Izotópok alkalmazása az orvostudományban

Átírás

1 JELZÉSI TECHNIKÁK AUTORADIOGRÁFIA FEHÉRJÉK JELZÉSEI Izotópok alkalmazása az orvostudományban kutatás diagnosztika terápia Dr. Márián Teréz NUKLEÁRIS MEDICINA INTÉZET DEOEC anyagcsere folyamatok sejtosztódás nyomjelzés térfogatmérés koncentráció mérés biokémiai folyamatok Gyógyszerkutatás anyagcsere folyamatok tumor diagnosztika izotópeloszlás térkép kétdimenziós térkép háromdimenziós térkép funkcionális vizsgálatok sugárterápia radionuklid terápia Az autoradiográfia nagy múltú technika Niepce St. Victor in 1867 ben mutatta ki, hogy az uránium só feketedést okoz az ezüst klorid/bromid sót tartalmazó emulzión E.H. London készítette az első makroautoradiográfiát, ahol egy békát rádium izotóppal jelölt meg, és rádium sugárzást, ami a békából jött leképezte egy filmre. Autoradiográfia-Fotoemulziós eljárás A sugárforrás lefényképezése két vagy három dimenzióba egy fotográfiai emulzió segítségével A sugárzásnak a fotoemulzióra gyakorolt hatása denzitométerrel mérhető Denzitométer: speciális fotométer, amely a fotoemulziók feketedését határozza meg, és széles tartományban arányos a sugárzás intenzitásával. Kvantitálás (mennyiségi kiértékelés): a vizsgálandó emulzió feketedését un. normálsorozat feketedésével hasonlítjuk össze. 5 6 Autoradiográfia szerepe a biológiai kutatásokban Az izotóppal jelölt biológiailag aktív molekulák szervezetben, szervekben, sejthalmazon, sőt egyes sejteken belüli lokalizációja meghatározható Gyógyszerkutatás Élettani folyamatok nyomon követése Molekuláris biológiai izotópos módszerek (génexpresszió, membrán fehérjék kimutatása, izotópos antitest jelölésekkel stb) Kémiai analitikai módszerek Mikro-autoradiográfia: izotóppal jelölt néhány mikronos vékony metszet (pl. tumoros szövet, specifikus izotópos antitesttel jelölve). Parafinba ágyazott fixált minták, fagyasztott minták (metszetek) Detektálás: filmmel Értékelés: fénymikroszkóp, elektronmikroszkóp Makroautoradiográfia: nagyméretű mintákat értékelünk. Planáris minták (röntgen film). Feldolgozás után szabad szemmel is látható Egésztest autoradiográfia: egér, patkány, nyúl stb. egész testéről készített fagyasztott metszetek (szeletek) 7 8

2 Autoradiográfia CMC: carboxi-metil-cellulóz Izotóp injektálása Állatok előkészítése a metszésre A beágyazó anyag előkészítése Beágyazás Metszés Előmetszés Metszés A metszetek kezélése (fagyasztva szárítás) A szeletek előkészítése a detektáláshoz A szeletekben feldúsult radioaktivitás megjelenítése, film vagy foszfor imager technikával. Kiértékékelés 9 10 Beágyazás, fagyasztás Állatok előkészése 11 Metszés 12 A metszetek fagyasztva szárítása Izotópeloszlás detektálása sugárérzékeny filmen,vagy beta imager technikával LEICA CM 3600 cryomacrotom 15 16

3 Egésztest autoradiográfia Transzmissziós felvétel Tumordiagnosztika, terápia hatékonyságának Anatómia kép kimutatása állatkísérletekben Patkány modell 18FDG Megelőző Orvostani Intézet TTK Molekuláris Biológiai Intézet Képfúzió 30 perc 60 perc Anatómiai kép (felső) és emissziós FDG-PET kép (középső) Farmakon akkumuláció időfüggésének vizsgálata Fúziója (alsó kép) A radioaktivitás detektálása film autoradiográfiával AgBr kristály AgBr kristályból Ag kiválás a radioaktív sugárzás hatására Zselatin Radioactív halmozás Minta (metszet) 21 A fényérzékeny anyag (film) egy szilárd hordozóra felvitt zselatinba ágyazott AgBr. Ha fény, vagy radioaktív sugár éri a kristályt, egy elektron kilökődik, továbbhalad, majd egy hibahelyen befogódik.22 A radioaktivitás detektálása film autoradiográfiával Előhívás Látens kép kialakítása Ag+ + e- = Ag folyamatban keletkező Ag atomok a látens kép prekurzorai Instabil állapot Az előhívó oldat az AgBr szemcsék kémiai redukcióját végzi, amelyet az ezüst atomok katalizálnak. AgBr----Ag Látens kép ezüst szemcse Előhívás itt jelenik meg gyorsabban a látható kép Látens kép stabilizálása: az expoziciót -70 oc-on végezzük A látens kép láthatóvá tétele 23 24

4 Autoradiogram Fixálás Az előhívott kép rögzítése: Az előhívás után a visszamaradó, redukálatlan AgBr-ot a fixirfürdőben eltávolítjuk Felbontóképesség: az a minimális távolság amikor még két különálló pont helyét meg tudjuk különböztetni a filmen A felbontóképesség függ: az izotóp energiájától a minta rétegvastagságától a fotoemulzió rétegvastagságától a minta és a film közötti vastagságtól az expoziciós és előhívási időtől stb. Mosás: sók eltávolítása a zselatinból Érzékenység: egységnyi aktivitás által egységnyi felületen (1 cm 2 ) létrehozott Ag szemcsék száma Optimalizálás Denzitométerek: a filmen létrejött feketedések értékelése Probléma: a feketedési értékek nem lineárisan változnak az aktivitással In vitro autoradiográfia Receptor kutatás Az előzetesen lemetszett, és fagyasztva tárolt metszetek jelölése az izotóppal jelölt bioaktív molekulákkal Preflash elővilágítási technika 27 Dopamin receptorrendszer feltérképezése 125 Izotóppal jelölt receptor liganddal postmorten agyszeleten (computeres színskála megjelenítés) 28 A radioaktivitás mértékegységei Aktivitás (bomlás/másodperc) [Bq] Becquerel SI mértékegység, 1Bq 1bomlás /másodperc [Ci] Curie 1gram tiszta 226 Ra aktivitása 1Curie=3,7x10 10 Bq 10mCi=400MBq 1MBq= 27uCi 37MBq=1mCi Fehérjék jelzési módszerei A fehérjék nagy molekulatömegű, aminosavakból peptidkötésekkel felépített makromolekulák, a sejtek szervesanyag-állományának jelentős részét képezik Aminósavak Az élő szervezet legelterjedtebb makromolekulái a fehérjék. A fehérjék aminosavakból peptidkötésekkel -CO-NHépülnek fel

5 33 Fehérjék jelölése Izotópjelölés jelentősége: szerkezetvizsgálat, funkcióvizsgálat, kimutatásuk, lokalizálásuk, kvantitatív meghatározásuk, Fehérjeszintézis in vivo mérése, tumordiagnosztika, terápia, receptorrendszer vizsgálata, peptidek, hormonok, antitestet jelölése stb. Kutatás, diagnosztika, terápia Jelzéseknél kérdés: Mi a jelző atom? Hol történik a jelzés a fehérjén? Melyek a kémiailag, biológiailag aktív csoportok a fehérjében az adott vizsgálatnál? 34 A fehérjék izotóppal történő jelöléseknél kívánalmak - a jelölés nagy érzékenységet biztosítson (nagy fajlagos aktivitás) - detektálási lehetőség biztosítva legyen - a használt radionuklid felezési ideje optimális legyen - a jelzés stabilitása megfelelő legyen - a jelzés során a biológiai aktivitás ne károsodjon Melyik funkcionális csoportot kívánjuk jelezni, hogy a kémiai, biológiai, immunológia stb. tulajdonságaik ne változzanak meg????? Jelzett funkcionális csoport szerinti jelölések: Tirozin- 125 I Tirozin csoportok jódozása ( 125 I, 131 I) NaI-ból oxidálószer segítségével reaktív I + (H2O) oxidált jód gyök állítható elő, amivel a fehérjék, peptidek tirozin csoportjai jelölhetők. Amino-csoport- 14 C, 3 H Oxidálószerek: SH csoport- 14 C, 3 H Chloramin T- fehérjék denaturálódhatnak COO - H 3N + C H CH Iodogén- lassúbb reakcióidő, kontrolálható 2 Enzimatikus jódozás: legkíméletesebb Komplexképző fémionok: 99m Tc, 111 In (antitestek) Peptidek, aminosavak jelölése PET izotópokkal 37 (H 2 O 2 jelenlétében, laktoperoxidáz enzim) A be nem épült jódtól redukálással szabadulunk meg, tisztítás, gélszűrés, HPLC. Jódozással megváltozhat a fehérje molekula biológiai aktivitása! OH

6 kaliumborohidrid 3-(p-Hydroxyphenyl)-propionicsav-N-hydroxysuccinimidyl észter Immunoradiometric assay IRMA 1. A mérendő anyag ellen termeltetett antitestet szilárd felületen rögzítjük. 2. Hozzáadjuk a mintát 3. A reakcióidő eltelte után a nem kötött antitestet lemossuk. 4. Egy másik az előző antitest ellen termeltetett radioaktív izotóppal jelölt antitestet adunk a mintához. 5. A reakcióidő eltelte után a nem kötött másodlagos antitestet lemossuk. 6. Megmérjük a minták radioaktivitását. A módszer nm-nál alacsonyabb koncentrációk mérését is lehetővé tevő eljárás család High-grade tumor In vivo humán PET diagnosztika Low-grade tumor 18FDG 11-CMETIONIN FDG METIONIN 45 46