HYPOTHALAMIKUS STRUKTÚRÁK ÉS FAKTOROK JELENTOSÉGE A PROLAKTIN ELVÁLASZTÁS SZABÁLYOZÁSÁBAN Bodnár Ibolya Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei Témavezeto: Prof. Dr. Nagy György Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola Idegtudományok Doktori Iskola Budapest, 2002 Doktori Iskola vezetoje: Prof. Dr. Réthelyi Miklós Programvezeto: Prof. Dr. Palkovits Miklós
BEVEZETÉS A prolaktin (PRL) a hypophysis elülso lebeny mammotrop sejtjei által termelt és kiválasztott polipeptid hormon. Elnevezése a szarvasmarha hypophyis-kivonat hatásai alapján történt, mely galambokban serkenti a begy növekedését illetve a begytej termelését, nyulakban pedig laktációt idéz elo. Emlosállatokban nélkülözhetetlen szerepet játszik a laktáció megindításában és fenntartásában. Leghatásosabb fiziológiás stimulusa a kölykök által kifejtett szopási inger, amelynek hatására az anyaállat szérum PRL szintje már néhány perc múlva az alapérték többszörösére emelkedik, és a szoptatás egész idotartama alatt magas marad. A PRL elválasztás fo fiziológiai szabályozója a mediobasalis hypothalamusban termelodo dopamin. Az agyalapi mirigy muködését befolyásoló dopaminerg neuronok a hypothalamikus nucleus periventricularis és a nucleus arcuatus területén helyezkednek el. Ez a két neuronális sejtcsoport három, egymástól mind morfológiailag mind funkcionálisan elkülönülo rendszerre osztható; ezek a periventriculo-hypophysealis (PHDA), a tuberohypophysealis (THDA) és a tuberoinfundibularis dopaminerg rendszer (TIDA). Az utóbbit alkotó neuronok axonjai az eminentia mediana külso rétegében, az ún. hosszú portális erek körül végzodnek. Az itt felszabaduló dopamin a portális erek vérével eljut az adenohypophysis laktotrop sejtjeihez és ott gátolja a PRL ürítését. Ugyanakkor a hypophysis közti-hátsó lebenyében végzodo, a tuberohypophysealis rendszerhez tartozó idegsejtek is részt vesznek a PRL elválasztás szabályozásában. A dopamin bioszintézisben a szintézis sebességét meghatározó lépés az L-3,4-dihidroxifenilalanin (L-DOPA) képzodése a neuronok által felvett tirozinból. Ezt a lépést a tirozinhidroxiláz (TH) enzim katalizálja. A keletkezett L-DOPA-t 1
ezután az aromás-aminosav-dekarboxiláz enzim alakítja át dopaminná. Az enzimreakciók során keletkezo aminok elleni specifikus antitestek használatkor kiderült, hogy a dopamin és az L-DOPA immunreaktivitás eltéro eloszlást mutat, amelynek alapján feltételezheto egy olyan neuronális rendszer megléte, amely csak TH-t tartalmaz, de aromás aminosav dekarboxilázt nem. Ezek a neuronok így dopamin helyett csak L-DOPA termelésére képesek. Az immunhisztokémiai vizsgálatok egyértelmuen megmutatták mindkét enzim és a dopamin jelenlétét is a PHDA, THDA és a TIDA neuronokban, de ez utóbbinak csupán egyik, dorsomedialis részében (DM-TIDA), míg a TIDA neuron rendszer ventrolateralis részében (VL- TIDA) csak TH immunreaktivitás találtak, dopamint és aromás aminosav dekarboxilázt nem. L-DOPA antitesttel viszont immunreaktivitás detektálható ezen a területen (Okamura és mtsai, 1988). A mindezen adatok alapján feltehetoen létezo L- DOPAerg rendszer szerepének tisztázása, különös tekintettel a PRL elválasztás szabályozásában betöltött szerepüket, még számos további vizsgálatot igényel. Hosszú ideig úgy tunt, hogy ellentétben a többi adenohypophysealis hormon szabályozásával, amelyekre serkento és gátló faktorok egyaránt hatnak, a PRL elválasztás szabályozásában kizárólag tónusos gátló szabályozás érvényesül. Napjainkra azonban bizonyossá vált, hogy a dopamin, a jól ismert gátló hatása mellett, meglehetosen alacsony koncentrációban alkalmazva képes serkenteni a PRL szekréciót. Az utóbbi évek kutatásai során több, a PRL elválasztást serkento anyagot is kimutattak Az anyagok jelentos része a hypothalamus paraventricularis magjában termelodik, melyek egyike a hypophysealis adenilát ciklázt aktiváló polipeptid (PACAP). Szisztémás PACAP-38 injekció szignifikánsan és dózisfüggoen emeli a plazma PRL és növekedési hormon szinteket hím és elválasztott laktáló nostényekben is, viszont folyamatosan szoptató anyákban nincs 2
hatása a plazma PRL koncentrációjára. Laktálókban a PACAP- 38 a szopás indukált PRL válaszhoz hasonló nagyságú elválasztást okoz. Az in vivo serkento hatással ellentétben, sejtkultúrában és reverz hemolítikus plakk assay-ben a PACAP-38 dózisfüggoen gátolta a PRL leadást, így PACAP laktáló nostényekben kifejtett hatásmechanizmusának pontosabb megismeréséhez még további vizsgálatok szükségesek. A szopás ingerére bekövetkezo PRL elválasztás meglehetosen széles körben vizsgált neuroendokrin reflex mechanizmus, amely neurális afferens, és humorális efferens szárból tevodik össze. A szopási inger által kiváltott ingerület az emlo mechanoreceptoraitól a gerincvelon és az agytörzsön át jut el a hypothalamusig. Itt a PRL elválasztást serkento és/vagy gátló faktorok szekréciójának megváltoztatásával alakul át humorális reflexválasszá. A szopási inger adott PRL válasz kialakításában részt vevo agyi struktúrákról napjainkban is csak kevés adat áll rendelkezésre. Ezért vizsgálataink egyik része ezzel a kérdéssel foglalkozott. Tanulmányoztuk továbbá a PACAP PRL szekrécióra kifejtett hatásának helyét és mechanizmusát, valamint a mediobasalis hypothalamusban elhelyezkedo dopaminerg illetve L-DOPAerg neuronok PRL elválasztásban játszott szerepét monoszodium glutamát (MSG) kezelt patkányokban. CÉLKITUZÉSEK 1. Tanulmányozni, hogy a szopási stimulusra adott PRL válasz kialakításában milyen agyi struktúrák vesznek részt. A. Vizsgálni a hypothalamus és az agytörzs közötti illetve a hypothalamuson belüli kapcsolatok részvételét a szopás által kiváltott PRL elválasztás szabályozásában. 3
B. Vizsgálni a hypothalamikus nucleus paraventricularis szerotoninerg és katekolaminerg innervációjának szerepét a szopási stimulus közvetítésében. C. Vizsgálni a nucleus paraventricularis mediális részének jelentoségét a szopásra adott PRL válasz kialakításában. 2. Feltárni a PACAP PRL elválasztást serkento hatásának helyét és mechanizmusát. A. Vizsgálni a PACAP-38 esetleges direkt, a hypophysis elülso lebenyén kifejtett hatását hím állatokban. B. Tanulmányozni a posztszinaptikus D 2 -receptor szerepét a PACAP okozta PRL és növekedési hormon elválasztásban. C. Megvizsgálni a mellékvese szteroidok hiányakor illetve exogén szteroid túlzott bevitele után kialakuló fiziológiás állapotokban a PACAP kezelés hatását. D. Meghatározni a szopási stimulus hatására kialakuló szöveti PACAP tartalom változását a hypophysisben és az eminentia medianaban. 3. Elemezni a hypothalamus dopaminerg és L-DOPAerg neuronjainak szerepét a PRL és? MSH elválasztás szabályozásában. A. Immunhisztokémiai módszerekkel vizsgálni a hypothalamikus dopaminerg neuronok három szubdivíziójába (PHDA, THDA és TIDA) tartozó idegsejtek monoszodium glutamát iránti érzékenységét, különös tekintettel a DM-TIDA rendszerhez tartozó dopaminerg és a VL-TIDA rendszer feltételezhetoleg L-DOPAerg sejtjeinek mennyiségi változásaira. B. Vizsgálni a dopaminerg illetve L-DOPAerg neuronok szerepét a bazális illetve a katekolamin bioszintézis gátlása után létrejövo plazma PRL és? MSH koncentrációk kialakításában. 4
MÓDSZEREK Agyi struktúrák részvétele a szopási stimulusra adott PRL válasz kialakításában Kísérleteinkhez elsoszülo, Sprague-Dawley törzsbol származó laktáló patkányokat használtunk, melyeket standard patkánytápon, állandó homérsékleten (22±2ºC) és kontans fényviszonyok között (14 h fény, 10 h sötétség) tartottunk. Hypothalamikus beavatkozások Kísérleteinkben a következo hypothalamikus beavatkozásokat végeztük: 1. kétoldali és egyoldali hátsó frontális metszés, 2. kétoldali és egyoldali elülso frontális metszés, 3. a nucleus paraventricularis mediális részének roncsolása, 4. a paraventricularis mag alatti horizontális metszés, 5. szerotonin illetve noradrenalin terminálisokat roncsoló neurotoxin beadása a paraventricularis magba. Az agyi mutéteket a szülés utáni 3.-4. napon végeztük sztereotaxikus készülék segítségével. A roncsolásos kísérleteket bajonett illetve L-alakú Halász-kés használatával végeztük. A kést a megfelelo agyi koordinátákig süllyesztettük, majd a beavatkozástól függoen 90º- illetve 360º-kal elfordítottuk. A nucleus paraventricularis szerotoninerg innervációjának roncsolását 5,7-dihidroxitriptaminkreatininszulfát, katekolaminerg innervációjának roncsolását 6- hidroxidopamin-hidroklorid oldat kétoldali agyi beadásával végeztük. A szopási inger által kiváltott prolaktin szekréció vizsgálata. Vérvétel A szopási stimulus hatására bekövetkezo PRL szekréciót a szülés utáni 10-11. napon vizsgáltuk. Két nappal a kísérlet 5
elott, éteraltatásban, egy krónikus kanült ültettünk be az állatok jugularis vénájába. A kísérlet napján reggel 9 órakor vért vettünk (200? l), majd a kölyköket 4 órára elválasztottuk az anyáktól. Az elválasztás végén illetve a kicsik visszatétele után, a szopás 30. és 60. percében szintén vettünk vért, majd a plazma PRL szintet radioimmunoassay (RIA) módszerrel meghatároztuk. Hisztológiai módszerek Az utolsó vérvétel után az állatokat paraformaldehid oldattal perfundáltuk. Az agyakból 20? m-es frontális illetve horizontális metszeteket készítettünk, melyeket krezilibolyával vagy hematoxilin-eozinnal megfestettünk és a metszések helyét meghatároztuk. A neurotoxin beadásos kísérleteknél 50 µm-es frontális metszeteket készítettünk, melyeken TH illetve szerotonin immunfestést végeztünk, nyúlban termelt TH vagy szerotonin antiszérum és az ABC technika használatával. A reakciót DAB-bal tettük láthatóvá. Hormonszint meghatározás A plazma PRL és a növekedési hormon szinteket radioimmunoassay (RIA) módszerrel határoztuk meg, a módszer menete kisebb, korábban leírt változtatások mellett megegyezett a kithez adott leírással. Az amsh szinteket a laboratóriumunkban kifejlesztett speciális RIA módszerrel határoztuk meg (Vecsernyés és mtsai, 1997). Minden vérmintából dupla sorozatot mértünk. A PACAP PRL elválasztást serkento hatás helyének és mechanizmusának vizsgálata A PACAP-38 esetleges hypophysealis hatásának vizsgálata Hím állatok hypophysisét eltávolítottuk, majd két, más hímekbol kivett, elülso lebenyt ültettünk be a vesetok alá. Az operáció után egy héttel iv PACAP-38-t (10 µg/állat) adtunk, 6
majd a kezelés után 15, 30 és 60 perccel vérmintát vettünk. A plazma PRL és növekedési hormon szinteket mindegyik kísérletben RIA módszerrel határoztuk meg. A posztszinaptikus D 2 -receptor szerepe a PACAP okozta PRL és növekedési hormon elválasztásban Laktáló anyákat reggel 9 órakor kölykeiktol elválasztottunk, majd a 4 órás elválasztás végén iv PACAP 38-t adtunk. A beadás elott 60 perccel az anyákat domperidonnal (0,2 mg/kg iv) kezeltük. A PACAP kezelés után 5, 15, 30 és 60 perccel vért vettünk. Az adrenalectomia és a dexamethasone kezelés hatásának vizsgálata a PACAP-38 által okozott PRL és növekedési hormon elválasztásra Laktáló nostények egyik csoportjában a laktáció 2.-3. napján adrenalectomiat végeztünk. A másik csoportot dexamethason-foszfáttal, egy szintetikus glukokortikoid agonistával kezeltük. 24 órával a kísérlet megkezdése elott 400?g/kg, 2 órával elotte újabb 200?g/kg adagot adtunk oldat formájában sc. A kontroll állatokat fiziológiás sóoldattal kezeltük. A 4 órás elválasztás végén a PACAP-38 beadása és a vérvétel az elozo kísérletben leírtakkal megegyezoen történt. A hypophysis és az eminentia mediana PACAP tartalmának mérése A kölyköket 9 órakor elválasztottuk az anyjuktól, majd 4 órával késobb az anyák egy része kölykeik visszahelyezése után 1 illetve 3 órát szoptathatott. Ezt követoen az állatokat lefejeztük, a törzsbol gyujtött vérbol a plazma PRL tartalmát meghatároztuk. A hypophysiseket kivettük, majd szétválasztottuk az elülso és a közti-hátsó lebenyt. A hypothalamus ventrális felszínérol eltávolítottuk az eminentia medianat, majd mindhárom szövetmintából, specifikus RIA 7
segítségével, meghatároztuk a szöveti PACAP koncentrációt (Arimura és mtsai, 1991). A mediobasalis hypothalamusban elhelyezkedo dopaminerg és L-DOPAerg neuronok szerepének vizsgálata a PRL és? MSH elválasztás szabályozásában Felnott, újszülött korban monoszodium glutamáttal (2., 4., 6., 8. és 10. postnatalis napon, 4mg/kg MSG, sc) kezelt hím és nostény patkányokat használtunk. A kontroll állatok azonos koncentrációjú NaCl oldatot kaptak. Két hónapos korukban az állatok egy csoportjából vért vettünk, melybol a bazális PRL koncentrációt meghatároztuk. A kezelés hatására kialakuló sejtpusztulás vizsgálatához az állatokat perfundáltuk, majd az agyakból és a hypophysisekbol készített metszeteken TH és aromás aminosav dekarboxiláz immunfestést végeztünk. A TH és aromás aminosav dekarboxiláz immunreaktív sejttesteket digitális fotóberendezés segítségével számoltuk meg. A sejtszámoláshoz mindegyik állatból 3-5 frontális agyi metszetet választottunk ki a nucleus arcuatus elülso illetve középso szintjébol. A dopamin bioszintézis gátlásának hatása a plazma PRL és? MSH szintekre Az MSG-vel kezelt illetve kontroll felnott állatokat (7-9 állat mindkét nembol)? -metil-p-tirozinnal (8mg/kg iv) kezeltük, amellyel gátoltuk a TH aktivitást. A kezelés utáni 15. 30. és 60. percben vért vettünk, amelyben a PRL és az? MSH szintet RIA módszerrel meghatároztuk. Statisztika Az eredményeket az egyes kísérletekben kapott értékek átlagával? SEM adtuk meg. A szöveti PACAP koncentráció meghatározáskor illetve a sejtszámoláskor kapott adatok 8
statisztikai értékelését kétszempontos varianciaanalízissel végeztük (ANOVA) majd Dunnett s posthoc tesztet alkalmaztunk a többszörös összehasonlításhoz. A kísérletek másik részénél, ahol a különbözo agyi beavatkozások után vizsgáltuk a szopási ingerre adott PRL választ, illetve a különbözo kezelések hatását vizsgáltuk a PACAP által kiváltott PRL szekrécióra ismétléses ANOVA-val teszteltünk. Az állatok kiindulási PRL értékei közötti különbséget mindegyik kísérletben kétszempontos varianciaanalízissel végeztük. A csoportokon belüli PRL szint változásokat páros T-teszttel analizáltuk. A kapott eredmények különbségét statisztikailag szignifikánsként értékeltük, amikor a p<0,05 volt. EREDMÉNYEK A szopási inger által kiváltott prolaktin elválasztás létrejöttében szerepet játszó agyi struktúrák Az intakt és álmutött kontroll állatokban a 4 órás elválasztást követo szopási inger hatására nagymértékben megnott a plazma PRL koncentrációja. Azon anyákban, amelyekben a hátulsó kétoldali frontális metszéssel megszakítottuk az agytörzs és a hypothalamus közötti összeköttetések jelentos részét, a szopási stimulus nem okozott emelkedést a szérum PRL szintben. Az unilaterális metszés, amellyel csupán az egyik oldalon szakítottuk meg ezeket a kapcsolatokat, csökkentette, de nem blokkolta a PRL választ. Az elülso frontális metszés (kétoldali és egyoldali egyaránt) gátolta a szopás indukálta PRL választ. A nucleus paraventricularisban található szerotoninerg terminálisok roncsolása után elmaradt a szopási ingerre adott PRL válasz. A szopási stimulusra adott PRL választ a paraventricularis magban található katekolaminerg rostok és terminálisok 9
roncsolása után a neurotoxinnal kezelt állatok mindegyikében megfigyeltük. A kölykök visszarakása után a vérplazmában a PRL koncentráció valamivel kisebb mértékben növekedett a kontroll állatokban tapasztaltnál, a különbség azonban nem volt statisztikailag szignifikáns. A hypothalamikus paraventricularis mag mediális részének roncsolása illetve a sejtcsoport alatti horizontális metszés után teljesen gátolttá vált a szopási ingerre adott PRL elválasztás. A PACAP-38 hatása a hypophysealis PRL és növekedési hormon elválasztásra Intakt hímekben és laktáló nostényekben a PACAP-38 intravénás injekciója után 15 perccel jelentosen megnott a vérplazmában a PRL és növekedési hormon koncentráció. A PACAP-38 direkt hypophysealis hatása Az agyalapi mirigy eltávolítása és a két elülso lebeny vesetok alá transzplantálása után egy héttel jelentosen megemelkedett a bazális szérum PRL szint. A PACAP-38 kezelés nem okozott további PRL koncentráció emelkedést. Ezzel szemben nem tapasztaltunk változást sem a bazális sem a PACAP-38 beadás után megemelkedo növekedési hormon szintekben a transzplantált hímekben a kontroll állatokkal összehasonlítva. A posztszinaptikus D 2 -receptor szerepe a PACAP-38 okozta PRL és növekedési hormon elválasztásban Laktáló nostény patkányokban a 4 órás elválasztás végén, domperidon elokezelés hatására - a hypophysealis D 2 posztszinaptikus receptorok gátlása révén - jelentosen megnövekedett a plazma PRL koncentrációja. A PACAP-38 kezelés után kialakult PRL szint emelkedés mértéke nem különbözött a kontroll állatokban megfigyelttol. A domperidon 10
elokezelés önmagában nem okozott változást a bazális növekedési hormon szekrécióban, viszont a PACAP-38 serkento hatását szignifikánsan csökkentette. A mellékvese hiány és a dexamethasone kezelés hatása a PACAP-38 által okozott PRL és növekedési hormon elválasztásra Laktáló nostényekben a mellékvese eltávolítása után egy héttel, a 4 órás elválasztás végén a kontrollhoz képest jelentosen megemelkedett bazális PRL és változatlan bazális növekedési hormon koncentrációt tapasztaltunk. A PACAP-38 injekció kisebb mértéku PRL választ okozott, míg a növekedési hormon elválasztás nagysága ugyanakkora maradt. A dexamethasone elokezelés, amelyben szintetikus glukokortikoid agonistát adtunk, nem okozott változást a bazális PRL és növekedési hormon koncentrációkban, de a PACAP-38 által kiváltott PRL elválasztást szignifikánsan csökkentette. A növekedési hormon válasz mértéke nem különbözött a kontroll állatokban megfigyelttol. A szopási inger hatása a hypophysis és az eminentia mediana PACAP tartalmára A 4 órás elválasztás végén a hypothalamikus eminentia medianában volt a legmagasabb a PACAP koncentráció, amely az 1 órás szopás végére szignifikánsan csökkent. A hypophysis közti-hátsó lebenyében jóval alacsonyabb PACAP koncentrációt mértünk az elválasztás végén, amely azonban az 1 órás szopás hatására szignifikánsan nott. A PACAP koncentrációkban nem tapasztaltunk további változást a 3 órás szopatási periódus végére. Az elválasztási periódus végén a hypophysis elülso lebenyében találtuk a legalacsonyabb PACAP koncentrációt, amely a szoptatás egész idotartama alatt változatlanul alacsony maradt. 11
A hypothalamus dopaminerg és L-DOPAerg neuronjainak szerepe a PRL és? MSH elválasztás szabályozásában Kontroll nostény állatokban az elülso periventricularis régióban (PHDA/THDA rendszer) a TH immunpozitív neuronok többsége aromás aminosav dekarboxiláz immunreaktivitást is mutat, így ezen neuronok többsége dopaminerg. Kontroll hímekben az ugyanezen a területen elhelyezkedo TH pozitív idegsejteknek csupán a kétharmad része rendelkezett aromás aminosav dekarboxiláz immunpozitivitással, tehát dopaminerg, míg a maradék egyharmad feltehetoen L-DOPAerg. Az MSG kezelés nem okozott számottevo sejtpusztulást ezen neuronok körében, ennek megfeleloen, a hypophysis közti-hátsó lebenyében, ahol a PHDA és a THDA rendszerhez tartozó neuronok axonjai végzodnek, sem találtunk különbség a TH és az aromás aminosav dekarboxiláz immunpozitív rostok mennyiségében és eloszlásában. Kontroll állatokban a nucleus arcuatus középso és hátsó szintjében (TIDA rendszer) a TH immunreaktivitást mutató sejttesteket a mag dorsomedialis és ventrolateralis részében is találtunk, az aromás aminosav dekarboxilázra pozitív neuronokat viszont csak a dorsomedialis területen mutattunk ki. Az MSG kezelés után 35-40%-os sejtszám csökkenést tapasztaltunk a TIDA rendszerhez tartozó TH-pozitív idegsejtek körében. A ventrolateralis területrol szinte teljesen eltuntek ezek a sejtek, a dorsomedialis részen ugyanakkor nem találtunk szignifikáns változást. Az aromás aminosav dekarboxiláz immunreaktív sejtek száma is alig változott a kontrollhoz képest. A TIDA rendszerhez tartozó neuronok morfológiai megjelenésében nem tapasztaltunk nemi különbséget a kontroll és az MSG-vel kezelt állatok esetében sem. Az MSG-vel kezelt hím és nostény patkányokban nem találtunk változást a bazális PRL koncentrációban. A TH 12
gátlása után 15 perccel szignifikánsan megnott a plazma PRL szint mindkét nemben. A növekedés mértéke jelentosen nagyobb volt nostény állatokban. A MSG kezelés nem okozott változást a PRL válaszban egyik nem esetében sem. Az MSG-vel kezelt nostény patkányokban kissé csökkent bazális? MSH koncentrációt találtunk, ez a különbség azonban nem volt statisztikailag szignifikáns. A TH gátlása nem okozott szignifikáns változást az? MSH koncentrációban a kontroll és az MSG-vel kezelt állatokban sem. MEGBESZÉLÉS A szopási inger által kiváltott prolaktin válasz létrejöttében szerepet játszó agyi struktúrák A szoptatás idoszakában fontos szerepet játszó hypophysis hormonok (mint a PRL és az oxitocin) ürítésének szabályozásában a hypothalamikus és az agytörzsi struktúrák jelentoségére és a ketto közötti intakt kapcsolat szükségszeruségére már számos vizsgálat rávilágított. Feltételezték, hogy az emlobimbó mechanoreceptoraitól az ingerület nagy valószínuséggel a gerincvelo, majd az agytörzs pályáin át jut el a hypothalamusig, viszont az üzenet továbbításában részt vevo idegi struktúrák pontos lefutását és foként természetét korábban nem térképezték fel. Tindal és mtsainak vizsgálatai szolgáltatták a legközvetlenebb bizonyítékot arra vonatkozóan, hogy a szopási inger neurális üzenetét közvetíto felszálló idegi útvonal a középagyból egy meglehetosen diffúz területen lép be a hátulsó hypothalamus területére, amely a tractus spinothalamicus mellett, valószínuleg magába foglalja a fasciculus longitudinalis dorsalis-t is. Az értekezésben bemutatott kísérleteink eredményei teljes mértékben alátámasztják és elso közvetlen kísérletes bizonyítékát jelentik annak, hogy e pálya kétoldali 13
megszakítása a hypothalamus hátsó szintjében felfüggeszti a szopási ingert követo plazma PRL szint emelkedést. A féloldali hátsó metszés viszont csak csökkentette a PRL választ. Ez egyértelmuen arra utal, hogy a hátsó hypothalamus szintjében a féloldali felszálló idegpályák épsége valójában nem elégséges a szopási stimulus által kiváltott ingerületi jelnek a hypothalamusba történo közvetítéséhez. Kísérleteinkben mind a féloldali mind a kétoldali elülso deafferentációt követoen a szopási stimulusra bekövetkezo PRL válasz teljes mértékben elmaradt. Az egyik lehetséges magyarázatként felvetheto, hogy az elülso metszéssel megszakítottuk a nucleus paraventricularisba tartó, a szopási stimulust közvetíto felszálló idegi útvonalat. Ugyanakkor az is lehetséges, hogy a nucleus arcuatusból a nucleus paraventricularisba érkezo pályát sértettük meg. Ezen túlmenoen, e metszéssel megszakíthattuk mind a magba belépo, mind az onnan rostralis irányba kilépo rostokat is. Számos irodalmi adat utal arra, hogy a szerotonin képes az elülso lebenyi PRL elválasztást serkenteni valamint, hogy a szerotoninerg idegelemek részt vesznek a szopási inger hatására létrejövo PRL válasz kialakításában. Mások és saját korábbi eredményeink egyértelmuen arra utalnak, hogy a hypothalamikus paraventricularis mag igen jelentos szerepet játszik a PRL elválasztás, különösképpen a különbözo ingerekre bekövetkezo elülso lebenyi PRL elválasztás szabályozásában (Kiss és mtsai, 1986, Minamitani és mtsai, 1987). Az is jól ismert, hogy a nucleus paraventricularis meglehetosen sok felszálló szerotoninerg rost végzodésének célpontja. A nucleus paraventricularisban található szerotoninerg idegvégzodések szelektív roncsolása után, a szopási ingerre adott PRL válasz elmaradt. Vizsgálataink elso alkalommal szolgáltatnak adatot arra vonatkozóan, hogy az endogén szerotonin alapvetoen a hypothalamikus nucleus 14
paraventricularis neuronjaira hatva vesz részt ebben a folyamatban. A nucleus paraventricularis katekolaminerg innervációjának roncsolása után nem találtunk szignifikáns változást a szopási ingerre adott PRL válaszban. Ez arra utal, hogy az agytörzsi noradrenerg és adrenerg sejtcsoportokból a paraventricularis magba érkezo katekolaminerg rostok nem vesznek részt a PRL válasz szabályozásában. Jelen vizsgálataink eredményei azt mutatták, hogy a paraventricularis mag mediális, ún. parvocelluláris részének roncsolása is teljes mértékben képes gátolni a szopási ingerre bekövetkezo PRL válasz megjelenését. Ezen a területen számos a PRL elválasztás szabályozásában szerepet játszó neurotranszmittert és modulátort valamint neuropeptidet termelo sejt található (pl. TRH, VIP, PACAP), amelyeknek hiánya okozhatja a szopásra adott PRL válasz elmaradását. A horizontális metszés következtében tapasztalt, a PRL válasz teljes elmaradásából arra következtethetünk, hogy a magból periventricularisan kilépo illetve az itt futó, és a magba belépo rostok alapvetoen szükségesek a szopási ingerre bekövetkezo PRL válasz kialakulásához. A PACAP-38 hatása a hypophysealis PRL és növekedési hormon elválasztásra A 38 aminosavból álló PACAP a nucleus paraventricularisban termelodo PRL elválasztást serkento faktorok közül az egyetlen olyan neuropeptid, amely in vivo körülmények között a szopási stimulushoz hasonló mértéku PRL szint emelkedést okoz, kölykeiktol elozoleg elválasztott laktáló nostényekben. A PRL elválasztásra gyakorolt hatásán kívül a növekedési hormon szekréciót is serkenti. In vitro körülmények között a PACAP-38 dózisfüggoen gátolja a hypophysisbol a PRL leadást, míg a növekedési hormon 15
elválasztást serkenti (Nagy és mtsai, 1993). Ennek alapján joggal feltételezhetjük, hogy a PACAP nem közvetlenül a laktotrop sejteken hat, hanem indirekt úton, egy másik típusú hypophysis sejten keresztül parakrin módon fejtheti ki hatását. Az intravénás PACAP-38 kezelés után a hypophysis transzplantált állatokban, az intakt állatokban tapasztaltakhoz hasonló mértéku növekedési hormon koncentráció emelkedést figyeltünk meg. A transzplantált állatokban a plazma PRL szint viszont nem emelkedett tovább. Ebbol, és a korábbi eredményeinkbol arra következtethetünk, hogy a PACAP közvetlenül az elülso lebeny somatotrop sejtjein hatva képes fokozni a hypophysis növekedési hormon elválasztását. Ugyanakkor a PACAP PRL elválasztást fokozó hatásában, az elülso lebenyen belül muködo parakrin kommunikációnak valószínuleg nincs szerepe. A hypothalamikus paraventricularis és supraopticus magban termelodo PACAP jelentos része feltehetoleg anterográd transzport révén az idegsejtek axonvégzodéseibe, tehát a hypophysis közti-hátsó lebenyébe jut, ahonnan a rövid portális ereken keresztül az elülso lebenybe kerülhet. A köztihátsó lebenyben felszabaduló PACAP a melanotrop sejteken hatva is részt vehet a PRL elválasztás befolyásolásában. Erre utal azon eredményünk, hogy laktáló állatokban a szopási inger hatására az eminentia medianaban szignifikánsan csökkent, a közti-hátsó lebenyben pedig jelentosen megnott a PACAP koncentrációja. Ugyanakkor az elülso lebenyben a PACAP koncentrációjában nem volt változás. Ezen adat ellene szól annak a felvetésnek, hogy a közti-hátsó lebenyben felszabaduló PACAP akár a hosszú-, akár a rövid portális ereken keresztül lejutna az elülso lebenybe. Kísérleti eredményeink egyértelmuen mutatják, hogy a D 2 - receptorok gátlása nem változtatja meg a PACAP PRL elválasztásra kifejtett hatását, ugyanakkor jelentosen csökkenti a PACAP beadását követo növekedési hormon elválasztás 16
fokozódást. Mindezek alapján megállapíthatjuk, hogy a laktotrop sejtek D 2 -receptorainak, és a hypothalamikus tónusos dopaminerg hatásnak nincs jelentos szerepe a PACAP PRL elválasztást serkento hatásának kifejtésében. Kísérletünkben laktáló állatokban a mellékvese eltávolítását követoen a plazma PRL bazális koncentrációja megemelkedett, ugyanakkor a PACAP kezelés hatására PRL elválasztás mértéke szignifikánsan csökkent. Ez a megfigyelésünk párhuzamba hozható a munkacsoportunk által korábban megfigyelt jelenséggel, miszerint mellékvese hiányában, a csökkent dopaminerg tónus ellenére, a szopási ingerre adott PRL válasz nagymértékben gátolt (Horváth és mtsai, 2001). Feltételezheto, hogy a serkento idegi impulzusok a mellékvese szteroidok hiányában nem képesek a PRL elválasztás normál mértéku fokozására. Ennek hátterében a laktotrop sejtek hypothalamikus faktorokkal szembeni válaszkészségének csökkenése állhat. Kísérleteinkben azt találtuk, hogy a dexamethasone elokezelés után nem változtak az elválasztás végén mért bazális hormon koncentrációk. A PACAP-38 által kiváltott PRL elválasztás azonban jelentosen csökkent. Magyarázatul szolgálhat az a tény, hogy szisztémásan alkalmazott kezelés során, a dexamethasone foképp az agyalapi mirigyben halmozódik fel. A glukokortikoid hypophysealis negatív feedback hatása révén gátolja a hypophysisben az ACTH szintézist és ürítést, aminek következtében az endogén glukokortikoid szintézis is csökken. Végeredményként hasonlóan alacsony endogén glukokortikoid szintet érzékel a hypothalamus, mint adrenalectomiát követoen. 17
A hypothalamus dopaminerg és L-DOPAerg neuronjainak szerepe a PRL és? MSH elválasztás szabályozásában Jelen vizsgálatainkkal elso alkalommal mutattuk ki, hogy az újszülöttkori MSG kezelés elsosorban a VL-TIDA rendszer TH immunpozitív és aromás aminosav dekarboxiláz immunnegatív (így L-DOPAerg) sejtjeit érinti, míg a DM- TIDA mindkét enzimre immunreaktív (így dopaminerg) neuronjainak száma alig változik. A sejtelhaláson kívül a DM rész zsugorodását és az eminentia mediana felé történo áthelyezodését is megfigyeltük. Az eminentia medianaban nem találtunk jelentos változást a TH immunpozitív rostok mennyiségében. Kísérleti megfigyeléseink alátámasztják a már korábban leírt eredményeket, amelyek szerint az MSG kezelésnek nincs hatása a TIDA neuronoktól rostralisan elhelyezkedo többi dopaminerg idegsejtre, azaz a PHDA és THDA rendszerhez tartozó neuronokra (Seress, 1982). Ezt megerosíti, hogy az MSG kezelés hatására nem találtunk változást a plazma? MSH szintekben. Kísérleteinkben azt tapasztaltuk, hogy az MSG kezelés után a bazális PRL szintekben nem következik be változás egyik nemnél sem. Azon tényekbol kiindulva, hogy az MSG kezelés elsosorban a nucleus arcuatus középso és hátsó szintjében elhelyezkedo L-DOPAerg neuronokat érinti, és a plazma PRL szint nem változik, arra következtethetünk, hogy a nyugalmi PRL ürítés szabályozásában az L-DOPAerg neuronok nem, vagy csak kis mértékben vesznek részt. Bár a hypothalamus L-DOPAerg és dopaminerg neuronjainak morfológiai megjelenésében nem találtunk különbséget az intakt hím és nostény állatok között, mégis jelentos nemi különbséget találtunk az L-DOPA illetve a dopamin bioszintézis elso enzimatikus lépésének gátlása után kialakult plazma PRL értékekben. A TH gátlása után létrejött, és a két nem között a PRL válaszban megmutatkozó eltérés 18
megerosíti azt a korábbi feltételezést, mely szerint a PRL elválasztás szabályozásában részt vevo hypophyseotrop dopaminerg neuronok bioszintézise és metabolikus aktivitása általában magasabb nostény állatokban, mint hímekben. Az MSG kezelés nem okozott változást a TH gátlásának következményeként kialakuló plazma PRL szint emelkedésben egyik nemnél sem. Ez szintén arra utal, hogy az L-DOPAerg neuronok nem vesznek részt a PRL elválasztás szabályozásában. KÖVETKEZTETÉSEK 1. A szopási ingerre bekövetkezo PRL válaszhoz a hypothalamus és az agytörzs közötti kapcsolat sértetlensége szükséges. 2. A hypothalamikus paraventricularis mag mediális, parvocelluláris része fontos szerepet játszik a szopási inger hatására létrejövo PRL válasz kialakításában, és feltétlen szükséges a neurális jelátvitel megfelelo muködéséhez. 3. A paraventricularis mag szerotoninerg innervációja részt vesz az azonnali, és nagyfokú PRL kiáramlást kiváltó szopási stimulus által beindított neuroendokrin reflex válasznak az agytörzsbol a hypothalamusba történo közvetítésében. 4. Az újszülöttkori MSG kezelés elsosorban a TIDA rendszernek a ventrolateralis részén elhelyezkedo L- DOPAerg neuronjait érinti és ezek közvetlenül nem vesznek részt a nyugalmi PRL szint szabályozásában. 5. A TH farmakológiai úton történo gátlását követo PRL szint emelkedés alapvetoen különbözik hím és nostény állatokban, s ezt az újszülöttkori MSG kezelés nem befolyásolja. 19
6. Az újszülöttkori MSG kezelés, hasonlóan a PRL elválasztáshoz, nem befolyásolja a felnottkori bazális illetve a TH gátlás után létrejövo? MSH elválasztást. 7. A PACAP a PRL elválasztást fokozó hatását nem közvetlenül, az elülso lebenyen fejti ki. A PRL elválasztás fokozódásában nagy valószínuséggel a közti lebenyben felszabaduló? MSH játszik szerepet. 8. A laktotrop sejteken található D 2 -receptorok nem vesznek részt a PACAP PRL ürítést fokozó hatásának közvetítésében. 9. A mellékvese szteroidok fiziológiás szintje szükséges a laktotrop sejtek serkento faktorok iránti válaszkészségének fenntartásához. 10. A PACAP a hypophysealis növekedési hormon szekréciót közvetlenül a somatotrop sejtekre hatva növeli. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetemet szeretném mindazoknak kifejezni, akiknek segítsége és támogatása nélkül ez a dolgozat nem jöhetett volna létre. Elsosorban szeretnék köszönetet mondani témavezetomnek, Prof. Nagy M. Györgynek, akinek értékes tudományos és személyes tanácsaira a diákkörösként illetve Ph.D. hallgatóként mellette töltött évek során mindig számíthattam. Nagyra értékelem, hogy a munkacsoporton belül egy családias, baráti, ugyanakkor szakmailag is nagyon stimuláló légkört sikerült kialakítania. Külön köszönettel tartozom a közlemények, valamint a jelen dolgozat megírásában nyújtott segítségéért. Szeretném megköszönni a Neuroendokrin Kutatócsoport szakmai vezetojének, Halász Béla Professzor Úr támogatását, akitol lehetoséget kaptam, hogy a kutatócsoportban dolgozhassam, és akinek jóindulatú tanácsai és segítsége végigkísért diákköri és Ph.D. munkámban is. Külön köszönöm 20
a közlemények és a Ph.D. dolgozatom megírásában nyújtott segítségét. Köszönettel tartozom Salamon Antalnénak és Takács Tivadarnénak az alapveto labortechnikák megtanításáért és az immunhisztológia munkákban nyújtott értékes segítségükért; Mészáros Máriának az állatmutétek megtanításáért illetve a kísérletekben nyújtott, gyakran nélkülözhetetlen, segítségéért; Dr. Bánky Bulcsúnénak az elso kísérletsorozat végrehajtása során nyújtott gyakorlati segítségéért, Dr Tóth Bélának és asszisztenseinek Balázs Istvánnénak és Szentmiklósi Lajosnénak a PRL és GH mérésekért, Dr. Vecsernyés Miklósnak a plazma? MSH szintek meghatározásáért valamint Dr. Somogyvári-Vigh Anikónak a PACAP mérésekért. Köszönöm Dr. Kocsis Katalinnak a számítógépes munkában nyújtott nélkülözhetetlen segítségét. Köszönetemet szeretném még kifejezni az itt most név szerint nem említett társszerzoknek és a Humánmorfológiai és Fejlodésbiológiai Intézet minden dolgozójának, aki jóindulatával és szakmai tanácsával segített. 21
Az értekezést megalapozó saját közlemények I. Bodnár, I., Göoz, P., Okamura, H., Tóth, B.E., Vecsernyés, M., Halász, B. and Nagy, G.M., 2001. Effect of neonatal treatment with monosodium glutamate on dopaminergic and L-DOPAergic neurons of the medial basal hypothalamus and on prolactin and MSH secretion of rats. Brain Res. Bull. 55: 767-774. II. Bodnár, I., Bánky Zs., Tóth, B.E, Nagy, G.M. and Halász, B., 2002. Brain structures mediating the suckling stimulus-induced release of prolactin. J Neuroendocrinology 14: 384-396. Egyéb közlemények 1. Vecsernyés, M., Nagy G., Mészáros, L., Bodnár, I., Ahmed, K., Tóth, R., Julesz, J. and Nagy, G.M., 2000. Suckling- induced change in oxytocin but not in alpha- MSH concentrations of the median eminence, the neural-, intermediate- and anterior lobes of the pituitary gland. Endocrine Res. 26: 333-345. 2. Tóth, B., Bodnár, I., Homicskó, K.G., Fülöp, F., Fekete, M.I.K. and Nagy, G.M., 2002. Physiological role of salsolinol. Its hypophysiotrophic function in the regulation of pituitary prolactin secretion. Neurotoxicology and Terratology 24. 22