Agrobacterium vitis rezisztencia kialakítása az iaam szekvencia segítségével DIPLOMAMUNKA készítette: GALAMBOS ANIKÓ biológus hallgató témavezető: Dr. PUTNOKY PÉTER PTE TTK Biológiai Intézet Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék PÉCS, 2007.
2 TARTALOMJEGYZÉK 1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 3 1.1. Egy természetes génsebész, az Agrobacterium 3 1.1.1. Ti-plazmid alapú növényi transzformációs vektorok 5 1.2. A géncsendesítés 6 1.3. Agrobacterium rezisztencia kialakítása géncsendesítéssel 7 1.3.1. Az iaam szekvenciák különbözősége 8 2. CÉLKITŰZÉSEK 10 3. ANYAGOK és MÓDSZEREK 11 3.1. Alkalmazott baktériumtörzsek és plazmidok 11 3.2. A baktériumok növesztése, tárolása 12 3.3. A baktériumok keresztezése 12 3.4. Összes DNS izolálás 13 3.5. Plazmid DNS izolálása 13 3.6. PCR reakciók 14 3.7. Agaróz gélelektroforézis és DNS-fragment izolálás 14 3.8. In vitro DNS-technikák 15 3.9. Transzformálás 16 3.10. DNS-szekvencia meghatározása 16 3.11. Kalanchoe fertőzési teszt 16 3.12. A pbs888 létrehozása 17 3.13. Mutáció létrehozása az iaam(s4) génben 17 4. EREDMÉNYEK és MEGVITATÁSUK 18 4.1. Az A. vitis S4 iaam szekvencia izolálása 18 4.2. Egy speciális klónozó vektor elkészítése 19 4.3. Az iaamc58- iaams4 fúzió létrehozása 20 4.4. Az iaams4 szekvenciát tartalmazó Agrobacterium vektor létrehozása 20 4.5. A. vitis S4 iaam mutáns baktérium létrehozása 21 4.6. Kontroll vizsgálatok kalanchoe növényeken 23 4.7. Kettős fertőzéses tesztek kalanchoe növényeken 23 5. ÖSSZEFOGLALÁS 27 6. IRODALMI HIVATKOZÁSOK 28 7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 31
3 1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS A szőlő egyik jelentős gazdasági növényünk, mind maga a gyümölcs, mind pedig a borfogyasztás szempontjából. Sajnos igen sok betegségre fogékony, így az Agrobacterium fertőzésre is. Földünkön mindenhol előforduló betegség a szőlő agrobaktériumos vesszőgolyvája, amely az intenzív művelésű ültetvényekben súlyos terméskiesést is okozhat. A fertőzött növények gyengén fejlődnek, levélzetük sárgászöld vagy vöröses, a levelek olykor kanalasodók. A talaj feletti részeken karfiolszerű, egyenetlen felületű tumorok képződnek (10). A betegséggel szemben ellenálló, Agrobacterium rezisztens fajták előállítása így nagy gazdasági jelentőséggel bír. A keresztezéses szőlőnemesítés rendkívül idő- és költségigényes feladat, és egy új szőlőfajta nemesítése akár több évtizedes munkát is igényelhet. Rezisztens növények létrehozására, a természetes rezisztenciagének klasszikus módszerekkel történő bekeresztezése mellett, a molekuláris biológiai módszerek bővülése és alkalmazása nyújt időtakarékos és hatékony lehetőséget (26). A gyakorlatban az agrobaktérium rezisztencia kialakításának egyik módja lehet olyan transzgenikus szőlőnövények létrehozása, melyekben a patogén baktérium által bejuttatott gének megnyilvánulása gátolt. A transzgénikus növények létrehozásához éppen az Agrobacterium által természetes úton megvalósított transzformáció megismerése szolgáltatott hatékony eszközöket. 1.1. Egy természetes génsebész, az Agrobacterium A talajbaktériumok által okozott betegség, a gyökérgolyvásodás molekuláris alapjainak megismerése vezetett az egyik leghatékonyabb és kiterjedten használt növényi transzformációs rendszer kifejlesztéséhez (2, 8). Az Agrobacterium fajok egyedülállóan rendelkeznek azzal a képességgel, hogy a növényi genomba géneket integráljanak. A Rhizobiaceae családba tartozó, Gram-negatív, patogén talajbaktériumok az Agrobacterium nemzetség képviselői, az A. tumefaciens, az A. vitis, az A. rhizogenes és az A. rubi fajok. A kétszikű növényeket sebzési helyeken fertőzik, majd a fertőzött növényeken tumorfejlődést illetve hajszálgyökeresedést okoznak. Az A. rhizogenes főleg almatermésű gyümölcsfajokat, míg az A. rubi a Rubus fajokat betegíti. Az A. tumefaciens számos növényfajon indukál tumorképződést ( crown gall, (6)), az A. vitis pedig a szőlőn idéz elő vesszőgolyvát (10).
4 A tumorszövetek in vitro hormonmentes táptalajon növekedésre képesek (3) és opinokat termelnek (7), szemben az egészséges növényi szövetekkel. A tumorképződésért és az opinszintézisért az Agrobacterium sejtekben található Ti-plazmid felelős (34). DNS hibridizációval igazolták, hogy a baktériumfertőzés során a Ti-plazmid egy része, az ún. transzfer vagy T-DNS átkerül a növényi sejtekbe, és stabilan integrálódik a sejtmag DNSállományába. Ezek a kísérleti megfigyelések nagyon fontosak voltak, mert fényt derítettek egy természetes génátviteli mechanizmusra, amelynek során bakteriális gének épülnek be a fertőzött növények sejtmagi örökítőanyagába. A folyamatról számos összefoglaló cikk jelent meg az elmúlt években (2, 5, 8, 12, 31, 32). A T-DNS hozzávetőlegesen 21-23 kilobázis hosszúságú, amelyen a tumoros növekedésért és az opinszintézisért felelős gének lokalizálhatók, és amelyet két rövid, 25 bázispár hosszúságú ismétlődő határszekvencia (left border: LB, right border: RB) vesz körül. A tumoros növekedésért felelős gének növényi növekedési hormonok bioszintéziséért felelős fehérjéket kódolnak, melyek túltermelése felborítja a normál növényi sejtosztódást és differenciációt. Az egyik növekedési hormon az auxin (indol-3-ecetsav, IAA), melynek bioszintéziséért két gén, az iaam és az iaah által kódolt enzim, a triptofán-monooxigenáz és az indol-3-acetamid hidroláz a felelős. A másik hormon a citokinin (zeatin), amelynek képződésében az ipt gén által kódolt AMP-izopentenil transzferáz enzim vesz részt. Az enzim által létrehozott vegyületet (izopentenil-amp) a növény által kódolt enzimek gyorsan tovább alakítják zeatinná (1. ábra). A Ti-plazmidon végzett deléciós analízis igazolta, hogy a két T-DNS határoló-szakasz (LB, RB) között található gének nem befolyásolják a fertőzőképességet, a virulenciát, az átvitelt és az integrációt (24). Az átvitel folyamatában a Ti-plazmidon lévő virulencia (vira - virg) régiónak, valamint a kromoszómális virulencia (chva, chvb) régiónak van meghatározó szerepe. A chv gének folyamatosan, úgynevezett konstitutív módon nyilvánulnak meg és termékeik a baktérium sejtfalhoz tapadását okozzák, a vir gének expressziója viszont szigorúan szabályozott, és aktiválódásuk indítja el az átviteli mechanizmust. A sérült növényi szövetekből kiszabaduló fenol vegyületek, mint például az acetosziringon, indukálják ezen gének átírását. Mivel a T-DNS jobb-, és baloldali határszakaszai közötti szekvenciák a T-DNS integráció szempontjából nem meghatározóak, ezért az Agrobacterium Ti-plazmid T-DNS része alkalmas arra, hogy vektorként felhasználva idegen géneket építsünk bele és juttassunk be általa magasabbrendű növényekbe (13, 27).
5 A növényi genomba épült mesterséges T-DNS a továbbiakban növényi szekvenciaként funkcionál. Ezek az alapvető felismerések vezettek el a különböző növényi transzformációs vektorrendszerek kidolgozásához. 1.ábra: Az auxin és citokinin bioszintézisének útvonala Agrobacterium transzformálta növényi sejtekben. (Escobar és társai (8) összefoglalójának módosított ábrája.). (a) auxin (b) citokinin bioszintézis. 1.1.1. Ti-plazmid alapú növényi transzformációs vektorok A DNS átvitele akkor is sikeres, ha a virulencia gének és a T-DNS két különböző plazmidon helyezkedik el az Agrobacterium sejten belül (14). Tehát a virulencia gének transz helyzetben is képesek a T-DNS mobilizációjához szükséges funkciók ellátására. A két funkció szétválasztása nyomán kifejlesztett növényi vektorrendszerek a kettős, ún. bináris vektorrendszerek. A T-DNS átvitelét segítő plazmid ( vir helper plazmid ) általában olyan Ti-plazmid származék, amelyből a határszekvenciákkal együtt eltávolítják a teljes T-régiót. Számos helper plazmidot fejlesztettek ki napjainkra (16). Lefegyverzett vagy "disarmed" vektoroknak is nevezik azokat a nem patogén Tiplazmidokat, amelyekből részben vagy egészben hiányzik a T-DNS régió.
6 A másik, a klónozó plazmid ( bináris vektor ), egy széles gazdaspecifitású vektor, mind E.coli, mind A. tumefaciens háttérben képes replikálódni, konjugációval könnyen átvihető az egyik baktériumból a másikba. Az ilyen klónozó vektorok tartalmazzák a T-DNS határszekvenciáit, ezen belül a növényi szelekciós markergéneket, mint pl. kanamicin-, higromicin-, vagy herbicid rezisztencia (11, 33), a klónozásra alkalmas helyet, ezen kívül a plazmid replikációjáért és stabilitásáért felelős géneket, valamint a bakteriális szelekciós markert (pl. kanamicin, gentamicin rezisztencia). Ezek az integratív vektorrendszerek már transzformáns növények létrehozását is lehetővé tették, mivel a transzformált növényi sejtekből, a megfelelő hormonok alkalmazásával, regeneráltatható a teljes, transzgént hordozó növény. Mindezek ismeretében az Agrobacterium rezisztencia kialakításában is speciálisan alkalmazhatók a géncsendesítés módszerei. 1.2. A géncsendesítés A géncsendesítés (posttranscriptional gene silencing - PTGS, RNS interferencia) egy napjainkban megismert mechanizmus, amely eukarióta szervezetekben gének expresszióját képes módosítani (1, 23, 29). A folyamat során duplaszálú RNS (double stranded, dsrns) indukálja a géncsendesítést. A Dicer nevű enzim a dsrns molekulát a sejtben rövid, jellegzetes struktúrájú és méretű, hozzávetőlegesen 21 nukleotid hosszúságú darabokra vágja (small interfering RNS, sirns). Ezekhez a rövid sirns oligonukleotidokhoz kötődik az RNS indukálta géncsendesítő komplex (RNA induced silencing complex, RISC), ami a dsrns két szála közül, valamilyen felismerő mechanizmus alapján, kiválasztja az egyiket. Ez lesz a vezető szál, a másik pedig degradálódik. A kiválasztott szál segítségével a komplex szekvencia specifikusan ismeri fel az mrns komplementer részét, majd azt a komplementer régió közepén hasítja. Ennek következtében az mrns degradálódik, így nem képződhet róla fehérje. A dsrns termelésére és sejtekbe juttatására sokféle módszert dolgoztak már ki. Az RNS vírusok vagy az agrobaktérium transzformációs rendszer hasznosítása széles körben elterjedtek. A T-DNS transzformációs módszer esetében a génnek (vagy a gén egy részének) egy normál és egy inverz másolatát tartalmazó, erős promóterrel rendelkező vektor bejuttatásával a transzformált sejtben termeltetjük a dsrns molekulát. Munkánk kiindulási pontjaként egy olyan kísérlet szolgált, melyben sikeresen hoztak létre agrobaktériummal szemben rezisztens növényeket RNS interferencia segítségével.
7 1.3. Agrobacterium rezisztencia kialakítása géncsendesítéssel A Ti-plazmidon lévő ipt és iaam (vagy iaah) gének inaktivációja megszünteti a tumorképződést. A talajban előforduló fertőző Agrobacterium törzsekben nem lehet e géneket elrontani, de meg lehet akadályozni azok működését a fertőzött, transzformált növényi sejtekben. A T-DNS bejutása után, ahogy a fenti fejezetek is bemutatták, ezek a gének növényi génként működnek, így a hormon bioszintézis transzgének működésének megakadályozására alkalmas eszköz lehet a géncsendesítés módszere. Ezt a módszert már eredményesen alkalmazták különböző, gyökérgolyvásodással szemben ellenálló, rezisztens növények létrehozására. Munkánkhoz kiindulásként Lee és társai által végzett kísérletek eredményeit használtuk fel (21). Létrehoztak több génkonstrukciót, az A. tumefaciens c58 törzsből származó iaam és ipt szekvenciák segítségével, melyek készítésénél figyelembe vették, hogy az idő előtti stop kodont tartalmazó RNS molekulák destabilizáló hatása erősebb. Ezért az elrontani kívánt két gén esetében a harmadik kodont stop kodonra változtatták és egyben egy frame shift mutációt is létrehoztak. Ehhez az iaam génnek csak az első 1797 bázispár hosszú kódoló részét, az ipt génnek pedig a teljes kódoló szekvenciáját felhasználták. A két génből létrehoztak egy hibrid génkonstrukciót úgy, hogy az ipt gén BamHI helyére beépítették az iaam kódoló részt. Az így elkészített konstrukciót egy növényi transzformációs vektorba építették, melyben a CaMV 35S promoterről egy irányban szensz RNS íródik át. A teszteléshez az ipt-stop, az iaam-stop, illetve a fúzionált iaam-ipt konstrukciót tartalmazó transzgenikus dohány növényeket készítettek. A konstrukció, különösen az iaam gén esetében, hatásosan működött és akadályozta a tumorképződést. Az RNS hibridizációs kísérletekből kiderült, hogy az eredetileg egyszálú RNS átírására alkalmas vektor esetében a nopalin szintáz promoteréről átíródott az antiszensz RNS is, így duplaszálú RNS is képződhetett, melyről ismert, hogy nagyobb mértékben aktiválja a géncsendesítés mechanizmusát. Ezt a jelenséget kihasználandó, készítettek egy olyan konstrukciót is, melyben a két gént egymás után építették, majd ezt két, egymással szemben elhelyezkedő, szensz és antiszensz RNS átírását biztosító promoter közé helyezték és növényi transzformációs vektorba juttatták. Ez a pjp17 vektorkonstrukció (2. ábra), amelynek hatásosságát koinokulációs kísérletek segítségével bizonyították.
8 2. ábra: A pjp17 vektorkonstrukció T-DNS része (21). LB, RB: jobb és baloldali határoló régiók, nptii: neomicin foszfotranszferáz (Km R ) gén, nos3 és nos5 nopalin szintáz 3 és 5 szekvencia, pcmv és pfmv növényi promoterek. A NotI hasítóhelyek által kijelölt fragmentet klónoztuk át a munka során a pbs888 vektorba. Az ábrán jelöltük a későbbi változtatásokhoz felhasznált SalI és BamHI enzimek hasítóhelyeit is. A koinokulációs teszt során a pjp17 konstrukciót tartalmazó törzset és a patogén baktériumot összekeverve fertőztek kalanchoe növényeket vagy burgonya korongokat. A teszt lényege, hogy a géncsendesítésre tervezett konstrukció és a patogén T-DNS egyaránt bejut a fertőzött sejtekbe, és így a védő vektor tumorképzést megakadályozó hatása, transzgenikus növények létrehozása nélkül, azonnal vizsgálható. Mivel nem minden sejtbe jut be mindkét vektor, tumorképződés is megfigyelhető, csak csökkent mértékben. Lee és társai kísérleteikben azt is bizonyították, hogy a géncsendesítés létrejöttéhez szükség van a gén transzlációs start szekvenciájára is, e nélkül hiába tartalmazza a konstrukció akár a teljes gén 90%-át, a silencing nem jön létre (21). A géncsendesítés abban az esetben is hatástalan, ha nincs megfelelő szekvencia azonosság a vektorral bejuttatott gén és a patogén Agrobacterium T-DNS részén elhelyezkedő gén között, hiszen a folyamat alapja a szekvencia specifikusan történő felismerés. Ebből következik, hogy ez a módszer nem általánosítható minden Agrobacterium törzsre, mert az iaam szekvenciák nagyon eltérőek, még a közeli rokon törzsek esetében is. 1.3.1. Az iaam szekvenciák különbözősége Számítógépes elemzés segítségével összehasonlítottuk néhány Agrobacterium törzs iaam génjének szekvenciáját illetve készítettünk egy rokonsági viszonyokat ábrázoló törzsfát is (3. ábra). Jól látható, hogy még a közeli rokon törzsek esetében is alig található bennük erősen konzerválódott rész (4. ábra). A legnagyobb eltérés az A. tumefaciens c58 és A. vitis S4 törzsek között van, tehát rokonsági kapcsolatban is ezek állnak egymástól legmesszebb.
9 Nagy valószínűséggel feltételezhető, hogy a géncsendesítés csupán egyetlen törzsre specifikus szekvenciával a különböző törzsek esetében - éppen a folyamat szekvencia specifikussága miatt - nem működik. Így feltehetően a pjp17 vektorkonstrukció is hatástalan az A. vitis S4 és más, akár közeli rokon törzsekkel szemben. Ezek alapján fogalmaztuk meg célkitűzéseinket. 3.ábra: A különböző Agrobacterium törzsek iaam DNS-szekvenciáinak összehasonlításából származó törzsfa. At: A tumefaciens törzsek, Av: A. vitis törzsek. 4. ábra: Részlet a különböző Agrobacterium törzsek iaam DNS-szekvenciáinak összehasonlításából. A szürke háttér a konszenzus (többségi) szekvenciától eltérő bázist jelzi. At: A tumefaciens törzsek, Av: A. vitis törzsek
10 2. CÉLKITŰZÉSEK Az előzőek alapján és ismeretében célul tűztük ki olyan konstrukció készítését és előzetes tesztelését, amivel létre tudunk hozni A. vitis S4 törzzsel szemben ellenállóbb vagy rezisztens szőlő növényeket. Ennek érdekében terveztük: - az A. vitis S4 iaam szekvencia izolálását - az iaam(s4) szekvencia pjp17 bináris vektorba való beépítését - az elkészített új vektor hatásosságának tesztelését kalanchoe és transzgenikus dohány növényeken A teszteredmények függvényében távlati céljaink között szerepel transzgenikus szőlő növények létrehozása és Agrobacterium törzsekkel szembeni ellenálló képességük jellemzése.
11 3. ANYAGOK és MÓDSZEREK 3.1. Alkalmazott baktériumtörzsek és plazmidok A munkánk során használt baktériumok és plazmidok jellemzőit az 1. táblázat tartalmazza. 1. táblázat: Alkalmazott baktériumtörzsek és plazmidok ELNEVEZÉS JELLEMZŐK REFERENCIA Escherichia coli törzsek: XL1-blue reca1 enda1 gyra96 thi-1 hsdr17 supe4 rela1 (4) lacz M15 Tc R PP211 JF1754 (prk2013) Km R, pjp konjugációhoz helper törzs Putnoky Péter PP4304 E. coli pcu101 Cm R - ppag160 konjugációhoz helper törzs Papp Péter. Agrobacterium törzsek: C58 A.tumefaciens c58 vad típus Szegedi Ernő S4 A. vitis S4 vad típus Szegedi Ernő MOG301 disarmed helper törzs T-DNS transzferhez, Rif R, Spc R (16) EHA101 disarmed helper törzs T-DNS transzferhez Km R, Nal R (17) GV3170 A. tumefaciens c58 "shooter" (aux-) mutáns (15) GV3297 A. tumefaciens c58 "rooter" (cyt-) mutáns (20) GA 4424 MOG301 pjp21 Rif R, Gm R, Spc R ez a munka GA 4425 MOG301 pjp17 Rif R, Gm R, Spc R ez a munka GA 4426 MOG301 pjp17s4 Rif R, Gm R, Spc R ez a munka GA 4427 EHA101 pjp21 Km R, Gm R ez a munka GA 4428 EHA101 pjp17 Km R, Gm R ez a munka GA 4429 EHA101 pjp17s4 Km R, Gm R ez a munka Plazmidok: pbs pbluescript II SK (+) klónozó vektor Amp R STRATAGENE pcu101 Cm R helper plazmid - ppag160 (30) prk2013 helper plazmid RK2 alapú vektorokhoz, Km R (9) ppag160 szűk gazdaspecifitású konjugatív vektor, Spc R /Str R Papp Péter pjp21 bináris vektor, CaMV, FMV promoterek, nptii gén, (21) pjp17 pjp21::iaamc58-stop, ipt-c58,(2. ábra) (21) pbs888 pbs KpnI-SacI helyen új oligo, (6. ábra) ez a munka pga4401 pbs EcoRV::iaaMS4 PCR fragment, (7. ábra) ez a munka pga4415 pbs888 NotI::iaaMc58-STOP, ipt-c58, (7. ábra) ez a munka pga4416 pga4415 SalI-BamHI::iaaMS4 pga4401, (7. ábra) ez a munka pjp17-s4 pjp17 NotI::NotI fragment pga4416, (7. ábra) ez a munka (iaamc58-stop, iaams4, ipt-c58 szekvenciák) pga4443 pga4401 iaams4 PaeI::Km R gén, (8. ábra) ez a munka pga4445 ppag160:: EcoRI-KpnI iaams4::km R fragment, (8. ábra) ez a munka
12 3.2. A baktériumok növesztése, tárolása Az Agrobacterium törzseket 28 o C-on TA (25) táptalajon, az E. coli törzseket pedig 37 o C- on LB (28) tápközegben növesztettük. A táptalajok a megfelelő antibiotikumot a 2. táblázatban leírtak szerint tartalmazták. Táptalaj készítésekor a tápoldatokat 1,5% agarózzal egészítettük ki. A baktérium törzseket 15 %-os glicerines TA-ban -20 o C-on lefagyasztva tároljuk. 2. táblázat: Az alkalmazott antibiotikumok és koncentrációjuk (µg/ml) Antibiotikum Rövidítés E. coli Agrobacterium törzsek ampicillin Amp 100 - rifampicin Rif 40 40 kanamicin Km 30 50 tetraciklin Tc 15 - spectinomicin Spc 10 100 gentamicin Gm 10 50 3.3. A baktériumok keresztezése A pjp plazmid származékokat a prk2013, a ppag származékokat pedig a pcu101 helper plazmidot tartalmazó baktériumtörzs segítségével, konjugációval juttattuk be E. coli sejtekből a megfelelő Agrobacterium törzsbe. Ez a módszer a háromszülős keresztezés, mely magában foglalja a donor és a recipiens törzset, valamint a mobilizáló plazmidot tartalmazó, helper törzset. A keresztezni kívánt donor és recipiens baktériumokat és a helper törzset felnövesztettük a megfelelő antibiotikumokat tartalmazó komplett táptalajon. A keresztezést 0,9%-os NaCloldatban felszuszpendált baktériumokkal végeztük, TA lemezen összecseppentve őket. Éjszakán át, 28 C-on történő inkubálás után a felnőtt baktériumokat 0,9%-os NaCl-oldatban ismét felszuszpendáltuk, majd különböző hígításokban szelektív lemezekre szélesztettünk belőlük 50 µl szuszpenziót. A 48 óra elteltével felnőtt telepek közül a kiválasztottakat legalább két lépésben tisztítottuk tovább szelektív lemezen, mielőtt tovább dolgoztunk velük.
13 3.4. Összes DNS izolálás Meade és társai módosított eljárását alkalmaztuk (22). 1,5 ml éjszakán át növesztett baktériumkultúrából a sejteket centrifugálással ülepítettük, és 300 µl TE oldatban (50 mm TrisHCL, 20 mm EDTA, ph 8,0) szuszpendáltuk. 100 µl 5% SDS-t tartalmazó TE oldatot és 100 µl pronáz oldatot (2,5 mg/ml pronáz TE oldatban) adtunk hozzá. 1-3 órás 37 C-os inkubálás után 500 µl TE-vel telített fenollal ráztuk össze, majd centrifugálás után a felülúszót új Eppendorf csőbe pipettáztuk át. 500 µl fenol:kloroform oldattal (25 térfogat fenol : 24 térfogat kloroform : 1 térfogat izoamil-alkohol) ráztuk össze. Centrifugálás után a felülúszóhoz 500 µl kloroform oldatot (24 térfogat kloroform : 1 térfogat izoamil-alkohol) adtunk, összeráztuk és centrifugáltuk. A vizes fázisból a DNS-t 1000 µl etanollal kicsaptuk. A kocsonyás csapadékot új, 500µl 70%-os etanol tartalmú, Eppendorf csőbe tettük át pipettahegy segítségével. Centrifugálás után a felülúszót leöntve, szárítást követően, a DNS csapadékot 100 µl desztillált vízben oldottuk fel. 3.5. Plazmid DNS izolálása A plazmid DNS-t 3-3 ml LB tápfolyadékban, a megfelelő antibiotikum jelenlétében éjszakán át növesztett E. coli sejtekből Ish-Horowicz és Burke (19) módszerének módosított változata szerint preparáltuk. 1,5 ml kultúrát Eppendorf-csõbe tettünk és a sejteket centrifugálással leülepítettük. A tisztítás során minden centrifugálás 5 percig tartott, 12000 fordulatszámmal, szobahőmérsékleten. A sejteket 100 µl TEG oldatban (25 mm TrisHCl, 10 mm EDTA, 50 mm glükóz ph 8,0) felszuszpendáltuk. A feltárást 200 µl NS oldat (0,2N NaOH, 1% SDS) hozzáadásával végeztük. A mintákat 5 percig 0 C-on inkubáltuk, majd 160 µl jéghideg Na-acetát oldatot (3M, ph 4,8) adtunk hozzájuk és az oldatot erõsen összeráztuk. 5 perc 0 C inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk, és a felülúszóból 320 µl izopropanollal kicsaptuk a plazmid DNS-t. 20 perc -20 C inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk, szárítottuk, és 100 µl Tris.acetát pufferben (50 mm Tris, 100 mm Na-acetát, ph 8,0) feloldottuk. Ezután 200 µl etanollal a DNS-t ismét kicsaptuk, centrifugáltuk, szárítottuk az előzőekhez hasonló módon, majd 30-50 µl RNáz tartalmú desztillált vízben (100 µg/ml forralt RNázA) oldottuk fel. Restrikciós emésztésekhez 1-10 µl preparátumot használtunk fel, az adott plazmid kópiaszámának függvényében. A DNS-szekvencia meghatározáshoz a preparátumokat további lépésekben tisztítottuk. Az előzőek szerint készített 50 µl plazmid preparátumhoz 0,1 térfogat 10% SDS oldatot és 1 térfogat 0 o C-os 7,5 M NH 4 -acetát oldatot adtunk és 15 percig inkubáltuk jégen. Ezután a csapadékot lecentrifugáltuk, és a felülúszóból 0,6 térfogat izopropanol hozzáadásával
14 kicsaptuk a plazmid DNS-t (-20 C, 20 perc inkubálás). Centrifugálás, etanolos mosás, szárítás után a tisztított DNS-t 40 µl desztillált vízben vettük fel. A preparátumok minőségét agaróz gélelektroforézis segítségével ellenőriztük általában 1 µl minta felhasználásával. 3.6. PCR reakciók Az A. vitis S4 törzs iaam génjének egy 800 bázispáros szekvenciáját sokszoroztuk fel az iaams45 és iaams43 primerek és a PP-iaaMS4 program segítségével (3. és 4. táblázat, 5. ábra). A klónozás sikerességének javítása érdekében a Taq DNS-polimerázzal kapott termék egytized részét ugyanezen primereket, és a jobb hatásfokkal tompa végeket létrehozó Pfu DNS-polimerázt, valamint a PP-4Pfu PCR-programot alkalmazva 4 ciklusban megsokszoroztuk. 3. táblázat: A munkában felhasznált oligonukleotidok Oligonukleotidok neve Nukleotidszekvencia Tm ( o C) iaams45 cgcgtccccgtttacacta 53,6 iaams43 cgagatcgcgcttcaagat 52,9 888fw ccctgcaggcggccgcacatttaaatcggtac 69,1 888rev cgatttaaatgtgcggccgcctgcagggagct 70,4 4. táblázat: Az alkalmazott PCR programok PP-iaaMS4: PP-4Pfu: 1. 2 min. 94 o C 1. 2 min. 94 o C 2. 30 sec. 94 o C 2. 30 sec. 94 o C 3. 30 sec. 56 o C 3. 30 sec. 56 o C 4. 40 sec. 72 o C 4. 40 sec. 72 o C 5. goto 2. x33 5. goto 2. x 4 6. 2 min. 72 o C 6. 2 min. 72 o C 7. end 7. end 3.7. Agaróz gélelektroforézis és DNS-fragment izolálás A DNS-minták elválasztására agaróz gélt használtunk, követve az általános módszertani leírásokat (28). Az izolálni kívánt fragment elé az agaróz gélbe Whatman DE 81 papírdarabot helyeztünk és 15 perc (60V) elektroforézis után azt a gélből eltávolítottuk. A fragmentet
15 tartalmazó papírt Eppendorf csőbe tettük, és a DNS-t kétszer 50 µl 1 M NaCl oldattal eluáltuk. A DNS kicsapása 0,1 térfogat 3M Na-acetát oldat (ph 7,0) és 2 térfogat 96%-os etilalkohol hozzáadásával történt. 20 perces -20 C-os inkubálás után lecentrifugáltuk, szárítottuk és 20 µl desztillált vízben oldottuk fel a csapadékot. 3.8. In vitro DNS-technikák (restrikciós emésztések, foszfatáz és T4 polimeráz kezelés, ligálási reakciók) A DNS-minták restrikciós emésztését Sambrook és mtsai szerint végeztük (28) a FERMENTAS cég termékeit használva. Kettős emésztés esetén, ha az enzimek nem vágtak egy pufferben, az első enzimreakció után a minta DNS tartalmát kicsaptuk 0,1 térfogat 3M Naacetát (ph:7,0) és 2 térfogat etanol (96%) hozzáadásával. Minimum 20 percig inkubáltuk - 20 C-on, majd 5 perc centrifugálás és 70%-os etanolos mosás, szárítás után 30µl steril desztillált vízbe vettük fel. Ez után végeztük el a második enzimreakciót. A vektor defoszforilálására és így az inszert nélküli, önmagában való ligálás megakadályozására néhány esetben alkalikus foszfatáz kezelést alkalmaztunk (Shrimp Alkaline Phosphatase, FERMENTAS), a kitben megadottak szerint. Más esetben kihasználtuk azt, hogy a kétféle restrikciós endonukleázzal megvágott, egymással kapcsolódni nem képes túlnyúló egyszálú végekkel rendelkező vektor csak a megfelelő enzimekkel létrehozott DNSfragment kapcsolódása esetén hoz létre replikálódni képes származékot (KpnI-SacI és SalI- BamHI klónozások). A polimeráz kezelést (tompa végek kialakítása) 20µl végtérfogatban, 50 ng vektor és fragment DNS, 2 µl 10x rekció puffer (FERMENTAS), 1 µl 2mM dntp felhasználásával készített elegyben végeztük el, 0,01 U T4 polimeráz enzim (FERMENTAS) hozzáadásával. Az elegyet 10-15 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd 10 percig 75 C-ra melegítettük, az enzim inaktiválása érdekében. Ezután a minta DNS-tartalmát 0,1 térfogat 3M Na-acetát (ph 7,0) és 2 térfogat etilalkohol (96%) hozzáadásával kicsaptuk, és minimum 20 percig inkubáltuk -20 C-on, majd 5 perc centrifugálás és 70%-os etilalkoholos mosás-szárítás után 10 µl desztillált vízbe vettük fel. Ezután végeztük el a ligálási reakciót. A ligálási reakciókat 20-25 µl térfogatban, 50-100 ng vektor és fragment DNS, és 1x T4 DNS ligáz puffer (40 mm TrisHCL, 10 mm MgCl 2, 10 mm DTT, 0,5 mm ATP, ph 7,8) segítségével végeztük el. A reakciókhoz ragadós végek esetén 0,01 U, tompa végek összekapcsolása esetén 0,5 U T4 DNS ligáz enzimet (FERMENTAS) használtunk. Az elegyet legalább 2 órán át, szobahőmérsékleten (22 o C) inkubáltuk a transzformáció előtt.
16 3.9. Transzformálás Egy transzformáláshoz 100 µl kompetens sejtet használtunk fel. A sejteket -80 C-ról jégre tettük, és 15 perc elteltével hozzáadtuk a transzformációhoz használt DNS-t. 30 percig jégen inkubáltuk, majd hősokkot alkalmaztunk (3 perc, 37 C). Ez után 400 µl LB tápfolyadékot adtunk a sejtekhez. Egy óra 37 C-os inkubáció után a sejteket szelektív táptalajra kentük. pbluescript használata esetén 20 ml táptalajba 100 µl ampicillin (25 µg/ml), 40 µl IPTG (100 mm) és 40 µl X-gal oldatot (2%, dimetil-formamidban) tettünk, és a transzformánsok közül a fehér telepeket választottuk ki további ellenőrzésre. A kompetens sejteket általában az XL1-blue törzsből készítettük, szobahőmérsékleten OD 600 =0,5 denzitásig felnövesztett sejtekből, melyeket többszöri mosás, centrifugálás után tízszeresre koncentráltunk és 400 µl-es adagokban, 7% dimetil-szulfoxid jelenlétében -80 Cra lefagyasztottunk (18). 3.10. DNS-szekvencia meghatározása A munkánk során tisztított plazmid DNS minták és PCR fragmentumok nukleotid szekvenciáját a megfelelő oligonukleotidok segítségével a MTA Szegedi Biológiai Központ DNS Szekvenáló Laboratóriumában határozták meg. A részszekvenciákat a Chromas Pro (www.technelysium.com.au/chromaspro.html) program segítségével ellenőriztük, javítottuk és a Lasergene (DNA Star Inc.) program alkalmazásaival illesztettük össze és elemeztük tovább. 3.11. Kalanchoe fertőzési teszt Az agrobaktériumokat TA táptalajon két napig 28 o C-on növesztettük a megfelelő antibiotikumok jelenlétében, majd 0,9%-os NaCl-oldatban szuszpendáltuk fel a kultúrákat, és OD 590 = 1,5 denzitásra állítottuk be a sejtszámot. Koinokulációs kísérletek esetén a védő és a kórokozó baktériumokat 9:1 arányban kevertük össze. A kalanchoe növények (Kalanchoe tubiflora vagy K. daigremontiana) szárát két helyen átszúrtuk, előzetesen a baktérium szuszpenzióba illetve kontroll NaCl-oldatba mártott lándzsatű segítségével. Kezelésenként 3-5 növényt fertőztünk, majd a növényeket növénynevelő kabinban 20 o C-on, 14 óra megvilágítás mellett neveltük. A tumorképződést 4-6 hét elteltével értékeltük ki.
17 3.12. A pbs888 létrehozása A tervezett két oligonukleotidot (888fw és 888rev, 3. táblázat, 6. ábra), TE (10 mm TrisHCL, 1 mm EDTA, ph 7,5) oldatban 200µM koncentrációjúra hígítottuk. Ezután 1-1µl-t, 20 µl végtérfogatú 1x ligáz pufferben PCR készülék segítségével 2 percre 94 o C-ra melegítettük, majd 25 o C-ra hűtöttük, hogy az oligonukleotidok hibridizáljanak. Az így létrehozott, KpnI és SacI ragadós végekkel rendelkező kettős szálú oligonukleotidot KpnI és SacI enzimekkel vágott pbs vektorba ligáltuk, majd az M13 univerzális és reverz primerekkel ellenőriztük a szekvencia helyességét. 3.13. Mutáció létrehozása az iaam(s4) génben A pbs plazmidba klónozott iaam(s4) PCR-fragment (pga4401) közepén található egy egyedi PaeI hasítási hely, ahova egy kanamicin rezisztenciagént kívántunk beépíteni. Egy Tn5 transzpozont tartalmazó plazmidból izoláltuk a gént hordozó HindIII-BamHI fragmentet. Mivel ennek egyszálú, ragadós végei nem ligálhatók össze a PaeI enzim által létrehozott tompa végekkel, ezért először T4-polimeráz kezelést alkalmaztunk, majd ligálás transzformálás és ellenőrző emésztések után kiválasztottunk egy Amp R, Km R klónt (pga4443) a további munkához. A pga4443 plazmidból egy EcoRI-KpnI fragmenten klónoztuk át a mutációt hordozó szekvenciát a ppag160 vektorba. A ppag160 konstrukciót (pga4445) konjugáció útján be lehet juttatni az A. vitis S4 törzsbe. A mutáció beépülésének ellenőrzése PCR segítségével történik, a mutáns fenotípust kalanchoe tesztben ellenőrizzük majd. A munka folyamatban van.
18 4. EREDMÉNYEK és MEGVITATÁSUK Az A. vitis S4 iaam szekvenciát is tartalmazó növényi transzformáló vektor kialakítását a pjp17 vektor (21) átalakítása révén kívántuk megvalósítani úgy, hogy a plazmidon lévő SalI- BamHI fragment helyére (2. ábra) - azaz az iaam(c58) gén 3 vége helyére - illesztjük be az új szekvenciát. Ehhez számos klónozási lépésre és egy új klónozó vektor kialakítására is szükség volt. 4.1. Az A. vitis S4 iaam szekvencia izolálása Két primert terveztünk (iaams45 / iaams43) az A. vitis S4 törzs iaam gén egy 800 bázispár hosszú részletének felsokszorozására. A primer tervezésnél figyelembe vettük, hogy a felsokszorozott szakasz a gén 3 végére essen és, hogy az elején legyen egy SalI hasítóhely, mivel azt a c58 törzs iaam szekvencia SalI helye után kívántuk beépíteni. A szekvencia izolálásához első lépésben összes DNS-t tisztítottunk az S4 törzsből, majd PCR segítségével felsokszoroztuk a megfelelő régiót (5. ábra). 5. ábra: Az iaam S4 PCR fragment klónozása A pbs vektor EcoRV helyére építettük be a PCR fragmentet. A fotón a kontroll (GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus, FERMENTAS) mellett az iaams45 / iaams43 primerekkel felsokszorozott PCR fragment látható. A kapott DNS fragmentet izoláltuk, EcoRV enzimmel linearizált pbluescript (pbs) vektorral ligáltuk, majd XL1-blue sejtekbe transzformáltuk. A továbbiakban plazmid DNS-t izoláltunk a fehér telepekből és a fragment beépülésének ellenőrzésére PCR reakciót is
19 végeztünk. A beépült iaam(s4) szekvencia orientációjának megállapítására SalI emésztést alkalmaztunk. A további munkához megfelelő orientációban beépült inszert esetében egy közel 3600 bázispár hosszú látható fragmentet kapunk, míg a másik orientáció esetén egy közel 700 bp és egy 3100 bp hosszú fragment keletkezett. A helyes orientációban lévő PCR fragmentet SalI és BamHI enzimekkel tudtuk tovább klónozni. A SalI enzim hasítóhelye az izolált fragment elején, a BamHI hasítóhely pedig a vektoron található (5. ábra). 4.2. Egy speciális klónozó vektor elkészítése Az izolált SalI-BamHI fragmentet szerettük volna az A. tumefaciens c58 iaam szekvenciát tartalmazó pjp17 vektorba klónozni. Azonban az átklónozáshoz használt restrikciós enzimek hasítóhelyei többször is előfordultak a vektorkonstrukción, így nem tudtuk a PCR-fragmentet direkt az adott részre beépíteni. Ezért először izolálnunk kellett az iaam(c58)-ipt(c58) szekvenciákat tartalmazó NotI fragmentet, hogy ezen elvégezhessük a tervezett átalakítást. A klónozás céljára alkalmas, a NotI enzim nyolcas felismerési helyét tartalmazó vektor azonban nem állt rendelkezésünkre. Ezért előbb megterveztünk és elkészítettünk egy, a célnak megfelelő speciális vektort a pbs plazmid klónozó helyének átalakításával (6. ábra). 6. ábra: A pbs888 vektor poliklónozó helyének szekvenciája A pbs plazmid SacI és KpnI hasítóhelyei közötti szekvenciát változtattuk meg. Az erre felhasznált két oligonukleotid (888fw és 888rev ) szekvenciája látható az ábra alján, mint összehibridizált, kettős szálú DNS. Két 32 bázis hosszú komplementer oligonukleotidot (888fw, 888rev, 3. táblázat, 6. ábra), szintetizáltattunk, melyeket hibridizálva kaptunk egy SacI és KpnI ragadós végekkel rendelkező duplaszálú DNS-fragmentet. Ez, a NotI enzimen kívül, a SdaI és SwaI enzimek nyolcas felismerési helyeit is tartalmazta. Az oligonukleotid tervezésénél azt is figyelembe
20 vettük, hogy érintetlen maradjon a poliklónozó helyen áthúzódó leolvasási keret, amely a lacz alfa fragmentet kódolja. Így, megfelelő genetikai háttérben (pl. XL1-blue), a létrehozott vektornál is alkalmazható a kék-fehér detektáló rendszer, amely a β-galaktozidáz aktivitás megszűnése révén jelzi az inszert beépülését. A létrehozott oligonukleotidot SacI és KpnI enzimekkel emésztett pbs plazmiddal ligáltuk. Transzformáció után néhány β-galaktozidáz aktivitást mutató (X-gal jelenlétében kék) transzformánsból plazmid DNS preparátumot készítettünk, és ezeket NotI emésztéssel, majd a poliklónozó hely szekvenciájának meghatározásával ellenőriztük. A terveknek megfelelő poliklónozó helyet tartalmazó egyik klónnak a pbs888 nevet adtuk és további kísérleteinkben ezt használtuk. 4.3. Az iaamc58- iaams4 fúzió létrehozása Az elkészült pbs888 vektorba építettük át a pjp17 konstrukció NotI fragmentjét, amely tartalmazza az átalakítani kívánt részt, az iaam-ipt c58 génkonstrukciót (Irodalmi áttekintés, 2. ábra). A kék-fehér tesztnek köszönhetően a NotI fragmentet hordozó transzformánsokat könnyen ki tudtuk válogatni. A fehér telepekből plazmid DNS-t izoláltunk és NotI emésztéssel ellenőriztük, egyben igazoltuk is a fragment beépülését. Ezután SalI és BamHI restrikciós enzimekkel megvágtuk, majd izoláltuk a vektort, és a PCR segítségével izolált A. vitis S4 iaam szekvenciát tartalmazó SalI-BamHI fragmentet kapcsoltuk össze vele (7. ábra). Ily módon sikerült létrehozni a tervezett iaam(c58)-iaam(s4) szekvencia fúziót, amit NotI fragment formájában be kívántunk építeni a T-DNS határoló régiókat tartalmazó Agrobacterium vektorba. 4.4. Az iaams4 szekvenciát tartalmazó Agrobacterium vektor létrehozása Az előzőekben létrehozott iaam(c58)-iaam(s4) és ennek 3 végén néhány száz bázispárnyi ipt szekvenciát hordozó NotI fragmentet izoláltuk, és az eredeti iaam(c58)-ipt(c58) NotI fragmentet már nem tartalmazó pjp17 plazmidba ligáltuk (7. ábra). A konstrukció létrehozását segítette, hogy a NotI enzimmel megvágott vektor DNS-t alkalikus foszfatáz segítségével defoszforiláltuk, hogy megakadályozzuk a beépítendő NotI fragment nélküli vektor önmagában való ligálását. A módosított pjp17 konstrukciókat tartalmazó transzformáns kolóniákból plazmidot izoláltunk és NotI, illetve SalI-BamHI kettős emésztéssel ellenőriztük, hogy valóban a kívánt konstrukciót hordozzák-e. Az elvárásoknak megfelelő restrikciós fragmenteket hordozó egyik plazmidnak a pjp17-s4 nevet adtuk (7. ábra), és ezzel folytattuk a kísérleteket.
21 A tervezett fertőzési kísérletekhez a létrehozott új és a kontroll plazmid konstrukciókat konjugációval juttattuk be a MOG301 és az EHA101 disarmed ( lefegyverzett ) Agrobacterium törzsekbe. Ezek a törzsek nagy hatékonysággal képesek a mesterséges T-DNS konstrukciók különböző növényekbe való transzformálására, mivel a tumort eredményező, vad típusú T-DNS szakaszt eltávolították belőlük és a vir gének expresszióját is a célnak megfelelően változtatták meg. 7. ábra: A pjp17-s4 konstrukció létrehozása LB, RB: jobb és baloldali határoló régiók, nptii: neomicin foszfotranszferáz (Km R ) gén, nos3 és nos5 nopalin szintáz 3 és 5 szekvencia, pcmv és pfmv növényi promoterek A NotI hasítóhelyek által kijelölt fragmentet klónoztuk át a pbs888 vektorba, majd ennek SalI és BamHI hasítóhelyei közé építettük az iaam-s4 szekvenciát hordozó SalI- BamHI fragmentet. További magyarázat a szövegben. 4.5. A. vitis S4 iaam mutáns baktérium létrehozása Ideális esetben, ha a géncsendesítés hatékonyan működik, az iaam gén által kódolt fehérje egyáltalán nem keletkezik a transzformált sejtekben, és így az auxin túltermelés sem valósul meg. A citokinin túltermelés miatt a transzformált sejtekből csak gyökérszerű, képletek nélküli sejtburjánzás jön létre. Ezt a fenotípust az iaam génben hibás A. tumefaciens c58 és A. vitis S4 törzsek segítségével is létre lehet hozni. Mivel az A. vitis S4 iaam mutáns nem állt rendelkezésünkre, ezért kontrollként szerettük volna elkészíteni azt.
22 Az iaam mutációt egy kanamicin rezisztenciagén beépítésével hoztuk létre, ahogy azt az Anyagok és módszerek fejezet (3.13.) és a 8. ábra bemutatja. A transzformánsokat ampicillin és kanamicin antibiotikumok jelenlétében szelektáltuk ki. A Km R gén beépülését EcoRI-KpnI kettős emésztéssel is ellenőriztük, és izoláltuk is a keletkező fragmentet, ami tartalmazta az Km R gén által megszakított iaams4 szekvenciát (8. ábra). Ezt a fragmentet direkt be tudtuk építeni a ppag160 vektor EcoRI-KpnI helyére. Erre azért volt szükség, mert a mutációt hordozó ppag160 származék konjugáció révén bejuttatható agrobaktériumba, és segítségével létrehozható az iaams4::km R mutáns baktérium. A ppag160 plazmid ugyanis nem képes replikálódni agrobaktériumban, így, ha a Km R gén jelenlétére szelektálunk, valójában a homológ rekombinációval létrejövő mutánsokat válogatjuk ki az exkonjugáns agrobaktérium populációból. Az iaams4::km R mutációt hordozó ppag származék segítségével az A. vitis S4 törzs mutáns változatának elkészítése és ellenőrzése jelenleg folyik laboratóriumunkban. 8. ábra: Az iaam-s4 mutáció létrehozásának lépései Az izolált kanamicin rezisztenciagént beépítettük az iaam-s4 fragment PaeI helyére, majd a ppag160 vektor EcoRI-KpnI helyére inszertáltuk. ( ): jelzi a PaeI fragment beépülési helyét, ahol a klónozásra használt egyik enzimnek sincs hasítóhelye, a T4 polimeráz kezelés következtében.
23 4.6. Kontroll vizsgálatok kalanchoe növényeken Ezekben a tesztekben először azt ellenőriztük, hogy a rendelkezésünkre álló, a kísérletekben használni kívánt Agrobacterium törzsek képesek-e a kalanchoe növényeket transzformálni és rajtuk tumort okozni. A vad típusú törzsek tumorképződést és hajszálgyökeresedést kell hogy okozzanak a tesztnövényen, míg a disarmed baktériumok tumor képzésre alkalmatlanok, így az ezekkel való fertőzés során csupán a sebzési hely látható. Az auxin (iaam, iaah) mutáns A. tumefaciens c58 esetében a sebzési helyen gyökér nélküli tumorképződés várható, a citokinin túltermelés miatt. A citokinin (ipt) mutáns esetében pedig csak gyökeresedés várható, az auxin túltermelés következtében (5. táblázat). 5. táblázat: A különböző Agrobacterium törzsek által okozott tumorok Agrobacterium törzsek okozott tumor C58 hajszálgyökeresedő tumor S4 hajszálgyökeresedő tumor C58 aux- hajszálgyökér nélküli tumor C58 cyt- csak hajszálgyökér képződés MOG301 (pjp17) (GA 4425) nincs tumor EHA101 (pjp17) (GA 4426) nincs tumor Előkísérleteinkből kiderült, hogy a vizsgált baktériumok a tumorképzési tesztben alapvetően az elvártaknak megfelelően működnek, kivéve az auxin mutáns törzset, amely egyáltalán nem okozott látható elváltozást (9. ábra). A közeljövőben megpróbálunk egy, az elvárásoknak megfelelő aux- törzset beszerezni, vagy konstruálni. 4.7. Kettős fertőzéses tesztek kalanchoe növényeken A kettős fertőzések lényege, hogy a növényeket a védő konstrukciót tartalmazó disarmed és a kórokozó baktériumokkal együttesen fertőzzük, így lehetőség van rá, hogy a növényi sejtek egyidejűleg transzformálódjanak mindkét T-DNS konstrukcióval. A védő konstrukcióról képződő dupla szálú RNS kiváltja a géncsendesítés mechanizmusát, aminek következtében a vad típusú gének megnyilvánulása gátlódik. A módszer előnye, hogy egy konstrukció hatásosságának teszteléséhez nem kell idő- és munkaigényes folyamatban transzgenikus növényeket létrehozni. Természetesen, az előzetes tesztben hatásosnak bizonyult vektorok segítségével létre kell hozni később a transzgenikus növényt, hiszen csak így biztosítható, hogy az egész növény Agrobacterium rezisztens legyen.
24 9. ábra: Agrobacterium törzsek tumorképzése kalanchoe (K. tubiflora) növényeken K: fertőzetlen kontroll, C58: A. tumefaciens c58 törzs által okozott tumor, S4: A. vitis S4 törzs által okozott tumor, C58 cit-: A. tumefaciens c58 citokinin mutáns által okozott gyökeresedés, C58 aux-: A. tumefaciens c58 auxin mutáns törzzsel való fertőzés. Nem képződött tumor, ami arra utal, hogy a törzs nem hordozza a kívánt mutációt. Az ábra jobb oldalán látható egy teljes, tumorokat hordozó növény, négy héttel a fertőzés után. A koinokulációs kísérleti módszerrel megkezdtük az általunk létrehozott pjp17-s4 valamint kontrollként a pjp17 vektorok tesztelését kalanchoe növényeken. Mindkét vektor hatását vizsgáljuk az A. tumefaciens c58, az A. vitis S4 illetve a A. tumefaciens c58 citokinin és auxin mutáns, illetve az A. vitis S4 iaam::km R törzsek esetében. A kísérletek összeállítását a 6. táblázat tartalmazza. 6. táblázat: A koinokulációs kísérletek összeállítása védő konstrukciók (1) patogén törzsek - pjp17 pjp17-s4 pjp21 (2) - A.t. c58 A.v. S4 A.t. c58 aux- GV3170 A.t. c58 cyt- GV3297 A.v. iaams4::km R (1) EHA101 vagy MOG301 háttérben; (2) iaam és ipt szekvenciákat nem tartalmazó üres kontroll plazmid (Lee 2003)
25 Az A. tumefaciens c58 törzs ellen mind az eredeti pjp17, mind pedig az új pjp17-s4 konstrukció hatásosnak bizonyult. (10.ábra) 10.ábra: A pjp17 és pjp17-s4 konstrukciók hatása az A. tumefaciens c58 törzzsel szemben A: A. tumefaciens c58 törzs által okozott tumor B: A. tumefaciens c58 + A.t. (pjp17) kettős fertőzött növényen kialakult gátolt tumor C: A. tumefaciens c58 + A.t. (pjp17-s4) kettős fertőzött növényen kialakult gátolt tumor A kísérleteket az A. tumefaciens c58 citokinin mutáns törzzsel is elvégeztük, melyen a konstrukciók hatásossága - az erős gyökeresedés miatt - jobban érzékelhető. Ebből a tesztből is úgy látszik, hogy a tumor képződést mindkét konstrukció eredményesen gátolja, de az általunk készített pjp17-s4 hatékonysága valamivel gyengébb. (11.ábra) 11.ábra: A pjp17 és pjp17-s4 konstrukciók hatása az A. tumefaciens c58 citokinin mutáns törzzsel szemben A: A. tumefaciens c58 cit- törzs által okozott gyökeresedés B: A. tumefaciens c58 + A.t. (pjp17) kettős fertőzött növényen kialakult gátolt gyökér képződés C: A. tumefaciens c58 + A.t. (pjp17-s4) kettős fertőzött növényen kialakult gátolt gyökér képződés
26 Az A. vitis S4 törzs esetében, az előzetes növényi tesztekkel ellentétben, a vad típusú tumorok nem a vártnak megfelelően fejlődtek, annál sokkal kisebb tumorok keletkeztek, így a védő konstrukciókat tartalmazó baktériumokkal való együtt fertőzés során a tumor képződés gátlása nem volt egyértelműen megfigyelhető. Emiatt a konstrukciók hatását az A. vitis S4 törzzsel szemben jelenleg még ezekben a növényi tesztekben nem tudtuk kimutatni. (12.ábra) 12.ábra: A pjp17 és pjp17-s4 konstrukciók hatása az A. vitis S4 törzzsel szemben A: A. vitis S4 törzs által okozott tumor B: A. vitis S4 + A.t. (pjp17) kettős fertőzött növényen kialakult tumor C: A. vitis S4 + A.t. (pjp17-s4) kettős fertőzött növényen kialakult tumor Mivel az auxin mutáns törzs nem az elvárásoknak megfelelően működött illetve az A. vitis S4 iaam::km R mutáns törzs elkészítése folyamatban van, ezért a konstrukciók hatékonyságát ezeken a baktériumokon még nem tudtuk tesztelni. Idő közben elkészültek a pjp17 és pjp17-s4 vektort tartalmazó transzgenikus dohány növények, a továbbiakban a tesztelést ezeken a növényeken is folytatjuk, valamint megpróbáljuk a kalanchoe növényi tesztek elvégzéséhez szükséges körülményeket az A. vitis S4 törzs számára optimálisan beállítani. Mindezek mellett tervezzük újabb konstrukciók létrehozását is, amelyek több (3-5), egymással kevéssé homológ iaam szekvenciát tartalmaznak, hogy minél szélesebb körben alkalmazható, hatásosabb vektorral kezdhessük el a transzgenikus szőlő növények létrehozását.
27 5. ÖSSZEFOGLALÁS A különböző Agrobacterium fajok a kétszikű növényeket a sebzési helyeken fertőzik, és tumorfejlődést illetve hajszálgyökeresedést okoznak. A kóros folyamatért a növényi genomba beépülő agrobaktérium DNS-szakaszon (T-DNS) levő több gén is felelős. Az iaam és az iaah által kódolt enzimek (triptofán-monooxigenáz, indol-3-acetamid hidroláz) a triptofánt auxinná (indol-3-ecetsav) alakítják. Egy harmadik gén az ipt, ami az AMP-izopentenil transzferázt kódolja. Ez a citokinin (izopentenil-amp) bioszintézisét végzi. Az ipt és iaam (vagy iaah) gének inaktivációja megszünteti a tumorképződést. Az agrobaktérium rezisztencia kialakításának egyik módja lehet, hogy olyan növényt állítunk elő, amelyben a patogén baktérium által bejuttatott gének megnyilvánulása gátolt. Erre napjainkban az egyik alkalmas eszköz a géncsendesítés, amelyet már eredményesen alkalmaztak a gyökérgolyvásodással szemben ellenálló, rezisztens növények létrehozására. Célul tűztük ki olyan transzgenikus szőlő növények létrehozását, amelyek rezisztensek több Agrobacterium fajjal szemben is. Munkánk kezdetekor rendelkezésünkre állt egy géncsendesítésre alkalmas konstrukció, amelyet sikeresen használtak az A. tumefaciens c58 törzs iaam és ipt génjeinek inaktiválásához dohány és kalanchoe növényeknél. E vektor alkalmazása azonban csak az A. tumefaciens c58 törzzsel szembeni fertőzésnél bizonyulhat hatásosnak. Más Agrobacterium törzsek esetében az adott gének poszttranszkripciós inaktiválása feltehetően elmarad. Ennek magyarázata az, hogy a különböző agrobaktériumokban nagyon eltérő az iaam gének DNS-szekvenciája, így az azokról képződő mrns molekulákat az inaktiváló rendszer már nem ismerheti fel. Szőlő esetében az egyik fontos kórokozó az A. vitis S4 törzs, amelynek iaam szekvenciája nagyfokban eltér az A. tumefaciens c58 törzsétől. Munkánk kezdetén izoláltuk az A. vitis S4 törzs iaam génjének egy részletét PCR technika segítségével, majd számos klónozási lépésen keresztül hozzákapcsoltuk azt az A. tumefaciens iaam génből származó szakaszhoz. Az így létrehozott T-DNS konstrukciót egy megfelelő ( disarmed ) A. tumefaciens törzsbe juttatva megkezdtük a fertőzéses kísérleteket kalanchoe növényeken. Az A. tumefaciens c58 törzs tumor képzését az eredeti pjp17, és az általunk készített pjp17-s4 konstrukció is eredményesen gátolta, bár a pjp17-s4 konstrukció hatékonysága egy kicsit gyengébb. A konstrukciók A. vitis S4 törzzsel szembeni hatását még nem tudtuk kimutatni. A tesztelést a továbbiakban transzgenikus dohány növényeken is folytatjuk. Ha ezekben a biológiai tesztekben a géncsendesítés a várakozásoknak megfelelően megtörténik, akkor érdemes az elkészített vektort transzgenikus szőlő növények létrehozására is alkalmazni.
28 6. IRODALMI HIVATKOZÁSOK 1. Baulcombe D. 2004. RNA silencing in plants. Nature 2005: 356-63 2. Binns AN. 2002. T-DNA of Agrobacterium tumefaciens: 25 years and counting. Trends in Plant Science 7: 231-3 3. Braun AC. 1978. Plant tumors. Biochim Biophys Acta 516: 167-91 4. Bullock WO, Fernandez JM, Short JM. 1987. Xl1-blue: A high efficiency plasmid transforming RecA Es. Biotechniques 5: 376-9 5. Christie PJ. 2004. Type IV secretion: the Agrobacterium VirB/D4 and related conjugation systems. Biochim Biophys Acta 1694: 219 34 6. De Cleene M, De Ley J. 1976. The host range of crown gall. Botanical Rev 442: 389-466 7. Dessaux Y, Petit A, Farrand SK, Murphy PJ. 1998. Opines and opine-like molecules involved in Plant-Rhizobiaceae interactions. In The Rhizobiaceae: Molecular Biology of Model Plant-Associated Bacteria., ed. HP Spaink, A Kondorosi, PJJ Hooykaas. Dordrecht-Boston-London: Kluwer Academic Publisher 8. Escobar MA, Dandekar AM. 2003. Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease. Trends in Plant Science 8: 380-6 9. Figurski DH, Helinski DR. 1979. Replication of an origine- containing derivative of PlasmidRK2 dependent on a Plasmidfunction provided in trans. Proc Natl Acad Sci USA 76: 1648-52 10. Folk G, Glits M. 1993. Kertészeti növénykórtan. Budapest 61: 264-5 11. Gasser CS, Fraley RT. 1989. Genetically engineering plants for crop improvement. Science 244: 1293-9 12. Gelvin S. 2003. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol Mol Biol Rev 67: 16-37 13. Gheysen G, van Montagu M, Zambrysky P. 1987. Integration of Agrobacterium tumefaciens DNA (T-DNA) involves rearrangements of target plant DNA sequences. Proc Natl Acad Sci USA 84: 6169-73 14. Hoekema A, Hirsh PR, Hooykaas PJJ, Schilperoort RA. 1983. A binary plant vector strategy based on separation of vir- and T-regions of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid. Nature 303: 179-81 15. Holsters M, Silva B, Van Vliet F, Genetello C, De Block M, et al. 1980. The functional organization of the nopaline A. tumefaciens plasmid ptic58. Plasmid 3: 212-30
29 16. Hood EE, Gelvin SB, Melchers LS, Hoekema A. 1993. New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Transgen Res 2: 208-18 17. Hood Ee, Helmer Gl, Fraley Rt, Chilton M-D. 1986. The Hypervirulence of Agrobacterium tumefaciens A281 Is Encoded in a Region of ptibo542 Outside of T- DNA. J Bacteriol 168: 1291-301 18. Inoue H, Nojima H, Okayama H. 1990. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96: 23-8 19. Ish-Horovicz D, Burke JF. 1981. Rapid and efficient cosmid cloning. Nucl Acids Res 9: 2989-98 20. Joos H, Inze D, Caplan A, Sormann M, Van Montagu M, Schell J. 1983. Genetic analysis of T-DNA transcripts in nopaline crown galls. Cell 32: 1057-67 21. Lee H, Humann J, Pitrak J, Cuperus J, Parks T, et al. 2003. Translation start sequences affect the efficiency of silencing of Agrobacterium tumefaciens T-DNA oncogenes. Plant Physiol 133: 966-77 22. Meade HM, Long SK, Ruvkun GB, Brown SE, Ausubel FM. 1982 Physical and genetic characterization of symbiotic and auxotrophic mutants of Rhizobium meliloti induced by transposon Tn5 mutagenesis. J Bacteriol 149: 114-22 23. Meister G, Tuschl T. 2004. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature 431: 343-9 24. Miranda A, Janssen G, Hodges L, Peralta EG, Ream W. 1992. Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism. J Bacteriol 174: 2288-97 25. Orosz L, Svab Z, Kondorosi A, Sik T. 1973. Genetic studies on Rhizobio- phage 16-3. Genes and functions on the chromosome. Mol Gen Genet 125: 341-50 26. Perl A, Eshdat Y. 1998. DNA transfer and gene expression in transgenic grapes. In Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, ed. MP Tombs, pp. 365-86. Andover (UK): Intercept Ltd 27. Ream W. 1989. Agrobacterium tumefaciens and interkingdom genetic exchange. Annu Rev Phytopathol 27: 583-618 28. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual - 2nd ed. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press 29. Susi P, Hohkuri M, Wahlroos T, Kilby NJ. 2004. Characteristics of RNA silencing in plants: similarities and differences across kingdoms. Plant Molecular Biology 54: 157 74 30. Thatte V, Bradley DE, Iyer VN. 1985. N conjugative transfer system of plasmid pcu1. J Bacteriol 163: 1229-36