DIPLOMATERV Dolgozat címe: Kortikális lassú oszcillációk és a bajuszingerlés kapcsolata altatott patkányban Szerző neve: Fiáth Richárd Balázs Konzulensek neve: Dr. Ulbert István Dombovári Balázs Szak: Műszaki Informatika 9. félév Pázmány Péter Katolikus Egyetem Információs Technológiai Kar
Jelen dolgozat 2009. áprilisában a 2009. évi OTDK-n Biológia szekcióban III. helyezést ért el
Nyilatkozat Alulírott Fiáth Richárd Balázs, a Pázmány Péter Katolikus Egyetem Információs Technológiai Karának hallgatója kijelentem, hogy ezt a diplomatervet meg nem engedett segítség nélkül, saját magam készítettem, és a diplomamunkában csak a megadott forrásokat használtam fel. Minden olyan részt, melyet szó szerint, vagy azonos értelemben, de átfogalmazva más forrásból átvettem, egyértelműen a forrás megadásával megjelöltem. Ezt a Diplomamunkát más szakon még nem nyújtottam be. Budapest, 2009. június. Fiáth Richárd Balázs 3
Tartalomjegyzék I. Feladat rövid összefoglalása... 5 II. Abstract... 6 III. Biológia háttér... 7 III.1. Az EEG jel generátor struktúrái... 7 III.2. Az EEG jel keletkezésének mechanizmusa... 7 III.3. Alvásciklusok... 10 III.3.1. Az NREM alvást meghatározó neurális rendszerek (4.ábra)... 12 III.4. Lassú hullámú alvás (Slow Wave Sleep) és lassú oszcillációk... 13 III.5. A szenzoros eseményhez-kötött válasz... 15 III.6. A bajuszingerlés és a lassú oszcilláció kapcsolata... 16 IV. Műtéti áttekintés, elvezetési metódus... 18 IV.1. A felhasznált elektródák... 18 IV.2. Az elektródák implantálása... 19 IV.3. Elvezetési metódus... 21 IV.4. Elektródák elhelyezkedése... 21 IV.5. A bajuszingerlés részletezése... 23 V. Számítógépes analízis... 24 V.1. A lassú oszcilláció fázisainak elkülönítése... 24 V.1.1. Up-state kezdetek válogatása manuálisan, szemmel... 25 V.1.2. Hilbert-transzformáció [5]... 27 V.2. Esemény-körüli idő hisztogram (Peristimulus Time Histogram, PSTH, [5]) 29 V.2.1. Fázis PSTH (Phase PSTH)... 30 V.3. Áramforrás sűrűség (Current Source Density, CSD[5, 6, 16])... 31 V.4. Multiunit analysis (MUA) map... 32 V.5. Idő-frekvencia analízis [6]... 33 VI. Eredmények... 36 VII. Összefoglalás... 43 VIII. Köszönetnyilvánítás... 45 IX. Irodalomjegyzék... 46 4
I. Feladat rövid összefoglalása Mély alvási fázis során (lassú hullámú alvás, slow wave sleep, SWS), illetve altatásban az agykéreg szinte egész területén egy kb. 0.5-2 Hz-es lassú oszcilláció figyelhető meg. Ez alatt a kérgi neuronok membránpotenciálja két állapot között oszcillál. A hiperpolarizált állapotot down state -nek nevezzük: a neuronok ekkor egyáltalán nem, vagy alig tüzelnek és az agykéreg felszíni rétegeiben negatív polaritású, mélyebb rétegeiben pedig pozitív polaritású lokális mezőpotenciál jellemzi. A depolarizált állapotot up state -nek hívjuk: fokozott tüzelési aktivitás figyelhető meg, lokális mezőpotenciáljának polaritása pedig ellentétes a down state -nél ismertetettel. A bajuszszőrök a patkányok legfontosabb érzékszervei közé tartoznak, melyre tájékozódás során nagymértékben támaszkodnak. Korábbi kutatásokban intracelluláris elvezetések vizsgálatával, altatott patkány elsődleges szomatoszenzoros kérgében (barrel kéreg) kimutatták, hogy rövid idejű periódikus bajuszingerek hatására a lassú oszcilláció aktuális állapota megváltozhat: up state -ből down state illetve down state -ből up state váltás mehet végbe az aktuális állapottól függően. Célom altatott patkány parietális asszociációs kérgéből elvezetett lokális mezőpotenciál és a többsejt-aktivitás elemzésével választ adni a következő kérdésekre: van-e kapcsolat a szenzoros ingerléssel kiváltott válaszok és a lassú oszcilláció állapotai között altatás alatt? Vajon a szenzoros ingerlés válthat-e ki up state -eket illetve down state -eket? Képes-e a bajuszingerlés a lassú oszcilláció vezérlésére, szinkronizálására? A kísérleteket ketamin-xylazinnal altatott patkányokon végeztük. A műtétek során egy 24 csatornás multielektródot implantáltunk az állatok agyának parietális asszociációs kérgi részébe, mely a különféle szenzoros jelek integrációjáért felel. Az akut elvezetések során a lassú kérgi oszcillációkat vizsgáltuk, miközben - egy léptető-motorból kialakított készülék segítségével - ingereltük az altatott állat bajuszszőreit. A bajuszingerléseket eltérő frekvenciákkal, ingerhosszakkal és ingererősségekkel megismételtük. Többféle számítógépes elemző módszerrel megvizsgáltam a bajuszingerlés által befolyásolt agyi jeleket, valamint a spontán lassú oszcillációkat tartalmazó, ingerlésmentes elvezetéseket is. Eredményként azt kaptam, hogy az ingerek jelentős része röviddel (kb. 50-100 ms) az up state illetve down state kezdetek előtt volt jelen, vagyis a szenzoros ingerlés képes megváltoztatni a lassú oszcilláció aktuális állapotát a parietális asszociációs kéregben. Ezen kívül megfigyeltem, hogy az ingerlés képes volt hosszabb-rövidebb ideig szinkronizálni a lassú oszcillációt. A kapott eredmények alapján látható, hogy szenzoros ingerléssel nem csak az elsődleges szomatoszenzoros kéregben, hanem a parietális asszociációs kéregben is befolyásolhatóak a lassú oszcilláció állapotai. 5
II. Abstract During natural slow wave sleep and under deep anesthesia a slow oscillation with 0.5-2 Hz frequency is apparent almost in the whole neocortex. This oscillation is caused by the fluctuation of the membrane-potential of cortical neurons. The hyperpolarized state is called down state or inactive state, where neurons show no or little firing activity. The down states are characterized by a negative polarity local field potential in the superficial layers of the cortex and by positive polarity in the deep layers. The depolarized state is called up state or active state, where an increased discharge activity is present, and the polarity of the local field potential is the opposite compared to that showed by the down state. Previous studies with intracellular recordings in the primary somatosensory cortex of anesthetized rats had shown that short periodic whisker stimuli can change the actual state of the slow oscillation: a stimulus appeared in an up state can terminate the actual state or a stimulus present in the silent state can trigger a new up state. My aim is to find answers to the following questions with the analysis of the local field potential and multiunit activity of anesthetized rats recorded from the parietal association cortex: is there a connection between the sensory evoked potentials and the states of the slow oscillation under anesthesia? Can the sensory stimulation evoke up or down states? Is the whisker stimulation able to drive or synchronize the slow oscillation? The experiments were carried out on rats anesthetized with ketamine-xylazine. A multielectrode with 24 contacts was implanted in the parietal association cortex, wich brain region is responsible for the integration of multimodal stimuli. Under the recording procedure the main whisker-hairs of the anesthetized animals were stimulated with a device built from a stepper-motor. The stimulations were performed with different values of a three element parameter set: frequency, duration of the stimuli and amplitude of the stimuli. The brain signals influenced by the whisker stimulation were analysed with various computer based analytical methods and compared with the spontaneous recordings, that contained no stimulation. As a result it was clearly visible, that a significant part of the stimuli were present short (50-100 ms) before the initiation of up and down states which means that sensory stimulation can change the actual state of the slow oscillation in the parietal association cortex. Besides, I also observed, that the stimulation was able to synchronise the slow oscillation for a short amount of time (for a few seconds). From these results we can declare, that we can affect the slow oscillation with sensory stimulation not only in the primary somatosensory cortex, but in the parietal association cortex too. 6
III. Biológia háttér III.1. Az EEG jel generátor struktúrái A központi idegrendszer (Central Nervous System- CNS) legfőbb alkotói az idegsejtek és gliasejtek. Mind a két típus további csoportokra és alcsoportokra osztható. A neuronok felelősek a külső illetve belső környezeti hatásokra kialakuló ingerek létrehozásában, feldolgozásában, valamint továbbításában. A két agyféltekéből álló körülbelül másfél kilós agyvelő külső felületén található az agykéreg (neocortex), melyben az idegsejtek általában réteges elrendeződésben helyezkednek el, és kisméretű, hordó alakú, kolumnáknak nevezett önállóan működő funkcionális egységeket alkotnak. Az agykéreg két legfőbb idegsejttípusa a piramissejt (a neocortex sejtjeinek 80%-át teszi ki), mely az idegrendszer két fő mechanizmusa (serkentés és gátlás) közül a serkentésért felelős, míg az interneuronoknak nevezett elemek gátlást valósítanak meg. Ez a két sejttípus szintén további alcsoportokra osztható. A glia sejtek a neuronok között találhatók, főként az idegsejtek táplálásáért, valamint nyúlványaik szigeteléséért felelősek, de újabb kutatások kimutatták, hogy az idegsejtek elektromos tevékenységeinek modulálásában is szerepet játszhatnak. A neuron sejttestjéből különböző nyúlványok származnak. Ezek a nyúlványok alapvetően két osztályba sorolhatóak funkciójuk szerint. A legtöbb nyúlvány dendrit, melyek elágazódásaikkal számos kis szövevényt alkotnak. Általában az idegsejt tartalmaz egy ún. axont is, mely több kollaterálisra is felbomolhat. Az axon teremti meg a kapcsolatot más neuronokkal, célszervekkel. Interneuronális kapcsolatok esetén a kontaktusokat szinapszisoknak hívjuk, melyek a dendritekre, a sejttestekre és axondombokra koncentrálódnak. Íly módon az idegsejtek akár több ezer másikkal is kapcsolatba kerülnek. A glia sejtek az idegsejtek sejttestjei, axonjai és dendritjei közötti térben beágyazódva helyezkednek el. Általában rendelkeznek néhány nyúlvánnyal, melyek kapcsolatot teremtenek a neuronok sejttestjeivel és nyúlványaival, ill. a véredényekkel. Ez a hisztológiai elrendezés azt eredményezi, hogy az agyi extracelluláris tér nagyon szűk intercelluláris réseket tartalmaz. III.2. Az EEG jel keletkezésének mechanizmusa Az EEG jel keletkezésének mechanizmusa a mai napig pontosan nem ismert. Valószínű, hogy több ezer neuron összesített elektromos aktivitását tükrözi, melyek az agykéreg felszíni részének megfelelően helyezkednek el. A mélyebb struktúrák aktivitása a szignál gyengülése miatt nem idézhet elő a fejbőrről elvezethető mikrovoltos nagyságú jelet. Rétegelektródákkal azonban pár száz mikrovoltos jeleket is kaphatunk, viszont csak az elektróda kontaktusaihoz közeli, lokális tevékenységekről (lokális mezőpotenciál, local field 7
potential, LFP). Tekintettel az EEG fokozatos jellegű változásaira, inkább a piramissejtek dendritnyúlványain lejátszódó küszöb alatti posztszinaptikus potenciálváltozások felelősek keletkezéséért, semmint a gyors, mindent vagy semmit jellegű akciós potenciálok. Elul klasszikus elképzelése [2] szerint az EEG jel generálásában számos neuron kiterjedt dendritfáinak szinkronizált, összesített aktivitása játszik szerepet. Ezeket a több neuronhoz tartozó, de együttműködő kapcsolatokat nevezte szinaptikus funkcionális egységeknek. Az agy spontán ritmusának megfelelő, és az adott ingerek függvényében számos átfedést mutató funkcionális egység közül más és más csoportok mutathatnak szinkronizált aktivitást. Ez a mintázat időben dinamikusan változik. Például az epilepszia alkalmával látható nagy amplitúdójú kisülések a kóros aktivitású gócnak megfelelően elhelyezkedő sok idegsejt szinkronizált működését mutatják. A szinaptikus funkcionális egységek koordinációjában fontos szerepet tölthetnek be a kéreg alatti struktúrák, elsősorban a thalamus [2]. A szinkronizált elektromos aktivitáson felül fontos az agyi struktúrák geometriai konfigurációja is. Az EEG jel kialakulásának feltétele ugyanis, hogy a sok kis lokális elektromos változás felerősítse egymást[2]. Az egymással párhuzamosan elhelyezkedő kérgi piramissejtek transzmembrán áramai ideálisan képesek összeadódni, ezt nevezzük open field elrendeződésnek. A neuronok véletlenszerű orientációja esetén a mikroáramok kioltják vagy nagyon lecsökkentik a jel erősségét, ezt closed field elrendeződésnek nevezzük. Míg az agykéreg szerveződésére az open field, addig az egyes mélyebben elhelyezkedő agytörzsi struktúrákra a closed field organizáció a jellemző (1. ábra). A párhuzamosan elhelyezkedő piramissejtek dendritjein végződnek az afferens rostok. Ingerület esetén a dendrit membránja depolarizálódik, a sejtbe pozitív töltésű ionok áramlanak be az extracelluláris térből. Emiatt az extracelluláris térben az ionok eloszlása megváltozik, mikroáramok kialakulásához vezetve. A párhuzamos (open field) szerveződés következtében e mikroáramok összeadódnak, így a skalpon valamint a rétegelektróda kontaktusain is mérhető potenciál alakul ki [2](1. ábra, A rész). Eseményfüggő potenciálok keletkezésekor számos, az adott eseményhez kapcsolódóan ingerületbe jött neuron mutat együttes aktivitást. Ez erős dipólusok kialakulásához vezet. A dipólus modellek szerint ezek képezik a skalpon regisztrálható hullámok forrását. Forrásanalízis során e hullámok jellemzőiből próbálunk visszakövetkeztetni a dipólusok agyi lokalizációjára. A zárt - closed field - szerveződés esetén a mikroáramok kioltják egymást, így regisztrálható dipólus nem jön létre [2](1. ábra, B rész). 8
1. ábra Az agykéreg szerveződésére az open field, az agytörzsi struktúrákra a closed field organizáció a jellemző [2] Az EEG jelet frekvencia és amplitúdóbeli különbségek alapján spektrális tartományokra osztjuk fel (2.ábra). Más irodalmi források kis mértékben eltérhetnek ezektől a frekvenciaértékektől, mivel a tartományok között nincsenek éles határok, de ez a felosztás igaz a rétegelektródával elvezetett lokális mezőpotenciálokra is. Különböző állatmodelleken szintén lehet különbség a konkrét értékekben, például rágcsálók hippocampus-ában exploráció során létrejövő théta ritmus a 4-10 Hz-es tartományban van definiálva. Lokális mezőpotenciál esetén a delta sáv alsó része (0.5-2 Hz) felel meg a lassú oszcillációknak. Érdemes még megemlíteni az alvás korai szakaszaiban megfigyelhető alvási orsókat (sleep spindles), melyek rövid idejű (pár száz ms), 10-14 Hz-es oszcillációk, amiket talamusz és az agykéreg interakciója hoz létre. A hippocampus-ban látható pár tíz milliszekundum hosszú, 80-160 Hzes magas frekvenciás oszcillációk pedig a ripple-ök, melyek feltételezések szerint a hosszú távú memória kialakításában játszanak fontso szerepet. A klasszikus nevezéktan szerint, ha a nagyobb amplitúdójú és kisebb frekvenciájú hullámot egy kisebb amplitúdójú és nagyobb frekvenciájú váltja fel, deszinkronizációról beszélünk. Ennek a folyamatnak az ellenkezője a szinkronizáció. 9
2. ábra Az EEG jel frekvencia és amplitúdó szerinti spektrális tartományai [2] III.3. Alvásciklusok Természetes körülmények között három olyan alapvető tudatállapot van, amelyek egymástól élesen elkülönülnek: az ébrenlét, az NREM alvás és a REM alvás [2](3. ábra). Az ébrenlétet alacsony amplitúdójú magas frekvenciájú elektromos tevékenység jellemzi (béta hullámok). Az alvás folyamata két egymástól jól elkülöníthető alvásfázis ciklikus váltakozásából épül fel [2]. Fiziológiás körülmények között az alvás NREM fázissal (az angol Non-Rapid Eye Movement kifejezés alapján, mely a szemmozgások hiányára utal) indul, amit az EEG-jegyek alapján lassú hullámú alvásnak is neveznek. A lassú hullámok a kérgi neuronok ritmikus gátlásának a jelei. A gátlás a talamusz és a kéreg közötti kölcsönhatás eredménye, ami egyszersmind az érzékszervi bemenet feldolgozásával is interferál. Az NREM alvást az EEGdelta hullámok mennyisége alapján sekély stádiumokra (1. és 2. kevés delta hullám), valamint mély stádiumokra (3. és 4. sok delta hullám) lehet felosztani. A mély NREM alvás általában nehezebb ébreszthetőséggel jár, mint a sekély. Az elalvás előtt, ébrenlét-csukott 10
szem állapotában szabályos alfa-tevékenység jelenik meg az EEG-elvezetésekben. Az elalvás másodperceiben (NREM 1. stádium) még mindig alacsony amplitúdójú, de lassúbb théta hullámokkal kevert mintázat észlelhető, és az alfa hullámok eltűnnek. Felületes alvásban (NREM 2. stádium) még több lassú és nagyobb amplitúdójú elem keveredik az EEG- képbe, ezenkívül megjelennek az alvási orsók és a K-komplexusok. Az NREM 3. és 4. stádiumokban először a nagy feszültségű és kis frekvenciájú delta tevékenység válik uralkodóvá, majd később, mikor az alvás elérte a legmélyebb stádiumot, megjelenik a lassú oszcilláció. (3. ábra) Az alvásciklusok második fele REM (Rapid Eye Movement) fázisból áll [2]. Elnevezésének megfelelően ez az alvásfázis gyors szemmozgásokkal jellemezhető, amelyek némileg különböznek az ébrenlét alatti szemmozgásoktól, azoknál lassúbbak és nagyobb amplitúdójúak. Az EEG alapján fokozott agyi aktiváció valószínűsíthető: eltűnnek a deltahullámok és az alvási orsók, helyettük kevert béta- és théta-hullámok jelennek meg. EEGjegyek alapján a REM fázis nagyfokú hasonlóságot mutat az NREM alvás 1. stádiumával. 3. ábra Az egyes alvásfázisokra jellemző EEG-mintázatok [2] 11
III.3.1. (4.ábra) Az NREM alvást meghatározó neurális rendszerek Elalváskor az agytörzsi kolinerg neuronok aktivitása csökken, és az NREM alvásban alacsony marad. A csökkent agytörzsi kolinerg aktivitás csökkenti a talamokortikális neuronok ingereltségének szintjét (1), és a talamikus retikuláris rendszerre kifejtett gátló hatást (2).A talamokortikális neuronok spontán vagy ingerlésre adott akciós potenciáljai a kérgi kortikotalamikus neuronok mellet (3) kollaterálisokon keresztül serkentik a retikuláris talamuszt is (4), ami a serkentésre gátlással válaszol. Ez a gátlás megszünteti a talamokortikális neuronok aktivitását, de egyszersmind kiiktatja saját forrását is (4), ezért megszűnik. A gátlás megszűnésekor a folyamat újraindulhat. A kortikotalamikus neuronok a talamokortikális neuronok ritmikus serkentése és gátlása hatására ritmikusan depolarizálódnak és hiperpolarizálódnak, ami az EEG-ben előbb alvási orsók, majd delta hullámok formájában jelentkezik. Depolarizáció esetén a kortikotalamikus idegsejtek akciós potenciáljaikkal bekapcsolódnak a serkentés és gátlás váltakozását fenntartó körbe a talamokortikális és a retikuláris talamikus rendszerek serkentése révén (6 és 7). E folyamat eredményeként a perifériás ingerek feldolgozása akadályozott (8), mert a talamokortikális neuronokat ingerelve rekurrens gátlást indukálnak (4 és 5), ami megakadályozza a folyamatos információáramlást. (részleteket lásd a következő alfejezetben) 4. ábra A NREM alvást jellemző talamokortikális oszcilláció üzemmód szemléltetése [2] 12
III.4. Lassú hullámú alvás (Slow Wave Sleep) és lassú oszcillációk Mircea Steriade és munkatársai írták le először ezt a kérgi és talamikus neuronokból intracellulárisan elvezetett lassú (<1 Hz) oszcillációt [1]. Ez a természetes alvás és altatás alatt megfigyelt oszcilláció a szinkronizált neuronhálózatok aktivitását tükrözi. A szinkronitás fogalmait és a szinkronizált és deszinkronizált EEG mintázatok közötti különbségeket az elmúlt hat évtizedben széles körben használták az alvás alatti nagy amplitúdójú lassú hullámok és az ébrenlétre jellemző alacsony amplitúdójú gyors hullámok megkülönböztetésére. Valószínűleg Adrian és Matthews [12] voltak az elsők akik felvetették, hogy az EEG hullámok amplitúdója arányos a neuronális szinkronitás mértékével. Azonban, hogy következtethessünk a neuronok közötti szinkronitás folyamataira, egyidejűleg több helyről kell elvezetnünk a jeleket. Steriade és munkatársai több helyről történő intracelluláris elvezetésekkel megmutatták, hogy alvó macskákban - ketamine/xylazin anesztézia és természtes alvás során egyaránt - a lassú oszcillációk alatt a kérgi neuronok ritmikus hiperpolarizációs és depolarizációs periódusokat produkálnak [1,3,4,5]. A hiperpolarizációs fázisban az idegsejtek pár száz milliszekundumig inaktívak ( down-state ), míg a depolarizációs fázisban a membránpotenciál meghaladhatja a tüzelési küszöbértéket, amitől a neuronok akciós potenciálokat generálnak, tüzelnek ( up-state )(5. ábra). Rétegelektródákkal az agykéregből elvezetett mezőpotenciálon a down-state -et negatív polaritás jellemzi a felszínhez közeli rétegekben (superficial layers), majd a mélyebb réteg felé haladva egy polaritás-fordulás követően a mezőpotenciál polaritása pozitívra változik. Up-state esetén ennek pont a fordítottja igaz: a felszíni, szupragranuláris rétegben pozitív, míg az infragranuláris rétegekben negatív polaritású lokális mezőpotenciálként vezethető el. Állatokon végzett in vivo és in vitro kutatások, valamint számítógépes modellek kimutatták, hogy a lassú oszcillációk létrehozásában szinaptikus, nemszinaptikus hálózati és intrinzik membránáramok vesznek részt. A lassú oszcilláció a kéregben spontán is kialakul, függetlenül a többi agyi struktúrától. Megmarad talamikus lézió esetén is, de eltűnik az intrakortikális pályák elmetszése után. (viszont néhány óra után újra helyreáll). Az oszcilláció kéregbeli eredetét támogatja az a megfigyelés is, hogy az up-state és a down-state is korábban jelenik meg a kéregben, mint a talamuszban. Egy bizonyos mennyiségű agyszövet azonban szükséges a kérgi lassú hullámok kialakulásához, bár bizonyos körülmények között in vitro kérgi agyszeletek is mutathatnak hasonló mintázatokat. Az alvás regeneráló hatását csak úgy érheti el, ha az élőlény mentesül az őt érő külső és belső ingerek hatásától, ehhez azonban meg kell akadályozni, hogy az érzékszervek által közvetített ingerületek eljussanak a magasabb agyi területekre. Viszont egyúttal lehetőséget is kell adni, hogy az élőlény számára veszélyes és ártalmas ingerek feldolgozásra kerüljenek az 13
agykéregben. Erre a lassú oszcilláció két fázisa megfelelő lehetőséget nyújt: az up-state alatt nyitva van egy ablak a kéreg felé, így az érzékszervi átkapcsolóközpontként működő talamuszból érkező bemenetek elérhetik a kérget, míg down-state alatt ez az ablak zárva van, ezáltal a szenzoros bemenetek jutnak el a kéregbe. Tehát ez az ingerfeldolgozás egy olyan hatékony stratégiáját jelentheti, amely lehetővé teszi, hogy lassú hullámú alvás alatt is elérhessék a külső világ hang-, tapintási- és szagingerei az agykéreg szintjét, egyúttal megtartva az alvás összes pozitív hatását. Ennek a stratégiának tehát illeszkednie kell a lassú hullámú alvás fiziológiás körülményeihez, tehát a lassú oszcilláció fázisaihoz. Tovább részletezve az előbb említetteteket: a mechanizmusnak egyrészt biztosítania kell elegendő mennyiségű alvást a szervezet számára (sleep protecting effect), másrészt az ébrenlét alatti ingerfeldolgozási követelményeknek is teljesülniük kell (awakening effect). Ahogy az már korábban említettem, a kéreg egy aktív ( up-state ) és egy inaktív ( downstate ) állapot között oszcillál az alvás mély fázisában. A down-state alatti hiperpolarizáció nem nyújt megfelelő feltételeket az ingerfeldolgozáshoz, mivel az idegsejtek egy kevésbé ingerelhető állapotban vannak. A fordítottja igaz az up-state -re: aktív állapotban (ami hasonlít az ébrenlét állapotához) van ingerfeldolgozás, ez az állapot felel az ébrenléti hatásért (awakening effect). Az inaktív állapot (ahol az ingerfeldolgozás mértéke lecsökken) pedig az alvás-védő hatásért lesz felelős (sleep protecting effect). Például amikor egy zebra alszik, és egy oroszlán lépéseinek gyenge zörejét hallja, alszik tovább, mivel az inger nem elég erős a zebra felébresztéséhez (például, ha az inger pont akkor érkezett amikor az agykéreg éppen az inaktív állapotban volt), azonban amikor a zörejt egy üvöltés, az oroszlán szaga vagy még több lépés követi, az agykéreg reagál és a zebra felébred (a több inger nagyobb eséllyel kerül feldolgozásra, vagyis amikor éppen aktív állapotban van az agykéreg). Egyre több bizonyítéka van annak, hogy az alvás NREM fázisai, különösen a lassú oszcillációk fázisa fontos szerepet játszik a memóriakonszolidációban, emberek és állatok esetén egyaránt. Ezen folyamatok alapvető táptalaja a theta/gamma kölcsönhatások, az alvási orsók és még más egyéb, beleértve a lassú oszcillációk up-state -jeihez kötött gamma oszcillációkat is. Feltételezik, hogy a lassú és delta oszcillációkkal társított szinaptikus plaszticitási folyamatok hozzájárulhatnak az ébrenlét alatt megszerzett memórianyomok konszolidálásához, megszilárdításához. Lassú oszcillációk természetes alvás alatti extracelluláris elvezetési adatainak elemzésére alapozva, felvetették, hogy a lassú hullámú alvás aktív állapotai ( up states ) alatti gyors oszcillációk (ripple) az ébrenlét alatt megszerzett tapasztalatok gyors visszajátszását tükrözhetik. 14
5. ábra Ketamine/xylazinnal altatott patkányból 24 csatornás rétegelektródával elvezetett lassú oszcillációk. Az ábra tetején az egyik csatornáról elvezetett lokális mezőpotenciál néhány másodperc hosszú részlete látható. Alatta ugyanez a csatorna látható 500 és 5000 Hz között megszűrve és egyenirányítva, mellyel a többsejt-aktivitást jeleníthető meg. Az ábra alján látható, hogy éppen down vagy up state -ben vagyunk-e. A down state -hez tartozó pozitív mezőpotenciál arra utal, hogy a kiválasztott csatorna éppen a agykéreg valamelyik mélyebb rétegében volt. III.5. A szenzoros eseményhez-kötött válasz Az eseményhez-kötött válaszok (potenciálok) olyan agyi potenciálváltozásokat tükröznek, amelyek valamely esemény (pl. mozgás indítása) vagy különböző természetű szenzoros ingerek (pl. hang, fény, tapintás) hatására az eseménynek vagy ingernek megfelelő agystruktúrákban keletkeznek [7]. A szenzoros eseményhez-kötött potenciál (EKP) kategóriában az inger modalitásának megfelelően beszélünk akusztikus, vizuális, szomatoszenzoros, olfaktórikus, gusztatórikus, vesztibuláris és fájdalom kiváltotta EKP. A klasszikus értelmezés szerint az EKP-k fő jellemzője, hogy a hátterükben álló neuronális aktivitás a kiváltó ingerrel szigorú idő kapcsolatban áll (time-locked). Ez tulajdonképpen abból adódik, hogy az EKP-k EEG-ből való kinyeréséhez átlagolást használunk, ezért azon komponensek, melyek időben nem szigorúan kötöttek a kiváltó inger adásának időpontjához, kiátlagolódnak a válaszból. Az EKP-k egymást követő pozitív és negatív polaritású kitérésekből, hullámokból állnak. Az EKP-k hullámai, akárcsak a spontán EEG-hullámok, idegsejtpopulációkon létrejövő excitátoros és inhibitoros posztszinaptikus potenciálok (EPSP, IPSP) szummációjaként jönnek létre, és a keletkezés helyéről ún. volumenvezetéssel terjednek a környező szövetekre. A konkrét generátorfolyamathoz köthető hullámokat komponensnek nevezzük. Az EKP-k különböző komponenseit funkcionális jellemzőik alapján exogén és endogén komponensekre oszthatjuk. Az exogén komponensek amplitúdója és latenciája főleg az inger fizikai paramétereitől 15
függnek, míg az endogén komponensek inkább kognitív folyamatokkal mutatnak összefüggést. Régebben mezogén komponenseket is megkülönböztettek, melyeket a fent említett tényezők mindegyike befolyásol, ma azonban ezt a kifejezést már nem nagyon használják. A komponensek fenti felosztása részben latenciában is elkülönülő csoportokra bontja az akusztikus EKP hullámait. Az egymást követő EKP komponensek latenciái hűen tükrözik az agyi információfeldolgozás időbeli viszonyait. Például emberben az akusztikus EKP exogén (korai) komponensei a 20-150 ms-os időtartományban, míg az endogén (késői) komponensek a >150 ms időtartományban jelentkeznek. Macskán a különböző komponensek latenciája rövidebb. A legkorábbi komponens latenciája a hallókéregben 7-8 ms, a határ az exogén és endogén komponensek közt pedig kb. 60 ms-nál húzható meg. Generátoraik invazív vizsgálata adatokkal szolgálhat az őket létrehozó neuronális folyamatokra vonatkozólag, ami lehetővé teheti a különböző szenzoros és kognitív jelenségek hátterében álló idegi működések megismerését és megértését. Egy EKP komponenst tulajdonképpen háromféle módon lehet jellemezni: - a komponens amplitúdója, latenciája és formája (konfigurációja) - a komponens funkcionális jellemzése (kapcsolata különböző exogén (az inger fizikai tulajdonságai) ill. endogén (kognitív) faktorokkal) - a komponens topográfiája szerint A dolgozatban olvasható kísérletek során szomatoszenzoros ingerlést alkalmaztunk (bajuszingerlés, whisker-stimulation), melynek részletei a következő fejezet végén olvashatóak. Ezen kísérletek során azonban az ingerlés hatására keletkező EKP tulajdonságainak részletes vizsgálata nem olyan fontos, csupán a megléte a lényeges, tehát, hogy kapunk-e megfelelő válaszjeleket az elvezetett területről. Amennyiben igen, akkor valószínűleg jó helyre implantáltuk az elektródákat, tehát a kísérlet folytatódhat, ha azonban mégsem jelenik meg a kiváltott válasz, akkor az elektródák újrapozícionálása szükséges. III.6. A bajuszingerlés és a lassú oszcilláció kapcsolata A bajuszszőrök a patkányok legfontosabb érzékszervei közé tartoznak, tájékozódás során nagyobb mértékben támaszkodnak tapintásukra, mint látásukra. Az egyes szőrszálakat akár egymástól függetlenül is képesek mozgatni, átlagosan 7 Hz-es frekvenciával. A bajuszszőrök agyi reprezentációjáért a primer szomatoszenzoros területen található barrel kéreg a felelős. Hasenstaub és munkatársai [11] altatott patkányon kimutatták, hogy a diszkrét, rövid idejű (50-100 ms) bajuszingerek megváltoztathatják a lassú oszcillációk aktuális állapotát, up-state -et down-state -be, vagy fordítva, down-state -et up-state -be juttatva. Az 16
előbbit termináló up-state -nek (terminating up state), az utóbbit, pedig kiváltott up-state - nek (evoked up state) nevezték el. A kísérlet a szomatoszenzoros barrel kortex területén történt, intracelluláris elvezetéssel, üveg mikropipetta felhasználásával. Az ingerléseket egy piezoelektromos stimulátorhoz kapcsolt üvegpipettával végezték, melynek másik vége az 1 cm-esre levágott bajuszszőrökhöz kapcsolódott. Ezután megkeresték a mozgatott bajuszszőr reprezentációjáért felelős kérgi idegsejtet, mely a legnagyobb amplitúdójú választ adja a legrövidebb időn belül. A diszkrét ingerek 500 ms-onként követték egymást, trapezoid emelkedik-és-tart (ramp-andhold) típusúak voltak, amplitúdójuk pedig véletlenszerűen változott nullától a bajuszszőr 2 mm-es kitéréséig. Intracelluláris elvezetés során az up-state -re depolarizáció és akciós potenciálok jellemzők, míg a down-state -re hiperpolarizáció. Az intracelluláris elvezetés tulajdonságai alapján szétválogatták az ingereket, hogy a lassú oszcilláció mely fázisába estek. Négy csoportot hoztak létre: (1) kiváltott up state -ek, ha az inger down state -be esett, de röviddel utána (kb. 50ms) up state következett, tehát állapotváltás történt. A (2) down-to-down csoportba azok az ingerek kerültek, ahol az inger a down state -ben volt jelen, és utána nem történt állapotváltás. A harmadik csoport a (3) terminálódó up state -ek, tehát az up state -ben található ingert röviddel down state követi. Végül az (4) up-to-up csoport: inger az up state -ben, melyet 50 ms-al nem követ állapotváltás down state -be. A kísérleteik során tehát megfigyelték, hogy gyakran röviddel (50 ms) az ingerek után állapot-váltás történt. A down-to-up váltások nagyobb valószínűséggel fordultak elő, mint az up-to-down váltások. Egy előző állapotváltás után közvetlenül szinte sosem történt újabb váltás inger hatására, viszont 300-400 ms-al a váltás után, ha inger jött, majdnem mindig volt kiváltott up state vagy termináló up state. Nem csak az inger időzítése, hanem erőssége is kapcsolatban áll az állapot-váltásokkal: erősebb inger nagyobb valószínűséggel vált ki down state -ből up state -et. A fenti eredményeket figyelembe véve célom volt megvizsgálni, hogy van-e kapcsolat a szenzoros ingerléssel kiváltott válaszok és a lassú oszcilláció állapotai között altatott patkányon valamint, hogy a szenzoros ingerlés válthat-e ki up state -eket illetve down state -eket. Míg a fenti esetben az elsődleges szomatoszenzoros kérgi területeket vizsgálták intracelluláris elvezetéssel, az én esetemben a vizsgálódás helye a parietális asszociációs kéreg, lokális mezőpotenciál és többsejt-aktivitás elemzésével. Célom továbbá megvizsgálni, hogy a bajuszingerlés képes-e a lassú oszcilláció vezérlésére, szinkronizálására. 17
IV. Műtéti áttekintés, elvezetési metódus IV.1. A felhasznált elektródák A Pázmány Péter Katolikus Egyetem Információs Technológiai Karának elektrofiziológiai laborjában a műtétek során egy 24 kontaktusú rétegelektróda került beültetésre a patkányok agyába. Rétegelektróda: 24 elvezetési kontaktus található rajta, az egyes csatornák között 100 mikrométer távolság van. Az elektróda vastagsága 350 mikrométer, benne 24 db polyimid szigetelt platina-iridium vezeték fut, amelyek egyenként 25 mikrométer vastagságúak, és ezek átmetszett része adja az elvezetési kontaktust. (A kísérlet során alkalmazott elektróda 13. és 22. kontaktusa rossz volt, ezeket a feldolgozás során eltávolítottam) A rétegelektróda a 6. ábrán látható. A 7. ábra bal oldalán az agykéregbe szúrt elektróda térbeli elhelyezkedése látható. 6. ábra 24 csatornás rétegelektród Ajobb oldali képen az elektróda hegye látható kinagyítva, melyen már kivehető a 24 kontaktus és az elektróda végén található kb. 1mm-es hegyes csúcs, amivel az implantálás során az agyszövetbe hatolunk 18
7. ábra Bal oldalon látható a rétegelektróda térbeli elhelyezkedése: középen egy piramissejt tőle balra pedig egy rétegelektróda első 16 csatornája. A kis ábrán egy szinapszis látható. Jobb oldali ábra: a rétegelektródáról elvezetett mezőpotenciál (bal grafikon) és soksejt aktivitás (jobb grafikon) IV.2. Az elektródák implantálása A kísérleti patkányoknál akutan beültethető elektródákat használtunk. Az elektródák implantálását követően történtek az ingerléses és ingerlésmentes neurális jelek elvezetése, melyeket Grand László doktorandusz hallgatóval és Dr. Ulbert István témavezetőmmel közösen végeztünk. Ezek után a kapott jelek feldolgozásra kerültek. A kb. 500 g súlyú patkányok 1ml interperitoneálisan (ip) adott ketamin/xylazine (0.2ml/100g) keverékkel lettek elaltatva a műtét előtt. Ezután óránként további kb. 0.2 ml ketamin/xylazint kaptak intramuszkulárisan (im). A patkány sztereotaxiás agyi atlaszának [8] (A referenciapont a patkány koponyáján található bregma volt 8. ábra, bal oldal) segítségével meghatároztuk az elektródák kívánt pozícióját, majd sztereotaxiás készülék (8. ábra, jobb oldal) segítségével Grand László doktorandusz hallgató implantálta azokat. A sztereotaxiás technika használata lehetővé teszi, hogy a megfelelő agyszövettani atlaszok alapján a tér három irányának megfelelően 0.1 mm-es pontossággal az agy adott területére juttassuk az elektródákat. A berendezés számos módosított változatát használják, és a sztereotaxikus készülékek különböző fajokra készíthetők (patkány, nyúl, macska, kutya, majom). A sztereotaxiás készülék koponyarögzítőből, valamint egy elektródatovábbító berendezésből áll. Az anesztetikummal kezelt, felszínesen altatott állat koponyáját a külső hallójáratba helyezett fémrudakkal, valamint a szemfogak mögé helyezett fémrúddal rögzítjük. 19
Az elektródatovábbító (mikromanipulátor) antero-poszterior (AP), medio-laterális (ML) és vertikális (V) síkban képes az elektródok pozícionálására. 8. ábra Bal oldali kép: mérőpontok a laboratóriumi patkány koponyáján (B bregma, L lambda) jobb oldali kép: sztereotaxiás célzókészülék (SF) A narkózisban lévő kísérleti állat fejét az előzőekben leírt módon sztereotaxiás készülékben rögzítjük. A koponyatetőn a bőrt a középvonalban átvágjuk, a temporális izomzatot lefejtjük. A koponyatetőn a csontot megtisztítjuk a csonthártyától. Egy referenciaelektród segítségével a sztereotaxiás készüléken beállítjuk a kívánt AP és ML értékeket, majd a pontos helyet megjelöljük a koponyacsonton. Ezen a helyen a csontot 1-2 mm-es fogászati fúróval átfúrjuk a dura materig. Az elektródák pontos helyének meghatározásához szükséges lehet a műtét alatti agyi aktivitás monitorozása is. Ahhoz, hogy az adott agyi struktúra megfelelő pontjára tegyük az elektródát, időnként el kell vezetni az ottani aktivitást és kiértékelni, hogy valóban jó helyen járunk-e. Ezt a feladatot a többi elvezetéssel egyetemben egy Dr. Ulbert István által fejlesztett mintavevő-rendszerrel valósítottuk meg. A mikromanipulátor óvatos mozgatásával az elektródot a megfelelő vertikális koordináta-értékig süllyesztjük. A kísérletek végén az állatokat túlaltatják és perfundálják az agyukat. Ezt követően az elektródák szúrt csatornájának pontos helye hisztológiai vizsgálatok során derül ki (9. ábra). 20
9. ábra Hisztológiai vizsgálatokkal meghatározásra kerül az elektródák pozíciója. A képen az egyik kísérleti patkány agyából készített agyszelet látható, melynek felső-középső részen található sötétebb foltok mutatják az elektróda helyét. A kép felső részén az agykéreg, középső részén a hippocampus látható. IV.3. Elvezetési metódus A csatornakiosztás az eltérő vertikális pozíciók miatt nem mindig volt ugyanaz, de egy fejezettel később látható lesz az elektródák pontos elhelyezkedése a patkány agyában. Egy ún. trigger csatorna is alkalmazva lett, ez a 24-es kontaktus szignáljai helyén jelzi az állatnak adott bajuszingerek idejét. Az agyhullámok megfelelő minőségű rögzítéséhez szükséges a jelek előerősítése. Az előerősítő a rétegelektróda kontaktusokkal ellentétes végén található. A jeleket ezután tovább erősítjük és szűrjük, majd A/D kártyával (National Instruments PCIe 6259, konvertálási tartomány: 0.1-20kHz, felbontás: 16 bit) és a Dr. Ulbert István által fejlesztett LabView alapú mintavevővel digitalizáljuk. A jeleket 20 khz-el mintavételezzük, végül egy.cnt kiterjesztésű folytonos fájlt kapunk eredményül. A sokcsatornás jelek ezek után megjeleníthetők, valamint feldolgozhatóak a NeuroScan [9] programcsomaggal, illetve az MCFA [6] és a SpikeSolution [5] Matlab [10] alapú szoftverekkel. Megfelelő tartományban való szűréssel megkaphatjuk külön a lokális mezőpotenciált (local field potential - LFP) és a többsejt aktivitást (multiunit activity - MUA)(7. ábra, jobb oldali kép). IV.4. Elektródák elhelyezkedése Patkánynál legtöbbször a bregmát tekintik az origónak - mely a patkány koponyacsontjainak illeszkedési helyén található - ehhez a ponthoz viszonyítva kerültek elhelyezésre a műtött patkányok elektródái is. A kraniotómia a parietális asszociációs kéreg 21
fölött történt mindkét esetben, csupán néhány tized milliméter eltérés volt a végső célterületek között. A parietális asszociációs kéreg a különféle szenzoros jelek integrációjáért, valamint magas-szintű információfeldolgozásért felel. Az első patkány (Rat15) esetében a célterület a bregmától posterior 3.8 mm-re volt, míg laterálisan 1.5 mm-re volt. (10. ábra felső kép) A második patkánynál (Rat 17) a célterület 4 mm-re volt a bregmától posterior irányban, és kissé laterálisabban az előbbi patkányénál, 2 mm-re az origótól (10. ábra alsó kép). 10. ábra Felső kép: A 15-ös számú patkányba implantált rétegelektróda elhelyezkedése az agyi atlaszra rávetítve (Target: AP -3.8 mm, ML 1.5 mm) Alsó kép: A 17-es számú patkányba implantált rétegelektróda elhelyezkedése az agyi atlaszra rávetítve (Target: AP -4.0 mm, ML 2.0 mm) 22
IV.5. A bajuszingerlés részletezése Az altatott állat bajuszszőreit egy léptető-motorból kialakított készülék segítségével ingereltük. Egyszerre több bajuszszőrt (kicsiket és nagyokat egyaránt) igereltünk. Az ingerlések az elektródával kontralaterálisan történtek (néhány esetben ipsilaterális ingerlés is történt). A bajuszingerléseket eltérő frekvenciákkal (0.5, 0.66, 1, 1.66, és 2 Hz), ingererősségekkel (1 és 2 V), valamint ingerhosszal (50 és 100 ms) végeztük. Az ingererősséggel a néhány centiméter hosszú ingerlőpálcika kitérését tudtuk szabályozni (1V-os ingererősséggel kb. 12 -os kitérés hozható létre). Ez 1 V-os ingerlés esetén kb. 2-3 mm-es mozgást jelentett a pálcika végénél, ahol az a bajuszszőrökkel érintkezett. Ezzel tehát befolyásolni tudtuk az érintett bajuszszőrök mennyiségét. Egy kiválasztott kísérleti elrendezésből (pl. 1 Hz, 1 V, 100 ms) kb. 5-10 percig készítettünk elvezetéseket, tehát így átlagosan 200-300 ingert tartalmazó adatfájlokat kaptunk. Készítettünk ezen kívül ingerlésmentes, spontán elvezetéseket is. A kísérleti körülményekről és a bajuszingerlőberendezésről a 11. ábrán láthatunk képeket. 11. ábra Bal oldalon az egyik kísérleti alany látható a sztereotaxiás készülék társaságában elvezetés közben. Jobb oldalon a bajuszingerlő-készülék. 23
V. Számítógépes analízis Az elvezetések során kapott nyers adatok tartalmazzák tehát a szükséges információkat, amelyeket különféle számítógépes elemző módszerek segítségével nyerhetünk ki. Ebben a fejezetben az általam az adatokon alkalmazott módszereknek a rövid ismertetése és bemutatása olvasható. A lassú oszcilláció fázisainak szétválogatását, az elvezetések tisztítását (artefaktok eltávolítása, rossz minőségű részek kivágása, hibás csatornák eltávolítása) a kereskedelmi forgalomban kapható NeuroScan Edit szoftverrel végeztem, míg az előbb említett számítógépes módszerekkel történő analízist két, Matlab alapú szoftverrel történt (MCFA és SpikeSolution). A Multiple Channel Frequency Analysis (MCFA, [6]) Matlab alapú programcsomag, mely Fourier vagy Wavelet analízisét tudja kiszámítani sok csatornának egy időben, majd az eredményt egy kezelőfelületre teszi, ezáltal könnyítve meg az elvezetett sokcsatornás jelek idő-frekvencia teljesítményeinek nyomonkövetését, összehasonlítását. Többféle időfrekvencia elemzési módszert található benne. Az MCFA ezen kívül jól használható koherencia, komoduláció vizsgálatára; jelteljesítmény-analízisre, áramsűrűség-eloszlás (Current Source Density: CSD) vizsgálatára, különböző frekvenciájú hangsorozatok által kiváltott potenciálok elemzésére, valamint sokcsatornás EEG- vagy CNT-jel megtekintésére. Ezzel a programmal végeztem a jelek CSD, MUA valamint idő-frekvencia elemzését. A SpikeSolution egy szintén Matlab alapú többcsatornás feldolgozó rendszer, mely rengeteg hasznos funkcióval segíti elemezni az elvezetési adatokat. Egyik fő erőssége az automatikus állapot-detekciós módszer. Ezt a szoftvert felhasználva végeztem a Hilberttranszformációval történő állapotdetektálást, a Peristimulus Time Histogram-al (PSTH) valamint a fázis-psth-val történtő elemzéseket. V.1. A lassú oszcilláció fázisainak elkülönítése Hogy hozzá tudjunk kezdeni az adatok elemzéséhez, az egyik első lépés az up-state - ek és down-state -k elkülönítése. Erre többféle algoritmus létezik, ezek többsége jelenleg még nem megfelelő hatékonysággal működik. A legpontosabb módszer, és egyben a leglassabb is, a manuális szétválogatás. Ezen kívül három fő állapot-detekciós módszer van, melyet gyakran használnak: az egyik a gamma frekvenciasávban működik (30-200 Hz) [14, 15], a másik a multiunit-aktivitást veszi figyelembe [5] (500-5000 Hz), míg a harmadik a Hilbert transzformáció segítségével különíti el a lassú oszcilláció fázisait[13]. Ezek közül talán a leghatékonyabb a Hilbert-módszer, tehát ezt és a manuális, szemmel történő szétválogatást választottam a két fázis elkülönítéséhez. 24
V.1.1. Up-state kezdetek válogatása manuálisan, szemmel A nyers elvezetések alapján a legtöbb esetben nem lehet szabad szemmel látni az upstate kezdetek pontos helyét, idejét. Ezért előbb szükséges az adatok szűrése vagy a gamma sávra (30-200 Hz) vagy a soksejt aktivitás frekvenciasávjára (500-5000 Hz), esetleg mind a kettőre. Először azonban, mivel a 24 csatornás rétegelektródánk nem minden kontaktusa az agykéregben foglalt helyet, a számunkra érdektelen kontaktusok jeleit eltávolítjuk. Ennek az volt az oka, hogy az elektróda néhány kontaktusa a közvetlenül az agykéreg alatt található hippocampusba került, így az elvezetett adatok felhasználhatóak egy párhuzamosan folyó kísérletsorozathoz is, mely az agykéreg és a hippocampus közötti kapcsolatot vizsgálja. Ezután a hibás csatornák jeleit (jelen esetben a 13-as és 22-es) először interpoláljuk a csatornák között (és simítjuk egyben egy Hamming ablakkal konvolúciós maszk: [0.23 0.54 0.23]), valamint a trigger csatornát (24-es, amelyen a bajuszingerek láthatóak) nem vettem figyelembe. Ezután gradiens elemzéssel (téri deriválás) megállapítjuk két szomszédos csatorna közötti változást, tulajdonképpen a két szomszédos csatornát kivonjuk egymásból, megkapva a változást. Mivel lassú oszcilláció során a down-state -ek esetében a változás nagyjából konstans, a neuronok csökkent tüzelőképessége miatt, és mélyebb agyi területeken a lassú oszcillációtól eltérő aktivitás jellemző (hippocampus CA1 és CA3 régiója), a gradiens elemzéssel elkülöníthetővé válnak a lassú oszcillációt tartalmazó kérgi csatornák (általában az első 10 csatorna), melyeken ekkor egy periódikus, a down-state -eknél nagyjából sima és konstans jel látható. (12. és 13. ábra) Miután megkaptuk a kérgi csatornák helyzetét, a szükségtelen csatornákat eltávolítottuk, ezzel is csökkentve a feladat méretét és növelve az elemző módszerek sebességét. Ezután kiválasztunk 3 vagy több kérgi csatornát, valamint a trigger csatornát, majd az egyik csatornát a gamma sávra, egy másikat a soksejt-aktivitás sávjára megszűrjük és egyenirányítjuk, a harmadikat pedig változatlanul hagyjuk. A trigger csatornára azért lesz szükségünk, hogy a későbbiekben kiválogathassuk azokat az up-state -eket, melyeket a down-state -ekben indított stimulusok előztek meg. Végül a kapott jelek segítségével már könnyen elkülöníthetőek az aktív és inaktív fázisok. (14. ábra) 25
12. ábra A nyers elvezetés 24 csatornája (13-as, 22-es földelt csatornák, 24-es trigger csatorna) 13. ábra Interpolálás és gradiens elemzés után kapott jelalak. Látható, hogy az első 11 csatornán a jelalak periodikus, és tartalmaz kb 300 ms hosszú konstans részeket. Ezek lesznek a lassú oszcillációkat tartalmazó kérgi csatornák. Az alsó négy csatorna (18-21) a hippocampus CA1 régiójából elvezetett mezőpotenciál 26
14. ábra A lassú oszcilláció fázisai a mezőpotenciál (első három csatorna), a gamma sávra szűrt csatorna (4. csatorna, 30-200 Hz, zero phase shift, 24dB/okt, rectified), és multiunit aktivitás (5. csatorna, 500-5000 Hz, zero phase shift, 24dB/okt, rectified) segítségével már könnyen elkülöníthetőek (utolsó csatorna a triggercsatorna) V.1.2. Hilbert-transzformáció [5] Az agyi elvezetések zajosak és nemstacionáriusak. A Hilbert-transzformáció egy olyan lineáris operátor, mely hasznos lehet nemstacionér jelek elemzésére, a frekvenciát a fázisban bekövetkező változás arányaként kifejezve, úgy hogy a frekvencia időben változhat. Azonban a nyers elvezetésekben több ilyen időben változó frekvencia is jelen van egyszerre, ezért egy előzetes szűrés szükséges a lényegtelen komponensek kiküszöbölésére. Ez a lassú oszcilláció esetén egy 0.3-3 Hz-es sávszűrést jelent. Míg a gyors Fourier-transzformáció (FFT) jobb frekvencia-felbontást ad frekvencia, fázis és amplitúdóváltozások állapotváltozóinak gyors változásairól, addig a Hilbert-transzformáció időben ad jobb felbontást, mivel az FFT és waveletek időbeli felbontása a Nyquist feltétel miatt kötve van. A Hilbert-transzformáció definíciója a következő: 27
ahol: Tehát a lassú oszcillációk fázisainak meghatározásához a kiválaszott kérgi csatornát megszűrjük a lassú oszcilláció frekvencia-tartományában (0.3-3 Hz). Így egy szinuszjelhez hasonló jelet kapunk, amelyen alkalmazzuk a Hilbert-transzformációt. Az eredmény egy fűrészfog jel, melynek minden pontja a jel aktuális fázisát tartalmazza. A fázis egy alsó korláttól megy felfele a fázisváltozástól függően bizonyos meredekséggel, majd elér egy felső korlátot, ahonnan visszazuhan az alsó korlátba. Ez a fűrészfogjel megy végig a lassú oszcilláció minden ciklusán. A feladat ezek után csupán meghatározni, hogy az up state kezdetek melyik fázisban kezdődtek. Ez a fázisérték nagyjából konstans a jel teljes hosszára egy elvezetés esetén, így ez egy viszonylag pontos módja az up-state kezdetek gyors kiválogatásának. Elvezetésenként és patkányonként ezek a fázisértékek azonban változnak, mivel a lassú oszcilláció frekvenciája általában a kísérleti állattól és az altatás mélységétől függően kis eltéréssel bár, de más értékű. A Hilbert-transzformációt ajánlatos az előző alfejezetben említett interpolált és gradiens elemzett jelen alkalmazni, és nem az eredeti jelen, ezzel is pontosabbá téve a detektálást (15. ábra). 15. ábra A Hilbert-transzformációval történő állapotdetektálás folyamata: Gradiens elemzés után megszűrjük a jelet a lassú oszcilláció frekvencia-tartományában, majd ezen alkalmazzuk a Hilbert-transzformációt. Végül meghatározzuk a lassú oszcilláció fázisaihoz tartozó értékeket a kapott fűrészfoghoz hasonló jelen 28
V.2. Esemény-körüli idő hisztogram (Peristimulus Time Histogram, PSTH, [5]) A stimulus és az up state -ek közötti kapcsolat vizsgálatára PSTH analízist használtam. Ez tulajdonképpen egy hisztogramot készít egy kiválasztott csatorna eseményei (a mi esetünkben az up state kezdetek lesznek az események), valamint egy trigger csatorna ingerei (bajuszingerlés időpontjai) között. Az egyik csatorna lesz a referencia (kérgi csatorna), ehhez lesznek viszonyítva a másik csatorna eseményeinek időpontjai. A PSTH elkészítése a következőképpen néz ki: fogjuk a két csatorna eseményeinek időpontjait, majd a referencia csatorna eseményeinek minden időpontjához létrehozunk egy általunk definiált méretű időablakot az eseménnyel a 0 időpontban. Az időablakot felosztjuk több kisebb időszegmensre vagy rekeszre (bin-ekre), majd megnézzük a trigger csatorna időértékeit minden ilyen időablak esetén. Amennyiben találunk olyan stimulust ami benne van ebben az időablakban, akkor a megfelelő szegmenst (bin), amelybe az inger esett, inkrementáljuk. Tehát a PSTH megmutatja, hogy hány stimulus esett a referenciacsatorna eseményeihez képest bizonyos időeltolással a megadott időablakba. Az időeltolás minimális és maximális értéke, valamint az időrekeszek (bin) nagysága változtatható. Az eltolás a vízszintes tengelyen látható, pozitív és negatív eltolások egyaránt értelmezettek. A rekeszértékek a pozitív oldalon a nulla időpont után történt események számát jelentik, míg negatív oldalon a referencia esemény előtt történt események számát. (16. ábra). Például ha vesszük az up state kezdetnél lévő rekeszt (50 ms-os rekesznagyság esetén tehát a (-25)-25 ms-os időrészletet nézve) és az tartalmaz mondjuk 50 eseményt, ez annyit jelent, hogy megvizsgálva az összes up state -et, összesen 50 inger található az up state -ek ezen időtartományában. Az időrekeszekben található események összege megadja tehát az elvezetésben található ingerek számát, azonban, ha az időablakunk nagysága nagyobb mint a ingerlés periódusideje (periódusidő = 1/frekvencia, tehát például 2 Hz esetén 0.5 s), akkor egyes ingerek több rekeszbe is beleszámolódnak, így az események összege már nem adja vissza az ingerek helyes számát. Fontos még megjegyezni, hogy ha megcseréljük a két kiválaszott idősor szerepét, tehát most a trigger értékek lesznek a referenciák, ugyanazt az eredményt kapjuk, csupán nulla időponton áthaladó függőleges tengelyre tükrözve. Ezzel a módszerrel fogjuk megvizsgálni, hogy milyen viszonyban vannak egymással a bajuszingerek és az up state kezdetek. 29
16. ábra PSTH példa: 50 ms-os időrekessszel, -300 ms-tól 500 ms-ig tartó időablakkal, a referenciaeseményekkel a 0 időpontban. Két csúcs látható kb. -100 és 400 ms-nál, ezekhez kb. 60 esemény tartozott. Az időrekeszekben található összes esemény száma: 548 V.2.1. Fázis PSTH (Phase PSTH) A fázis PSTH megmutatja hogy a lassú oszcilláció mely fázisában történt egy adott esemény, pl. bajuszingerlés időpontjai. A végeredményként kapott ábrán a lassú oszcilláció egy piros görbeként látható, a kék oszlopok pedig az események hisztogramját jelentik a megfelelő fázisban (17. ábra). A fázisrekeszek száma változtatható, hogy minél finomabb felbontást kaphassunk. A módszerhez a Hilbert transzformációt is felhasználjuk, tehát az előző fejezetek két módszerének kombinálása. A transzformációval fogjuk megkapni, hogy a lassú oszcilláció éppen melyik fázisában vagyunk. Esetünkben először szükségünk van tehát a bajuszingerlések időpontjaira. Ezután megszűrünk egy kiválasztott kérgi csatornát a Hilbert transzformációnál említett módon, a lassú oszcilláció frekvencia-tartományára, majd alkalmazzuk ezen a csatornán a transzformációt. A bajuszingerlések időpontjaiból és a kapott fűrészfogjelből számolhatjuk ki a fázis PSTH-t. 30
17. ábra Fázis PSTH példa: Piros görbével a lassú oszcilláció fázisa van jelölve, a kék téglalapok pedig az oszcilláció egy adott fázisába eső események hisztogramját jelentik. Tehát a vízszintes tengelyen a fázisrekeszek láthatóak, a függőlegesen pedig egy adott rekeszbe eső események száma V.3. Áramforrás sűrűség (Current Source Density, CSD[5, 6, 16]) A CSD térkép az idegsejt-populációk transzmembrán áramainak lokális összege egy adott területen (18. ábra). Különböző neuronok más és más áramokat generálhatnak az áram nagysága és polaritása tekintetében. A pozitív és negatív membránáramok egymás ellen hatnak, így a CSD egy makroszkópikus (mezőpotenciál szintű) és nem mikroszkopikus leírás, tehát lokális makroszkopikus membránáramok jeleníthetőek meg vele. A CSD megadja az áramnyelők (sinks - pozitív töltések vándorolnak a membránon keresztül a sejtbe) és áramforrások (sources pozitív töltésekből kialakuló áram, ki az extracelluláris térbe) téridőbeli mintázatát. A fiziológiai jelentése a CSD-nek: az áramnyelők a membrán depolarizációja és visszatérő áramforrás esetén míg az áramforrás hiperpolarizáció vagy visszatérő áramnyelő esetén figyelhető meg. A CSD a mezőpotenciál második térbeli deriváltjával közelíthető. 31
18. ábra CSD map az átlagolt up state kezdetekre: pirossal az áramnyelők (sink), kékkel az áramforrások (source), x-tengely: idő (ms), az up-state kezdettel a 0 időpontban, y-tengely: csatornák V.4. Multiunit analysis (MUA) map A többsejt aktivitás a közeli neuronok akciós potenciálját mutatja (19. ábra), viszont a tüzelési küszöbérték alatti poszt-szinaptikus potenciálok, mint az EPSP, IPSP megjelenítésére nem képes. Klaszterezéssel egysejt-aktivitást is vizsgálhatunk (SUA single unit activity), mely során a kiválogatott idegsejtek tüzelési mintázatát jelenítjük meg. A többsejt aktivitás vizsgálatához az elvezetést meg kell szűrni egy sávszűrővel az 500-5000 Hz-es tartományban (zero phase shift, 24dB/oct, rectify). A MUA és CSD összehasonlítása fontos lehet a mezőpotenciál kérgi generátorainak működési mechanizmusainak vizsgálatához, ugyanis például egy nyelő a CSD térképen és tüzelés a MUA térképen szinaptikus serkentést jelent. 32
19. ábra A kérgi up state kezdetekre átlagolt többsejt-aktivitás térképe: pirossal az aktív területek, kékkel a tüzelésmentes részek. ), x-tengely: idő (ms), az up-state kezdettel a 0 időpontban, y- tengely: csatornák. Az ötös csatorna (csillaggal jelölve) jele külön, az ábra alsó felén látható V.5. Idő-frekvencia analízis [6] A Fourier-transzformáció (FT) használható nem stacionárius jelekre, amennyiben arra vagyunk kíváncsiak, hogy milyen spektrális komponenseket tartalmaz a jel, de arra nem, hogy mikor történnek azok. Azonban, ha pl. meg szeretnénk tudni, hogy mely spektrális komponensek, időben mikor történtek, akkor az FT erre a feladatra nem a legjobb választás. Ezen probléma megoldásához egy olyan transzformációt kell alkalmaznunk, amely reprezentálja a jel idő- frekvencia térképét. A wavelet-transzformáció többek között alkalmas erre a feladatra, tehát megadja egy jel idő-frekvencia felbontását. A Wavelet egy olyan időben korlátozott tartamú hullámforma, amelynek zérus átlaga van. A wavelet analízis ehhez hasonlóan egy jel olyan összetevőkre bontását jelenti, amely 33
összetevők egy eredeti ψ(t) (ún. anya) wavelet eltolt és átskálázott változatai. Az anya waveletet mindig a feladatnak megfelelően kell választani. Matematikailag az anya wavelet skálázása és eltolása a következőt jelenti: ahol ψ(t) az anya wavelet, b az eltolás, a a skála paraméter. Világos, hogy amint az a skála paraméter értéke csökken, úgy a wavelet is egyre jobban lokalizálódik spektrális tartományban, egyre inkább alkalmas a magas frekvenciás jelek elemzésére. Egy wavelet a frekvencia- idő síkot Δf *Δt méretű cellára bontja. Ebben a spektrális tartományban a szokásos idő- és frekvenciatartománybeli ábrázolás egy olyan speciális felbontásként fogható fel, amikor az adott cella egyik irányban végtelen kiterjedésű lesz. Az agyi elektromos jelek vizsgálatának területén egyik gyakran használt módszer, mellyel egy spektrogram formájában megkapjuk a jel idő-frekvencia felbontását az eseményhez kötött spektrális perturbáció (event-related spectral perturbation ERSP, [17]). Ahhoz, hogy megkapjuk az ERSP értéket, először kiszámoljuk a teljesítményspektrumot egy adott csúszóablakkal, majd átlagoljuk az adatokra. Az eredmény-képen az egyes képpixelek színe a teljesítményt jelzi decibelben (db) egy adott frekvenciaértéken és egy, az eseményhez viszonyított időértéken. Képlet formájában: ahol n az epoch-ok száma, pedig a k. adat becsült spektrális értéke az f frekvenciánál a t időpontban. Az érték kiszámítása szinuszos wavelet transzformáció segítségével történik. A szinuszos waveletek alkalmazása során a waveleteket meghatározó egyik fontos paraméter a ciklusok száma lassan emelkedik a frekvenciával együtt, amivel job frekvenciafelbontás érhető el a magas frekvenciák esetén, szemben a hagyományos szemlélettel, mely konstans ciklushosszat használ. Valamint ez a módszer jobban passzol a frekvenciák lineáris skálán való megjelenítéséhez. Az alapvonalra-normalizált ERSP-t pedig úgy kapjuk, hogy minden becsült spektrális értékből ( ) kivonjuk az átlagos alapvonali teljesítmény-spektrum logaritmusát, így láthatóvá válnak a frekvenciatartományon belüli teljesítményváltozások. Ezzel a módszerrel tehát megvizsgálhatjuk, hogyan változik a jelünk frekvenciaspektruma a lassú oszcilláció során. Az esemény ebben az esetben az up state illetve a down state kezdet lesz, ez kerül a nulla időpontba. Azt várjuk, hogy up-state esetén nő a lokális mezőpotenciálra jellemző frekvenciakomponenensek teljesítményértéke, 34
ugyanis ebben az esetben nő a neuronok tüzelési aktivitása, míg down-state esetén ezen frekvenciakomponensek teljesítménye csökken. 20. ábra Wavelet analízis a kérgi up state kezdetekkel a 0 időpontban. x-tengely: idő (ms) y- tengely: frekvencia (5-100 Hz). Látható a teljesítménynövekedés (színskála db-ben) a gamma és beta sávban (piros) up-state esetén és a teljesítménycsökkenés (kék) down state esetén 35
Bin count VI. Eredmények Az elvezetésekben látható lassú oszcilláció frekvenciája az egyik patkány esetében 1.9 és 2.1 Hz közötti volt, a másik patkánynál pedig 1-1.2 Hz-es. A két patkányon és a különböző paraméterű elvezetések vizsgálata során hasonló eredményeket kaptam, ezért jelen dolgozatban általában egy állatból származó adatokat ismertetek. Az up state kezdetek szemmel történő és Hilbert-transzformációval történő kiválogatása hasonló eredményt produkált. Ez PSTH-val leellenőrizhető (21. ábra). Tehát a többi adat elemzéséhez elegendő a hosszú és fáradságos manuális válogatás helyett az automatikus módszert használni. Number of peaks: 794 140 120 100 80 60 40 20 0-400 -300-200 -100 0 100 200 300 Window size (ms) 21. ábra A szemmel válogatott és a Hilbert transzformációval válogatott up-state kezdetek PSTHja. Látható, hogy a két módszer eredményei közel vannak egymáshoz,csupán +- 20ms-os az átlagos differencia. Miután megtörtént a szétválogatás, meg lehet vizsgálni az ingerek és az up-state kezdtek viszonyát. A PSTH és a fázis PSTH is hasonló eredményt mutatott: az up-state kezdett előtt kb. 50 ms-al egy csúcsot láthatunk (22. és 23. ábra). Tehát több inger volt jelen közvetlenül a down state up state átmenet előtt. Ez arra enged következtetni, hogy az ingerléssel up state -ek válthatóak ki. Ezen kívül érdemes még megemlíteni, hogy az up state előtt található ingerek nem csak elszórtan láthatóak az elvezetésekben, hanem több esetben is néhány másodpercen keresztül az up state kezdet előtt jelennek meg. Ebből azt lehet feltételezni, hogy nem csak up state kiváltásra képes az ingerlés, hanem egyúttal szinkronizálhatja is a lassú oszcillációt. Érdekesség még, hogy míg egy átlagos up state kb. 150 ms ideig tartott, a down state pedig dupla ennyi ideig (kb. 350 ms), az ingerek 36
Bin count körülbelül 50-50% arányban voltak jelen mindkét állapotban, tehát az up state -ekben nagyobb valószínűséggel voltak jelen az ingerek. 22. ábra A 15-ös patkány 1 Hz-es 1 V-os ingerlése során kapott fázis PSTH. 2 mm mélyen vagyunk az agykéregben. Látható egy csúcs a lassú oszcilláció egy bizonyos fázisnál. A következő ábrán látható lesz, hogy ez a csúcs azokat az ingereket jelenti, melyek kevéssel az up state előtt voltak jelen. 70 Number of peaks: 1997 60 50 40 30 20 10 0-1500 -1000-500 0 500 1000 Window size (ms) 23. ábra 37
A 15-ös patkány 1 Hz-es 1 V-os ingerlése során kapott PSTH. A nulla időpontban van az up-state kezdet. Látható, hogy az ingerek jelentős része röviddel az up state előtt csoportosul (csúcs 0 ms környékén). A csúcs 1 másodpercenként ismétlődik, az 1 Hz-es ingerlésnek megfelelően. Látható a képen még két kisebb csúcs: ezek azok az up state -ek ahol nem volt ingerlés, ugyanis a lassú oszcillációnk 2 Hz-es volt. Összehasonlítottam egy spontán oszcillációkat tartalmazó elvezetést és egy ingereket tartalmazó elvezetést, természetesen úgy, hogy az ingereket tartalmazó elvezetésből csak azokat az up state -eket választottam ki, amelyek előtt inger volt jelen. A következő ábrákon látható a mezőpotenciálok átlaga az up state -ek körül (25. ábra), valamint az up state kezdeteket tartalmazó epoch-ok egymásra rajzolva (24. ábra). 24. ábra Bal oldalon a kiváltott up state -ek 800ms hosszú epochjai egymásra rajzolva (60 esemény), jobb oldalon ugyanez spontán oszcillációk esetén (200 esemény). Nulla időpontban az up state kezdet, 4- es csatorna, a jobb láthatóság érdekében egy 30 Hz-es aluláteresztőszűrővel megszűrve 25. ábra Bal oldalon a kiváltott up state -ek 800ms hosszú átlagai az első 9 kérgi csatornára, jobb oldalon ugyanez spontán oszcillációk esetén. Nulla időpontban az up state kezdet, A 26. és 27. ábrákon megtekinthetjük a spontán és kiváltott up state -ek CSD térképét az up state kezdetekkel a nulla időpontban. A CSD és az előző ábrákon jelentős különbség nem látható a kiváltott és a spontán up state -ek között. 38
26. ábra Egy spontán oszcillációkat tartalmazó elvezetés CSD térképe az up state kezdetekkel a nulla időpontban. Pirossal látható az áramnyelő, kékkel az áramforrások. x-tengely: idő (ms) y- tengely: csatornák (kéregmélység) 27. ábra Ingereket tartalmazó elvezetés CSD térképe az up state kezdetekkel a nulla időpontban. Pirossal látható az áramnyelő, kékkel az áramforrások. x-tengely: idő (ms) y-tengely: csatornák (kéregmélység) 39
A MUA ábrák összevetése spontán és kiváltott up-state -ek esetén is megtörtént. Látható, hogy az 5-ös és 6-os csatornák környékén volt jelentős a neurális aktivitás.(28. ábra) 28. ábra Többsejt-aktivitás. Bal oldalon a kiváltott up-state -ek, jobb oldalon a spontán up-state -ek esetén. Vízszintes tengely: idő (ms), Függőleges tengely: csatornák. A nulla időpontban az upstate kezdetek. Az ötös csatorna (csillaggal jelölve) jele külön, az ábra alsó felén látható Az idő-frekvencia elemzéseket szintén az előzőek alapján kiválaszott kiváltott és spontán up state -ekre végeztem el. (29., 30., 31., 32. ábrák) Jól megfigyelhetőek az up state -ek során bekövetkező teljesítmény növekedések a gamma-sáv egy részén (20-40 Hz) és a teljesítmény-csökkenés a down state -ek alatt. 29. ábra Kiváltott up state -ek idő-frekvencia analízise a 11 kérgi csatornára, 5 Hz-től 100 Hz-ig (ytengely), -500-1500 ms-ig (x-tengely), up state kezdet a nulla időpontban. Jól látható a teljesítményemelkedés up state esetén a 20-40 Hz-es sávban. 40
30. ábra Spontán up state -ek idő-frekvencia analízise a 11 kérgi csatornára, 5 Hz-től 100 Hz-ig (ytengely), -500-1500 ms-ig (x-tengely), up state kezdet a nulla időpontban. Jól látható a teljesítményemelkedés up state esetén a 20-40 Hz-es sávban. 31. ábra Kiváltott up state -ek idő-frekvencia analízise a 4. kérgi csatornára, 5 Hz-től 100 Hz-ig (ytengely), -500-1500 ms-ig (x-tengely), up state kezdet a nulla időpontban. Jól látható a teljesítményemelkedés up state esetén a 20-40 Hz-es sávban. 41