Éles tüskék vizsgálata patkány hippocampusban, in vitro. Diplomamunka és integrált tanári szakdolgozat

Átírás

1 Éles tüskék vizsgálata patkány hippocampusban, in vitro Diplomamunka és integrált tanári szakdolgozat Készítette: Váci Péter V. éves ELTE biológia-informatika szakos hallgató Témavezető: Dr. Wittner Lucia tudományos munkatárs, MTA Pszichológiai Kutatóintézet, Összehasonlító Pszichofiziológiai csoport Belső konzulens: Dr. Világi Ildikó egyetemi docens, ELTE TTK Élettani és Neurobiológiai tanszék 2008, MTA Pszichológiai Kutatóntézet

2 Tartalom Tartalom...2 Rövidítések...3 Összefoglalás...4 Abstract...6 Bevezetés...8 A terminológiáról...8 A hippocampus felépítése...8 A hippocampus belső kapcsolatai...11 A hippocampus funkciója...12 Sharp wavek...14 Hippocampalis oszcillációk...14 In vivo SPW...14 In vitro SPW...17 Célkitűzések...22 Módszer...23 Műtét...23 Adatok rögzítése...26 Adatfeldolgozás...27 Eredmények...29 Diszkusszió...41 A hippokampusz oktatása...45 Bevezetés...45 A hippokampusz helye a gimnáziumi oktatásban...45 Tanmenet...46 A hippokampusz, mint az agy része...52 A hippokampusz, mint az emlékezés kulcsszereplője...55 A hippokampusz és neuropszichiátriai betegségek...57 Összegzésül...57 A fejezet megírásához felhasznált irodalom...57 Felhasznált irodalom...59 Köszönetmondás...62 ~ 2 ~

3 Rövidítések ACSF...artificial cerebrospinal fluid, mesterséges liquor AMPA...alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-izoxazolpropánsav CA...cornu Ammonis, Ammon-szarv CSD...current source density, áramforrás sűrűség DW...dentate wave GABA...gamma-amino-vajsav GD...gyrus dentatus LTP...long term potentiation, hosszú távú potenciáció NMDA...N-metil-D-aszpartát SPW...sharp wave, éles hullám SPW-R...SPW ripple SRFP...synchronous rhythmic field potential, szinkron ritmikus mezőpotenciál ~ 3 ~

4 Összefoglalás Szakdolgozatomban a patkány hippocampusban kialakuló igen speciális agyhullámot, az éles hullámot (sharp wave, SPW) vizsgálom. A hippocampusnak kulcsszerepet tulajdonítanak a kognitív térkép kialakításában, az emléknyomok rögzítésében és a térbeli tájékozódásban. A hippocampalis oszcillációk közül sokat tanulmányozták a 4-8 Hz-es theta, valamint a Hz-es gamma hullámokat. Az inaktív állapotra és lassú hullámú alvásra jellemző jellegzetes agyhullámot, a SPW-et azonban csak a 80-as években kezdték intenzíven vizsgálni. A SPW-ek hippocampalis eredetű, nagy amplitúdójú mezőpotenciál hullámok, melyekre gyakran magas frekvenciás ( Hz) oszcillációk, úgynevezett ripple-ek szuperponálódnak. A feltételezések szerint a SPW-eknek az emléknyomok rögzítésének elősegítésében, a szinapszisok megerősítésében lehet kulcsszerepe. Az elmúlt években több kutatócsoport is leírta, hogy SPW-ek kimutathatók in vitro körülmények között is, életben tartott agyszelet preparátumban. Az in vitro SPW-ek keletkezésében fontos szerepet tulajdonítanak mind a glutamáterg serkentő, mind a GABAerg gátló folyamatoknak, feltételezve a hippocampus principális sejtjeinek és interneuronjainak szoros együttműködését. Dolgozatomban patkány hippocampus CA3b régiójában spontán keletkező SPW-eket vizsgáltam in vitro, valamint azok előfordulási frekvenciájának változását a sejtek excitabilitásának módosítására. A vizsgálathoz 600 µm vastag ventrális hippocampus szeletek felszínére helyezett, 24 csatornás, lamináris multielektródát használtam, melynek kontaktusai egymástól 50 µm távolságra vannak. Ennek segítségével a CA3b régió teljes vastagságából, annak minden rétegéből egyszerre tudtam elvezetni a mezőpotenciálokat. A post hoc mezőpotenciál és áramforrás sűrűség (CSD) analízis segítségével megállapítottam, hogy két, jelentősen különböző típusú SPW lehet jelen a hippocampus szeletekben. Mindkettő a CA3 régióban keletkezik, és egy sejtrétegi gátlással jellemezhető, de míg a T1-es típusú dendritikus serkentési mintázata a gyrus dentatus bemenetével, addig a T2-es típusú a CA3 piramissejtek bemenetével fed át. Az extracelluláris K + koncentráció - azaz a sejtek excitabilitásának - csökkentése mindkét típusnál a SPW-ek gyakoriságának csökkenését, néhány esetben teljes megszűnésüket eredményezte. A koncentráció növelésére a T2 típusú SPW-ek erős frekvencia növekedéssel válaszoltak, a T1-es típusúak azonban csak kis mértékben, vagy egyáltalán nem ~ 4 ~

5 növelték gyakoriságukat. A gátló interneuronok szerepét a GABAa receptor blokkoló bicucculline hatására teljesen megszűnő SPW-ekkel is igazoltuk. Összességében elmondható, hogy a patkány hippocampus CA3 régiójának neuronpopulációja in vitro körülmények között többféle szinkron populációs aktivitás létrehozására képes. A spontán keletkező SPW-ek komplex, serkentő és gátló szinaptikus folyamatokat is magukban foglaló események, melyekkel jól modellezhető a memóriafolyamatokban oly fontos szerepet játszó éles hullám. ~ 5 ~

6 Abstract The sharp wave (SPW), a special kind of brain oscillation in the rat hippocampus has been studied in my thesis. According to recent scientific results, the hippocampus has an important role in building cognitive maps and in spatial orientation, as well as in the creation of new memories. Two types of the hippocampal oscillations have thoroughly been studied: the theta oscillations (4-8 Hz), and the gamma oscillations (30-80 Hz). However, the SPW, which is typical in slow wave sleep and behavioral inactivity, has only begun to raise interest in the 80s. SPW-s emerge from the hippocampus, and they are high amplitude field potential waves, often superimposed with high frequency ( Hz) oscillations, so called ripples. According to a common concept, SPW-s have a key role in the fixation of new memories, the strengthening of new synapses. Numerous research groups have demonstrated in the past few years that the hippocampus can generate spontaneous SPW-s in vitro, in slice preparations. It is considered that GABAergic inhibitory and glutamatergic excitatory signaling pathways play an important role in the generation of in vitro SPW-s. In my experiments I studied spontaneously generated SPW-s in the CA3 region of rat hippocampus in vitro, as well as their frequency changes in relation to the modification of cellular excitability. Slices from the ventral hippocampus with the thickness of 600 µm have been investigated. A laminar multielectrode, with 24 channels, with contacts 50µm far from each other was used, positioned on the surface of the slice, above the CA3b region. Field potentials could be recorded simultaneously from the entire thickness of the CA3b, including all layers. Post hoc field potential and current source density (CSD) analysis showed that two, significantly different types of SPW-s can be generated in the same area of hippocampal slices. Both of them emerged from the CA3 region, and were characterized by an inhibition in the cell body layer. Type 1 SPW dendritic excitation overlaps with input from the dentate gyrus, type 2 SPW excitatory processes extend to CA3 pyramid cell input. A decreased extracellular potassium ion concentration, reducing cellular excitability, resulted in a decreased frequency of SPW-s, and in some cases, totally abolished them. Potassium concentration enhancement resulted in a strong increase of frequency in case of type 2 SPW-s, but only a moderate or no frequency increase in the case of type 1 SPW-s. The role of inhibitory neurons was confirmed by the use of the GABAa receptor antagonist bicucculline, which totally abolished SPW-s. ~ 6 ~

7 In conclusion, we demonstrated that the CA3 region of the rat hippocampus is capable of generating different types of spontaneous synchronized population activities. These spontaneous SPW-s are complex events, that require both excitatory and inhibitory synaptic signaling. These in vitro synchronous events are good models of in vivo SPW-s participating in memory formation and consolidation processes. ~ 7 ~

8 Bevezetés A terminológiáról Dolgozatomban törekedtem az általánosan elfogadott, használt terminológia alkalmazására. Bár sok jelenségnek, szervnek van magyar neve, ezt gyakran a hazai kiadványokban sem használják, helyette a latin vagy angol, esetleg ezek magyarított változata szerepel. Ilyen például a fogazott tekervény kifejezés, aminek a jelentése komoly fejtörést okozhat a téma legavatottabb szakértőinek is, a gyrus dentatust azonban mindenki ismeri. Egyedül a szakmódszertani fejezetben térek el ettől a terminológiától, a közoktatásban ugyanis kiemelkedően fontosnak tartom a minél egyszerűbb, érthetőbb kifejezések alkalmazását, és nem utolsó sorban anyanyelvünk ápolását. A rövidítések tekintetében törekedtem a nemzetközileg elfogadottakat választani, de ez nem minden esetben egyértelmű. A sharp wave ripple kifejezésére használják a SWR (O'Neill et al., 2006) és a SPW-R (Maier et al., 2003; Nimmrich et al., 2005) rövidítéseket is. Ilyen esetekben a gyakoribbat használtam. A hippocampus felépítése A hippocampus az előagy része, emberben az oldalkamra alsó szarvának mediális és alsó falát bedomborító, páros képlet. Nevét Arantiusnak köszönheti, aki 1587-ben a tengeri csikóhalhoz hasonlította formáját. Ez a hasonlóság koronális metszetben látható, és csakis az emberi hippocampusra igaz más gerincesek hippocampusa csak az anatómiai analógia miatt kapta ugyanezt a nevet. A hippocampus három fő részre osztható: a fej (uncus) a temporális lebeny csúcsa felé néz. Ezt követi a hippocampus teste, majd a kérgestest alá dorzálisan, majd anterio-mediálisan hajló farok. (1. ábra) A mediális oldalon fut végig a fimbria fornicis, mely a farokrészt alkotó fornixba megy át. Ez a képlet a be- és kimenő rostokat tartalmazza. Ezeken kívül formatio hippocampalis néven együtt szokták még említeni a hippocampus-szal szomszédos régiókat is. Ezek az archicortexhez tarozó területek a subiculum, presubiculum, parasubiculum és entorhinális kéreg. ( 2. ábra) (Régebbi irodalomban előfordul a prosubiculum kifejezés is, ezt azonban ma már a subiculum részének tartják.) Ez utóbbi területeket gyakran emlegetik ~ 8 ~

9 parahippocampalis gyrusként is, és általában együtt tárgyalják a hippocampus többi részével, hiszen mind anatómiailag, mind funkcionálisan szoros egységet alkotnak (Duvernoy, 1998; Halász, 2005). A hippocampus hossztengelyére merőleges átmetszetekben jól elkülönül két egymásba fonódó régió. A régiók leírásánál elsősorban rágcsálókban szerzett adatokra fogok támaszkodni, lévén, hogy lényegesen részletesebben kutatott terület, mint az emberi hippocampus (Golgi et al., 2001; Lorente de Nó, 1934; Ramón y Cajal, ). A hippocampus régiói közül a mediálisabb a gyrus dentatus (GD), a laterális pedig az Ammon-szarv (cornu Ammonis, CA). (3. ábra) A gyrus dentatus legnagyobb tömegét a szemcsesejtek adják, melyek viszonylag egyszerű szerkezetű serkentő sejtek. Többségüknek kerek és kis sejtteste van, melyek szorosan egymás mellett elhelyezkedve 1. ábra: Humán hippocampus; 1. hippocampus teste; 2. hippocampus feje (uncus); 3. zárt réteget alkotnak. Ezen kívül kis számban még hippocampus farka; 4. fimbria; 5. subiculum; 6. GABA tartalmú gátló sejtek is találhatók a GD corpus callosum; (Duvernoy, 1998) hilusában (összefoglalásként lásd: (Freund and Buzsáki, 1996)). A szemcsesejtek dendritjei a sejtrétegre nagyjából merőlegesen egy irányba futnak a gyrus dentatus molekuláris rétegében. Axonjaikat moharostnak, nagy végződéseit mohaterminálisnak nevezzük. Ezeken keresztül az Ammon-szarv CA3 régiójának sejtjeivel biztosítják a kapcsolatot (Golgi et al., 2001; Lorente de Nó, 1934; Ramón y Cajal, ). ~ 9 ~

10 2. ábra: A humán temporális lebeny; (Halász, 2005) 3. ábra: Patkányagy koronális metszet, Nissl-festés Az Ammon-szarvat túlnyomó többségében piramissejtek alkotják, ezen kívül még gátló interneuronok is előfordulnak benne. Ezt az egységet három területre szokták osztani, a benne található piramissejtek morfológiája és kapcsolataik alapján: CA1, CA2 és CA3. A gyrus dentatustól legtávolabb eső régió a CA1, mely egyúttal az Ammon-szarv kérgi kimenetét is képzi. Az itt található piramissejtek apikális dendritjei általában a stratum radiatumban elágazódnak, és a stratum lacunosum-moleculareban végződnek. Bazális dendritjeikkel az alveussal tartanak kapcsolatot. Axonjaik a stratum oriensben elágazódnak, egyik águk a septumba, másik a subiculumba vagy az entorhinális kéregbe fut. A CA1 piramissejteken végződnek a CA3 piramissejtekről érkező afferens rostok, a Schafferkollaterálisok. A középső, CA2 terület kis sejtszámú, aránylag nagy számban tartalmaz gátló ~ 10 ~

11 idegsejteket. Ez a terület patkányban nehezen elkülöníthető. A gyrus dentatushoz legközelebb eső régió a CA3, ahol a szemcsesejtek moharostjai a piramissejtek apikális dendritjeinek komplex tüskéin, az úgynevezett stratum lucidumban végződnek. A CA3 régió piramissejtjeinek bazális dendritjei a str. oriensbe futnak, apikális dendritjeik pedig a str. radiatumban, valamint a disztálisabb str. lacunosum-moleculare-ban ágazódnak el. A CA3 régióban található piramissejtek a CA1-beliekel ellentétben gazdagon beidegzik a szomszédos piramissejteket, valamint kommisszurális rostjaikkal az ellenoldali CA3 és CA1 terület piramissejtjeit is. Axonjaik mind a CA3, mind a CA1 régióban a piramissejtek dendritjeire, vagyis a str. oriensbe és radiatumba érkeznek. A CA1 piramissejtek csak az ellenoldali CA1 piramissejtekhez küldenek axon-kollaterálisokat. Mind a CA1 és a CA3 régió is felosztható további három részre (a, b, c), de ezeket általában csak a kapcsolatok topográfiájának leírásakor használják (Golgi et al., 2001; Lorente de Nó, 1934; Ramón y Cajal, ). A hippocampus belső kapcsolatai A hippocampuson belül, az agykéreggel szemben, nem a reciprok, hanem az egyirányú kapcsolatok jellemzőek. A perforáns pályán érkezik be az agykérgi információ az entorhinális kéregből a GD szemcsesejt rétegébe. Innét a már korábban említett módon a moharostok szállítják az információt a CA3 régióba, ahonnan a Schaffer-kollaterálisok futnak a CA1 régió piramissejtjeihez. Ezt az utat, a GD szemcsesejtjeitől a CA1 piramissejtjeiig nevezzük a hippocampus triszinaptikus pályájának. A CA1 piramissejtek axonjai a subiculumba és az entorhinális kéregbe vezetnek, ez utóbbiban azonban nem ugyanoda érkeznek, ahonnét a perforáns pálya indul, ezért nem beszélhetünk körről. (A perforáns pálya a II-III. réteg piramissejtjeiről indul, a CA1 piramissejtek axonjai viszont az V. rétegbe érkeznek. Persze az itt található axon-kollaterálisok elérik a II.-III. réteg piramissejtjeit is, így tehát mégis van visszacsatolás.) (4. ábra) ~ 11 ~

12 4. ábra: A triszinaptikus pálya; (Ramón y Cajal, ) nyomán, módosítva A hippocampus funkciója A hippocampus szerepe a mai napig sem teljesen tisztázott. A legkorábbi elképzelések szerint a szaglásban játszik szerepet, mely elméletet fizikai helyzetére, a szaglókéreghez közeli elhelyezkedésére alapozták. A limbikus rendszer átkapcsoló helyének is gondolták, melynek különböző szelvényeiben különböző, a limbikus rendszerhez tartozó feladatok segítése folyik (Szentágothai és Réthelyi, 2003). Mára azonban ezeket az elméleteket a tudományos világ elvetette. A másik teória szerint a hippocampus az emléknyomok kialakításában, rögzítésében játszik kulcsfontosságú szerepet. Ennek alapjául Scoville és Milner 1957-es jelentése szolgált, melyben H. M. azóta híressé vált bilaterális hippocampus eltávolításáról számolnak be. A műtét után H. M. súlyos amnéziával küzdött: képtelenné vált új emléknyomok rögzítésére (Scoville and Milner, 1957). Ez indította el a hippocampus ez irányú tanulmányozását, és mára széles körben elfogadott lett ez az elmélet is csakúgy, mint a térbeli tájékozódásról szóló. A harmadik elképzelés szerint a térbeli tájékozódásban, a kognitív térkép kialakításában játszik kulcsfontosságú szerepet a hippocampus. Ezt az elméletet John O'Keefe és Lynn Nadel kutatta és dolgozta ki, és 1978-ban a The Hippocampus as a Cognitive Map ~ 12 ~

13 című művükben foglalták össze az eredményeket (O'Keefe and Nadel, 1978). E szerint a hippocampusban található hely-sejtek a környezet agyi leképezését alkotják. CT és MRI felvételekkel igazolható, hogy térbeli tájékozódáskor a hippocampus régiói megnövekedett aktivitást mutatnak (Maguire et al., 1998). Ma gyakorlatilag általános egyetértés van abban, hogy a hippocampusnak fontos, de nem kizárólagos szerepe van a kognitív térkép kialakításában. O'Keefe és Nadel kimutatták, hogy a hely-sejtek tüzelése korrelációban van az állat térbeli helyzetével (O'Keefe and Nadel, 1978). Wilson és McNaughton kutatásukban több CA1 helysejt aktivitását egyszerre vezették el, és megmutatták, hogy bizonyos sejtek többnyire együtt tüzelnek, ún. együtteseket (ensembles) alkotnak (Wilson and McNaughton, 1993; Wilson and McNaughton, 1994). Egy labirintusos tanítási kísérletben jól látható, hogy a tanulási folyamat alatt gyakrabban együtt tüzelő sejtek a tanulás utáni alvás során is gyakran mutatnak együttes tüzelési mintázatot (5. ábra). Ez az utólagos erőteljes ensemble valószínűleg a kognitív térkép kialakításában és megjegyzésében játszik szerepet, a memóriakonszolidáció fontos lépése lehet. 5. ábra: hely-sejtek együttes tüzelése a tanulás előtt (pre), alatt (run) és után (post). A vastagabb ill. vörösebb vonal erősebb korrelációra utal. (Wilson and McNaughton, 1994) ~ 13 ~

14 Sharp wavek Hippocampalis oszcillációk A hippocampusban jellemzően theta, gamma oszcillációkat és sharp wave-eket találhatunk. A theta a 4 és 8 Hz közötti hullámokat jelenti. Ezek a hullámok általában explorációs viselkedés, valamint a gyors szemmozgásos REM alvás során jelentkeznek patkányoknál. Tanulás és memórianyomok előhívásakor is megfigyeltek theta oszcillációt, és a hosszú távú potenciáció (long term potentiation, LTP) előidézésében is fontos szerepet tulajdonítottak neki (Buzsáki, 2002). Ez utóbbi folyamatot a tanulás és a memória sejtes, illetve hálózati mechanizmusának tartják (Bliss and Lomo, 1973). A gamma hullámok a Hz-es tartományba esnek. Intenzív figyelmi állapotban és REM alvás álomképei alatt figyelhetők meg in vivo. A neuronok gyors tüzelése ebben az esetben is szinkronizált. A hippocampalis gamma oszcillációnak fontos szerepet tulajdonítanak a memórianyomok bevésésében, valamint előhívásában (Bragin et al., 1995; Chrobak and Buzsáki, 1998). In vivo SPW A 80-as évek előtt a kutatók kevés figyelmet szenteltek a SPW-eknek. Általában a theta hullámokat vizsgálták, és az ezek hiányában jelentkező, rendszertelen SPW-ekről csak annyit tudtak, hogy lassú hullámú alvásban, illetve immobil ébrenléti periódusokban jelentkezik. Az első tanulmányt a témában Jouvet és mtsai. készítették 1959-ben (Jouvet et al., 1959). A mélyebb tanulmányozás azonban a 80-as évek második felében kezdődött. Az általam itt összefoglalt cikkek mindegyikében patkányokon tanulmányozták a SPW-eket in vivo. Buzsáki György 1986-os cikkében számol be eredményeiről (Buzsáki, 1986). Patkányban vizsgálta a SPW-ek eredetét és terjedését a dorzális hippocampusban. A terjedés pontos vizsgálata érdekében az elektródot 82,5 µm-enként léptették odébb. Alvás, immobil ébrenlét, evés-ivás és párzás alatt találtak SPW-eket, melyek a CA1 str. radiatumában és a CA3 str. lucidumában voltak a legerősebbek. Megfigyelése szerint a SPW-ek keletkezése a ~ 14 ~

15 piramis sejtek populációs tüzelésével függ össze, amely esemény alatt az interneuronok és a piramissejtek megnövekedett tüzelési gyakoriságot mutattak. Vizsgálta különböző vegyületek hatását is. A GABAa receptor antagonista picrotoxin és a muszkarinikus acetil-kolin receptor antagonista atropin megnövelte a SPW-ek amplitúdóját, a GABAa receptor agonista diazepam és nembutal viszont nagymértékben lecsökkentette a frekvenciájukat, bár az amplitúdójukra nem volt hatással. Néhány esetben utóbbi szerek teljesen el is tűntették a SPW-eket. Mesterséges léziók segítségével Buzsáki azt is kimutatta, hogy a SPW-ek keletkezését nem a külső területek indukálják, sőt, bizonyos kapcsolatok megszüntetése növelte a SPW-ek amplitúdóját. Ez a felfedezés fontos az in vitro kísérletek miatt, ugyanis ez arra utal, hogy valószínűleg az izolált hippocampusban is keletkezhetnek SPW-ek. Buzsáki feltételezése szerint a SPW-ek keletkezése a következő mechanizmusnak köszönhető: az afferens kontroll hiánya megszűnik egy pillanatra, majd a gátlás alól felszabadult CA3 piramis sejtek populációs tüzelést produkálnak, ami kialakítja a hippocampalis SPW-et. Egy összefoglaló munkájában 1989-ben Buzsáki többek között azt is leírja, hogy a CA3 sejtek tüzelésének következtében a CA1 régióban található posztszinaptikus partnereikben hosszú távú potenciáció figyelhető meg (Buzsáki, 1989). Megfigyelte, hogy tetanizáló stimuláció (theta frekvenciájú stimulusokat használt) hatására növekszik a SPWburstök szinkronizáltsága, illetve, hogy a neokortikális aktivitás dönti el, mely CA3 piramissejt-csoport fog aktivitást mutatni. Mindezekből Buzsáki arra következtet, hogy valamiféle emléknyom-tárolási mechanizmus lehet a hippocampusban. Explorációs viselkedés alatt a neokortikális információt a szemcsesejtek továbbítják a cornu Ammonisba, ahol a CA3 piramissejtek egy csoportjában egy gyenge heteroszinaptikus potenciáció megy végbe. Ezek a piramissejtek az explorációs tevékenység végével populációs aktivitást, úgynevezett populációs burstöket indukálnak. Valószínűsítik, hogy ezek a populációs tüzelések elegendőek a megkezdett szinaptikus változások teljes kiépítéséhez, megerősítéséhez, mind a CA3 piramis sejtcsoportokban, mind a posztszinaptikus CA1 partnereikben. Ezt a modellt nevezi Buzsáki Two-stage model -nek, azaz kétfázisú modellnek. Ha akár az első fázis, tehát az emléknyomok hippocampusba juttatása a theta (explorációs) fázisban, akár a második lépés, azaz a SPW fázis alatti konszolidáció hibát szenved, az egész emléknyom-tárolás károsodik. Ez az elmélet roppant tetszetős, megmagyarázza például a gyakori, rendszertelen populációs tüzelések szerepét, vagy a korlátozott memóriakapacitást (a CA3 piramissejtek összetett tüskéinek ( mohatüskék ) ~ 15 ~

16 törékeny volta miatt), azonban akkor még hiányolta a kísérletes igazolásokat, és leginkább spekuláció volt. Egy 1995-ben megjelent cikkben, Aarne Ylinen, Buzsáki György és munkatársaik leírják a ripple-ket (Ylinen et al., 1995). Ezek a CA3 populációs tüzelés után a CA1-ben kialakuló magas frekvenciás (~200 Hz, mv amplitúdójú) oszcillációk, melyek a SPWek jellemző velejárói. Megfigyeléseiket patkányon végezték. Az egyes piramissejtek tüzelése nem volt gyors, de mivel időben eltolva tüzeltek a sejtek egy-egy ripple esemény alatt, ezért az elvezetett jelen magas frekvenciájú oszcillációt láttak. Valószínűsítik, hogy a ripple-k szerepe a tárolandó emléknyomok közvetítésének elősegítése lehet a hippocampus felől az entorhinális kéreg felé. A ripple frekvencia Hz volt ébren lévő állatban, Hz altatottban (uretán vagy ketamin). Érdekesség, hogy a halothan-os altatás teljesen elnyomta a ripple-ket ben Csicsvári József és munkatársai további megfigyeléseket publikáltak a ripple-kkel kapcsolatban (Csicsvári et al., 1999). Megfigyeléseiket nem-theta aktivitás alatt végezték, tehát például SPW-ek alatt is (de nem kizárólag akkor). Kétféle frekvenciájú rippleket találtak. A gyors, Hz-es oszcillációk megfigyeléseik szerint a CA1 régió piramissejt-rétegéből erednek, ellenben a lassabb, Hz-es ripplek a CA3 régióból erednek és szállítódhatnak a CA1 régióba. Egy későbbi cikkében Csicsvári tovább pontosítja a SPW-ek keletkezési mechanizmusát (Csicsvári et al., 2000). A CA3a-b régióban megjelenő SPW-burstök először a CA3c régióra terjedtek át, és innét jutottak el a CA1 régióba. Megfigyelték azt is, hogy a CA3-ban legalább a sejtek 10%-ának kellett 100 ms-on belül tüzelniük ahhoz, hogy a SPW átterjedjen a CA1 régióra is. Valamint bizonyos CA3 piramissejtek tüzelése előre jelezte a CA1 ripple-k megjelenését. O Neill, Senior és Csicsvári egy 2006-os cikkében (O'Neill et al., 2006) az exploráció alatti, tehát a theta hullámok alatti, és azok rövid szüneteiben jelentkező ripple-ket (espw-r) hasonlította össze az inaktív állapotbeli ripple-kkel (SPW-R). Bár első ránézésre ezek hasonlóak voltak, de megfigyelték, hogy az espw-r alatt a neuronális aktivitás helyfüggő, konkrétan a place-sejtek területén erősebb volt, mint azon kívül. Kutatásaikkal megerősítették azt a feltételezést, hogy a ripplek szerepe a kognitív térkép kialakításában és hosszú távú tárolásának elősegítésében döntő jelentőségű. ~ 16 ~

17 In vitro SPW A. Draguhn, R. D. Traub, D. Schmitz és J. G. R. Jefferys 1998-as cikkükben in vitro tanulmányozták a hippocampus oszcillációit patkányban (Draguhn et al., 1998). Eredményeikben beszámolnak magas frekvenciájú ( Hz) oszcillációkról, melyek a hippocampus minden principális sejtrétegében megjelentek. Ezen oszcillációk összehangolásában nem kémiai, hanem elektromos kapcsolatok, valószínűleg gap junctionok játszanak szerepet. Ezt gap junction blokkolókkal és serkentőkkel végzett vizsgálatok segítségével mutatták ki. Ez valószínűleg azért van így, mert a theta és gamma oszcillációkban szerepet játszó GABA tartalmú gátló interneuronok túl lassú mechanizmusa nem felel meg a 200 Hz körüli gyors oszcillációk kialakításához. A cikkírók megjegyzik a hasonlóságot a talált oszcilláció és az in vivo ripplek között, azonban az utóbbiak kialakításában kulcsfontosságú SPW-eket ők normál ACSF alkalmazásakor nem találtak, csupán epileptogén, módosított ACSF alkalmazásakor (például bicucculline hozzáadásával). Továbbá a ripplek terjedése, lokalizációja is eltért az in vivo-ban tapasztaltaktól. Más kutatócsoportok azonban kimutatták, hogy SPW-ek spontán módon is megjelenhetnek in vitro, hippocampus szeletekben. Kubota és mtsai. patkány hippocampusszal dolgoztak, a temporális részéből készítettek 350 µm-es szeleteket (Kubota et al., 2003). Ezekből a szeletekből több órán keresztül rendszertelen, átlagosan 4 Hz-es előfordulású hullámokat tudtak elvezetni a CA3 régió több területéről is. Kísérleteik során kolinerg és szerotonerg stimulációval meg tudták gátolni a SPW-ek kialakulását. Megjegyzik, hogy korábbi in vitro kísérletekben más kutatócsoportok nem találtak SPW-eket. Ezt azzal magyarázzák, hogy a hippocampus CA3 régiójában található piramissejtek kapcsolatai nagymértékben sérülnek metszéskor, hiszen a metszési síktól eltérő irányú, hosszú asszociációs rostok jelentős része levágásra kerül. Így a szeletben a kialakuló SPW kialakításában nem tud megfelelő mennyiségű piramissejt részt venni. Ennek kiküszöbölésére a hippocampus temporálisabb régiójából készítették a metszeteket, ahol a piramissejtek kapcsolatai térben kevésbé kiterjedtek, így megfelelő irányú metszéssel a kapcsolatok nagyobb része megőrizhető. Érdekes, hogy a szeletek vastagságának növelésével nem próbálkoztak, pedig ez is jelentősen növelheti az épen maradt kapcsolatok számát. Természetesen ennek is vannak határai, hiszen az ACSF gyakorlatilag csak a szeletek felületein keresztül képes a sejteket tápanyagokkal ellátni, így egy vastagabb szelet közepén óhatatlanul meghalnak a sejtek. Az általuk vizsgált szeletekben spontán kialakuló hullámok ~ 17 ~

18 eltértek a theta hullámoktól, és a SPW-re emlékeztettek. A szerzők szerint valószínűleg az in vivo megfigyelt SPW-ek in vitro korrelátumát találták meg (Kubota et al., 2003). Maier és mtsai. egér hippocampus szeleteken tanulmányozták a spontán SPW-eket és ripple-ket (Maier et al., 2003). A szeparált CA1 régióból is sikerült SPW-eket elvezetniük, intakt szeletben azonban a CA3 és CA1 SPW-ek szinkronizáltan jelentek meg, és a CA3 régióból eredtek. Megfigyelték továbbá, hogy mind a gátló, mind a serkentő kapcsolatokra szükség van a SPW-ek kialakulásához és terjedéséhez, sőt, az elektromos kapcsolatok megléte is elengedhetetlen, leginkább a ripple-k kialakulásában. Ezzel alátámasztják Draguhnék 98-as cikkében leírtakat a gap junctionok szerepéről. A SPW-ek alatt a CA1 piramis sejtek nagy része erős gátlás alatt állt, csak egy kis részük tüzelt, azok azonban szinkronban voltak a ripple-kkel. Ez az erős szelekció fontos szerepet játszhat a helyes kapcsolatok megerősítésében, azaz az emléknyomok tárolásában. Colgin és mtsai. patkány temporális GD-ban vizsgálták a spontán kialakuló hullámokat (Colgin et al., 2004). 0,7 Hz-es negatív hullámokat találtak, melyek helyben, a szemcsesejt-rétegben keletkeztek, és melyek leszálló ágán akciós potenciálokat figyeltek meg. Ezeket a hullámokat párhuzamba állították az in vivo megfigyelt ún. dentate weavekkel (DW), melyek a SPW-hez hasonló, de annál valamivel alacsonyabb frekvenciájú, a GD-ban megfigyelt hullámok. Ezek a hullámok a SPW-hez hasonló állapotú állatban (inaktív, alvó stb.) vannak jelen in vivo. A hullámok a GD külső és belső ívén szinkronban jelentek meg. Ezt a szinkronitást rés-kapcsolatok biztosítják. A DW-k kialakulásuk után képesek a szemcsesejteken keresztül átterjedni a CA3 régióra, és ott a SPW-hez hasonló populációs aktivitást alakítanak ki. Dzhala és Staley cikkükben beszámolnak róla, hogy a kálium csatornák blokkolása csökkentette a ripple-k amplitúdóját (Dzhala and Staley, 2004). Behrens és mtsai. stimulációval állítottak elő SPW-eket hippocampus szeletekben (Behrens et al., 2005). A CA1 str. radiatumába adtak az LTP kialakításához szükséges, magas frekvenciájú impulzus sorozatokat, mely után két órán keresztül el tudtak vezetni SPW-eket. Megjegyzik, hogy a ventrálisabb szeletekben nagyobb a valószínűsége a spontán SPW-ek feltűnésének. A jelek terjedéséről megállapították, hogy a kiváltott SPW-ek a CA3 régióból a CA1-be, majd a subiculumba terjednek. Glutamát (AMPA és kainát) receptor antagonistákkal, valamint rés kapcsolat blokkolókkal sikeresen blokkolni tudták a jelek kialakulását és fennmaradását. ~ 18 ~

19 NMDA blokkolóval csak a jelek kialakulását tudták megakadályozni, de a már kialakult SPW-eket nem tudták vele leállítani. Az ACSF ionkoncentrációjának változtatásával változásokat értek el a SPW-R-k kialakulásában. Alacsony Mg-koncentráció mellett könnyebben tudták kiváltani a SPW-eket. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a SPW-ek kialakulásában szerepet játszhat az LTP, mely folyamathoz az NMDA receptorok működése szükséges, míg a potenciációval már létrehozott SPW-ek generálásában az NMDA nem, de az AMPA és kainát receptorok, illetve gap junction-ok működése játszik közre. Kano, Inaba és Avoli a hullámok spontán kialakulását kutatták (Kano et al., 2005). Metszeteikben az entorhinális és a perirhinális kérget, valamint az amygdala bizonyos részeit is egyben hagyták. Az ilyen szeletekben 5-11 Hz-es szinkron hullámokat találtak. Ezek a hullámok több helyről is eredhettek, és kialakulásuk alatt a rendszeresen tüzelő sejtek szinaptikus depolarizációját figyelték meg intracelluláris elvezetéssel. Megfigyelték továbbá, hogy a hullámok 8-20 ms alatt terjednek tova. Izolációs kísérletekkel kimutatták, hogy a parahippocampalis területekben megjelenő spontán, SPW-szerű hullámok az izolált agyrészekben is fennmaradnak, tehát az amygdala, entorhinális és perirhinális kéreg képes maga is generálni ilyen hullámokat. NMDA, AMPA és kainát receptor antagonistákkal, réskapcsolat blokkolókkal és GABA-antagonistákkal igazolták az ionotróp GABAerg és glutamáterg receptorok aktivitását, valamint ők is belátták, hogy rés kapcsolatok is részt vesznek a hullámok továbbításában, továbbá kimutatták, hogy valószínűleg preszinaptikusan elhelyezkedő GABA B receptorok szabályozzák az oszcillációt. Nimmrich és munkatársai egér CA1 szeleteken tanulmányozták a SPW-ek, a SPW-Rök és a GABA-erg gátló interneuronok kapcsolatát (Nimmrich et al., 2005). A GABAa receptor blokkoló gabazine alkalmazásával sikerült gátolniuk a spontán ripple-k kialakulását. A dendritikus régióba történő lokális KCl adagolással azonban SPW-eket tudtak generálni, mely SPW-eken 200 Hz-es ripplek jelentek meg. Ez az oszcilláció glutamát receptor blokkolók hozzáadása mellett is megmaradt, de a rés kapcsolat blokkolók megszüntették a szinkronitást. Ezzel ők is belátták, hogy a magas frekvenciájú ripple oszcillációk összehangolásában rés kapcsolatok játszanak szerepet, de emellett kimutatták, hogy a SPW-ek generációjában a GABA-erg gátló kapcsolatoknak kulcsszerepe van. Wu és mtsai. Kubotáék által felvetett problémát vizsgálták egy másik megközelítésből (Wu et al., 2005a; Wu et al., 2005b). 1mm vastag szeleteket vágtak egér hippocampusból. ~ 19 ~

20 Mivel ilyen vastag szeleteknél már fennáll a hypoxia veszélye, a jobb tápanyag-ellátottság érdekében szeparált CA-GD preparátumon dolgoztak, sőt, még a GD-t is elválasztották a CA1/CA2 régiótól, ezzel nagyobb felületet biztosítva az ACSF diffúziójának. Ügyeltek azonban arra, hogy a GD-CA3-CA1 kapcsolat épen fennmaradjon. Erőteljes, 1-4 Hz-es populációs aktivitást találtak, mely a CA3 régióból eredt. A szelet vastagsága miatt azonban felvetődött, hogy esetleg hypoxia vagy más kísérleti melléktermék okozza a jelenséget, ezért mérték a szöveti O 2 -t, a ph-t, a K + koncentrációt valamint a sejt- és szinaptikus-aktivitást. Az eredmények alapján kimondták, hogy a szeletek tápanyag-ellátottsága megfelelő, tehát a megfigyelt spontán hullámok az egészséges szelet termékének tekinthetők, tehát az ilyen szeletek kiválóan alkalmasak a SPW-ek tanulmányozására (Wu et al., 2005b). Egy későbbi cikkükben határozottan kimondják, hogy a talált hullámok alakban, gyakoriságban és lokalizációban nagyban hasonlítanak az in vivo SPW-ekre, tehát valószínűleg azok in vitro korrelátumáról van szó. Ezen kívül megfigyelték, hogy a CA3 régióban kicsiny, de fontos glutamáterg aktivitás indítja a populációs aktivitást (Wu et al., 2005a). Bár a korábbi kutatások alapján egyértelműnek tűnik, hogy a spontán SPW-ek és ripple-k kialakulásához csak a CA és GD régiókra, valamint ezek belső kapcsolataira van szükség, mégis problémásnak találom, hogy a hippocampus többi területét eltávolították, hiszen minden terület valamilyen szinten kapcsolatban áll a parahippocampalis régióval is, így előfordulhat, hogy ha nem is közvetlenül, de közvetve befolyásolják például a subiculáris területek a SPW-eket, vagy fordítva, ezeken a területeken is éreztetik hatásukat a CA3-ból eredő oszcillációk. Erre világít rá Wu én mtsai. egy későbbi cikke (Wu et al., 2006). Itt is vastag szeleteket használtak: a dorzálisabb régióból 1mm-es, a ventrálisabb régióból µm-es szeleteket készítettek, mivel utóbbiban térben kevésbé kiterjedtek a CA régió belső kapcsolatai. Érdekesség, hogy Kubotáék a temporális régióról állították ugyanezt, de a megállapítás jól összecseng Behrensék megfigyelésével, akik vékony szeleteken dolgozva a ventrálisabb régióban találtak gyakrabban spontán SPW-eket. A szeletek a CA és GD területek mellett a subiculumot és az entorhinális kérget is tartalmazták. Utóbbi területekben a spontán ritmusos field potenciálokat (SRFP) vizsgálták. Azt találták, hogy ezek a CA1 régióból terjedtek a subiculumba, majd az entorhinális kéregbe, bár a szeparált subiculum maga is generált SRFP-ket. Feltételezésük szerint a subiculum erősítő és átkapcsoló helyként funkcionálhat. ~ 20 ~

21 A fenti cikkeket áttekintve megállapítható, hogy a megfelelően megválasztott in vitro preparátumok jól modellezik az in vivo SPW-eket és rippleket. Fontos a szeletek vastagsága és a metszés iránya. Túl vastag szeleteknél a hypoxia, rossz ion- és tápanyag-ellátottság miatt a sejtek pusztulásának valószínűsége nagy, a vékony szeleteknél azonban a CA régiók szövevényes, térben nagyon kiterjedt belső kapcsolatai sérülhetnek, így a spontán hullámok kialakulásának valószínűsége erősen csökken. Az 1mm-es szeletek valószínűleg már a felső határt közelítik, Wu és mtsai. ilyen szeleteknél mindig figyeltek arra, hogy ahol csak lehet, szétválasszák az egymás mellett lévő régiókat, ezzel is növelve a felületet. Az ilyen beavatkozások azonban minden esetben magukban hordozzák a sérülés veszélyét. A µm vastag szeleteknél viszont kicsi volt a valószínűsége a spontán SPW-ek kialakulásának. A ventrálisabb szeletekben a belső kapcsolatok jellegéből adódóan nagyobb a kapcsolatok megőrződésének a valószínűsége, ezért nagyobb a spontán aktivitás megjelenésének valószínűsége is. A SPW-ek valamint a ripplek kialakulási mechanizmusát sokat tanulmányozták, többen is kimutatták a GABAerg és glutamáterg szignalizáció szerepét (Behrens et al., 2005; Kano et al., 2005; Maier et al., 2003; Nimmrich et al., 2005; Wu et al., 2005a), valamint a réskapcsolatok szinkronizáló tulajdonságát (Colgin et al., 2004; Kano et al., 2005; Maier et al., 2003; Nimmrich et al., 2005). Nem sok figyelmet szenteltek azonban a körülmények változására, a ph és ionkoncentrációk megváltozásának hatásaira, pedig néhány tanulmányból látszik, hogy jelentős szerepük lehet a spontán hullámok kialakulásában. (vö. (Behrens et al., 2005)). Ezen kívül a SPW-ek terjedését, keletkezését többen is leírták, megemlítve, hogy több helyen is keletkezhetnek hasonló oszcillációk, spontán hullámok (Behrens et al., 2005; Colgin et al., 2004; Kano et al., 2005; Maier et al., 2003; Nimmrich et al., 2005; Wu et al., 2005a; Wu et al., 2005b; Wu et al., 2006). A mi sokcsatornás lineáris elvezetési rendszerünk remek alkalmat nyújt a SPW-ek térbeli karakterisztikájának (vagyis a mezőpotenciálok, áramforrás sűrűségek és a sejtes aktivitás térbeli mintázatának) leírására. Ezen információk sokat nyújthatnak annak megértésében, hogy egy adott régión belül mely rétegekben és milyen szinaptikus folyamatok eredményeképpen jönnek létre a SPW-ek. További fontos kérdés, hogy a fiziológiás körülmények (például a K + -koncentráció) kismértékű változtatása hogyan befolyásolja a SPW-ek kialakulását. ~ 21 ~

22 Célkitűzések A kísérletek megkezdése előtt az alábbi kérdések megválaszolását tűztem ki célul: - Található-e spontán SPW in vitro, patkány hippocampus CA3 régiójában, közepesen vastag (600 µm) szeleteket használva? - Milyen ezen SPW-ek elektrofiziológiai (mezőpotenciál gradiens, sejtaktivitás, áramforrás sűrűség) jellemzőinek térbeli karakterisztikája a CA3 régióban? - Van-e többféle SPW? - Ha, igen, miben különböznek, mi okozhatja a különbözőségeket? - Hogyan reagálnak a SPW-ek a megnőtt és a lecsökkent extracelluláris K + koncentrációra? - Milyen hatással van a SPW-ekre a GABAa receptor blokkoló bicucculline? - Van-e változás a hosszú ideig megfigyelt, de semmilyen módon nem befolyásolt szeletekben található SPW-ekben? ~ 22 ~

23 Módszer Műtét A kísérletekhez külön erre a célra, helyben, engedéllyel tenyésztett és tartott laboratóriumi Wistar patkányokat használtam. A kísérletek a Fővárosi Állategészségügyi és Élelmiszerellenőrző Állomás jóváhagyásával történtek. Az állatokat hasüregbe adott 40%-os uretánnal altattam, 100 g testtömegenként 0,2 ml-t adva. Ez a szer általánosan használt olyan mélyaltatásos állatműtéteknél, ahol a kísérleti alany nem ébred fel a műtét után, és ezért nem okoz gondot a szer karcinogén hatása. Megjegyzendő, hogy Buzsáki és mtsai. kutatásai alapján az uretán felére csökkenti a SPW-Rek frekvenciáját (Ylinen et al., 1995). Az altatás után azonban több óra is eltelt a mérések megkezdéséig, így az uretánnak bőven volt ideje kimosódni a folyamatosan cserélődő mesterséges agyi folyadék (ACSF) segítségével. A műtétet az után kezdtem meg, hogy a cornea- valamint a fájdalomreflex megszűnt. Első lépésben hideg (fagypont körüli), oxigenált, módosított mesterséges agyi folyadék (szaccharóz-acsf) oldattal perfundáltam az állat agyát. Az oldatot a mellkas felnyitása után a szív bal kamrájába adva juttattam az agyba. (6. ábra) Az oldat 6. ábra Az agy perfundálása módosított ACSF-fel a szív bal kamráján keresztül célba érését a szem kifehéredésén vagy a fül hajszálereinek elszíntelenedésén lehet nyomon követni. Ez után eltávolítottam az agyat, és jeges, oxigenált szaccharóz-acsf oldatba helyeztem (az agy a szelés végéig ebben az oldatban van). Ennek az oldatnak az összetétele (lásd alább) és hőmérséklete is a neuronok tüzelésének lassítását, ideiglenes leállítását szolgálja, mellyel témavezetőm tapasztalata szerint csökkenthető a sejtek excitotoxicitás okozta halálának veszélye. ~ 23 ~

24 Az agyról eltávolítottam a kisagyat, valamint az agy frontális felét, majd óvatosan lehúztam a lágy agyhártyát a metszés megkönnyítése érdekében. Végül az agyat vibratommal a ventrális irányból dorzálisan haladva 600 mikrométeres szeletekre metszettem. (7. ábra) Az első néhány szeletben a hippocampus formájából következően szinte longitudinális metszeteket kaptam, így azokat nem tudtam használni. Általában 5-6 használható metszetet tudtam féltekénként előállítani. jeges, oxigenált szaccharóz-acsf (módosított ACSF) penge oxigén vezeték hippocampus, és a jobb támaszték kedvéért meghagyott kortexrészlet 7. ábra: A hippocampus szeletelése vibratommal A szeleteket oxigenált, fűtött ACSF folyamatos áramoltatása mellett interface kamrába helyeztem, ahol a mérés megkezdése előtt fél-egy órát állni hagytam, hogy helyreállhasson a sejtek működése (8. ábra). A folyadék viszonylag gyorsan, pontosan meghatározott idő alatt érte el a szeleteket. Mérés közben az extracelluláris kálium-koncentrációt a kamrákon átáramló folyadék cseréjével változtattam. Néhány esetben a GABAa receptor blokkoló bicucculline hatását is vizsgáltam. Ezt szintén az átfolyó folyadékkal juttattam a szeletekre. Az oldatok összetétele: - Szaccharóz-ACSF: 248 mm szacharóz, 26 mm NaHCO 3, 1 mm KCl, 1 mm CaCl 2, 10 mm glükóz, oxigenálva 95%O 2-5%CO 2 A megfelelő oxigenáltságot metilvörös hozzáadásával tudtam nyomon követni. - ACSF: 125 mm NaCl, 26 mm NaHCO 3, 4 mm KCl, 2 mm CaCl 2, 2mM MgCl 2, 10 mm glükóz, oxigenálva 95%O 2-5%CO 2 ~ 24 ~

25 - Magas K + : 125 mm NaCl, 26 mm NaHCO 3, 6 mm KCl, 2 mm CaCl 2, 2mM MgCl 2, 10 mm glükóz, oxigenálva 95%O 2-5%CO 2 - Alacsony K + : 125 mm NaCl, 26 mm NaHCO 3, 2 mm KCl, 2 mm CaCl 2, 2mM MgCl 2, 10 mm glükóz, oxigenálva 95%O 2-5%CO 2 - bicucculline: ACSF + 10 µm bicucculine-methiodide Kimenő ACSF Hőmérő Agyszeletek Bejövő ACSF 8. ábra: Az interface kamra Referencia elektróda (intracelluláris elvezetéshez) 9. ábra: A munkaállomás ~ 25 ~

26 Adatok rögzítése Az adatok rögzítésére módosított 24 csatornás extracelluláris lamináris multielektródát (Ulbert et al., 2001) használtam (10. ábra), melynek kontaktusai egymástól 50 µm távolságra voltak. Ennek segítségével a sejten kívüli térből a mezőpotenciál gradiens (field potential gradient, FPG), több sejt együttes, populációs aktivitása mérhető (multiunit, MUA), de egyes sejtek akciós potenciáljainak (AP) mérése is lehetséges (single unit) (Ulbert et al., 2001). Az elektróda típusából és a rögzítés módszeréből (bipoláris elvezetés) adódóan a felvétel egyszeres térbeli deriváltnak számít. Az elektródát a kamrában lévő szeletekre helyezve, többszöri kísérlettel minden szeletet végigtapogatva kiválasztottam a legalkalmasabb szeletet a kísérletre. Az elektróda elhelyezésénél törekedtem arra, hogy az érzékelők a CA3b régió fölött legyenek, merőlegesen a piramisrétegre. Így az adott régió minden rétegéből egyszerre tudtam elvezetni a neuronális aktivitást. Az elektróda helyének pontosítása akkor volt lehetséges, ha egy szeletben találtam megfelelő SPW-eket. Ekkor törekedtem arra, hogy a piramis sejt réteg (a felvételen gyakori AP-k megjelenése jelezte a piramis réteg helyét) az elvezetések második ötödébe essen. Általában így volt a legjobban látható a SPW teljes kiterjedése. 10. ábra: a lamináris multielektróda alulnézetben (Ulbert et al., 2001) Az adatokat, amelyek egy tízszeres gradiens előerősítés után jutottak az erősítőbe, amely 0, Hz tartományban megszűrte őket, A/D konverterrel digitális jellé alakítva számítógéppel rögzítettem a LabView alapú Acquire programmal, 20 khz frekvenciával. A rögzítő programot a labor vezetője, Dr. Ulbert István készítette, kifejezetten az ilyen kísérletekhez. Mivel a jelet bipoláris (gradiens) elvezetéssel vettük fel, a regisztrátum ~ 26 ~

27 egyszeres térbeli deriváltnak számít. ( 11. ábra) A számítógépek memóriakapacitásának véges volta miatt 10 perces fájlokra daraboltam a felvételt. Fontos volt, hogy rezgésmentes asztalon dolgoztam, így az épület rezgései, az utcáról beáramló vibrálások nem okoztak zajt a felvételeken. Az elektromos zaj kiszűrésére a munkaállomás körüli Faraday-kalitka volt hivatott. ( 9. ábra) Adatfeldolgozás A rögzített adatot sokféleképpen elemeztem. Az elemzéshez Neuroscan 4.3 Edit programcsomagját használtam elsősorban, de emellett a Matlab programhoz a labor doktoranduszai által készített kiegészítőket is alkalmaztam. A frekvencia analízishez az Edit programban található Voltage Treshold funkciót használtam, mely képes egy adott csatornán bizonyos feszültségnél nagyobb vagy kisebb értékeket detektálni és megjelölni. Első lépésben meg kellett határoznom a megfelelő elvezetést, és megkeresni azt az értéket, melynél pontosan az összes eseményt megtalálta a program. Ez a helyenként zajos felvételek miatt nem mindig volt könnyű feladat, de előzetes szűrésekkel (általában 1 és 100 Hz között), illetve matematikai simításokkal, transzformációkkal, deriválással a SPW-ek könnyebben detektálhatóvá tehetők. Miután sikerült megjelölni a SPW-eket, importáltam táblázatkezelő programba az előfordulási időiket. Az eredmények ellenőrzése céljából néhány regisztrátumot manuálisan is végigszámoltam, de nem találtam eltérést. Ezt folytattam az összes, adott szelethez tartozó fájllal, majd az összes adatot egyetlen táblázatba foglaltam a könnyebb kezelhetőség kedvéért. Az így kapott adatsorból osztással meghatároztam a 10 másodpercre eső események számát, amit ábrázoltam egy derékszögű koordináta rendszerben, majd mozgó átlagot illesztettem rá a jobb átláthatóság kedvéért. Ez után meghatároztam a jegyzőkönyv alapján, hogy mikor milyen összetételű folyadékot adtam a szeletekhez, és ez alapján a megfelelő kategóriákban átlagoltam a frekvenciákat, illetve jelöléseket helyeztem el a grafikonon.. A SPW-ek lokális membránáramainak meghatározásához áramforrás sűrűség (current source density, CSD) analízist végeztem. Az agykéregben detektálható mezőpotenciálok szummációs jellegű elektromos folyamatok eredményei, tehát kialakulásukért a megfigyelési helytől távoli idegsejtek éppúgy felelősek, mint közeliek. A CSD megadja a potenciálteret ~ 27 ~

28 generáló helyi áramforrások (source), illetve áramnyelők (sink) idő és térbeli mintázatát. A sink a lokális sejtpopulációnak az extracelluláris térből az intracelluláris térbe irányuló szummált membránáramát jelzi. A befelé folyó áram egyrészt a membránok szinaptikus depolarizációjából eredhet, mint aktív CSD komponens, másrészt jelentheti az aktív áramforrás (source) által meghatározott áramkör passzív záródását. A source kifelé irányuló szummációs membránáramot jelez. Fiziológiailag ez egyrészt passzív kiegyenlítődési áramként interpretálható, másrészt aktív hiperpolarizációt is jelenthet. Utóbbi lehet szinaptikusan, vagy nem szinaptikusan hajtott hiperpolarizáció. Az általam használt CSD analízis menete a következő: a már említett szűrésekkel detektáltam a SPW-eket. Az Edit program képes arra, hogy külön event fájlba elmentse a detektált helyeket, és azt egy másik fájlra alkalmazza. Ezért nyugodtan lehet akár egészen durva torzításokat is eszközölni az eredeti fájlon a helyes detekció kedvéért, a végeredményt ezek nem befolyásolják. Az event fájl elkészítése után az eredeti felvételt Hamming eljárással térben simítottam, azaz minden csatornához fele részben hozzávettem az előző és következő csatornát. Ennek eredményeként a több csatornán is megjelenő jelek hangsúlyosabbak lettek, míg a szelektíven csak az egyik csatornán, vagy csak két csatornán de ellentétesen megjelenő jelek gyengülnek. (13. ábra) Mivel az általam elemzett SPW-ek a csatornáknak a nagyobb részén láthatóak voltak, ez a módszer remekül alkalmas kiemelésükre. Ez után egy egyszerű lineáris deriválással, vagyis CSD eljárással megkaptam a regisztrátum második térbeli deriváltját. (14. ábra) Az így előkészített regisztrátumot az event fájl alapján 300 ms-os darabokra vágtam úgy, hogy minden darab közepén egy SPW legyen. Ezeket átlagoltam, majd a Matlab alá a labor PhD hallgatói által készített Spike Solution programmal hőképes ábrát készítettem belőle. ( 15. ábra) Ezen az ábrán grafikai programmal jelöltem a piramis réteg helyét, melyet a jegyzőkönyv alapján, a regisztrátumon látható sejttüzelésekkel megerősítve tudtam meghatározni. ~ 28 ~

29 Eredmények Más kutatócsoportokhoz hasonlóan (Behrens et al., 2005; Colgin et al., 2004; Kano et al., 2005; Maier et al., 2003; Nimmrich et al., 2005; Wu et al., 2005a; Wu et al., 2005b; Wu et al., 2006) spontán előforduló SPW-eket figyeltem meg patkány hippocampusában in vitro. (11. ábra) Munkacsoportunk előzetes eredményei alapján mind a gyrus dentatusban, mind a CA3 és CA1 régiókban megfigyelhetők a spontán SPW-ek. Lévén, hogy leggyakrabban, és a legnagyobb amplitúdójú SPW-eket a CA3b régióban figyeltük meg, jelen dolgozatban szereplő kutatásaim erre a régióra korlátozódnak. 100 µv 11. ábra: 10 s hosszú nyers regisztrátum. A bal oldali számok a csatorna számát jelölik. Jól láthatóak a nagy kiterjedésű SPW-ek, valamint a piramis rétegben (kb csatorna) néhány sejt tüzelése is látható. (Lsd. még a következő ábrát!) ~ 29 ~

30 ábra: A piramis rétegről elvezetett aktivitás kinagyítva. Valószínűsíthető, hogy az 1-essel jelölt tüskék egyazon sejt akciós potenciáljai. Ez a tüzelés később is többször megismétlődik. Az elvezetés típusából következik, hogy ugyanaz az akciós potenciál néhány csatornán pozitív, másokon negatív irányba mutat. A 2-es esemény valószínűleg egy másik, az elektródától távolabb eső sejt burst-je. Bekarikázva egy SPW látható. Az alsó ábra egy SPW-et mutat még nagyobb nagyításban, 0, Hz-es széles sávú szűréssel. Jól látható a mezőpotenciálra rátevődő magas frekvenciás oszcilláció (középső görbén megszűrve Hz között), valamint a megnövekedett sejttüzelés (MUA, alsó görbe). ~ 30 ~

31 100 µv 13. ábra: A fenti ábrán bemutatott felvétel szakasz Hamming eljárással simított képe. Érdemes megfigyelni, hogy a 2-es jelzésű burst az eljárás következtében szinte teljesen eltűnt. Az egyedi, egy-egy csatornán megjelenő jelenségeket a Hamming eljárás hatékonyan szűri, míg a több csatornán is látható jelenségek, mint például a SPW-ek vagy az 1-essel jelzett akciós potenciálok hangsúlyosak maradnak. Ez az eljárás megkönnyíti a SPW-ek automatikus detektálását, valamint veszteségmentesen és melléktermékek nélkül szűri a zajt. ~ 31 ~