A PEPTIDERG NEUROMODULÁCIÓ MOLEKULÁRIS ALAPJAI

A PEPTIDERG NEUROMODULÁCIÓ MOLEKULÁRIS ALAPJAI Dobolyi Árpád MTA-ELTE Molekuláris és Rendszer Neurobiológiai Ktcs. Semmelweis Egyetem, Anatómiai, Szövet-és Fejlődéstani Intézet, Neuromorfológiai Kutatócsoport

A NEUROPEPTIDEK DEFINÍCIÓJA / JELLEMZŐI 3-50 aminosavból álló, neuromodulátor funkcióval rendelkező bioaktív peptidek Prepropeptidként szintetizálódnak, és processzálódnak Axonokban szállítódhatnak, anterográd irányba történő vezikuláris transzporttal Szabályozott vezikuláris szekrécióval ürülnek Nagy affinitású, 7TM domén, G-protein csatolt sejtmembrán receptorokhoz kötődnek

NEUROPEPTIDEK CSOPORTOSÍTÁSA

A NEUROPEPTIDEK TÍPUSAI ÉS ELTERJEDTSÉGE 5949 különböző neuropeptid szekvencia ismert, 2406 gerinces, és 3455 gerinctelen fajokból. Összesen 493 fajban találtak eddig neuropeptideket (Wang és mtsai, 2015). Emberben 283 különböző neuropeptid ismert, amit 62 gén kódol Szerkezetük alapján a neuropeptidek 65 csoportba sorolhatóak: FARP: FMRFamid -rokon peptidek (C-terminális: Arg-Phe-NH2) Humanban: Prolactin-releasing peptid, Neuropeptid AF, SF, FF, RFRP Tachykinin: Pl. substance P, Neurokinin A és B, Neuropeptid K Yan Wang, Mingxia Wang, Sanwen Yin, Richard Jang, Jian Wang, Zhidong Xue, Tao Xu. NeuroPep: a Comprehensive Resource of Neuropeptides. Database (Oxford). 2015 Apr 29. doi: 10.1093/database/bav038

SZIGNÁLPEPTIDEK ÉLESZTŐBEN: ALFA-MATING FAKTOROK 12 ill. 13 aa-ból álló a ill. alfa mating faktor Élesztő ivaros szaporodását segíti elő, haploid sejtek termelik Egy haploid sejt vagy az egyiket, vagy a másikat termeli, és kibocsátja Feromonként írható le, de a neuropeptidek neurokémiai modellje: Neuropeptidekhez hasonlóan processzálódik Szekretálódik Specifikus GPCR receptorokon hat Hatásaik: Szomszéd haploid sejtek G1 fázisban leállnak Körte alakú lesz a sejttest egy keletkező nyúlvány miatt Enzimatikus felkészülés a fúzióra

NEUROPEPTIDEK CAENORHABDITIS ELEGANS-BAN 113 neuropeptid gén kódol több, mint 250-féle neuropeptidet 40 gén kódol inzulin-szerű peptideket 31 gén kódol FMRFamide-szerű peptideket 42 gén kódol nem-inzulin, és nem-fmrfamide-szerű peptideket Az aktív peptidek prekurzor fehérjékből poszttranszlációs módosítással keletkeznek A neuropeptidek elsősorban az idegrendszerben fejeződnek ki, mind érző, mind motoros neuronokban, mind pedig interneuronokban Néhány neuropeptid nem-idegszövetben is kifejeződik Knock-out állatokban defektes lehet a lokomóció, az alakváltozás, a peterakás, az etanol válasz, és a szociális viselkedések

NEUROPEPTIDEK TÖRZSFEJLŐDÉSÉNEK ELVE A GRF (GHRH) PEPTIDCSALÁDON BEMUTATVA Gluc: glukagon; GLP: glukagon-szerű peptid; GRF: növekedési hormon felszabadító faktor (growth hormone releasing factor); PACAP: hipofízis adenilát cikláz aktiváló polipeptid (pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide); PRP: PACAP-pal rokon peptid; PHI: peptid hisztidin-izoleucin; Sekr: szekretin; VIP: vazoaktív intesztinális peptid

NEUROPEPTIDEK SZINTÉZISE

GLUTATION SZINTÉZIS

NEUROPEPTIDEK TRANSZLÁCIÓJA

NEUROPEPTIDEK POSZTTRANSZLÁCIÓS MÓDOSÍTÁSAI Strand FL: Neuropeptides, 1999, MIT Press, 48. oldal, módosítva

GLIKOPROTEIN HORMONOK Thyroid-stimulating hormone Follicle-stimulating hormone Luteinizing hormone Chorionic gonadotropin - Két alegység dimer - Alpha alegység közös - N- és O-glikoziláció - Glikolizáció kell a működéshez

PREPROPEPTIDEK JELLEMZŐ FELÉPÍTÉSE CPON: C-flanking peptide of NPY Brady ST, Siegel GJ, Albers RW, Price DL (Editorok): Basic Neurochemistry, 8. kiadás, 2012, Elsevier, 392. oldal, módosítva

PROPEPTIDEK HASÍTÁSA - ENDOPEPTIDÁZOK Strand FL: Neuropeptides, 1999, MIT Press, 47. oldal, módosítva

PROHORMON KONVERTÁZOK (PC) Brady ST, Siegel GJ, Albers RW, Price DL (Editorok): Basic Neurochemistry, 8. kiadás, 2012, Elsevier, 394. oldal, módosítva

A POMC ENDOPROTEOLÍZISÉT VÉGZŐ ENZIMEK, ÉS A HASÍTÁSAIK SORRENDJE Brady ST, Siegel GJ, Albers RW, Price DL (Editorok): Basic Neurochemistry, 8. kiadás, 2012, Elsevier, 398. oldal, módosítva

A POMC GÉN TERMÉKEI A HIPOFÍZISBEN ÉS AZ AGYBAN (PL. N. ARCUATUS) ACTH: adrenocorticotropin; CLIP: corticotropin-szerű intermedier lebeny peptid; LPH: lipotropin; MSH: melanocita-stimuláló hormon; MC-R: melanocortin receptor

A NEUROPEPTID KUTATÁS NOBEL DÍJAS (1977) ÚTTÖRŐI Az agy peptid hormon termelésének felfedezésért Peptidszintek mérésének kidolgozásáért

TOVÁBBI PÉLDÁK SZÖVETFÜGGŐEN PROCESSZÁLT NEUROPEPTID PREKURZOROKRA Preproenkefalin 15-35 aa peptidek a mellékvesében, met- és leu-enkephalin pentapeptidek a hypothalamusban Preprosomatostatin Som-28 a bélben és a pancreasban Som-14 a hypothalamusban Preprocholecystokinin kb. 30 aa peptidek a bélben kisebb peptidek az agyban

ALTERNATÍV SPLICING PREPROTACHIKININ A

NEUROPEPTIDEK GÉNSZERKEZETE PÉLDA: POMC

NEUROPEPTIDEK POSZTTRANSZLÁCIÓS MÓDOSÍTÁSAI Strand FL: Neuropeptides, 1999, MIT Press, 48. oldal, módosítva

PEPTIDEK AMIDÁLÁSA A C-TERMINÁLISON enzim: peptidilglicin alfa amidáló mono-oxigenáz (PAM) PHM: peptidilglicin-alfa-hidroxiláló mono-oxigenáz; PAL: peptidil-alfa-hidroxiglicin-alfa-amidáló liáz

AZ NPY PROCESSZÁLÁSA PC2 ÁLTALI PROTEOLÍZIS ÉS AMIDÁLÓDÁS CPON: C-terminal flanking peptide of NPY

PIRO-GLUTAMÁT KÉPZŐDÉS PEPTIDEK N-TERMINÁLISÁN Glutaminil-peptid N-terminálisán piroglutamáttal védett peptid

TOVÁBBI LEHETSÉGES MÓDOSÍTÁSOK A GOLGI KÉSZÜLÉKBEN: FOSZFORILÁLÁS ÉS SZULFATÁLÁS Viszonylag kevés számú neuropeptid esetén Az érintett peptidek hatásához lehet szükséges, esetleg féléletidejüket hosszabíthatja Irreverzibilis reakciók, dinamikus szabályozás nem ismert Foszforilálódó peptidek: ACTH, gasztrin, opioid peptidek, parathormon, növekedési hormon, atrial natriuretic (pitvari nátriumürítő) peptid Szulfatálódó peptidek: enkefalin, gasztrin, cholecisztokinin

GASZTRIN ÉS CHOLECISZTOKININ (CCK) - Azonos a 2 peptid C-terminálisa - A gasztrin az antrum G sejtjeiből ürül táplálék hatására, H+ szekréciót okoz - CCK a bélből ürül táplálék hatására, emésztőenzimek bélbe kerülését okozza - CCK az agy sok területén, így a cortexben is jelen van. Funkciói: szorongás, fájdalom, táplálékfelvétel modulálása - CCK esetén a szulfatálódás szükséges a hatáshoz - Gasztrin esetén a szulfatálódás csak stabilizál - CCK A receptor: gasztrin és CCK - CCK B receptor: specifikus CCK-ra

NEUROPEPTIDEK FELSZABADULÁSA Nem axonterminálisból való felszabadulás lehetősége: M Ludwig, N Sabatier, PM Bull, R Landgraf, G Dayanithi & Gareth Leng (2002) Intracellular calcium stores regulate activity-dependent neuropeptide release from dendrites. Nature 418, 85-89.

NEUROPEPTIDEK AXONÁLIS TRANSZPORTJA Brady ST, Siegel GJ, Albers RW, Price DL (Editorok): Basic Neurochemistry, 8. kiadás, 2012, Elsevier, 150. oldal, módosítva

NEUROPEPTIDEK FELHALMOZÓDÁSA PRESZINAPTIKUS TERMINÁLISOKBAN A neuropeptidek nagy, denz magvú szinaptikus vezikulában (large dense core vesicle LDCV), nem pedig kicsi és áttetsző szinaptikus vezikulában (small synaptic (or clear) vesicle - SSV vagy SCV) helyezkednek el.

NEUROPEPTIDET TARTALMAZÓ PRESZINAPTIKUS TERMINÁLIS Piros nyíl: LDCV D: dendrit

NEUROPEPTIDEK INGERÜLET HATÁSÁRA TÖRTÉNŐ FELSZABADULÁSA Strand FL: Neuropeptides, 1999, MIT Press, 68. oldal, módosítva

NEUROPEPTIDEKET TARTALMAZÓ VEZIKULÁK MOBILIZÁLÁSÁNAK MECHANIZMUSA

NEUROPEPTIDEK FELSZABADULÁSÁNAK LEHETŐSÉGE KISS AND RUN MÓDON A felszabadulás mértéke PKCe függő lehet

PEPTIDEK EGYÜTTES TÁROLÓDÁSA

PEPTIDEK EGYÜTTES TÁROLÓDÁSA PÉLDA Elektronmikroszkópos immunarany technika CGRP SP

PEPTIDEK EGYÜTTES FELSZABADULÁSÁNAK EGY LEHETSÉGES SZEREPE Van den Pol (2012) Neuropeptide transmission in brain circuits. Neuron 76: 98-115.

NEUROPEPTIDEK RECEPTOR KÖTŐHELYEI

NEUROPEPTIDEK RECEPTORAI G-PROTEIN CSATOLT RECEPTOROK CSOPORTJAI

RECEPTOR AKTIVITÁST MÓDOSÍTÓ PROTEINEK (RAMP)

CGRP PEPTIDCSALÁD RECEPTORAI AM: adrenomedullin; AMY: amylin; CT: calcitonin; CGRP: calcitonin gene-related peptide; CL receptor: calcitonin receptor-like receptor

GUANILÁT-CIKLÁZ KAPCSOLT RECEPTOROK

NATRIURETIKUS PEPTIDEK

ANP CSÖKKENTI A VÉRTÉRFOGATOT

AZ ANP ELOSZLÁSA AZ AGYBAN

INZULIN RECEPTOR SZIGNÁL TRANSZDUKCIÓJA

A PROLAKTIN RECEPTOR SZIGNÁLTRANSZDUKCIÓJA

FMRFamide HATÁSA H + -RECEPTOR IONCSATORNÁKRA

PEPTIDEK HATÁSAI A NEUROTRANSZMISSZIÓRA

NPY HATÁSAI EGY NEURON MŰKÖDÉSÉRE Van den Pol (2012) Neuropeptide transmission in brain circuits. Neuron 76: 98-115.

TRH HATÁSA NTS NEURONOK AKTIVITÁSÁRA

NEUROPEPTIDEK INAKTIVÁCIÓJA Proteolítikus degradáció az extracelluláris térben A résztvevő peptidázok általában integráns membránfehérjék Szférikus okokból fehérjéket nem hasítanak Peptidázcsaládok Neprilysin-szerű endopeptidázok (Zn-metallopeptidázok) hasítás hidrofób aminosavak N-terminális oldalán Pl. enkefalináz (neutrális endopeptidáz 24.11), endothelinkonvertáló enzim, DINE ( damage-induced neuronal endopeptidase ) további szubsztrátok: opiátok, tachykininek, szomatosztatin Aminopeptidázok (metallo-exopeptidázok) Pl. aminopeptidáz A, P; puromicin-szenzitív aminopeptidáz Dipeptidil peptidáz III és IV-szerű peptidázok (szerin proteázok) dipeptid hasítás az N terminálisról szubsztrátok: glukagon-szerű peptid, angiotenzin II Angiotenzin-konvertáló enzimek-ace (Zn-metallopeptidázok) dipeptid hasítás a C terminálisról szubsztrátok: enkefalin, P anyag (substance P), LH-RH, cholecisztokinin

NEUROPEPTIDEK DEGRADÁCIÓJA ENDOSZÓMÁKBAN

SUBSTANCE P (P ANYAG) von Euler és Gaddum, 1931 hatás felfedezése Bengt Pernow, 1953 agyi eloszlás Susan Leeman, 1971 szekvenálás 1987-re 3 féle receptor farmakológiai elkülönítése Nakanishi, 1987 receptor klónozása

HYPOCRETIN FELFEDEZÉSE James Sutcliffe és mtsai, 1998 Csak hypothalamusban kifejeződő mrns azonosítása (directional tag PCR subtraction) A hypothalamusban expresszálódó szekretin-szerű peptid kémiai szintézise A peptid neuroaktív hatásának bizonyítása

OREXIN FELFEDEZÉSE Reverz farmakológia: ligand azonosítás ismert receptor alapján Orphan (árva) receptor kifejezése sejtvonalban Részlegesen tisztított szöveti homogenizátumok hatásának tesztelése a receptort tartalmazó sejtvonalon orexin: Masushi Yanagisawa és mtsai, 1998

NEUROPEPTIDEK TISZTÍTÁSA Szövet (pl. kétszáz patkányagy, 20 szarvasmarha hypothalamus) homogenizálása savas acetonban Felülúszó többszörös extrakciója éterrel Többszörös, különböző elven működő kromatográfiás lépések (detektor: UV, 210 nm) gélszűrés fordított fázisú kromatográfia ioncserélő kromatográfia Homogenitás ellenőrzése és molekulatömeg meghatározása tömegspektrométerrel

OREXIN TISZTÍTÁSÁNAK KROMATOGRÁFIÁS LÉPÉSEI

PEPTID SZEKVENCIÁJÁNAK MEGHATÁROZÁSA TÖMEGSPEKTROMETRIÁVAL

A LATERÁLIS HYPOTHALAMUS OREXIN ÉS MELANIN- CONCENTRATING HORMONE (MCH) SEJTJEI

OREXIN KNOCK-OUT EGÉR NARKOLEPSZIÁS TÜNETEI

OREXIN GYÓGYSZERKÉNT VALÓ FELHASZNÁLÁSA Humán narkolepsziásoknál általában nem az orexin rendszerrel van probléma, ettől még az orexin segíthet narkolepsziásokon Problémák a gyógyszerfejlesztéshez: - Az orexin az agyban előforduló természetes anyag, szerkezete nem szabadalmaztatható - Jerry Siegel (UCLA) publikálta, hogy orexin intranazálisan beadva hatékony, így a beadási mód sem szabadalmaztatható - Nem sikerült kismolekulás agonistát készíteni - Narkolepsziások száma az USA-ban 200 000, míg az álmatlanságban szenvedők száma 60 millió, jóval nagyobb piac - Intenzív gyógyszerfejlesztés eredményeképpen piacra került altatóként egy orexin receptor antagonista: belsomra (Suvorexant)

OREXIN SZEREPE KOKAIN FÜGGŐSÉGBEN Kokain-indukált helypreferencia visszatérése stressz hatására Orexin hiányában a stressz nem fokozza a helypreferenciát Tung et al. (2016) Orexins contribute to restraint stress-induced cocaine relapse by endocannabinoid-mediated disinhibition of dopaminergic neurons. Nat. Commun. Jul 22;7:12199.

OREXIN HATÁSA DOPAMINERG NEURONOK mipsc-jére A VENTRAL TEGMENTAL AREA-BAN (whole cell recording kinurénsav és tetrodotoxin jelenlétében) Frekvenciára való hatás Amplitúdóra kifejtett hatás Tung et al. (2016) Orexins contribute to restraint stress-induced cocaine relapse by endocannabinoid-mediated disinhibition of dopaminergic neurons. Nat. Commun. Jul 22;7:12199.

OREXINERG MECHANIZMUS KOKAIN FÜGGŐSÉGBEN

AJÁNLOTT IRODALOM Brady ST, Siegel GJ, Albers RW, Price DL (Editorok): Basic Neurochemistry, 8. kiadás, 2012, Elsevier Strand FL: Neuropeptides, 1999, MIT Press Kastin AJ (Editor): Handbook of Biologically Active Peptides, 2013, Elsevier Internetes adatbázisok: http://www.neuropeptides.nl

KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!