymértékben (>0,3-0,5MPa). Szükség esetén nyissuk ki a `PURGE` szelepet, és addig engedjük ki az oldószert, míg a buborékolás megszűnik. Ezután zárjuk a szelepet. A PU-2080 HPLC pumpa működésével kapcsolatos további adatok a MODEL PU-2080 Intelligent HPLC Pump Operator`s Manual, P/N B kezelési útmutatóban találhatók meg. 4. A gyakorlaton alkalmazott Clarus 500 GC gázkromatográf leírása A Clarus 500 gázkromatográf a Nukleáris Medicina Intézet Radiokémiai Központjának Minőségellenőrző laboratóriumában van elhelyezve (25. szoba), melynek egységeit és tartozékait az alábbi táblázat foglalja össze: Egység Típus Gyártó Szériaszám Funkció GC Clarus 500, Firmware Rev 2.02 Interfész NCI 901 Szoftver TCWS, Version Perkin Elmer, Inc. Perkin Elmer, Inc. Perkin Elmer, Inc. 650N WS0017 Számítógép Optiplex 780 Dell, Inc. 4C3605J Kromatografálás, detektálás Adatgyűjtés és adattovábbítás Vezérlő- és kiértékelő szoftver Rendszervezérlés 20

21 A Clarus 500 GC kétcsatornás, hőmérséklet programozható gázkromatográf, amely manuális injektálási módban használatos, valamint kapilláris kolonna injektorral (split/splitless mód), FID és TCD detektorral van ellátva. A detektorok analóg kimenettel rendelkeznek, az általuk kibocsátott jelet az NCI 901 interfész fogadja és továbbítja a vezérlő egység felé. A műszerhez kapilláris kolonna installálható. A rendszer működtetése A gázkromatográf elindítása előtt ellenőrizzük, hogy a hélium (vivőgáz), a sűrített levegő (égést tápláló gáz) és a hidrogén (égést biztosító gáz) vezetékek csapjai nyitott állapotban vannak. Ezt követően a Clarus 500 GC-t a jobb oldalán lévő főkapcsolóval lehet bekapcsolni. Önellenőrzés után a műszer kijelzőjén a Log in felirat jelenik meg, mely megérintésével beléphetünk a rendszerbe, ahol a megfelelő ikonok érintésével navigálhatunk az egyes menüpontok között. Az Oven menüben a kolonnatér paraméterei követhetőek: a hőmérséklet és a kromatográfiás módszerek által alkalmazott hőmérsékletprogramok alakulása. A Cap az injektor hőmérsékletét, a vivőgáz áramlási-sebességét és a Split arányt jelzi ki. A FID menüben a lángionizációs detektor hőmérséklete, a hidrogén és a levegő áramlási-sebessége olvasható le többek között. A TCD menüben a hővezető-képességi detektor hőmérséklete, a referencia gáz áramlási-sebessége figyelhető meg. A kromatográfiás mérés alatt a kromatogram alakulása a Signal menüpontban követhető nyomon a megfelelő nagyítás mellett. A mérés indítására a Run menüpontba való belépéssel van lehetőség. A továbbiakban indítsuk el a számítógépen az adatgyűjtő és vezérlő programot: klikkeljünk a TCNav ikonra. A belépéshez meg kell adnunk egy felhasználónevet és a hozzá tartozó jelszót, amellyel csak a gázkromatográfot jogosultan használó személy rendelkezik. Sikeres belépés után a TotalChrom Navigator-Clarus 500 GC felület jelenik meg. Abban az esetben, ha a FID detektort szeretnénk használni, akkor az Instruments közül a Clarus 500 GC fület kell aktiválni, viszont ha a TCD detektorral mérünk, az NCI900 opciót kell választani. Az Instruments -ek állapotát a Status fülön lehet nyomon követni. Abban az esetben, ha zöld színben jelenik meg a felirat, a műszer kész a mérés indítására, ha kék színű a kiírás, akkor az interfész aktív állapotban van (mérés megy vagy az interfész éppen feltölti a TotalChrom-ra az adatokat), piros szín esetén a műszer nem kész az adatok gyűjtésére, mivel nincs kapcsolatban az interfésszel, vagy nincs aktiválva a módszer, illetve szüneteltetve van a műszer használata. Egyszeri mérés indításához be kell lépni a Setup menüpontba, ahol a Method opció kijelölésével behívhatjuk a használni kívánt módszert, és megadhatjuk a fájl azonosítóját, valamint a fájl mentési helyét. Sorozatos mérések indításához a Setup menüpontban a Sequence opciót kell kiválasztani. Ezután behívjuk az előzetesen megszerkesztett seq kiterjesztésű fájlt, amely tartalmazza a mérések számát, a mérési fájlok nevét, mentési helyét, az alkalmazott kromatográfiás módszereket, jelentéseket. Mindkét méréstípus esetén a beállított adatokat OK val fogadtatjuk el, miután beállnak és stabilizálódnak a kívánt paraméterek (többek között a vivőgáz áramlási-sebessége, az injektor, a detektor és a kolonnatér hőmérséklete, split arány), amit a GC kijelzőjén is nyomon követhetünk. A mérés indításának lehetőségét a gázkromatográf kijelzőjén a Run menüpontban az Equilibrating és a Pre-Run lefutása után a Ready felirat jelzi. Az injektálást a Start jelzés megérintését követően 5 másodperc után a hosszú sípszó után kell elvégezni. Mérés közben a Real-Time plot -tal követhető az aktuális kromatogram alakulása. Az egyszeri mérés végeztével a műszer visszaáll az alkalmazott módszer kezdeti paramétereire. Több mérésre nincs lehetőség, ehhez a Setup menüpontban kell kezdeményezni az újabb mérést. 21

22 Sorozatos mérés esetén a rendszer felajánlja az Equilibrating és a Pre-Run műveletek után a soron következő mérés indításának lehetőségét anélkül, hogy a Setup menüpontban kezdeményeznénk azt. (TotalChrom Workstation User s Guide) Tekintettel arra, hogy a gázkromatográfiás mérések során egészségre káros radioaktív és/vagy szerves gázok, gőzök keletkezhetnek mérés közben az elszívókar használata kötelező! A vizsgálatok alatt az elszívókart bekapcsolt állapotban kell az injektor és a Vent cső felé helyezni! A mérés végeztével a kiértékelő szoftver az alkalmazott módszer beállításai alapján meghatározza a csúcsok integrálásához szükséges pontokat, meghúzza az alapvonalakat és elvégzi a megfelelő számításokat (koncentráció-meghatározás, területarányok számítása stb.). Az eredmények értékelése, a csúcsok esetleges újra integrálása és azonosítása a főmenü Results menüjében végezhető el, az értékelni kívánt rst kiterjesztésű fájl behívása után. A kromatogramok manuális kiértékelésekor a Manual Integration parancsot kell aktiválni, majd a kijelölendő csúcs kezdetére klikkelve folyamatosan húzva az alapvonalat a csúcs végénél elengedjük a bal egér gombot. A csúcs azonosításához a Manual Identification parancsot kell aktiválni, majd ráklikkelve az azonosítandó csúcsra a legördülő ablakból kell kiválasztani a megfelelő anyagnevet és a Reassign paranccsal elfogadtatni a változtatást. A mérési eredményt jelentés formájában kinyomtathatjuk, ha a Print report parancsra klikkelünk. Kromatográfiás módszereket, ezen belül kalibrálási fájlokat, jelentési fájlokat csak adminisztrátori jogosultsággal rendelkező felhasználók hozhatnak létre. Ezek a műveletek a TotalChrom Workstation User s Guide utasításai alapján végezhetők el. A gázkromatográf kikapcsolását az alábbiak szerint végezzük el. A Run menüpontban ráklikkelünk a Release control opcióra, és a GC kijelzőjén a kolonnateret 30ºC-ra hűtjük le, majd kilépünk az adatgyűjtő programból, illetve a kromatográf paneljén kiválasztható Log Out ikon megérintésével a főmenüből. A kolonnateret az ajtó megnyitásával hűteni szigorúan tilos, különben a kapilláris kolonna a hirtelen hőmérsékletesés következtében károsodhat! Ezt követően a GC főkapcsolójával kikapcsolhatjuk a műszert. Végezetül elzárjuk a gázvezetékek csapjait. (Clarus 500 GC User s Guide) 5. A gyakorlaton alkalmazott Canberra gamma spektrométer összetevői A Nukleáris Medicina Intézet Radiokémiai Központjának 003. sz. helyiségében telepített Canberra gamma spektrométer összetevői: Egységek Gyártó Típus Széria szám Ge félvezető detektor Cryostat Preamp Canberra GC SL 2002CSL b Spektrum analizátor Canberra DSA Kiértékelő szoftver Canberra Genie 2000 C37535/S500 Személyi számítógép Dell Optiplex 780 GB3605J Nyomtató Hewlett-Packard Deskjet 3845 TH4BP1511Q 22

23 A gamma spektrométer elektromos csatlakozásai: A gamma spektrométer helyes működésének feltétele a mérőműszer egységei közötti megfelelő elektromos csatlakozások megléte. Ennek biztosítása végett a műszer használata előtt ellenőrizzük az alábbi táblázatban megadott egységek közötti kapcsolatok meglétét. Gamma spektrométer egység Gamma spektrométer egység Kapcsolódási mód Személyi számítógép Hardverkulcs (SCT 11912) USB HUB Személyi számítógép DSA-1000 spektrum analizátor Kábel: Ge félvezető detektor (Canberra) Ge félvezető detektor, DSA-1000, HV bemenet Kábel: C DSA-1000, HV INH. bemenet Kábel: C HV inhibit kimenet Ge félvezető detektor, DSA-1000, AMP IN. bemenet Kábel: C ENERGY kimenet Ge félvezető detektor, C kimenet DSA-1000, PREAMP bemenet Kábel: 96A21652 A gamma spektrum felvétele: A gamma spektrumok felvételét az alábbiak szerint valósítjuk meg. Miután meggyőződtünk arról, hogy a spektrométer egységei között megfelelő az elektromos csatlakozás, illetve a detektorrendszer cseppfolyós nitrogénnel fel van töltve, bekapcsoljuk a számítógépet és elindítjuk a Genie2000 programot: Gamma Acquisition&Analysis. Ezt követően az MCA menüben kiválasztjuk az Adjust opciót. A megjelenő felületen bejelöljük a HVPS-t a Statust pedig ON-ra állítjuk. Ezzel a DSA-1000 beállítja a megfelelő feszültség értéket. A spektrum felvétel indításához az Analyze menübe lépünk és kiválasztjuk az Acquisition majd az Acquire parancsokat. A mérés indítása előtt megadhatjuk a fájl nevét, a mérési időt, a mentés helyét, stb. Abban az esetben, ha sorozatmérést akarunk kivitelezni, szekvencia fájlt kell létrehozni. Ehhez az Edit menüben az Analysis sequence parancsot kell választani. A feljövő ablakban meg lehet adni a mérések számát, kiértékelés módját, az eredmények nyomtatását, stb. A sorozatmérés elindításához az Analyze menüben az Execute sequence opciót kell kiválasztani, majd megadni a megfelelő szekvencia fájlt. A vizsgálati jelentéseket PDF formátumban is elmenthetjük, ehhez a File menüben az Export report to PDF opciót kell választani. A mérés végeztével a nagyfeszültséget nullára csökkentjük: az MCA menüben kiválasztjuk az Adjust opciót, a megjelenő felületen bejelöljük a HVPS-t a Status-t pedig OFF-ra állítjuk. Ezt követően kilépünk a Genie2000 programból. A Genie2000 szoftverrel kapcsolatos további információ a Genie2000 Operational Manual útmutatóban található. 23

24 6. A gyakorlaton elvégzendő feladatok A gyakorlat alkalmával el kell végezni a kiadott L-[metil- 11 C]metionin tartalmú minta részleges minőségellenőrzését. Ennek keretében a Minőségellenőrzés pontban részletezett eljárások alapján az alábbi feladatokat kell elvégezni: Enantiomer tisztaság vizsgálat: eluens készítés és a kiadott minta enantiomer tisztaságának meghatározása Etanol tartalmom meghatározás: belső standard oldat, 60 mg/ml etanol vizes oldatának készítése illetve a standard etanol oldat (rendszeralkalmasság) és a kiadott minta gázkromatográfiás vizsgálata. Gamma spektrometriás vizsgálat: energiakalibráció, a minta radionuklidos azonosítása és felezési idő mérés. A kapott eredményeket és tapasztalatokat jegyzőkönyv formájában szükséges leadni a gyakorlat végéig. 7. Kérdések önálló felkészüléshez A PET elve A L-[metil- 11 C]metionin szintézise és minőségellenőrzése a Nukleáris Medicina Intézetben HPLC és GC alapjai Gamma spektrometria 8. Felhasznált és ajánlott irodalom [1] Megtekintve: [2] Galbács Gábor, Galbács Zoltán, Sipos Pál: Műszeres analitikai kémiai gyakorlatok, JATEPress, [3] Dr. Lázár István: Nagynyomású folyadékkromatográfia (Elválasztástechnika segédanyag). 24