Állatkísérletek Elmélete és Gyakorlata A kurzus

Átírás

1 Állatkísérletek Elmélete és Gyakorlata A kurzus Core modul 2/1 Az állatkísérletek elméleti háttere és jelentősége Állatmodellek az orvosbiológiai kutatásokban Prof. Dr. Boros Mihály egyetemi tanár Dr. Kaszaki József egyetemi docens Sebészeti Műtéttani Intézet SZTE ÁOK I. szemeszter

2 Mi a kurzus célja? Az állatkísérletek elmélete és gyakorlata c. specializációs képzésekről (HU A, B) A képzés hátterét az évi XXVIII. törvény az állatok védelméről és kíméletéről 30. (1), valamint a tudományos célokra felhasznált állatok védelméről szóló 2010/63/EU európai parlamenti és tanácsi irányelv uniós rendelkezései jelentik, melyeket január elsejétől hazánkban is alkalmazni kell. E kötelezettség teljesítése érdekében az irányelvben foglalt előírások átvétele, a kapcsolódó hazai szabályozás átalakítása megtörtént, az erre vonatkozó rendelet (40/2013. (II. 14.) Korm), részletesen előírja az állatkísérletetekkel foglalkozó személyek elméleti és gyakorlati képzését, a rendeletben foglalt tematika alapján.

3 A Kormány 40/2013. (II. 14.) Rendelete az állatkísérletekről M A G Y A R K Ö Z L Ö N Y évi 23. szám A Kormány az állatok védelméről és kíméletéről szóló évi XXVIII. törvény 49. (3) bekezdés d) pontjában kapott felhatalmazás alapján eljárva a következőket rendeli el. 35. (1) A tenyésztő, beszállító és felhasználó megfelelő számú személyzetet köteles foglalkoztatni a létesítményben. (2) A személyzetnek megfelelő képzésben és oktatáson kell részt vennie az alábbi tevékenységek bármelyikének végzését megelőzően: a) állat gondozása; b) állaton végzett kísérlet; c) kísérlet és projekt megtervezése; d) állat leölése. Ez a rendelet a tudományos célokra felhasznált állatok védelméről szóló, szeptember 22-i 2010/63/EU európai parlamenti és tanácsi irányelvnek való megfelelést szolgálja.

4 A szintű specializációs képzettség szükséges: Laboratóriumi kísérleti állatok gondozásával, kezelésével, tenyésztésével, állatkísérletek végzésével, kísérletek kivitelezésével foglalkozó tudományos diákköri munkát végző graduális hallgatók laboratóriumi asszisztensek technikusok általában a fenti munkakörben foglalkoztatott, érettségivel rendelkező munkatársak számára. B szintű specializációs képzettség szükséges: Laboratóriumi kísérleti állatok felhasználásra épülő kísérletek és kísérleti projektek tervezésével, végzésével és vezetésével foglalkozó PhD hallgatók tudományos minősítéssel nem rendelkező kutatók kutatás-vezetők, akiknek a PhD védése 5 éven belül történt általában a fenti munkakörben foglalkoztatott, felsőfokú végzettséggel rendelkező munkatársak számára, akiknek a PhD védése 5 éven belül történt.

5 SZTE kurzusok 1. Állatkísérletek az orvostudományban elméleti képzés gyakorlat NÉLKÜL (20 óra) 2. Az állatkísérletek elmélete és gyakorlata - A szintű specializációs képzés A szint (12 hét); 40 kontaktóra, ebből 20 óra elmélet, 20 óra gyakorlat 3. Az állatkísérletek elmélete és gyakorlata - B szintű specializációs képzés B szint (tömbösített kurzus, 2 hét); 80 kontaktóra: 40 óra elmélet, 20 óra szeminárium, 20 óra gyakorlat 4. FELASA C level course Animal experiments - theory and practice 80 kontaktóra angol nyelven: 40 óra elmélet, 40 óra gyakorlat

6 1. ÁLLATKÍSÉRLETEK AZ ORVOSTUDOMÁNYBAN Szabadon választott tantárgy az ÁOK, FOK, GYTK, TTIK, JGYPK II-V. éves hallgatói számára Kredit: 1. Kurzuskódok: AOK II-IV. év: AOK V. év: FOK II-V. év: TTIK; GYTK; JGYPK: AOK-K99031; AOK-K99031K; FOG-KSZ31; XA0021-K99031 (BSc); XM0021-K99031 (MSc); Tantárgyfelelős: Dr. habil. Kaszaki József, Ph.D., egyetemi docens és Prof. Dr. habil. Boros Mihály, az orvostudomány doktora, tanszékvezető egyetemi tanár Előadás időpontja: Szerda Helyszín: Petri Gábor előadóterem (a régi Sebészeti Klinika előadóterem) Vizsga: elméleti teszt vizsga

7 Nem célja a szabadon válaszható kurzusnak: Gyakorlati képzés A gyakorlati képzések (A, ill. B) = specializációs részhez tartoznak (Állatkísérletek elmélete és gyakorlata - lásd ETR) Csak az elméleti képzés és a gyakorlati oktatás (együttesen) jogosítja fel állatkísérletek végzésére az illetőt az ország, ill. az EU bármely intézményében.

8 Állatkísérletek az Orvostudományban (szabadon választható elméleti kurzus) A teljesítés (leckekönyv aláírás) feltétele: részvétel az előadások 2/3-án Írásbeli tesztvizsga (min. 50%-os eredményesség, 5 fokozatú jegy). Időpont: az utolsó előadást követő héten. Helyszíne: Petri Gábor tanterem A tanfolyam megfelel Az állatkísérletek elmélete és gyakorlata A szintű specializációs képzés elméleti részének.

9 2. AZ ÁLLATKÍSÉRLETEK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA A SZINT Kötelezően választható tantárgy az ÁOK, FOK, GYTK, TTIK, JGYPK II-V. éves hallgatói számára; Felvétel feltétele: az első két félév teljesítése és témavezetői igazolás az állatkísérletek végzésén alapuló tudományos diákköri munkáról Kredit: 3. Kurzuskódok: Elmélet: Gyakorlat: AOK II-IV. év: AOK-K1951; AOK-K1952 AOK V. év: AOK-K1951K; AOK-K1952K FOK II-V. év: FOG-KSZ36; FOG-KSZ37 TTIK; GYTK,: JGYPK; BSc XA0021-K1951 XA0021-K1952 TTIK; GYTK,: JGYPK; MSc XMA0021-K1951 XM0021-K1952 Tantárgyfelelős: Dr. habil. Kaszaki József, Ph.D., egyetemi docens és Prof. Dr. habil. Boros Mihály, az orvostudomány doktora, tanszékvezető egyetemi tanár Előadás időpontja: Szerda ; Helyszín: Sebészeti Klinika előadóterem Gyakorlat időpontja: csütörtök: Helyszín: Sebészeti Műtéttani Intézet (a volt Sebészeti Klinika épület alagsor) Első gyakorlat: szeptember 15. Vizsga: elméleti teszt vizsga; gyakorlati vizsga

10 Előadások tematikája 1. Az állatkísérletek elméleti háttere és jelentősége; Állatmodellek az orvosbiológiai kutatásokban; Dr. Kaszaki József 2. Az állatkísérletek törvényi szabályozása, az engedélyezések menete. A helyettesítés, csökkentés és tökéletesítés (3R) követelménye; Dr. Kaszaki József 3. A kísérleti állatok species specifikus biológiája I. Kis állatok bonctana, élettana, örökléstana, immungenetikája, viselkedés biológiája; Dr. Tőkés Tünde Molnár Máté 4. A kísérleti állatok species specifikus biológiája II; Nagy állatok bonctana, élettana, örökléstana, immungenetikája, viselkedés biológiája; Állatokkal való bánásmód és kezelési formák; Dr. Varga Gabriella 5. A kísérleti állatok és állatházak higiénés fokozatai, a kísérleti állatház működtetése, jogi szabályozása és a környezetgazdagítás; Dr. Érces Dániel 6. A fájdalom, szenvedés-stressz felismerése; Az altatás és a fájdalomcsillapítás általános szabályai; Kíméletes végpontok és az eutanázia alkalmazása; Dr. Érces Dániel 7. A műtétek általános elvei, az aszepszis szabályai, alapvető sebészi beavatkozások és sebkezelés, Dr. Varga Gabriella 8. Kísérletek tervezése; Életjelenségek megfigyelése, nyilvántartása; Dr. Kaszaki József 9. Kísérletek és projektek tervezése, kivitelezése. A kísérleti adatok feldolgozása, a statisztikai analízis alapjai; Dr. Kaszaki József 10. Az állatkísérletek etikai vonatkozásai; Az állati jólét szempontjai; Az állatok tudományos célra való felhasználása mellett és ellen szóló érvek; Prof. Dr. Boros Mihály

11 3. AZ ÁLLATKÍSÉRLETEK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA B SZINT Kötelező tantárgy a Multidiszciplináris Doktori Iskola hallgatóinak, a többi Ph.D. hallgatónak szabadon választható kurzus. Felvétel feltétele: témavezetői igazolás az állatkísérletek végzésén alapuló tudományos munkáról Kredit: 8 Kurzuskódok: elmélet gyakorlat AOK Ph.D. SEBMUT-061 SEBMUT-062 TTIK/GYTK Ph.D. XD0011-SEBMUT061 XD0011-SEBMUT062 Tantárgyfelelős: Dr. habil. Kaszaki József, Ph.D., egyetemi docens és Prof. Dr. habil. Boros Mihály, az orvostudomány doktora, tanszékvezető egyetemi tanár Tömbösített kurzus 80 óra, Időpont: 2016 november 28 december 09; naponta Helyszín: Sebészeti Műtéttani Intézet Vizsga: elméleti teszt vizsga; gyakorlati vizsga; állatkísérletes engedély írása

12 4. ACCREDITED FELASA C LEVEL COURSE ANIMAL EXPERIMENTS - THEORY AND PRACTICE (035/14) FELASA = Federation of European Laboratory Animal Science Associations). SZTE Akkreditáció 2014/15-től B Szint = FELASA C típusú bizonyítvány. Feltételek: részvétel az oktatott óraszám 100%-n, B szintű sikeres vizsga, tanfolyam részvételi ill. vizsgadíj Accreditation course number Hungary Szeged Univ. Szeged M. Boros Hungarian 035/14

13 Példa a közgondolkodásra : mi a véleményed Csernus doktorról? Fogalmam sincs, ki az 5% Kemény legény 3% Érdekes, szimpatikus egyéniség 22% Fantasztikus szakember lehet 12% Eladta magát a médiának 11% Ki nem állhatom 36% Nem tartom hitelesnek 11%

14 A bevezető előadás témakörei A tudományos módszer: problémák definiálása és megoldásuk A tudományos módszer része: a modellalkotás Az orvostudományi modellalkotás gyakorlata: - a modellalkotás oka és célja - a modellalkotás (az állatkísérletek) korlátai - modellek főbb csoportjai az orvostudományi gyakorlatban

15 Az orvostudományi kutatás elvi alapjai Kit nevezünk tudományos kutatónak? Wikipedia: Individuals who use the scientific method

16 A módszerről általában It was six men of Indostan To learning much inclined, Who went to see the elephant, Though all of them were blind That each by observation Might satisfy his mind. Blind men and the elephant John Godfrey Saxe ( )

17 Módszerünkkel hibás eredményeket is kaphatunk And so these men of Indostan Disputed loud and long, Each in his own opinion Exceeding stiff and strong. Though each was partly in the right And all were in the wrong.

18 1. Következtetés A tények megismerését lehetővé tevő A tények megismerését lehetővé tevő módszer legyen alkalmas többféle megközelítésre

19 Többféle megközelítésre alkalmas módszer Mit tudunk eddig? mások eredményeinek összegzése Hipotézis javaslat próba Eredmények az új adatok elemzése, mérlegelés Új információ a felismerést átadjuk másoknak

20 2. Következtetés A tények megismerését lehetővé tevő módszer legyen alkalmas többféle megközelítésre és korrekciókra

21 Az orvostudományi kutatás lényege a hipotézis alapú módszer Megfigyelés Hipotézis Predikció Elvetem Teszt Elfogadom Megjegyzés: hipotézisünk csakis kontrollálható lehet (!)

22 A kutatások célja: az igazság keresése A módszer A tudásanyag folyamatos integrálása és korrekciója B módszer Az ismeretanyag teljes elfogadása Nincs örökös érvényű elmélet Változatlan/változhatatlan elmélet Tudományos Nem tudományos

23 Van tehát egy hipotézisem - mit tegyek 1. hogy a dolog (az igazság ) végére járjak; 2. hogy a következtetésem mások számára is elfogadható legyen?

24 A mások számára is elfogadható következtetések feltétele: a jó modell A tudomány nem magyaráz, nem interpretál, hanem modelleket állít (Neumann János)

25 Mit nevezünk modellnek? 1. A valóságos rendszer egyszerűsített, a vizsgálat szempontjából lényegi tulajdonságait kiemelő mása. 2. A világ leírásának, megértésének az eszköze.

26 Modellezési alapfogalmak A modell legfontosabb jellemzője a jósága: - a jó modell használható: alkalmazásakor kísérletek útján összevetjük a forrásául szolgáló valóságos jelenséggel, azaz - a modell alkalmazásakor méréseket végzünk. A mérés a tudományos módszerrel történő ismeretszerzés legalapvetőbb eleme; minden tudományterület a természet jelenségein végzett mérésekre épít.

27 Használhatóság és mérések: a tudományos modell szükségszerű jellemzői

28 Használhatóság és mérések: a nem tudományos modell nem szükségszerű jellemzői 2012 második felében hatalmas természeti csapás éri a Földet. Négy óra leforgása alatt mínusz fokra lehűl a hőmérséklet, és ez a helyzet 2013 májusáig áll majd fenn.

29 A modellalkotás általános érvényű elvei - Szeparáció - Szelekció - Gazdaságosság

30 Alapfogalmak 1. Szeparáció: a modellezendő rendszert vagy jelenséget a többitől (külső környezettől, a világtól) el kell különíteni. 2. Szelekció: a modellezés során a megvalósítandó cél szempontjából szelektálni kell (a kölcsönhatások között). 3. Gazdaságosság: a modellnek (a vizsgálat célkitűzésének megfelelve) a lehetőségek közül a legegyszerűbbnek kell lennie. Occam borotvája: Entia non sunt multiplicanda praeter necessitatem" (szükségtelenül ne szaporítsuk a dolgokat, és a redundáns dolgok leválaszthatók - Pluralitas non est ponenda sine necessitate )

31 1. Következtetés 1. A szeparáció és a szelekció elvéből adódóan a modell a valóság egyszerűsített és hibás képe. 2. Hibás, DE szeparáció és szelekció nélkül a modellalkotás elképzelhetetlen.

32 A modellezés alapfogalmai A modell felállításához szükséges információk forrásai: 1. A priori ismeretek: a modellezendő jelenségre vonatkozó, a vizsgálat megkezdésekor rendelkezésre álló ismeretek összessége; 2. A posteriori ismeretek: a modellezési eljárás befejezésével rendelkezésünkre álló ismeretek (előzetes ismeretek + a jelenség megfigyelése során nyert információk összessége).

33 A modellezés alapfogalmai Deduktív modellalkotás => kizárólag a priori ismereteket használ Általános érvényű törvényszerűségekből kiindulva (természettudományos ismeretanyagra támaszkodva) egy konkrét, ismert jelenség leírására törekszik. Induktív modellalkotás => kizárólag kísérleti adatokra épít - A kísérletek során végzett megfigyelések információt tartalmaznak a jelenség és annak környezete között érvényesülő kölcsönhatásokról (a rendszer bemenő és kimenő jeleiről) - A kísérleti vizsgálatok célja a jelenség olyan modelljének felállítása, mely utánozni képes a jelenség tényleges lefolyását.

34 2. Következtetés Az orvostudományi kutatás lényege a jó modell Releváns, jó modell => Good science

35 A modellek alaptípusai In vitro modell In vivo modell

36 In vitro modellek Egész szerv perfúzió Szövet superfusio Primér sejttenyészet Immortalizált sejtvonal tenyészet Szubcelluláris vizsgálatok Molekuláris vizsgálatok - gén, protein expresszió Értékes adatokat szolgáltatnak DE sohasem biztos, hogy ezek pontosan reflektálják az integratív, élő természetet.

37 In vivo modellek Humán vizsgálatok - (általában) nem lehet invazív - a háttér információk kérdései Nem humán (pl. állati) vizsgálat - a fenti problémákat megoldja - DE: nem biztos, hogy az eredmények alkalmazhatók lesznek humán esetekre

38 Krónikus vizsgálatok In vivo modellek - Problémák: pl. tartósan beültetett eszközök, katéterek, etc. kérdésköre Akut vizsgálatok - Problémák: pl. anaesthesia hatása - Eltérések az élettani állapottól

39 Az eddigiek összefoglalása A tudományos módszer humán / nem emberi Problémafelvetés A háttér elemzése Hipotézis megfogalmazása Kísérletek elvégzése in vivo, in vitro További kísér- letek tervezése Kiértékelés Elemzés Végső következtetés Új kísérletek Problémamegoldás A hipotézis érvényessége (modell) kísérletekkel igazolható Kísérleti alaptípus a tárgy alapján élő vagy élettelen (alcsoport: in silico), in vivo kísérleti lehetőség: emberi vagy nem emberi (állati vagy növényi) lehet.

40 Analógia A tudományos módszer alkalmazása a klinikumban Panaszok Anamnaesis Differenciáldiagnózis Vizsgálatok A módszer ismételt alkalmazása embereken További vizsgálatok Több lehetőség Adatok alapján a diagnózis szűkítése Csak egy lehetőség Végső diagnózis Kezelés Az orvosi döntéshozatal analógiája: az adatgyűjtéstől a betegség kezeléséig

41 Hogyan lehet alkalmazni a tudományos módszert azaz a modellalkotást - az orvosi gyakorlatban, a klinikumban? Helsinki Deklaráció (1964) 1. Az orvos kötelessége az alanyok életének, egészségének, magánélethez fűződő jogának, emberi méltóságának oltalmazása. 2. A kutatás feleljen meg az általánosan elfogadott tudományos elveknek. 3. A kutatás alapuljon a tudományos irodalom alapos ismeretén. 4. A kutatást előzze meg laboratóriumi és állatkísérlet. 5. A kutatást meg kell tervezni és világosan megfogalmazott protokoll szerint kell eljárni.

42 Szabályozási rendszerek Laboratóriumi eredmények In vitro modellek Állatkísérletek In vivo modellek Emberi (klinikai) vizsgálatok In vivo modellek

43 Mi az élő állatokat igénylő modellalkotás oka? (Miért végzünk állatkísérleteket?)

44 Miért végzünk állatkísérleteket? Hogy megfeleljünk a törvények előírásainak

45 Miért végzünk állatkísérleteket? Mert szükségesek a tudományos módszer alkalmazása vagyis a jelen (és valószínűleg a jövő) tudományos fejlődése szempontjából. Mert bizonyos hipotéziseket nem lehet embereken vizsgálni (nem lehet emberi modelleken megoldani)

46 A tudományos módszer tárgyai az medicinában Terápia: veszettség (kutyák, nyulak); angolkór (kutya); lepra (majom, tatu); stb. Megelőzés: diftéria (ló); polio (nyúl, majom); bárányhimlő (majom); kanyaró (majom) Felfedezés: inzulin (kutya); modern anaesthesia (kutya); DNS (egér, patkány) Fejlesztés: laparoszkópos sebészet (disznó); nyitott szívműtét (kutya); stb.

47 Mi korlátozza az élő állatokat igénylő modellalkotást (azaz az állatkísérleteket)? (a morális kérdésektől eltekintve?)

48 A legfontosabb korlát: az eredmények nem minden esetben relevánsak nem mindig alkalmazhatók - humán körülmények között (!) (1) Species különbségek Csokoládé (theobromin) toxikus a kutyákra Kortizon teratogén egerekben Inzulin toxikus lehet több állatban (stb.) (2) Egyes fontos jeleket, bizonyos változásokat nehéz / lehetetlen felismerni (pl. enyhébb fájdalom) (c) Bizonyos esetekben alternatívák lehetségesek (ld. alább)

49 A 3 R - Russel & Burch (1959) (a) Refinement: az állati fájdalom és szenvedés csökkentése (b) Reduction: a kísérletekben felhasznált állatok számának csökkentése a lehetőségek határáig (pl: az emberi reakcióknak megfelelően, genetikusan módosított állatok használata). (c) Replacement: az állati modellek helyettesítése más modellekkel (i) Relatív helyettesítés: olyan kísérletek, melyek teljesen megszüntetik az állati szenvedést, anélkül hogy mindez kizárná a vizsgálatok további folytatását (tökéletes finomítás, absolute refinement) (ii) Teljes helyettesítés: olyan kísérletek, melyekhez nem szükséges állati eredetű biológiai anyag

50 Replacement / helyettesítés (a) Információ-áramlás fokozása (szükségtelen ismétlések számának csökkentése) ( ) (b) Computer-alapú rendszerek, matematikai modellezés (?) (c) Fiziko-kémiai technikák, pl. a kemikáliák irritációs hatását előrejelző EYTEX rendszer (Draize teszt helyettesítése), stb. (?) (d) Alacsonyabb rendű szervezetek (baktériumok, gombák) alkalmazása (pl. Ames teszt). (?) (e) Emberi vizsgálatok, pl. önkéntesek, populációk (?) (f) Sejt, szövet és szerv kultúrák (?)

51 Mi tehát az állatkísérletek - vagyis az állatkísérletes modellalkotás gyakorlati célja?

52 Az állatkísérletes modellalkotás célja Magának a fajnak, reakcióinak tanulmányozása (állatorvosi kutatás) Állati viselkedés kutatása (pl. stressz-tűrő képesség mechanizmusa) Nem gyógyszerészeti készítmények tesztelése (pl. toxicitási vizsgálatok) Gyógyszerek kipróbálása (pl. in vivo tesztek új gyógyszerek, vaccinák, fázis 2 vizsgálatok) Oktatási cél (pl. egyetemi hallgatók) Általános biológiai mechanizmusok tanulmányozása - nem közvetlenül orvosi célú kutatás ( következtetések humán biológiai mechanizmusokra) - általános orvostudományi cél (pl. rák, AIDS kutatás, xenotranszplantáció)

53 Általános biológiai mechanizmusok tanulmányozása = alapkutatások Leíró vizsgálatok - Élettan, kórtan, etológia - Nincs valódi hipotézis => kísérleti tervezés, minőségbiztosítás nehéz Válaszreakció valamilyen intervenciót követően - Élettan, kórtan, viselkedés - A kísérleti tervezés meghatározó fontosságú

54 Biológiai mechanizmusok vizsgálata, állatokat tanulmányozva, megfigyelve, a kapott következtetéseket extrapolálva - ilyen a legtöbb kísérlet Terápiás - preklinikai vizsgálatok Toxikológia / beavatkozások biztonsága Anatómia, sebészet Fertőzések és immunitás Daganatos mechanizmusok (kutatás, diagnózis) Viselkedés / pszichológia

55 Miért nem lehetséges (mindig) az extrapoláció? Mert a fajok közötti összehasonlíthatóság mindig kérdéses lesz (kiragadott példa: LD50 értékek, eltérő toxikus szintek, stb ) Világos következtetések levonására alkalmas, egyszerű modellre van szükség!

56 Állati modellek főbb csoportjai 1. Spontán modell 2. Indukált modell 3. Negatív modell 4. Egyéb modell

57 1. Spontán modellek Hasonló (azonos) mechanizmusok emberben és állatban Vizsgált faj Defektus / érzékenység Humán megfelelője Min egér Mutáns apc-gén Fam. adenomatosus polyposis (colon cc) Miért alkalmazzák Azonos emberi végpont Macska Asztma Asztma Azonos patológia Ír szetter Mormota Tatu (armadillo) VIII faktor hiány Hepatitis B érzékenység Hemophilia A Hepatitis B Terápiás vizsgálat Infekció vizsgálat Lepra Lepra Terápiás vizsgálat

58 2. Indukált (kiváltott) modellek Valamilyen manipuláció szükséges Viselkedés, pl. stressz tanulás Kérdés: azonos-e az emberi és állati stressz? Sebészi beavatkozások, pl. idegek átmetszése, erek elzárása Kérdés: mekkora az eltérés az élettani helyzettől? Genetikai manipulációk, pl. transzgén, knock-out, knock-in Kérdés: mekkora az eltérés az élettani helyzettől, mik a genetikai előkezelés nem ismert következményei?

59 3. Negatív modell Miért nem modellek Miért nem - kapnak a kutyák atherosclerosist; - lesznek AIDS-esek a HIV vírussal fertőzött csimpánzok?

60 4. Egyéb modellek Jellegzetességek, melyeknek fontos biológiai jelentőségük lehet - Sertéseknek sok CD4+CD8+ T-sejtjük van - Kérődzőknek sok γδt-sejtjük van - Az állati leukosis fertőző - Mutáció indukció, mint fontos kutatási terület

61 Az orvostudományi modellalkotás alapfeltétele: az állati biológia ismerete

62 A patkány mint standard modell Ember Jellegzetesség ++ Plazma zma-protein kötés Orr-száj Kis coecum Szőrtelen Eltérő Ritka Légzés Bélflóra eltérés Bőr Teratogenitástás Patkány alacsony Orr Nagy coecum Szőrös Eltérő Albinizmus 95% + Epehólyag -

63 Eltérés: albinizmus Defektus: tirozináz hiány Idegrendszeri eltérések Fényérzékenység, retina károsodás Halláscsökkenés Szövettani eltérések Alacsony P450 aktivitás Alacsony szérum protein szintek (befolyásolja a xenobiotikumok reakcióit): streptomycin, clindamycin, klorokvin, klórpromazin, nikotin, pilocarpin, serotonin, adrenalin, noradrenalin, dopamin.

64 Eltérés: viselkedés Éjszakai vagy nappal aktív (fordított fény ciklus?) Szociális rangsor (természetes viselkedés vagy csak indukciós modell - úsznak-e a patkányok?) Tigmotropizmus (egymáshoz tapadás) - túlzsúfoltság tenyésztés alatt és kísérletek közben

65 Eltérés: emésztőrendszer Fogak Gyomor (üres vagy sem?) A táplálék (rosttartalom) Coecum (coecotropok koprofágia)

66 Eltérés: kórélettan Betegség jelei (láz vagy hipotermia) Harder mirigy Speciális betegségek Porfirin nyomok az orrnyílás környékén

67 Eltérés: gyógyszerek reakciói A species választás befolyásolja a farmakológiát, toxikológiát, anaesthesiát A metabolizmus hőmérséklet függő Species különbségek gyakran összefüggnek a testfelszínnel Szalicilátok plazma fél-életideje A trimetoprim fél-életideje

68 Lehetséges megoldások 1. Allometrikus extrapoláció (Watanabe & Bois. Risk Analysis 16; : 754: 1996; K. Schmidt-Nielsen: Scaling, Cambridge 1984) Y = dosage level A = species independent scaling coefficient bw = body weight B = if Y depends upon body weight B = 0,75 - if Y depends upon metabolic rate B = 0,67 - if Y depends upon body surface Y = Abw B 2. Egyszerű dózis-skálázási faktor a testsúlyhoz viszonyítva (Peters-Volleberg et al. Reg. Tox. Pharmacol. 20; :1994) Body weight (kg) Scaling factor Man 60 1 Beagle 8 2 Monkey 6 2 Rabbit 2 3 Rat 0,2 5 Mouse 0,02 8

69 Modellek a gyakorlatban = a klinikai gyakorlat modellezése 1. Szepszis súlyos, gyakran halálos megbetegedés, főleg a pathomechanizmus tisztázatlan 2. Vérzéses shock súlyos, gyakran halálos megbetegedés, főképp a kezelési elvek tisztázatlanok

70 Modellek a gyakorlatban I. Rágcsáló modellek a humán szepszis vizsgálatára Áttekintés: LPS (endotoxin) CLP coecum lekötés és punctio Fecalis inokuláció Intravénás baktérium Pneumonia

71 LPS (endotoxin) Előnyök Egyszerű pl. i.p. injectio, io, shock 4-6 órán belül DE: Anti-LPS hatékony LPS ellen állatokban, de emberekben (klinikumban) nem

72 CLP Előnyök DE: Pl. perforált appendicitishez hasonló Standardizálás nehéz Műtétet igényel (behatolás, zárás, felépülés)

73 Fecalis inoculum Előny DE Standard, konzisztens Alkalmazása egyszerű (IP injekció) Nincs jelentős trauma

74 Pneumonia modellek Előnyök Egyszerű beadni (tracheába vagy az orrba) A dózis ellenőrizhető, reprodukálható DE Esetenként csak helyi reakció (nincs szisztémás gyulladás)

75 Intravénás baktérium Előny DE Könnyű dozírozni Szisztémás infekció Gyorsan elpusztul, befolyásolja a gazdaszervezet immunitását

76 Eredmények (intravénás baktérium és kezelés) Kezelés Iv. E. coli (kísérlet) Klinikai szepszis (humán) Methylprednisolon hatékony 1 hatástalan 2 / ront 3 Anti-TNFα hatékony 4 hatástalan 5 1 Hinshaw et al. Ann Surg 1981;194: VA SSCSG N Eng J Med 1987;317: Bone et al. N Engl J Med 1987;317: Tracey et al. Nature 1987;330: Abraham et al. JAMA1995;273:

77 Mi lehet a probléma oka? Jó a modell? Eltér-e a valóságtól?

78 A modell és a valóság 1. Kísérletes szepszis Homogén genetikai háttér (egy nem) Beltenyészet Eltérő fajok: patkány, kutya, sertés Egészségesek Fiatal felnőttek Endotoxin érzékenység eltérő (koprofágia/szennyezett környezet) Klinikai szepszis Heterogén (mindig két nem) Outbred Homo sapiens Társbetegségek Újszülöttek vagy idősek Rendszerint tiszta környezet

79 A modell és valóság 2. Kísérletes szepszis Általában előkezelés Nincs adjuváns kezelés Nincs pl. lélegeztetés A fertőzés leggyakrabban hematogén utón történik Heparin, anesthesia, analgesia Uniform inzultus Gyors kialakulás A vizsgálat ideje standardizált Különféle végpontok (rendszerint nem a lethalitás) Klinikai szepszis Addig nem lehet kezelni, amíg a betegség nincs jelen Aktív terápia (folyadék, antibiotikum, inotróp szerek) Lélegeztetés gyakori Fészek ( nidus ) Optimális kezelés Helye és mértéke változó Rendszerint lassú Egyedi lefutás Klinikai végpontok, szervfunkciók, mortalitás

80 Modellek a gyakorlatban 2. A vérzéses shock Alapvető lehetőségek a vérzés modellezésére Ellenőrzött véreztetés (konstans nyomás vagy térfogat) Éber vagy altatott Nem ellenőrzött vérzés

81 Az állandó nyomás modell Wiggers, C.J. The present state of the shock problem. Physiol. Rev. 1942;22: Vérzés az a. femoralis-ból egy nyitott reservoir-ba. Az érpálya hidrosztatikai nyomását az előre meghatározott artériás középnyomás (MAP) értékre állítják (MAP=40 Hgmm) Újraélesztés meghatározott időben (pl. 60 perckor)

82 Állandó térfogat modell Számított vértérfogat = testsúly %- a ( 60 ml vér/tskg). Vérzés az artéria femoralisból 1 ml/perc sebességgel a 40% vértérfogat eléréséig Reszuszcitáció 60 perckor

83 Eredmények állandó térfogatú vérvesztés esetén Esetszám Súly (g) Oxigén felhasználás ml/min/kg Túlélés n=8 289 ± n= ±

84 Tanulságok 1. A patkányok vértérfogat / testsúly aránya 100 és 400 g között a testsúly növekedésével lineárisan csökken. Rágcsálóknál a csoportok közötti kicsiny (pl g) súlykülönbséget nem könnyű felismerni. Arra következtethetünk, hogy a kezelés hatékony, pedig csupán az állatok súlya kissé alacsonyabb a kezeletlen kontrollokhoz képest. Rágcsálók esetén a kísérletes protokoll állandó része a testsúly szigorú ellenőrzése (!)

85 Tanulságok 2. Ismerni a társ- vagy távoli szakterületek irodalmát (is): a testsúly/vértérfogat következményét leíró eredeti közlemény: Lee, H.B. & Blaufox, MD. J. Nuclear Med. 1985;26:72-76.* * The use of an arbitrary value of 7% for estimation of blood volume can lead to significant errors in calculating radiopharmaceutical distribution. The use of the general formula for the blood-volume calculation described here should improve the accuracy and reliability of estimates of radiopharmaceutical distribution. BV (ml) = 0.06 X BW (r = 0.99, n = 70, p < 0.001). The difference between male and female rats was not statistically significant.

86 Gainer és mtsai* vizsgálatai 280 g-os patkány Kiindulási O 2 felhasználás = 23 ml/perc/kg 40% vérzés az O 2 felhasználást 10 ml/perc/kg-val csökkenti Vérzés alatt az O 2 felhasználás = (23-10) 13 ml/perc/kg Várhatóan túlélő 315 g-os patkány Kiindulási O 2 felhasználás = 15 ml/perc/kg 40% vérzés az O 2 felhasználást 10 ml/perc/kg-val csökkenti A vérzés alatt az O 2 felhasználás = (15-10) 5 ml/perc/kg Várhatóan nem éli túl a vérzést * Gainer JL et al. Hemorrhagic shock in rats. Lab Animal Sci 1995; 45(2):

87 További tényezők - az anaesthesia hatása Tanulmány Anestheticum (mg/kg) Watts et al. 1 Éber* Custalow et al. 2 Altatott Súly (g) MAP (Hgmm mm) 40 ± ± 1 Vértérfogat 15.5 ± ± 0.4 Laktát ± ± 0.5 Art. ph ± ± 0.02 Ketamin/ Xylazin (70/3 mg/kg) * Éber vérzéses modellek csak szigorú feltételek mellett engedélyezhetők * Éber vérzéses modellek csak szigorú feltételek mellett engedélyezhetők 1 Watts, JA, et al. AJP 2001;281:G498-G506 2 Custalow, CB, et al., Shock 2001;15(3):

88 Tanulságok Éber vs altatott modellek összefoglalása Az anaesthesia jelentősen befolyásolja a központi idegrendszer által irányított autonóm reflexeket. Az anaesthesia általában jelentősen befolyásolja (deprimálja) a légzést. Bizonyos anaesthetikumok jelentősen befolyásolják (csökkentik) a gyulladást.

89 Tanulságok - a Nem szerepe A legtöbb vizsgálatra hímeket használnak Azonban: Alacsony tesztoszteron és magas ösztradiol védő hatású (és pl. kivédi az immunszuppressziót is (Angle, M.K. et al.: Effect of gender and sex hormones on immune responses following shock. Shock 2000;14(2):81-90) Azóta védőhatást igazoltak (állatokban): Ivartalanítás Estradiol Flutamide (androgén receptor antagonista) DHEA (ösztrogén agonista) Etc. esetén Tanulság: a gyengébbik nem jobban tolerálja a traumás vérzést.

90 A vérzéses modellek tanulságai A (pl. 40 Hgmm mm-es) középnyomás csökkenésre adott reakció nem uniform (ld. testsúly ). A nem és az altatás befolyásolja a kórlefolyást, a súlyosságot is A vérvesztés (pl. 40 Hgmm-es MAP elérése) módja sem mellékes, és a nyomáscsökkenés sebessége is befolyásolja a vesztett vértérfogatot, különösen éber állapotban.

91 A tanulságok összefoglalása A hatékony kutatómunkához alapos tervezésre - és az állati modellek korlátainak ismeretére van szükség. Meg kell világosan határozni a célt és ezt sohasem szabad túlhaladni: Élettani jelenség kutatása Kórélettani mechanizmus kutatása Kórélettani változások befolyásolása Kezelések (pre-klinikai) vizsgálata

92 A tanulságok összefoglalása Minden állatkísérletes vizsgálat legfontosabb eleme (eredményeit és következtetéseit leginkább befolyásoló tényezője): a megfelelően tervezett modell. Az orvostudományi modellt mindig a klinikai valósághoz viszonyítva kell kialakítani Fontos figyelembe venni, a modellek nem tudják teljes mértékben reprodukálni a humán betegséget Irreleváns, klinikailag nem megfelelő, alkalmatlan modellek elhibázott kísérletek hibás klinikai vizsgálatok hibás következtetések

93 Köszönöm a figyelmet

94 Ajánlott irodalom Gems of wisdom from Watson and his colleagues that should guide young scientists in all fields on how to be the best that one can and how to learn from failures 1. Conventional wisdom is often wrong. 2. Take real joy in the discoveries of others; what matters most is whether the result is important. 3. "Jim and Francis believed that in order to go fast, you must share information in the expectation of learning things, rather than withhold it from fear of theft." 4. Sometimes, "a beautiful insight could solve a jigsaw puzzle even when the best solid evidence had been ignored." 5. There is value in scientific partnerships of equals. 6. "Two people are better than one. Otherwise you get in a rut, you can get too fond of your own ideas, you get the wrong idea, you can't get out of it." 7. Young scientists who feel the need to assert their independence should not do it by cloistering themselves. 8. "Rosalind Franklin just needed a collaborator. She didn't have somebody to break the pattern of her thinking." 9. Above all, find the best mentor. Judah Folkman: Watson and DNA: Making a Scientific Revolution. In Nature Medicine (April 2003)