A glükokortikoidok iránti érzékenység biokémiai és molekuláris biológiai vizsgálata mellékvese daganatos betegekben

Átírás

1 A glükokortikoidok iránti érzékenység biokémiai és molekuláris biológiai vizsgálata mellékvese daganatos betegekben Doktori tézisek Dr. Majnik Judit Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Témavezetı: Dr. Rácz Károly, egyetemi tanár, MTA doktora Hivatalos bírálók: Dr. Barta csaba, egyetemi adjunktus, Ph.D Dr. Gergely Péter, adjunktus, Ph.D Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Szende Béla, egyetemi tanár, MTA doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Alföldi Sándor, egyetemi docens, Ph.D Dr. Váradi András, tudományos tanácsadó, MTA doktora Budapest BEVEZETÉS A glükokortikoidok hatására létrejövı fiziológiás válasz és a glükokortikoidok iránti érzékenység lényegesen különbözhet a különbözı fajokban, egyedekben, szövetekben és sejttípusokban, sıt egy adott sejt esetében is a sejtciklus különbözı fázisaiban. Humán vizsgálatok szerint egészséges egyének plazma kortizol szintjében nagyfokú egyéni variabilitás figyelhetı meg, amely felveti annak a lehetıségét, hogy a hypothalamus-hypophysis-mellékvesekéreg (HPA) tengely feedback érzékenységét genetikai tényezık befolyásolhatják. A glükokortikoidok hatását közvetítı glükokortikoid receptor (GR) genetikai variánsai befolyásolhatják a receptor mőködését; az egészséges populációban gyakran elıforduló egyes GR gén polimorfizmusok például a metabolikus rendellenességre való hajlammal mutatnak összefüggést. Az N363S polimorfizmusról kimutatták, hogy a receptor érzékenységét növeli, és összefüggésbe hozható elhízással, kisebb csontsőrőséggel, coronaria betegséggel, magas koleszterin szinttel, stresszreakció során nagyobb kortizol elválasztással. Az ER22/23EK polimorfizmusról kimutatták, hogy a receptor érzékenységét csökkenti, és összefüggésbe hozható kisebb inzulin szinttel és kisebb inzulin rezisztenciával, alacsonyabb koleszterin szinttel, férfiakban nagyobb testmagassággal és izomerıvel, hosszabb túléléssel, idısekben kisebb CRP szinttel és kevesebb fehérállományi laesioval és dementiával.

2 A mellékvese daganatok leggyakoribb csoportját a klinikai hormontúltermeléssel nem járó mellékvesekéreg daganatok képezik, melyeket rendszerint véletlenül, más okból végzett radiológiai képalkotó vizsgálatokkal ismernek fel, incidenciájuk 0,34-4,36%. Jellegzetességük, hogy bár a hormonális eltérések általában hiányoznak, a betegekben mégis gyakran figyelhetık meg megnövekedett glükokortikoid hatásra utaló metabolikus eltérések. A véletlenszerően felfedezett mellékvese daganatok között meglepıen nagy, a matematikailag vártnál tízszeresen magasabb a kétoldali daganatok aránya, ami szisztémás hatás(ok), esetleg genetikai eltérés(ek) lehetıségét veti fel. A glükokortikoid hormonok a csont anyagcserét számos ponton befolyásolják. A csont anyagcsere jellemzésére szérum marker vizsgálatokat fejlesztettek ki, amelyek az ásványi anyag sőrőség méréshez képest sokkal gyorsabban és érzékenyebben jelezhetik a csont metabolizmus változásait. Ezek közé tartoznak a csontépítés aktivitását jelzı osteocalcin (OC) és a csontbontás mértékét jelzı β-crosslaps (β- CTx), amelyeket a rutin laboratóriumi vizsgálatban is egyre elterjedtebben alkalmaznak. A glükokortikoidoknak a szérum markerekre kifejtett rövidtávú hatását több tanulmány vizsgálta, azonban a HPA tengely vizsgálatára alkalmazott dinamikus tesztek során a szérum marker koncentrációkat még nem vizsgálták. 2. CÉLKITŐZÉSEK Munkámban a glükokortikoidok iránti érzékenység néhány aspektusának tanulmányozására a Semmelweis Egyetem ÁOK II. sz. Belgyógyászati Klinikán gondozott mellékvese daganatos betegekben és kontroll egyénekben klinikai, biokémiai és molekuláris biológiai vizsgálatokat végeztem. Célul tőztem ki: 1. A nemzetközi irodalomban leggyakrabban vizsgált GR gén polimorfizmus, az N363S kimutatására egy gyors, egyszerő és megbízható módszer kidolgozását, amely lehetıvé teszi nagyszámú DNS mintán az N363S genotípus meghatározását. 2. Klinikai hormontúltermeléssel nem járó mellékvesekéreg daganatos betegekben és kontroll egyénekben a GR N363S és ER22/23EK polimorfizmusok allél-frekvenciájának meghatározását annak a kérdésnek a vizsgálatára, hogy a glükokortikoidok iránti érzékenységet növelı N363S, illetve a glükokortikoidok iránti érzékenység csökkenésével járó ER22/23EK polimorfizmusoknak lehet-e jelentısége ezeknek a mellékvesekéreg daganatoknak a patomechanizmusában. E kérdéskörön belül különösen érdekesnek tőnt a kétoldali mellékvesekéreg daganatos betegek vizsgálata, amelyek patomechanizmusában mindkét mellékvesét érintı (feltehetıen szisztémás) faktoroknak lehet szerepe. 3. Klinikai hormontúltermeléssel nem járó mellékvesekéreg daganatos betegekben a nagy gyakorisággal elıforduló metabolikus zavarok 2

3 valamint a GR N363S és ER22/23EK genotípusok közötti lehetséges összefüggések vizsgálatát annak a tisztázására, hogy a glükokortikoidok iránti érzékenységet növelı vagy csökkentı polimorfizmusok összefüggésbe hozhatók-e a daganatokhoz társuló metabolikus zavarok kialakulásában es típusú diabetes mellitusban (amely szintén gyakran társul egyéb metabolikus zavarral) a GR N363S és ER22/23EK genotípusok allélfrekvenciájának meghatározását annak a kérdésnek a vizsgálatára, hogy a 2-es típusú diabetes mellitus összefügg-e ezeknek a polimorfizmusoknak a jelenlétével. 5. Az endogén és exogén glükokortikoidok által kifejtett gyors csontanyagcsere hatások kimutatására és összehasonlítására Cushing szindrómát okozó mellékvesekéreg daganatos betegekben, klinikai hormontúltermeléssel nem járó mellékvesekéreg daganatos betegekben és kontroll egyénekben a HPA tengely betegségeinek klinikai diagnosztikájában használt dexamethason, ACTH és metopyron tesztek szérum osteocalcin és β-crosslaps koncentrációkra kifejtett hatásának tanulmányozását. 3. BETEGEK ÉS MÓDSZEREK Az új PCR módszer validálását a következı vérminták felhasználásával végeztem: Semmelweis Egyetem II.sz. Belgyógyászati Klinikán különbözı okok miatt kezelt 301 beteg (84 férfi, 217 nı, életkor: év). A glükokortikoid receptor gén polimorfizmus vizsgálatokba bevont betegek: -143 klinikai hormontúltermelést nem okozó mellékvese adenomás beteg (99 egyoldali daganatos beteg, közülük 75 nı és 24 férfi, életkor: év; 44 kétoldali daganatos beteg, közülük 30 nı és 14 férfi, életkor: év kontroll személy (65 nı és 37 férfi, életkor: év) es típusú diabetes mellitusban szenvedı beteg, akiknél a HPA tengely esetleges rendellenes mőködésének jelét nem észleltük (42 nı és 58 férfi, életkor: év között). A csontanyagcsere marker vizsgálatokba bevont betegek: -40 egészséges személy (35 nı és 5 férfi, életkor: év), -49 klinikai hormontúltermelést nem okozó mellékvese adenomás beteg (34 nı és 15 férfi, életkor: év). -8 Cushing szindrómás beteg (3 nı és 5 férfi, életkor: év). Közülük 5 betegben kortizol-termelı mellékvese adenoma, 3 betegben Cushing-kór állt a betegség hátterében. Molekuláris biológiai vizsgálatok: -perifériás vér leukocytákból DNS izolálás, 3

4 -az N363S polimorfizmus vizsgálatára az irodalomban leírt PCR-RFLP mellett új, allélspecifikus PCR módszer kidolgozása, -az ER22/23EK polimorfizmus szőrésére az irodalomban leírt PCR- RFLP módszer beállítása, -ellenırzés direkt szekvenálással. Rutin laboratóriumi és hormonlaboratóriumi vizsgálatok: a klinikán alkalmazott módszerek és protokollok alapján. Csontanyagcsere marker mérések: A szérum OC és β-ctx méréseket electrochemoluminescens immunoassay módszerrel végeztük. Az osteocalcin vizsgálat mind az intakt molekulákat, mind a stabil N-mid fragmenst detektálta, a β- Crosslaps mérés pedig az I-es típusú kollagén C-terminális izomerizált telopeptidjének 8 aminosavas részletét ismerte fel. Csont ásványianyag sőrőség (BMD) mérése: DEXA módszerrel történt a lumbális gerincen és a femur nyaki régióján. Statisztikai elemzés: -χ2 teszt és Fischer-féle exact teszt -Student t-teszt és Mann-Whitney U-teszt -one-way ANOVA és Dunnet s post-hoc teszt Alkalmazott szoftver: SPSS 12.0 Szignifikancia határa: p<0, EREDMÉNYEK 1. Új, allélspecifikus PCR módszer kidolgozása. Az N363S polimorfizmus nagy számú mintán való szőrésére kidolgoztunk egy gyors, olcsó és egyszerően kivitelezhetı módszert. A módszer lényege, hogy egy PCR reakcióba két kontroll és egy a polimorf allélra specifikus primert téve, a variáns allél jelenléte egyetlen PCR reakcióval kimutatható. A minták kisebb hányadát kitevı pozitív esetekben ezután még egy PCR reakció szükséges a polimorfizmus homozigóta/heterozigóta formájának eldöntéséhez. Egy átlagos, 4%-os allélfrekvencia esetében 100 minta N363S genotípusának meghatározásához mindössze 108 PCR reakcióra van szükség. Költségkímélı, egyszerő és gyors kivitelezhetıségén kívül a módszer elınye, hogy nem igényel költséges eszközöket. Az új módszerrel nyert eredmények minden minta esetében megegyeztek a hagyományos módszerekkel nyert eredményekkel, ezért az új módszer széleskörő használatra ajánlható. 2. A GR N363S polimorfizmusának összefüggése kétoldali mellékvese daganatokkal A kétoldali mellékvese adenomás betegek csoportjában az N363S polimorf allélt hordozók aránya (20,5%) mind a kontroll csoporthoz (7,8%), mind az egyoldali mellékvese daganatos csoporthoz (7,1%) képest szignifikánsan nagyobb volt. Az N363S polimorfizmust hordozó 4

5 személyekben a kétoldali mellékvesekéreg adenoma elıfordulásának relatív kockázata 3,02 volt (95% CI, 1,04-9,45) a polimorfizmust nem hordozó személyekhez viszonyítva. Az ER22/23EK polimorfizmust hordozók aránya nem mutatott különbséget a kontroll (4,9%), egy- és kétoldali mellékvese adenomás (6,2% és 4,5%) betegek között. Eredményünk alátámasztja azt a feltevést, hogy a kétoldali daganatok kialakulásában az egyoldaliakétól eltérı tényezık is szerepet játszhatnak, és felveti az N363S polimorfizmusnak esetleges patogenetikai szerepét. 3. A cukoranyagcsere zavar összefüggése az N363S polimorfizmussal kétoldali adenomás betegekben A metabolikus eltérések (hipertónia, hiperlipidémia, elhízás, koszorúér betegség) gyakoriak mind egy-, mid kétoldali mellékvese adenomás betegekben, és ezek közül a szénhidrát-anyagcsere zavar kétoldali daganatos betegekben gyakoribb, mind egyoldaliakban. A GR polimorfizmusok metabolikus eltérésekkel való összefüggését vizsgálva azt találtuk, hogy mellékvesekéreg adenomás betegekben az N363S polimorfizmust hordozók között a cukoranyagcsere zavar (DM vagy IGT) gyakorisága szignifikánsan nagyobb volt (93,8%), mint a polimorfizmust nem hordozók között (53,5%). Külön vizsgálva az egyés kétoldali daganatos csoportokat, a kétoldali daganatos betegek között szignifikáns összefüggést találtunk a cukoranyagcsere zavar és az N363S jelenléte között, a DM vagy IGT gyakorisága a vad genotípusú kétoldali daganatos betegekben 57,1%, az N363S hordozókban 100% volt. Ezzel szemben egyoldali daganatos betegekben nem találtunk szingnifikáns összefüggést a cukoranyagcsere zavar és az N363S polimorfizmus között. Az N363S polimorfizmus és a többi metabolikus eltérés között nem találtunk összefüggést. AZ ER22/23EK polimorfizmus sem a cukoranyagcsere zavarral, sem más metabolikus eltéréssel nem mutatott összefüggést. 4. A GR polimorfizmusok nem mutatnak összefüggést 2-es típusú diabetes-szel Azokban a 2-es típusú diabeteses betegekben, akiknél a HPA tengely esetleges rendellenes mőködésének jelét nem észleltük, az N363S és ER22/23EK polimorfizmust hordozók aránya (13% ill.6%) nem mutatott szignifikáns eltérést a kontrollokban és mellékvese daganatos betegekben észlelet hordozó gyakoriságtól. Nem találtunk összefüggést az N363S vagy ER22/23EK polimorfizmus és a testtömeg index, a hipertónia elıfordulása, vagy az inzulin terápia szükségessége között sem. Miután 2-es típusú diabeteses betegekben nem észleltünk szignifikánsan nagyobb N363S gyakoriságot, kétoldali mellékvesekéreg adenomás betegekben az N363S polimorfizmus nagyobb gyakorisága nem magyarázható a cukoranyagcsere zavar és az N363S 5

6 polimorfizmus közötti közvetlen összefüggéssel. Nem zárható ki azonban, hogy az N363S polimorfizmus olyan patogenetikai faktor(ok) mőködését befolyásolja, amelyek a kétoldali mellékvese daganatok kialakulásán kívül ezekben a betegekben diabetes kialakulásához is vezethetnek. A GR megnövekedett transzaktivációs képessége következtében olyan target gének transzkripciója fokozódhat, melyek mind a kétoldali mellékvese adenoma képzıdésben, mind ezekben a betegekben a diabetes gyakori elıfordulásában szerepet játszhatnak. 5. A csontanyagcsere markerek változásai a HPA tengely dinamikus tesztelése során A reggeli alap szérum osteocalcin szint incidentalomás betegekben nem különbözött a kontrolloktól (29,8±15,9 ng/ml és 28,3±12,2 ng/ml), Cushing szindrómás betegekben azonban szignifikánsan alacsonyabb volt (17,7±9,6 ng/ml) mindkét másik csoportban mértnél. A reggeli β- Crosslaps koncentrációk nem mutattak különbséget a vizsgált csoportok között. Dexamethason szuppressziót követıen a szérum OC koncentráció szignifikánsan csökkent mind egészségesekben (28.3±12.2-ról 21.8±9.5 ng/ml-re), mind hormontúltermeléssel nem járó mellékvese adenomás betegekben (29.8±15.9-ról 24.1±14.1 ng/ml-re), azonban Cushing szindrómás betegekben a kontrollhoz képest szignifikánsan kisebb reggeli OC szintek dexamethason hatására nem változtak. A szérum β- 6 Crosslaps koncentráció dexamethason után kissé csökkent, de a csökkenés nem volt szignifikáns. ACTH adásának hatására a dexamethasonnál is markánsabb csökkenést észleltünk a szérum OC koncentrációban mind a kontroll (28.3±12.2-ról 12.5±4.6 ng/ml-re), mind a hormontúltermeléssel nem járó mellékvese adenomás csoportban (29.8±15.9-ról 12.2±6.5 ng/ml-re). A szérum β- Crosslaps koncentráció ACTH után is kissé csökkent, de a csökkenés itt sem volt szignifikáns. A glükokortikoid aktivitás metopyronnal való gátlása nem befolyásolta a szérum OC és β-ctx koncentrációkat. Eredményeink arra utalnak, hogy fiziológiás mellékvese mőködés mellett már egyszeri kis adag exogén szteroid adása, illetve az endogén glükokortikoid szintézis akut serkentése markáns gátló hatás fejt ki az osteocalcin szintézisre, valamint a glükokortikoidok csontra kifejtett katabolikus hatása elsısorban az osteoblast mőködés gátlásán keresztül valósul meg, amit az OC szintézis korai csökkenése mutat. 5. KÖVETKEZTETÉSEK 1. A glükokortikoid receptor gén N363S polimorfizmusának vizsgálatára kidolgozott új allél-specifikus PCR módszer megbízhatóan és pontosan mutatja ki a polimorfizmus jelenlétét. Az új módszer alkalmazása egyszerő, költségkímélı, nem igényel költséges eszközöket és alkalmas nagyszámú minta vizsgálatára.

7 2. Hormontúltermeléssel nem járó kétoldali mellékvesekéreg adenomás betegekben a glükokortikoid receptor gén N363S polimorfizmusa szignifikánsan gyakrabban fordul elı, mint azonos populációból választott kontroll személyekben, illetve egyoldali mellékvesekéreg adenomás betegekben. Feltételezhetı, hogy ez a polimorfizmus szerepet játszhat a kétoldali mellékvese adenomák patogenezisében, bár ennek mechanizmusa nem ismert. A glükokortikoid receptor gén ER22/23EK polimorfizmusa esetében ilyen összefüggés nem mutatható ki. 3. Hormontúltermeléssel nem járó kétoldali mellékvesekéreg adenomás betegekben az egyoldali daganatos betegekhez képest szignifikánsan gyakrabban fordul elı szénhidrát-anyagcsere zavar. Kétoldali mellékvesekéreg daganatos betegekben a szénhidrát-anyagcsere zavar összefüggést mutat az N363S polimorfizmus jelenlétével. Az elhízás, hyperlipidaemia és hipertónia egyik betegcsoportban sem hozható összefüggésbe az N363S vagy ER22/23EK polimorfizmusok jelenlétével es típusú diabeteses betegekben az N363S és ER22/23EK polimorfizmusok gyakorisága nem különbözik a kontroll személyekben észlelhetı polimorfizmus gyakoriságtól. Nincs összefüggés a diabetes megjelenésének ideje, a betegek testsúly indexe, vérnyomása, valamint az inzulin terápia szükségessége és az N363S illetve ER22/23EK polimorfizmusok elıfordulása között. 5. A hypothalamus-hypophysis-mellékvese tengely vizsgálatában elterjedten használt dinamikus tesztek közül a kis adag dexamethason és az ACTH teszt jelentıs szérum osteocalcin koncentráció csökkenést okoz egészséges személyekben és hormontúltermeléssel nem járó mellékvesekéreg adenomás betegekben, míg a kis adag dexamethason Cushing szindrómás betegekben nem befolyásolja a szérum osteocalcin koncentrációt. A kis adag dexamethason és ACTH teszt egyik vizsgált csoportban sem befolyásolja a szérum β-crosslaps koncentrációt. A kortizol bioszintézist gátló metopyron egyszeri adagja nincs hatással a szérum osteocalcin és β-crosslaps koncentrációkra. Ezek az eredmények alátámasztják, hogy a glükokortikoidok csontra kifejtett katabolikus hatása elsısorban az osteoblast mőködés gátlásán keresztül valósul meg. 7

8 6. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK LISTÁJA A dolgozathoz közvetlenül kapcsolódó közlemények 1. Majnik J, Patocs A, Balogh K, Toth M, Gergics P, Szappanos Á, Mondok Á, Borgulya G, Panczel P, Prohaszka Z, Racz K. Overrepresentation of the N363S variant of the glucocorticoid receptor gene in patients with bilateral adrenal incidentalomas. J Clin Endocrinol Metab 91: , IF: 6, Majnik J, Szücs N, Patócs A, Tóth M, Balogh K, Varga I, Gláz E, Rácz K. Effect of single doses of dexamethasone and adrenocorticotrop hormone on serum bone markers in healthy subjects and in patients with adrenal incidentalomas and Cusing s syndrome. Journal of Endocrinological Investigation, 27: , IF: 1, Majnik J., Patócs A., Balogh K., Tóth M., Rácz K. A rapid and simple method for detection of Asn363Ser polymorphism of the human glucocorticoid receptor gene. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 92(5): , IF: 2, Majnik J, Patócs A, Balogh K, Luczay A, Török D, Szabó V, Borgulya G, Gergics P, Szappanos Á, Bertalan R, Belema B, Tıke J, Sereg M, Nagy Z.Zs, Sólyom J, Tóth M, Gláz E, Rácz K, Németh J, Fekete Gy, Tulassay Zs. Glükokortikoid receptor génszekvencia variánsok és jelentıségük a glükokortikoidok iránti érzékenység meghatározásában. Orvosi Hetilap, 147 (44): , A dolgozathoz közvetlenül nem kapcsolódó közlemények 1. Majnik J. A csontanyagcsere biológiai markereinek klinikai jelentısége, a csontanyagcsere jellemzıi arthritis psoriaticában (Díjnyertes orvostanhallgatói pályamunka). Magyar Reumatológia, 44:93-104, Gergics P, Patocs A, Majnik J, Balogh K, Szappanos A, Toth M, Racz K. Detection of the BclI polymorphism of the glucocorticoid receptor gene by single tube allele-specific polymerase chain reaction. J Steroid Biochem Mol Biol., 100:161-6, IF: 2, Luczay A, Török D, Ferenczi A, Majnik J, Sólyom J, Fekete Gy. Potential advantage of N363S glucocorticoid receptor polymorphism in 21-hydroxylase deficiency. Eur. J. Endocrinol. 154: , 2006, IF: 2, Balogh K, Hunyady L, Patócs A, Valkusz Zs, Bertalan R, Gergics P, Majnik J, Tıke J, Tóth M, Szőcs N, Gláz E, Főtı L, Horányi J, Rácz K, Tulassay Zs. Az I-es típusú multiplex endokrin neoplasia klinikai tünetei, diagnózisa és kezelése. A genetikai vizsgálatok hazai tapasztalatai. Orvosi Hetilap, 146(43): , Balogh K., Patócs A., Majnik J., Varga F., Illyés Gy., Hunyady L., Rácz K. Unusual presentation of multiple endocrine neoplasia type 1 in a young woman with a novel mutation of the MEN1 gene. Journal of Human Genetics, 49(7): , IF: 2,316.

9 6. Patócs A, Karádi É, Tóth M, Varga I, Szücs N, Balogh K, Majnik J, Gláz E, Rácz K. Clinical and biochemical features of sporadic and hereditary phaeochromocytomas: an analysis of 41 cases investigated in a single endocrine center. European Journal of Cancer Prevention, 13: , IF: 1, Balogh K, Patócs A, Majnik J, Rácz K, Hunyady L. Genetic screening methods for the detection of mutations responsible for multiple endicrine neoplasia type 1. Molecular Genetics and Metabolism, 83:74-81, IF: 2,502. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS A munkámban nyújtott segítségért szeretnék köszönetet mondani: Prof. Dr. Tulassay Zsoltnak, aki lehetıvé tette, hogy a II-es számú Belgyógyászati Klinikán dolgozhassak. Témavezetımnek, Prof. Dr. Rácz Károlynak, aki szakmai irányításával, értékes tanácsaival, sok segítségével, és a magas színvonalú tudományos munkára való ösztönzéssel a TDK majd PhD munkámhoz nagy támogatást, és késıbbi munkámhoz is követendı példát adott. Dr. Patócs Attilának és Dr. Balogh Katalinnak, akik a laboratóriumi módszerek elsajátításában, valamint a mindennapi munka apróbbnagyobb nehézségeinek megoldásában szakmai és baráti segítséget nyújtottak. Dr. Tóth Miklósnak szakmai tanácsaiért és a kutatásomhoz szükséges beteganyag győjtésében nyújtott nagy segítségéért. Prof. Dr. Gláz Editnek, és a II. sz. Belgyógyászati Klinika endokrin munkacsoportjában dolgozó minden klinikusnak, akik a munkámhoz szükséges betegek és klinikai adatok győjtésében segítettek: Dr. Kiss Róbertnek, Dr. Ádler Ildikónak, Dr. Szőcs Nikolettenek, Dr. Pusztai Péternek. 9

10 A II. sz. Belgyógyászati Klinika Molekuláris Biológiai Laborjában dolgozó valamennyi PhD hallgatónak: Dr Gergics Péternek, Dr Szappanos Ágnesnek, Dr Tıke Juditnak, Dr Mondok Ágnesnek, Dr Bertalan Ritának, Dr Belema Boylenak, valamint Krauszné Vaczula Mária asszisztensnek. Dr Varga Ibolyának és a II.sz Belgyógyászati Klinika Szteroid Laborjában dolgozóknak, valamint Dr Kovács Ágnesnek és a II.sz Belgyógyászati Klinika Izotóp Laborjában dolgozóknak a mérések elvégzésében nyújtott segítségükért. Dr Pánczél Pálnak és dr Prohászka Zoltánnak a III. sz. Belgyógyászati Klinikáról a diabeteses beteganyag rendelkezésünkre bocsátásáért. Dr Borgulya Gábornak a statisztikai elemzésekben nyújtott segítségéért. Dr Koó Évának és a Budai Irgalmasrendi Kórház II. sz Reumatológiai Osztály valamennyi dolgozójának szakmai és baráti támogatásukért. Végül szeretném megköszönni férjemnek és családomnak a rengeteg segítséget, végtelen türelmüket és támogatásukat, ami nélkül ez a munka nem jöhetett volna létre. 10