Semmelweis Egyetem, Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola PATHOBIOKÉMIA DOKTORI PROGRAM Antioxidánsok szerepe a fehérje diszulfid kötések kialakulásában Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei SZARKA ANDRÁS Témavezető: Dr. Bánhegyi Gábor Semmelweis Orvostudományi Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet Budapest 2002
Bevezetés A sejtbiológia egyik napjainkig is megoldatlan kérdése az elsősorban szekréciós fehérjékben előforduló diszulfid kötések kialakulása. A diszulfid híd kialakulása specifikus kompartimentumokban prokariótákban a periplazmában, eukariótákban az endoplazmás retikulum lumenében történik. A tiol csoportról az elektronokat több komponensből álló elektron transzfer lánc szállítja el a végső elektronakceptorig, aerob körülmények között az oxigénig. A lánc fehérjéi (protein diszulfid izomeráz, Dsb fehérjék, Ero1p, Erv2p) baktériumokban és élesztőben viszonylag jól ismertek. A fehérjék mellett kis molekulasúlyú vegyületek is szerepet kap(hat)nak az elektronok közvetítésében. Ismert elektrontranszfer folyamatok szolgálnak példával: többek között ilyen a mitokondriális légzési elektrontranszferben az ubikinon; a prokarióták fehérje tiol érési folyamatában az ubikinon és a menakinon. Ezek a vegyületek képesek egy és/vagy két elektron transzferére, könnyen oxidálhatók és visszaredukálhatók. Az előbb említett tulajdonságok számos antioxidánsra is jellemzőek, melyek közül a C-vitamin, a glutation és az E-vitamin magas koncentrációban található az endoplazmás retikulum lumenében, illetve membránjában. A három kulcsfontosságú antioxidáns egymással összefonódó elektrontranszfer folyamatára jó példa a Foyer-Halliwell-Asada ciklus. Könnyen elképzelhető, hogy hasonló láncolatot alkot(nak) az endoplazmás retikulumban is a nascens fehérjeláncok diszulfid kötéseinek kialakulása során az elektronok szállításában. Az endoplazmás retikulum diszulfid híd kialakító képessége az izolált mikroszómális vezikulákban megszűnik, a fehérje tiol oldalláncok redox állapota nem változik még oxigén jelenlétében végzett inkubálás során sem. Ez a megfigyelés, valamint az a körülmény, hogy az emlős protein tiol oxidáló mechanizmusban eddig nem írtak le oxigén kötésére képes fehérjét, valószínűvé teszi, hogy kis molekulasúlyú, a mikroszóma preparálása során elvesző komponensei is vannak az elektrontranszfernek. A szóba jövő vegyületeknek vagy diffúzióval, vagy fehérjemediált transzporttal át kell tudnia jutni a membránon, illetve természetesen alkalmasnak kell lennie elektronfelvételre és leadásra. Ilyen vegyületek például a legfontosabb intracelluláris antioxidánsok. Korábbi megfigyeléseink alapján feltételeztük, hogy ezek a molekulák elsősorban az aszkorbát és a tokoferol valóban előmozdítják a diszulfid híd képződést az emlős sejtekben.
Célkitűzés az aszkorbinsav (és közvetlen prekurzora, a gulonolakton) szerepének bizonyítása a diszulfid kötés képződéséhez szükséges elektrontranszferben; a tokoferol mint lehetséges transzmembrán elektronszállító szerepének tisztázása a folyamatban; az aszkorbát és a molekuláris oxigén közötti elektrontranszfer vizsgálata: egy feltételezhető mikroszómális aszkorbát oxidáz vagy peroxidáz aktivitás keresése és jellemzése. Felhasznált módszerek Modellrendszerül májból izolált mikroszómális vezikulákat használtunk. Az aszkorbinsav oxidációját fordított fázisú HPLC és elektron spin rezonancia mérésekkel követtük nyomon. A mikroszómális membrán α-tokoferol szintjét fordított fázisú HPLC segítségével határoztuk meg. A fehérje tiol oxidációt Ellman módszerével vizsgáltuk. A mikroszómális és mitokondriális frakciókat jellegzetes markerenzim aktivitásaik alapján jellemeztük (citokróm c oxidáz, UDP-glukuroniltranszferáz, glukóz-6-foszfatáz). Eredmények Mikroszómális rendszerünkben mind a külsőleg hozzáadott, mind az in situ termeltetett aszkorbinsav oxidációja megfigyelhető volt. A megemelkedett aszkorbil gyök és dehidroaszkorbát szintek időben megtartottnak bizonyultak, tehát az aszkorbátból képződött dehidroaszkorbát az endoplazmás retikulum lumenébe jutva elektronakceptorként szolgálhat a fehérje tiolok oxidációjához. Ehhez az aszkorbát előzetes dehidroaszkorbáttá oxidálása szükséges. Az aszkorbát oxidáz aktivitás
szubcelluláris lokalizációjának vizsgálata során a mikroszómális frakció emelte meg messze a legnagyobb mértékben az aszkorbil gyök szintjét. Aszkorbinsav adagolása valamennyi vizsgált faj májából származó mikroszómális vezikula esetében kiváltotta a fehérje tiolok oxidációját. A mikroszómális rendszerhez dehidroaszkorbátot adva a korábbi megfigyelésekhez hasonlatosan a tiolok oxidációjával párhuzamosan aszkorbinsav képződött. Felmerült, hogy az aszkorbát oxidációja és az aszkorbil gyök keletkezése egy, a mikroszómális rendszer által termelt reaktív oxigénspecieszek keltette másodlagos folyamat. A feltevés helytállóságát különböző antioxidánsok aszkorbil gyök szintre gyakorolt hatásával ellenőriztük. Mind a szuperoxidfogó szuperoxid diszmutáz, mind a hidrogén-peroxid bontó kataláz, valamint az általános gyökfogó (igaz főleg hidroperoxil gyökfogó) hatású mannitol és dimetil-szulfoxid nem befolyásolta (csökkentette) sem az aszkorbil gyök szintjét, sem az aszkorbátfogyás mértékét mindezek alapján arra következtethetünk, hogy a reaktív oxigén specieszek szerepe nem döntő a mikroszómális aszkorbinsav oxidáció folyamatában. Az aszkorbát oxidáz aktivitás mikroszómális orientációját is vizsgálat tárgyává tettük. A mikroszóma tripszines kezelése az aszkorbát oxidáz aktivitás radikális csökkenését eredményezte, arra utalva, hogy az enzim a vezikula külső felszínén helyezkedik el. A mikroszómális vezikulákat a pórusképző antibiotikum alameticinnel permeabilizálva csak enyhe aszkorbil gyök szint emelkedést tapasztaltunk, ami arra utal, hogy az aszkorbát jól hozzáfér az oxidáció helyéhez. Ez az eredmény tovább növelte az aszkorbát oxidáz endoplazmás retikulum membrán külső felszíni lokalizációjának valószínűségét. Az aszkorbinsav mikroszómális oxidációja hő- és proteázérzékenynek bizonyult, ami egy fehérje mediált folyamatot valószínűsít. A szóba jöhető enzimek (hemoproteinek, flavoproteinek és metalloproteinek) hatékony gátlószereit adtuk mikroszómális rendszerünkhöz. Eredményeink alapján az aszkorbát mikroszómális oxidációjáért felelős enzimet nem lehet egyértelműen azonosítani, de a lehetséges enzimek körét leszűkíthetjük. A jellegzetes hemo- és flavoprotein gátlószerekkel kapott eredmények bizonytalanná teszik a hemo- és a flavoproteinek aszkorbinsav oxidációban történő közreműködését.
Ellenben különböző kelátorok, mint a dipiridil, az 1,10-fenantrolin vagy rézspecifikus analógja, a neokuproin jelentős mértékben csökkentették az aszkorbil gyök szintet. Az aszkorbinsav, az aszkorbinsav oxidáció fehérje diszulfid kötések kialakulásában betöltött szerepét bizonyítja, hogy az aszkorbinsav oxidáció gátlószerei gátolták a fehérje tiolok oxidációját is. Az E-vitamin fehérje tiol oxidációban betöltött szerepét E-vitamin-hiányos diétán tartott patkányokból izolált mikroszómákon követtük nyomon. Az aszkorbát dependens tiol oxidáció csökkenésével párhuzamosan az aszkorbát fogyás növekedését, valamint kifejezett lipidperoxidációt tapasztaltunk az E-vitamin deficiens mikroszómák esetében. A lehetőséget kizárandó, hogy a fehérje tiolok oxidációjának visszaesése az E-vitaminmegvonás másodlagos következménye, a deficiens mikroszómákhoz α-tokoferolt adtunk. A fehérjetiol oxidáció mértéke ebben az esetben megközelítette a kontroll csoport értékeit és jól korrelált az E-vitamin-szintjével. Mindezek alapján azt valószínűsíthetjük, hogy az aszkorbát oxidációja során a membrán közvetlen közelében reaktív oxidáló ágensek is keletkeznek, melyek az E-vitaminnal (vagy membránlipideken keresztül E-vitaminnal) reagálhatnak, tokoferil gyök képződését eredményezve. A gyök az intraluminális aszkorbát terhére további dehidroaszkorbátot eredményezve redukálódhat vissza. A lumenben a dehidroaszkorbát oxidálja a célfehérjék tioljait a protein diszulfid izomeráz (illetve más tiol-diszulfid kicserélődésre alkalmas fehérjék) által katalizált reakcióban. Legfontosabb új megállapításaink: Az endoplazmás retikulum membránja citoplazmai orientációjú aszkorbát oxidáz aktivitással rendelkezik. Az aktivitásért feltehetőleg egy réztartalmú metalloprotein felelős. A mikroszómális aszkorbát oxidáz aktivitás aszkorbinsav jelenlétében a szubsztrát fogyása mellett állandó aszkorbil gyök és dehidroaszkorbát szintet tart fenn. A mikroszómális aszkorbát oxidáz aktivitás elengedhetetlenül szükséges az aszkorbátfüggő diszulfid kötés képződéshez.
A mikroszómális membrán tokoferolja résztvesz az intraluminális aszkorbát és az extravezikuláris reaktív oxigéntartalmú vegyületek közötti elektrontranszferben, előmozdítván a diszulfid kötések generálását. Az értekezés témájában megjelent saját közlemények: Szarka A., Stadler K., Jenei V., Margittai É., Csala M., Jakus J., Mandl J., Bánhegyi G.: Ascorbyl free radical and dehydroascorbate formation in rat liver endoplasmic reticulum. J Bioenerg Biomembr. 34: 317-323 (2002). Csala M., Szarka A., Margittai É., Mile V., Kardon T., Braun L., Mandl J., Bánhegyi G.: Role of vitamin E in ascorbate-dependent protein thiol oxidation in rat liver endoplasmic reticulum. Arch Biochem Biophys. 388: 55-59 (2001). Csala M., Braun L., Mile V., Kardon T., Szarka A., Kupcsulik P., Mandl J., Bánhegyi G.: Ascorbate-mediated electron transfer in protein thiol oxidation in the endoplasmic reticulum. FEBS Lett. 460: 539-543 (1999). Nem az értekezés témájában megjelent saját közlemény: Cavarra E., Lucattelli M., Gambelli F., Bartalesi B., Fineschi S., Szarka A., Giannerini F., Martorana P.A., Lungarella G.: Human SLPI inactivation after cigarette smoke exposure in a new in vivo model of pulmonary oxidative stress. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 281: 412-417 (2001).