Őssejtek szöveti differenciációja

Átírás

1 Őssejtek szöveti differenciációja Mi tekinthető őssejtnek? Hol találhatóak az őssejtek? Mi alapján azonosíthatóak? Mit jelent a sejt differenciáció? Mikor és hogyan változik a fejlődési potenciál? Milyen tényezők befolyásolják a sejtek sorsát/fejlődési potenciálját? Van-e különbség a szövetspecifikus őssejtek között? Milyen kísérleti modellek és rendszerek vannak?

2 Őssejt: - Önmegújító képesség - Differenciált sejtek létrehozása: pluripotens - unipotens - Sérült szövet pótlása - Szimmetrikus-aszimmetrikus osztódás - aszimmetrikus osztódással egy önmagától eltérő (differenciált sejt) és egy önmagával megegyező (önmegújító képesség) sejt létrehozásának képessége

3 Aszimetrikus sejtosztódás Intrinsic út Extrinsic út

4 Mi alapján azonosítható? Tulajdonságok (aszimmetrikus osztódás, sérült szövet pótlása, pluripotens.stb. in vivo és in vitro tesztek) Jellemző korai markerek: transzkripciós faktorok:sox2, Nanog, Oct4; sejtfelszíni antigén: SSEA-1; membrán-transzporter: ABC2 Jellemző szövetspecifikus őssejt markerek: Nestin (intermedier fillamentum: ideg, izom és egyes endoderma eredetű szervekben is); CD34 (vérszövet) Jól használható általános őssejt marker nincs

5 Van-e a differenciációnak általános menete? Pluripotens őssejt: korlátlan fejlődési potenciállal (ICM, ES) Multipotens őssejtek: korlátozott fejlődési potenciállal (szövetspecifikus őssejtek) Köztes sokszorozó sejt /progenitor: korlátozott számú osztódás Korai differenciált sejttípus posztmitotikus Végdifferenciált sejt

6 Sorstérképek: gasztruláció környéki stádiumokban meghatározható egyes sejtcsoportok sorsa kétéltű hal

7 Őssejtsorsok a gasztrulációnál ES/epiblaszt sejtek: Oct4 +, Sox2 +, Nanog + LIF és BMP4 szezitív TS sejtek: Cdx2 + és Eomes + FGF és activin szezitív XEN/hipoblaszt sejtek: Gata6 + és Sox7 + FGF szezitív Már a gasztruláló embrióban elválik egymástól 3 őssejt populáció Oct4 kiütése vagy Cdx2 túlexpressziója ES-ből TS-t csinál!

8 Korai embrióból alapított sejtvonalak Ki pluripotens? az ES sejtek respecified csírasejtek újraprogramozott szomatikus sejtek (IPS) Tesztelhető: in vitro differenciációval teratóma képző képességgel kiméra képző képességgel csíra vonal képzéssel tetraploid komplementációval

9 Chimera képzés (fejlődési potenciál tesztelésére) LacZ - LacZ - Diana L. Clarke,1 Clas B. Johansson,1,2 Johannes Wilbertz,1 Biborka Veress,1 Erik Nilsson,1 Helena Karlstro m,1 Urban Lendahl,1 Jonas Frise«n1* 2 JUNE 2000 VOL 288 SCIENCE

10 Ki pluripotens? az ES sejtek respecified csírasejtek újraprogramozott szomatikus sejtek (IPS) Tesztelhető: in vitro differenciációval teratóma képző képességgel kiméra képző képességgel csíra vonal képzéssel tetraploid komplementációval Mi biztosítja a pluripotenciát? Oct4, Sox2, Nanog expressziója elengedhetetlen indukálja az FGF4 termelését Differenciáció Epigenetikus hatások: kromatin modifikáció, DNS metiláció stb. Kérdés: a pluripotencia aktív vagy passzív következmény

11 Mi biztosítja a pluripotenciát? ES sejtek ellenállnak a DNS metiláció hiányának. Az X kromoszóma aktiválása pedig elősegíti a pluripotecia megjelenését epiblaszt sejtekben és ES sejtekben is. Az Oct4-Sox2-Nanog fő hatása az extraembrionális differenciációs lehetőségek blokkolása lehet. Ezt destabilizálja az FGF4 szignál. A Nanog mennyisége nagyon változó az ES sejtekben. Feladata a metastabilis alapállapot fenntartása lehet. Hiánya nem szünteti meg a pluripotenciát, de elősegíti a differenciációt (permisszív).

12 Milyen géneket szabályoz az Oct4-Sox2-Nanog tirász? Kromatin immunoprecipitáció és DNS microarray ötvözése

13 Reprogramming stratégiák

14 Induced Pluripotent Stem Cells (IPS) Takahashi and Yamanaka, 2006, Cell, 126:

15

16 Felcserélhetőek-e a különböző csíralemezek sejtjei? Garcia-Martinez,V., Darnell,D.K., Lopez-Sanchez,C., Sosic,D., Olson,E.N., and Schoenwolf,G.C. (1997). State of commitment of prospective neural plate and prospective mesoderm in late gastrula/early neurula stages of avian embryos. Dev. Biol. 181, Yohko Hatada and Claudio D. Stern 1994

17 2. típusú kísérlet neuroectoderma mesoderma Garcia-Martinez,V., Darnell,D.K., Lopez-Sanchez,C., Sosic,D., Olson,E.N., and Schoenwolf,G.C. (1997). Dev. Biol. 181,

18 Garcia-Martinez,V., Darnell,D.K., LopezSanchez,C., Sosic,D., Olson,E.N., and Schoenwolf,G.C. (1997). Dev. Biol. 181, típusú kísérlet mesoderma neuroectoderma

19 Garcia-Martinez,V., Darnell,D.K., Lopez- Sanchez,C., Sosic,D., Olson,E.N., and Schoenwolf,G.C. (1997). Dev. Biol. 181, típusú kísérlet mesoderma neuroectoderma

20 1. típusú kísérlet neuroectoderma mesoderma HH7 donor állatból: nem váltanak a sejtek Garcia-Martinez,V., és mtsai. (1997). Dev. Biol. 181, HH8

21 Pluripotens őssejt: korlátlan fejlődési potenciállal (ICM, ES) Osztódási/differenciációs képesség Multipotens őssejtek: korlátozott fejlődési potenciállal (szövetspecifikus őssejtek) Köztes sokszorozó sejt: korlátozott számú osztódás Korai differenciált sejttípus Végdifferenciált sejt Differenciáltság mértéke

22 Az őssejtek fejlődési potenciálja változik az egyedfejlődés során A megfelelő sejt a megfelelő helyen! Indukció és kompetencia indukáló sejtcsoport inducer szignál indukált sejtcsoport responder Alakváltozás Mitotikus ráta változása Sejtek sorsának változása

23 A kompetencia egy adott sejtcsoport válaszadási képessége egy bizonyos induktív szignálra. A szemhólyag által indukált szemlencse indukciója során csak a Pax6-ot (kompetencia faktor) expresszáló ektoderma képes szemlencsét létrehozni.

24 Reciprok indukciónak nevezzük azt a jelenséget, amelynek során az indukált szövet később visszahat az induktorra. A lencse indukciója után a kialakult szemlencse visszahat a szemhólyagra és abban indukálja a retina kialakulását.

25 Pluripotens őssejt: korlátlan fejlődési potenciállal (ICM, ES) Multipotens őssejtek: korlátozott fejlődési potenciállal (szövetspecifikus őssejtek) A felnőtt szövet sejtjeinek egy része megőrzi széles fejlődési képességét Köztes sokszorozó sejt: korlátozott számú osztódás Korai differenciált sejttípus posztmitótikus Végdifferenciált sejt

26 A sejt sorsát alapvetően befolyásolják: 1. saját tulajdonságai (múltja) 2. környezete (jelene) Több tényező együttesen határozza meg a sejt fejlődési potenciálját receptor és transzkripciós faktor készlete, adhéziós molekula készlete, energetikai, sejtciklusbeli állapota, sejtórák állapota (pl.: telomertelomeráz aktivitás) a DNS állapota (metiláltság, térbeli struktúra) Mikrokörnyezet-niche szekretált faktorok környező sejtek felszíne extracelluláris mátrix

27 Extraceluláris Mátrix szerepe

28 Extraceluláris Mátrix szerepe

29 Activin-Nodal, BMP and WNT pathways. In both mouse embryos and embryoid bodies derived from mouse embryonic stem cells, these three pathways form a positive feedback loop that establishes polarity 6,7. The same three pathways can be manipulated to differentiate hescs to any of the three germ layers 2 5. However, because A method to recapitulate early embryonic spatial or A.H.B. (brvnlou@rockefeller.edu). patterning in human embryonic stem cells that the heterogeneity in colony geometries could affect cellcell signaling and result in a loss of reproducible spatial order upon differentiation. We therefore evaluated the effects of using micropatterned technology to grow cells in colonies of precisely controlled size and geometry (Fig. 1b). 1 Center for Studies in Physics and Biology, The Rockefeller University, New York, New York, USA. 2 Laboratory of Molecular Vertebrate Embryology, The Rockefeller University, New York, New York, USA. 3 These authors contributed equally to this work. Correspondence should be addressed to E.D.S. (siggiae@rockefeller.edu) RECEIVED 23 OCTOBER 2013; ACCEPTED 19 MAY 2014; PUBLISHED ONLINE 29 JUNE 2014; DOI: /NMETH Nature America, Inc. All rights reserved. America, Inc. All rights reserved. Aryeh Warmflash 1 3, Benoit Sorre 1 3, Fred Etoc 1,2, Eric D Siggia 1 & Ali H Brivanlou 2 ARTICLES Embryos allocate cells to the three germ layers in a spatially these protocols have been optimized to yield pure populations, it is ordered sequence. Human embryonic stem cells (hescs) unclear whether stem cells are capable of faithfully generating early a Standard culture b Micropatterned culture c d can generate the three germ layers in culture; however, Single-cell embryonic trackingpatterns. Simple OCT4 application of growth NANOG factors tends to SOX2 DAPI differentiation is typically heterogeneous and spatially produce multiple fates without inducing consistent spatial order 8,9. disordered. We show that geometric confinement is sufficient Previous studies using control of colony geometries noted a shift to trigger self-organized patterning in hescs. In response in the proportion of cells adopting different fates as the colony size to BMP4, colonies reproducibly differentiated to an outer was changed but did not observe spatial organization trophectoderm-like ring, an inner ectodermal circle and a Here we show that cells confined to circular micropatterns and ring of mesendoderm expressing primitive-streak markers in differentiated with BMP4 produce an ordered array of germ layers between. Fates were defined relative to the boundary with a along the radial axis of the colony. This order results from fixed length scale: small colonies corresponded to the outer self-organized signaling that confines response to the BMP4 to layers of larger ones. Inhibitory signals limited the range of the colony border while inducing a broader gradient of Activine OCT4 NANOG SOX2 BMP4 signaling Figure 1 to the colony edge and induced a gradient of Nodal signaling to pattern mesendodermal fates. Control of hescs in the pluripotent state fates Activin-Nodal signaling that patterned mesendodermal fates. is established from the border of the colony so that as colony size show prepatterning in micropatterned These results demonstrate that the intrinsic tendency of stem is reduced, the central 0.6 fates are lost. Thus, given minimal geometric and signaling cues, hescs will self-organize to generate culture. (a,b) Tiled scans of RUES2 hescs cells to make patterns can be harnessed by controlling colony grown under standard (a) and micropatterned geometries and provide a quantitative assay for studying embryonic patterns. paracrine (b) conditions. signaling in (c) early Single development. image from the tiled scan with all cells identified computationally. RESULTS During (d) Immunofluorescence gastrulation, the cells analysis of the embryo of are allocated into 500 Prepatterning in pluripotent hesc colonies three pluripotency germ layers marker in an ordered expression spatial in a sequence 1. In mammalian micropatterned embryos, epiblast m cells located colony. on the (e) interior Quantification of the embryo germ layers. We focused on differentiating cells with BMP4 ligand We investigated whether hescs could give rise to spatially ordered Distance (µm) Distance (µm) Distance (µm) migrate of expression to form the of markers definitive of endoderm the colony on shown the outside of fthe because 1,000-µm it represents colonies an early step in the 500-µm embryonic colonies signaling cascade 250-µm colonies OCT4 that initiates gastrulation 1,6. hescs OCT4 rapidly differentiate in embryo in d. proper Each dot and represents the mesoderm a single between cell, and the endoderm and 1.0 NANOG 1.0 NANOG 1.0 epiblast. the color Cells represents that remain the in the intensity epiblast of differentiate the to ectoderm. response to BMP4, in contrast to Activin-Nodal and WNT signaling, both of which also play a role 0.8 in the pluripotent state 9, SOX2 SOX2 Despite indicated the existence marker normalized of numerous to the protocols intensity to differentiate 0.8 hescs OCT4 of the toward DAPI cells stain. of (f) these Quantification three germ layers of average, it is unclear The results of BMP4 treatment on hescs have been controversial: NANOG to what nuclear degree intensity this spatial from immunofluorescence order can be recapitulated in vitro. 0.6 some groups have reported differentiation 0.6 to trophectoderm 16 19, 0.6 SOX2 Replicating data for embryonic the indicated spatial markers. ordering In all in vitro cases, would allow scientists to investigate, on the molecular level, the intercellular whereas others have reported a mixture of embryonic and extraembryonic nuclei were identified using the DAPI nuclear Distance from colony mesoderm center (µm). Distance from colony center (µm) Distance from colony center (µm) communication that is responsible for embryonic patterning in Under standard culture conditions, hescs grew in colonies that exhibited a wide range of sizes and shapes (Fig. 1a). counterstain, and the intensity of the indicated the human system. This would also be an important step toward markers was normalized to the DAPI intensity. In this and all other figures, graphs represent the mean of 25, 144 and 576 colonies for the colonies generating spatially ordered tissues for clinical purposes. Differentiation of embryonic stem cells with BMP4 led to spatial Studies of diameters in fish, 1,000, frog and 500 mouse and embryos 250 m, have respectively. established s.d. that between colonies patterns is of shown differentiation in Supplementary that differed Figure drastically 3. Each between marker was quantified in two independent experiments. a.u., arbitrary units. Scale bars, 500 m. DAPI spatial patterning during gastrulation is under the control of the Activin-Nodal, BMP and WNT pathways. In both mouse embryos and embryoid bodies derived from mouse embryonic stem cells, hescs grown on micropatterns for 24 h in pluripotency conditions maintained pluripotent morphology and expression of these three pathways form a positive feedback loop that establishes polarity 6,7. The same three pathways can be manipulated to differ- Distance (µm) Intensity (a.u.) Distance (µm) Intensity (a.u.) neighboring colonies (Supplementary Fig. 1). We hypothesized that the heterogeneity in colony geometries could affect cellcell signaling and result in a loss of reproducible spatial order the colony with larger, more spread cells radially to the inside and outside (Fig. 2a). We next examined whether the reproducible cell upon differentiation. We therefore evaluated the effects of using micropatterned technology to grow cells in colonies of precisely NATURE METHODS ADVANCE ONLINE PUBLICATION 1 Distance (µm) Intensity (a.u.)

30 ARTICLES a Distance (µm) CDX Distance (µm) BRA b Distance (µm) SOX Distance (µm) EOMES SOX17/EOMES Distance (µm) Distance (µm) Distance (µm) Distance (µm) 500 Distance (µm) SOX CDX2/BRA/SOX2 c Intensity (a.u.) CDX2 SOX17 BRA SOX2 d TE-like = CDX2 + BRA SOX17 SOX2 Endoderm = SOX17 + NANOG + SOX2 PS/mesoderm = BRA + NANOG + SOX17 SOX2 Ectoderm = SOX2 + NANOG BRA SOX Distance (µm) Position (µm) 2014 Nature America, Inc. All rights reserved. eserved. Figure 2 hescs differentiated on micropatterns form self-organized spatial patterns. (a,b) The plots show quantified immunofluorescence data for the indicated fate markers. Cells were seeded on micropatterned coverslips, grown overnight and then treated with BMP4 for 42 h. In a and b, all plots show data for the same colony. Each dot corresponds to a single cell. The bottom right panel in a and the right panel in b show an immunofluorescence image of the colony quantified in the plots. (c) Quantification of the mean across colonies of immunofluorescence data for germ layer markers. Numbers of colonies are as in Figure 1f. Error bars for these and other markers can be found in Supplementary Figure 5. Each marker was quantified in three independent experiments. a.u., arbitrary units. (d) Schematic of the results of 42 h of BMP4 treatment in micropatterned culture. TE, trophectoderm; PS, primitive streak. Scale bars, 100 m. ARTICLES of Figure individual 6 TGF- inhibitors cells, CDX2, are required EOMES for and NANOG CDX2 were all coexpressed pattern formation. with (a) BRA Immunofluorescence (Supplementary Figs. 6a c and 7a,b), whereas staining of SOX2 a 1,000- m was mutually micropatterned exclusive colony with all of these markers (Supplementary for the indicated markers, Fig. 6d,e). when transfected This set of observations is consistent with the identification of this region as primitive streak and with a nontargeting sirna (si-nc) or upon specific gene knockdown. Scale bars, 100 m. nascent mesodermal cells. (b,c) Quantification of the mean across colonies ARTICLES Beyond (n the = 25) ring of BRA of BRA (b) and expression, CDX2 (c). we found cells expressing the This definitive experiment endoderm was performed marker twice. SOX17 (Fig. 2b). Its expression overlapped a.u., Figure arbitrary 6 TGF- with units. inhibitors the outer are ridge required of the for cells that awere positive CDX2 for EOMES pattern formation. GATA6 (a) staining Immunofluorescence but extended further along the radial axis mesendodermal staining of the of a colony 1,000- m fates. (Fig. micropatterned 2b Cells and Supplementary the colony center Fig. 6g). Many of the of for the cells colony indicated expressing that markers, do SOX17 not when receive also transfected expressed either of high levels of NANOG, consistent with a nontargeting these signals with adopt a role sirna an of ectodermal NANOG (si-nc) or upon in endodermal fate. differentiation 23 (Supplementary specific gene knockdown. These results Fig. also 7c,d). Scale bars, shed No light expression 100 m. discrepancies this population in previous (Supplementary data regarding Fig. 6f). of SOX2 was detected (b,c) Quantification of the mean across in colonies (n = 25) of BRA (b) and CDX2 (c). the This Finally, outcome experiment we of observed was BMP-mediated performed a broad twice. differentiation a.u., arbitrary 16,20 at the. Note units. very that edge the of range the of colony CDX2 but extended through ring of CDX2 expression that peaked the expression mesendodermal extended from region. the The colony coexpression border mesendodermal and (Supplementary encompassed fates. BRA Fig. of CDX2 and BRA Cells + 6a) cells is as consistent well as with expression of CDX2 the trophoblast-like in the mesoderm cells 26 at the center of the colony that do not at receive ; however, the border either the (Supplementary of outermost cells Fig. of 11). the colony Thus, these signals expressed there are adopt CDX2 at an least ectodermal without two populations expression fate. of of mesendodermal CDX2 + cells at markers spatially BRA, distinct SOX17 locations: and GATA6 (i) a population or pluripotency that overlaps markers with a si-nc si-chrd + si-nog si-nc si-chrd + si-lefty1 si-nog + si-cer1 -CER1 a trophoblast-like BRA population Merge in an ordered sequence along the 0.5 BRA Control radial axis of the colony (Fig. 2c,d). si-chrd + si-nog 0.4 The radial structure of the patterns was si-lefty1 extremely + si-cer1 reproducible (Supplementary Figs. 5 and 0.38). There remained small angular inhomogeneities (for example, as seen in Figure 2a and 0.2 Supplementary Fig. 7a,c) that correlated with cell density and 0.1 were impossible to control during cell seeding. We found very similar patterns for two additional hesc lines, 200RUES and 500 H1 Distance from colony center (µm) (Supplementary BRA Fig. Merge 9a,b). We also b found similar patterns if cells 0.5 BRA were grown on recombinant Laminin-521 Control instead of Matrigel or c 0.30 si-chrd + CDX2 si-nog if they were grown in mtesr1 medium 0.4 instead si-lefty1 Control of + si-cer1 conditioned si-chrd + si-nog medium (Supplementary Fig. 9c,d) Thus, si-lefty1 forcing + si-cer1cells to grow in a confined geometry triggered 0.20 spontaneous emergence 0.2 of embryonic patterning in three 0.15 hesc lines and under all conditions examined. 0.1 Gastrulation-like events in micropatterned differentiation Distance from colony center (µm) The expression of BRA and the emergence of all three germ c CDX2 layers in the micropatterned cultures 0.30suggested Control that cells might si-chrd + si-nog be are patterned necessary by to gastrulation-like preserve the ectodermal events 0.25 in character a region resembling si-lefty1 + si-cer1 of the colony the center, primitive and those steak. of In the the Activin-Nodal embryo, 0.20 FGF branch signaling are in necessary the primitive restrict streak the leads primitive to cells streak like undergoing region an epithelial-to-mesenchymal from both sides. to These b Intensity (a.u.) Intensity Intensity (a.u.) (a.u.) sity (a.u.) Distance from colony center (µm)

31 Az oxigén, mint szöveti faktor embrionális fejlődésre és őssejt-funkcióra gyakorolt hatásai A szöveti oxigén tenzió az embrióban: Hgmm a felnőtt szövetekben: Hgmm Vannak a felnőtt szervezetben nagyon alacsony oxigén tenziójú (< 7,2 Hgmm) területek fiziológiásan is: thymus vese velőállománya csontvelő Megfigyelhetőek olyan fejlődési lépések, melyek kifejezetten igénylik az alacsony oxigén szintet. Pl.: a velőbarázda kialakulása (ex vivo embrio megfigyelése), érképződés Hipoxiás állapot: ha a szövet oxigén tenziója nem éri el a normoxiás szintet Mi az oxigén szenzor? az oxidatív foszforiláció hiánya, vagyis az alacsony ATP szint Hipoxia indukálta transzkripciós faktorok (HIFs) mtor komplex (anyagcsere szenzor)

32 Hipoxia indukálta traszkripciós faktorok (HIFs) basic helix-loop-helix domén: DNS szekvencia felismerés Per-Arnt-Sim domén: heteromerizáció traszaktivátor domén: fehérje-fehérje interakció oxigén függő degradációs domén: oxigén szenzor Heterodimerként aktív TF: HIF 1α, HIF 2α, HIF 3α HIF1β (ARNT) A HIFα folyamatosan képződik A hidroxilált ODD polyubiquitinálódik, és a proteoszómában lebomlik Hipoxia alatt a hidroxiláció és a polyubiquitináció elmarad. Dimerizáció történik. Bemegy a sejtmagba. A TF HIF reszpozív elemhez (HRE) kapcsolódik. Génátíródást segít elő: pl. glükóz traszportek, glikolitikus enzimek, angiogén faktorok, hematopoetikus faktorok stb.

33 HIF szerepe a placenta fejlődésben és a vasculo/angiogenezisben E9,5 előtt az egér embrió elsősorban glikolízisből tarja fent magát. A placentális keringés E10,5-11,5 között alakul ki. A HIF kaszkád elemeinek kiütése aberráns placenta szerkezetet okoz. Csökken a fötális erek száma. Alacsony oxigén szint mellett a citotrofoblasztok osztódnak, míg magasabb oxigén tenziónál invazívak lesznek.

34 HIF szerepe a placenta fejlődésben és a vasculo/angiogenezisben Drosophyla Emlős HIF regulálta faktorok BNL:Branchless

35 Az oxigén szint befolyásolja az őssejtek fenotípusát Alacsony oxigén szint: csontvelői mezenhimális őssejtek megnövekedett kolónia képzést mutatnak mezenhimális őssejtek több osteocitát képeznek hematopoetikus őssejtek spermatogoniális őssejtek HIF szerepe az őssejtek fenntartásában embrionális őssejtek (ES) jobban proliferálnak, illetve kevésbé csökken le in vitro az SSEA és az Oct4 expresszió (vagyis fontos a pluripotencia fenntartásában) Elősegíti a Notch szognalizációt, így gátolja a korai differenciációs gének (pl. Mash, MyoD, neurogenin) átíródását Köti a β-catenint így befolyásolja a Wnt szignalizációt Szabályozza az Oct4 átíródását.

36 mammalian target of rapamycin (mtor) szignalizáció

37 Definiált őssejt mikrokörnyezetek (niche)