A plazmamembrán típusú Ca 2+ ATPáz intramolekuláris kölcsönhatásainak vizsgálata

A plazmamembrán típusú Ca 2+ ATPáz intramolekuláris kölcsönhatásainak vizsgálata Doktori (Ph.D.) értekezés Padányi Rita Témavezetok: Dr. Enyedi Ágnes Dr. Sarkadi Balázs Készült az Országos Gyógyintézeti Központ Hematológiai és Immunológiai Intézetének Molekuláris Sejtbiológia Osztályán. Budapest, 2003. Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Molekuláris Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola Pathobiokémia program Szigorlati bizottság: Elnök: Dr. Staub Mária Tagok:Dr. Buday László Dr. Vértessy G. Beáta Hivatalos bírálók: Dr. Enyedi Péter Dr. Tompa Péter

Tartalomjegyzék 1 ÖSSZEFOGLALÁS...2 2 ABSTRACT...3 3 RÖVIDÍTÉSEK...4 4 BEVEZETÉS...5 4.1 A CA 2+ HOMEOSZTÁZIS...5 4.1.1 Az intracelluláris Ca 2+ -koncentráció emelkedését kiváltó mechanizmusok...6 4.1.2 Ca 2+ függo folyamatok (Effektor funkciók)...8 4.1.3 Az intracelluláris Ca 2+ -koncentrációt csökkento mechanizmusok...9 4.2 A CA 2+ TRANSZPORT ATPÁZOK...10 4.3 SERCA HARMADLAGOS SZERKEZETE...12 4.4 A PLAZMAMEMBRÁN TÍP USÚ CA 2+ ATPÁZOK...14 4.4.1 A katalitikus ciklusban résztvevo domének... 15 4.4.2 A C-terminális regulátor régió... 18 4.4.3 A különbözo izoformák aktivitásának kinetikai jellemzoi... 26 5 CÉLKITUZÉSEK... 29 6 METODIKÁK... 30 6.1 A KÍSÉRLETEKBEN FELHASZNÁLT DNS KONSTRUKCIÓK...30 6.2 SEJTKULTÚRA ÉS TRANSZFEKCIÓ...30 6.3 MEMBRÁNPREPARÁLÁS COS-7 SEJTEKBOL...30 6.4 KALPAINOS ÉS KIMOTRIP SZINES EMÉSZTÉS...31 6.5 EMÉSZTÉS KASZPÁZ-3-MAL...31 6.6 GÉLELEKTROFORÉZIS ÉS ELEKTROTRANSZFER...32 6.7 CA 2+ TRANSZPORT MÉRÉS...32 6.8 AZ ATPÁZ AKTIVITÁS MÉRÉSÉHEZ SZÜKSÉGES TISZTÍTOTT PMCA ELOÁLLÍTÁSA...32 6.9 A PMCA AKTIVÁLÓDÁSÁNAK KINETIKAI ANALÍZISE...33 6.10 A PMCA INAKTIVÁLÓDÁSÁNAK KINETIKAI ANALÍZISE...33 6.11 PMCA4B SZERKEZETI MODELLJE...34 7 EREDMÉNYEK... 35 7.1 A HPMCA4B IZOFORMA INTRAMOLEKULÁRIS KÖLCSÖNHATÁSAINAK VIZSGÁLATA LIMITÁLT PROTEOLÍZISSEL...35 7.1.1 Hasítási helyek a hpmca4b C-terminális régiójában... 35 7.1.2 Különbözo konformációs állapotok hatása a PMCA4b degradációjára... 41 7.2 A KALMODULIN-KÖTO SZEKVENCIÁBAN TALÁLHATÓ TRP 1093 MUTÁCIÓJÁNAK HATÁSA A PMCA4B INTRAMOLEKULÁRIS KÖLCSÖNHATÁSAIRA...45 7.3 AZ AUTOINHIBÍTOR RÉGIÓTÓL N-TERMINÁLISAN TALÁLHATÓ ASZPARAGINSAV (ASP 1080 ) SZEREPE A HPMCA4B IZOFORMA BELSO GÁT LÁSÁBAN...48 8 MEGBESZÉLÉS, KÖVETKEZTETÉSEK... 54 9 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS... 60 10 IRODALOMJEGYZÉK... 61 11 SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE... 70 1

1 Összefoglalás Élo sejtek számára létfontosságú az alacsony intracelluláris Ca 2+ koncentráció biztosítása. Ebben játszik kulcsszerepet a plazmamembrán típusú Ca 2+ ATPáz (PMCA), amely ATP hidrolízis energiájának terhére Ca 2+ ionokat pumpál a citoszolból az extracelluláris térbe. A PMCA C-terminális regulátor régiója tartalmaz egy kalmodulinköto szekvenciát, amely nyugvó sejtben kölcsönhatásba lép az enzim katalitikus centrumával, és gátolja az enzim aktivitását. Aktivált sejtben a Ca 2+ -kalmodulin komplex kötodik a kalmodulin-köto szekvenciához, aminek hatására a katalitikus régió felszabadul a belso gátlás alól, a pumpa aktiválódik. Az aktiválódás során bekövetkezo szerkezeti változásokon kívül, az enzimciklus közben is folyamatosan változik a pumpa konformációja a nagy Ca 2+ -affinitású (E1) és a kis Ca 2+ -affinitású (E2) állapotok között. Limitált proteolízissel és pontmutációk segítségével tanulmányoztuk a PMCA4b C- terminális régiójának és katalitikus centrumának kölcsönhatásait. Három különbözo proteázt választottunk, amelyek a C-terminális régióban a kalmodulin-köto szekvenciától N-terminális (kaszpáz-3) illetve C-terminális (kimotripszin, kalpain) irányban hasítják a pumpát. Mindhárom proteáz esetében azt tapasztaltuk, hogy a fehérje konformációjától függoen változott a fragmentképzodés intenzitása. Inaktív fehérje esetében, amennyiben az enzim konformációja E2 állapot felé tolódik (Ca 2+ hiányában), alig képzodött fragment, mivel a szoros intramolekuláris kölcsönhatások miatt a proteázok kevéssé férnek hozzá a hasítási helyekhez. Inaktív szerkezetu, de E1 konformációjú fehérje esetében (Ca 2+ jelenlétében) valamivel nagyobb mértéku fragmentációt detektáltunk. Ez arra utal, hogy ebben az esetben a C-terminális régió lazábban kapcsolódik a katalitikus centrumhoz. A leggyengébb intramolekuláris kölcsönhatást bizonyító, legintenzívebb degradációt a Ca 2+ -kalmodulin komplexet köto, aktív szerkezetu fehérje esetében figyeltünk meg. Kísérleteink alapján a C-terminális régió szerkezeti változásai a kalmodulin-köto szekvenciától N-terminális és C- terminális irányba is kiterjednek a pumpa muködése során. Ezzel ellentétben, amennyiben az 1093. triptofánt (Trp 1093, a kalmodulin-köto szekvencia egyik fontos eleme) alaninra cseréltük, csak a kalmodulin-köto szekvencián belül található hasítási helyek lettek hozzáférhetobbek a proteázok számára. Kimutattuk továbbá, hogy az 1080. aszparaginsav (Asp 1080, emellett hasít a kaszpáz-3), bár a kalmodulin-köto szekvencián kívül helyezkedik el, jelentosen hozzájárul az inaktív szerkezet stabilizálásához. 2

2 Abstract The plasma membrane calcium pump (PMCA) is the sole Ca 2+ extrusion system in many cells that is responsible for maintaining the low cytosolic calcium concentration critical to cell function. The role of this protein is to eject Ca 2+ from the cytosol to the extracellular space using the energy of ATP. The carboxyl terminus of PMCA contains a high affinity calmodulin-binding sequence that interacts with the catalytic core and inhibits the activity of the pump in resting cells. In activated cells binding of Ca 2+ -calmodulin to the calmodulin-binding sequence frees the catalytic core from the auto-inhibition and the pump becomes activated. In addition to the changes between the activated and inhibited states, the conformation of the pump also changes between the high (E1) and low (E2) Ca 2+ affinity states during the reaction cycle. In this study we utilized limited proteolysis and site directed mutagenesis to monitor the regions involved in the auto-inhibitory interactions of the ubiquitous PMCA4b. We used three different proteases that all cleaved the protein at its carboxyl terminus upstream (caspase-3) or downstream (chymotrypsin and calpain) of the calmodulin-binding sequence. We found that the fragmentation highly depended on the conformational state. When the pump was in the auto-inhibited state and the E1-E2 equilibrium was shifted more towards the E2 conformation (in the absence of Ca 2+ ) the C-terminal region was resistant to proteolysis because of tight intra-molecular interactions. When the equilibrium was shifted more towards the E1 conformation (in the presence of Ca 2+ ) the cleavage sites became more exposed and the pump was partially degraded suggesting that the interaction between the C-terminal region and the catalytic core was weaker. Binding of Ca 2+ -calmodulin to the binding site made the carboxyl terminus more flexible and the fragmentation more intensive. Our experiments show that the conformational changes in the C-terminal region induced by Ca 2+ or by Ca 2+ -calmodulin extend to the regions both upstream and downstream of the calmodulin-binding sequence. In contrast, replacing Trp 1093 (a key residue within the calmodulin-binding sequence) to an alanine exposed only proteolytic sites whithin the calmodulin-binding sequence. We also showed that an aspartate residue (Asp 1080, the target of caspase-3 cleavage), although, located outside of the calmodulin-binding sequence greatly contributes to the stabilization of the auto-inhibited conformation of the pump. 3

3 Rövidítések ATP bp BSA cadpr cdns ECL ER FCS hpmca IP 3 K 0,5 k akt K d k inakt MAGUK mrns NMDA receptor PCR PDZ PIP 2 PMCA pp60 src PSD PVDF SAP SDS SERCA SR TCA V max adenozin-trifoszfát bázispár borjú szérum albumin ciklikus adenozin-difoszfát-ribóz komplementer DNS enhanced chemiluminescence endoplazmás retikulum fetal calf serum (borjúszérum) humán plazmamembrán Ca 2+ ATPáz inozitol-1,4,5-triszfoszfát V max felének eléréséhez szükséges szubsztrátkoncentráció aktiválódási sebességi állandó disszociációs konstans inaktiválódási sebességi állandó membrán-asszociált-guanilát-kináz hírvivo RNS N-metil-D-aszpartát receptor polimeráz láncreakció PSD95/Dlg/ZO-1 foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfát plazmamembrán Ca 2+ ATPáz egy nem receptor tirozin-kináz posztszinaptikus denzitás polivinilidén-difluorid szinapszis-asszociált fehérje nátrium lauril-szulfát szarko/endoplazmás retikulum Ca 2+ ATPáz szarkoplazmás retikulum triklór-ecetsav a reakció maximális sebessége 4

4 Bevezetés A plazmamembrán Ca 2+ ATPáz a sejt aktív Ca 2+ -transzport-rendszerei közé tartozik, és az intracelluláris Ca 2+ -koncentráció egyik fontos szabályozó eleme. Ezek a transzport mechanizmusok különösen fontosak a sejt számára, hiszen a Ca 2+ homeosztázis olyan alapveto sejtfolyamatokban játszik reguláló szerepet, mint pl. az anyagcsere, az izomkontrakció vagy a szekréció (8,19,25). 4.1 A Ca 2+ homeosztázis A nyugalmi állapotban lévo sejt intracelluláris Ca 2+ -koncentrációja 100 nm alatti érték. A Ca 2+ szint emelkedése a sejten belül a legkülönbözobb folyamatokat szabályozza. A Ca 2+ jel sebessége, amplitúdója, térbeli és idobeli mintázata rendkívül változatos (7). Ezt a változatosságot tovább erosíti a jelátvitelben résztvevo molekulák nagy száma, valamint hogy sok molekulának több, eltéro tulajdonságú izoformája van. A jelátviteli rendszer fehérjéi összetett molekulakomplexeket hoznak létre, amelyek az egyes sejttípusokban, illetve a sejt különbözo részeiben eltéro kombinációkban lehetnek jelen, és így a legkülönbözobb térbeli és idobeli Ca 2+ szignál kialakítására képesek. A Ca 2+ jelátvitel megfelelo muködését szabályozó molekuláris mechanizmusokat három csoportra oszthatjuk (1.ábra): Ca 2+ szint emelkedését kiváltó mechanizmusok Ca 2+ koncentráció nyugalomban 100 nm Ca 2+ koncentráció aktivált sejtben 0,5-1?M Ca 2+ érzékeny folyamatok Ca 2+ szintet csökkento mechanizmusok (Berridge és mtsai alapján (8)) 1. ábra A Ca 2+ -jelátvitel három egysége 5

? Stimulusok hatására aktiválódnak az intracelluláris Ca 2+ -koncentráció emelkedését kiváltó mechanizmusok, amelyek Ca 2+ -ot juttatnak a citoszolba.? A Ca 2+ mint mediátor számos Ca 2+ érzékeny folyamatot aktivál (effektor funkciók).? Az intracelluláris Ca 2+ -koncentrációt csökkento mechanizmusok ebbe a csoportba tartoznak a plazmamembrán típusú Ca 2+ ATPázok eltávolítják a Ca 2+ -ot a citoplazmából, és visszaállítják a nyugalmi Ca 2+ -koncentrációt. 4.1.1 Az intracelluláris Ca 2+ -koncentráció emelkedését kiváltó mechanizmusok Az intracelluláris Ca 2+ -koncentráció emelkedés egyrészt a plazmamembránon keresztül létrejövo Ca 2+ -beáramlás, másrészt az intracelluláris raktárakból a citoszolba történo Ca 2+ felszabadulás következménye. 4.1.1.1 Ca 2+ felszabadulás az intracelluláris raktárakból A sejt belso Ca 2+ raktára az endoplazmás, illetve az izomban a szarkoplazmás retikulumban van (6,9). A Ca 2+ a raktárakban fehérjékhez kötve található, ami biztosítja, hogy a magas koncentráció (0,1-1mM) ellenére a Ca 2+ nem csapódik ki. Ezek a Ca 2+ - köto fehérjék nagy kapacitással kötik a Ca 2+ iont, Ca 2+ iránti affinitásuk azonban kicsi (K d ~ 1 mm), tehát megengedik a Ca 2+ kiszabadulását a raktárból (106,70). A sejtet éro szignálok több lépésen keresztül képesek megváltoztatni az intracelluláris raktárak membránjának Ca 2+ ionra vonatkozó permeabilitását azáltal, hogy aktiválják az itt található Ca 2+ csatornákat. Az intracelluláris raktárakban kb. négy nagyságrenddel nagyobb a Ca 2+ -koncentráció, mint a citoszolban, így az aktiválást követoen a Ca 2+ csatornákon keresztül a citoszolba passzív transzporttal áramlik a Ca 2+ (83). Az intracelluláris raktárak membránjában számos Ca 2+ csatorna található, amelyek közül az IP 3 receptor és a rianodinreceptor család tagjai a legismertebbek. Ezeknek a csatornáknak a muködését sokféle faktor szabályozza. Az IP 3 receptorhoz a PIP 2 hasításakor képzodo IP 3 molekula diffúzióval jut el, kötodése a receptor aktiválását eredményezi (4,91,44). Az IP 3 koncentrációtól függoen aktiválhatja a receptort maga a Ca 2+ ion is. Általánosságban igaz, hogy alacsony IP 3 koncentráció mellett magas intracelluláris Ca 2+ szint (?300nM) gátolja a csatorna muködését. Magas IP 3 koncentráció mellett, amenyiben a receptor köti az IP 3 molekulát, a receptor elveszti 6

érzékenységét a magas Ca 2+ -koncentráció gátló hatásával szemben. Ebben az esetben a Ca 2+ szint emelkedése stimulálja az IP 3 receptort (11). A rianodinreceptor fo aktivátora maga a Ca 2+ ion (Ca 2+ indukált Ca 2+ felszabadulás), amely a citoplazmatikus oldalról szabályozza a csatorna muködését. Ez a csatorna a szívizom és a harántcsíkolt izom szarkoplazmás retikulumában található, és a Ca 2+ iránti érzékenységét a ciklikus ADP ribóz (cadpr) befolyásolja még nem teljesen tisztázott módon (16,66). A Ca 2+ indukált Ca 2+ felszabadulás folyamata lehetové teszi, hogy az IP 3 illetve a rianodinreceptorok kommunikáljanak egymással, és koordinált Ca 2+ szignált hozzanak létre. 4.1.1.2 Plazmamembránon keresztül történo Ca 2+ beáramlás A sejten belüli Ca 2+ -koncentráció emelkedés másik lehetséges útja a Ca 2+ beáramlása a plazmamembránon keresztül. Az extra- és intracelluláris Ca 2+ - koncentráció különbsége és a sejtmembrán két oldala között fennálló nyugalmi membránpotenciál elektrokémiai grádienst hoznak létre. Amennyiben a sejtmembrán Ca 2+ ionra vonatkozó permeabilitása a sejtet éro stimulus hatására megno, az elektrokémiai grádiens hajtóereje Ca 2+ beáramlását eredményezi az extracelluláris térbol a citoszolba. A Ca 2+ beáramlása az extracelluláris térbol a citoszolba a plazmamembrán Ca 2+ - csatornáin keresztül történik. A Ca 2+ -csatornákat aszerint, hogy milyen fiziológiás szignál hatására nyílnak meg, több csoportra osztjuk:? Elektromos szignál, depolarizáció hatására a feszültségfüggo Ca 2+ -csatornák aktiválódnak, melyek az excitábilis sejtek membránjában találhatóak, és az általuk létrehozott Ca 2+ -szignál fontos szerepet játszik a neurotranszmitterek felszabadulásában, a simaizom-kontrakcióban és számos hormon szekréciójában (72).? A Ca 2+ -csatornák másik nagy csoportja a ligandfüggo ioncsatornák (pl. glutamát- NMDA receptor, P 2 purinerg receptor) extracelluláris kémiai anyagok hatására aktiválódnak, és dönto szerepet játszanak például a neurotranszmitter hatásának közvetítésében (15,82). Ezek a csatornák feszültségre nem vagy csak nagyon kevéssé érzékenyek, és jellemzo rájuk a nagyfokú Ca 2+ -szelektivitás.? A kapacitatív Ca 2+ beáramlás esetében a kiürült belso raktárak hatására aktiválódnak a raktárfüggo Ca 2+ -csatornák, még ismeretlen mechanizmussal (68,81). A legújabb bizonyítékok szerint az endoplazmás retikulumban található Ca 2+ mennyiségét az IP 3 receptor vagy a rianodinreceptor érzékeli, amely 7

struktúrális kapcsolatban áll a raktárfüggo Ca 2+ -csatornával. Az ER Ca 2+ szintjének csökkenése konformációs változást idéz elo a raktár ioncsatornájában, amely az intermolekuláris kapcsolat révén hat a plazmamembrán Ca 2+ -csatornára. A konformációs változás hatására a raktárfüggo Ca 2+ csatorna megnyílik, és Ca 2+ áramlik a sejtbe (5,12,63). 4.1.2 Ca 2+ függo folyamatok (Effektor funkciók) A kialakult Ca 2+ -szignál a sejt Ca 2+ érzékeny folyamatain keresztül számos celluláris választ hoz létre. Ezeket a folyamatokat Ca 2+ -köto fehérjék irányítják, amelyeket két csoportra oszthatunk:? Az ún. Ca 2+ szenzorok olyan fehérjék, amelyek konformációja a Ca 2+ - koncentrációtól függoen jelentosen változik. A család tagjai Ca 2+ -kötött formában különbözo effektor molekulákat aktiválnak. Klasszikus multifunkcionális szenzor a kalmodulin, mely az N- és a C-terminális globuláris doménjében 2-2 Ca 2+ iont köt meg (69). A Ca 2+ -kalmodulin komplex számos enzimhez képes kötodni, és ezáltal sokféle sejtfolyamat szabályozásában vesz részt: pl. miozin-könnyulánc-kináz (simaizom kontrakció, sejtmigráció, adhézió, szekréció) (58), Ca 2+ -kalmodulin függo protein-kinázok I és II (gén expresszió, szinaptikus plaszticitás) (73,89), plazmamembrán Ca 2+ ATPáz (Ca 2+ jelátvitel), ciklikus nukleotid foszfodiészteráz (camp-mediátorrendszer) (57), glikogén-foszforiláz-kináz (szénhidrátanyagcsere) (14), kalcineurin (transzkripció) (64), nitrogén-monoxid-szintetáz (NO-mediátorrendszer) (104). A másik klasszikus szenzor a troponin C, amely az aktin és a miozin kölcsönhatását szabályozza a harántcsíkolt izomban illetve a szívizomban (43). Ezenkívül sok egyéb Ca 2+ -szenzor található a sejtben még specifikusabb funkcióval. Pl. az annexin család (I-XII), amelynek tagjai Ca 2+ -függo módon kötodnek a membrán foszfolipid felszínéhez, és így megakadályozzák, hogy ezek a foszfolipáz A2 szubsztrátjai legyenek (46). Szerepet játszanak ezenkívül az endocitózisban és az exocitózisban is. A synaptotagmin olyan Ca 2+ -köto fehérje, amely membránvezikulákhoz kötodik, és a Ca 2+ függo exocitózisért felelos (23,65).? A Ca 2+ -köto fehérjék másik csoportját olyan Ca 2+ -köto enzimek alkotják, amelyek a Ca 2+ -koncentráció emelkedésének hatására közvetlenül aktiválódnak. Ide tartozik a kalpain, amely egy intracelluláris proteáz, és számos folyamat szabályozásában vesz részt (pl. sejtciklus, differenciáció, apoptózis) (18,90). 8

A protein kináz C (PKC) egy olyan szerin/treonin kináz enzimcsalád, amelyet mind a Ca 2+ jelátviteli rendszer, mind az inozitol-foszfolipid jelátviteli rendszer (diacilglicerol) aktiválhat (74,76). Az aktivált PKC számos sejtfunkciót génexpresszió, sejtproliferáció, differenciáció szabályoz. A szerin/treonin foszfoprotein-foszfatázok családjába tartoznak a PP2B enzimek. A PP2B, más néven kalcineurin egy olyan 2 alegységbol felépülo foszfatáz, amelyet különbözo alegységein keresztül mind a Ca 2+ ion, mind a Ca 2+ -kalmodulin komplex képes aktiválni (64). Az aktivált enzim a transzkripció szabályozásán keresztül hat különbözo sejtfolyamatokra. 4.1.3 Az intracelluláris Ca 2+ -koncentrációt csökkento mechanizmusok A stimulusok hatására létrejövo Ca 2+ -koncentráció emelkedés a citoplazmában átmeneti, mivel a plazmamembránban, illetve az endoplazmás és szarkoplazmás retikulum (ER/SR) membránjában található transzportrendszerek eltávolítják a Ca 2+ -t a citoszolból. E transzportrendszerek közé tartoznak a plazmamembrán típusú, illetve a szarko/endoplazmás retikulum típusú Ca 2+ ATPázok, valamint a plazmamembránban található Na + /Ca 2+ cseretranszporter. A Ca 2+ ATPázok ATP hidrolízisébol nyert energia felhasználásával pumpálnak Ca 2+ ionokat a citoszolból az extracelluláris térbe (plazmamembrán típusú Ca 2+ ATPáz), illetve az endoplazmás és a szarkoplazmás retikulum lumenébe (szarko/endoplazmás retikulum típusú Ca 2+ ATPáz). A Na + /Ca 2+ cseretranszporter? összehasonlítva a Ca 2+ ATPázokkal? nagyobb kapacitású, de kisebb Ca 2+ affinitású rendszer (10). Míg a Ca 2+ ATPázok már néhány tized? M Ca 2+ -koncentráció változásra is érzékenyen reagálnak, addig a Na + /Ca 2+ cseretranszporter optimális aktivitását néhány?m Ca 2+ -koncentrációnál éri el, és ezért kevésbé alkalmas a nyugalmi Ca 2+ szint (? 0,1?M) finomabb beállítására. A Ca 2+ ion eltávolítása az extracelluláris térbe ez esetben a Na + ion elektrokémiai grádiensének terhére történik. A Na + /Ca 2+ cseretranszporter (a plazmamembrán Ca 2+ ATPázokkal szemben) nincs jelen minden sejtben (hiányzik például a májsejtek membránjából), legnagyobb aktivitással idegsejtekben és szívizomsejtekben muködik. A citoszolból történo Ca 2+ eltávolításában szerepet játszik a mitokondrium is, amely képes arra, hogy a Ca 2+ jel kialakulása során gyorsan felvegye a Ca 2+ ionokat, majd a jel lecsengése alatt azokat lassan visszajuttassa a citoszolba. A Ca 2+ gyors eltávolításával a mitokondrium befolyásolja a Ca 2+ jel amplitúdóját, térbeli és idobeli 9

alakját (31). A Ca 2+ felvétel a protongrádiens energiájának terhére egy uniporteren keresztül történik, amelynek Ca 2+ iránti affinitása alacsony (félmaximális aktivitás ~15?M). Az alacsony affinitás azt jelenti, hogy a mitokondrium akkor akkumulálja a Ca 2+ -ot hatékonyabban, ha lokálisan magas a Ca 2+ ion koncentrációja (81). Erre akkor van lehetoség, amikor a mitokondrium és valamelyik ER/SR Ca 2+ -csatorna (pl. IP 3 receptor vagy rianodinreceptor) térben közel vannak egymáshoz (26). A két organellum között így kölcsönös kapcsolat alakulhat ki: az ER/SR által kibocsátott Ca 2+ ionokat a mitokondrium felveszi. A mitokondrium Ca 2+ -köto kapacitása nagy. A mitokondriális mátrix Ca 2+ puffereket tartalmaz, amelyek a szabad mitokondriális Ca 2+ -koncentrációt szabályozzák. Amikor az intracelluláris Ca 2+ visszaáll a nyugalmi értékre, a mitokondriális Na + /Ca 2+ cseretranszporter visszajuttatja a Ca 2+ ionokat a citoszolba. 4.2 A Ca 2+ transzport ATPázok A Ca 2+ transzport ATPázok Ca 2+ ionokat távolítanak el a citoszolból, fenntartva ezzel az alacsony intracelluláris Ca 2+ -koncentrációt. A többi P-típusú ATPázhoz (pl. Na + /K + -ATPáz, H + /K + -ATPáz) hasonlóan az iontranszporttal párhuzamosan foszforilálódnak, és nagy energiájú foszforilált intermediert képeznek (59). Az enzimciklusuk során a Ca 2+ ionok megkötése és a foszforiláció váltakozik a Ca 2+ transzporttal és a hidrolízissel (2. ábra). A folyamatot a fehérje konformációváltozása kíséri, aminek következtében a Ca 2+ -köto helyek Ca 2+ iránti affinitása megváltozik (105). foszforiláció E1Ca 2+ ATP ADP E1Ca 2+ -P Ca 2+ kötodése Ca 2+ E2 E2-P Ca 2+ Ca 2+ transzlokáció P i hidrolízis 2. ábra A Ca 2+ ATPázok enzimciklusa 10

Az E1 konformációjú szerkezet nagy affinitással, míg az E2 forma kis affinitással köti a Ca 2+ -ot. Valószínu, hogy az E2 forma H + iont köt, és az enzim a reakcióciklusa alatt H + iont juttat a citoszolba a Ca 2+ ionnal ellentétes irányba (hasonlóan a Na + /K + pumpához, amely szintén kétféle iont transzportál ellentétes irányba) (67,51). A plazmamembrán Ca 2+ pumpa (PMCA) és a szarko/endoplazmás retikulum típusú Ca 2+ ATPáz (SERCA) integráns membránfehérjék, amelyek fo tömege (~70%) a citoszolba nyúlik, és csak kb. 10%-a van az extracelluláris térben. Elsodleges szerkezetük 32%-ban megegyezik. Nagyon konzervatív az enzim katalitikus centruma az ATP-köto régió, illetve a foszforilálódó aszparaginsav környezete valamint a Ca 2+ ionok transzlokációjában résztvevo aminosavak egy része (96). Lényeges eltérés viszont, hogy a SERCA két Ca 2+ iont transzportál egy ATP molekula energiájának terhére (52), míg a PMCA pumpa csak egyet (51). Hasonló a két fehérje másodlagos szerkezete: mind a SERCA, mind a PMCA pumpák 10 transzmembrán hélixet és 2 nagyobb citoplazmatikus hurkot tartalmaznak (a 2. és 3. illetve 4. és 5. transzmembrán hélix között) (3. ábra). A legfeltunobb eltérés köztük, hogy a PMCA rendelkezik egy hosszú intracelluláris C-terminális régióval (17). Ez tartalmazza az autoinhibítorként is muködo kalmodulin-köto szekvenciát és egyéb regulációs helyeket. kis hurok COOH nagy hurok kalmodulinköto szekvencia NH 2 intracelluláris tér transzmembrán régió extracelluláris tér 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 3. ábra A PMCA szerkezetének sematikus modellje A két Ca 2+ ATPáz szerkezeti modellje megegyezik, kivéve, hogy a SERCA esetében a kék színnel jelölt C-terminális regulátor régió hiányzik. 11

A SERCA nem tartalmaz endogén autoinhibítor régiót. Helyette egy specifikus fehérje, a foszfolambán szabályozhatja aktivitását (53,61). A foszfolambán a szívizomban expresszálódik, és azáltal hogy intermolekuláris kapcsolatba lép a SERCA-val, gátolja annak aktivitását. 4.3 SERCA harmadlagos szerkezete Közvetlen szerkezeti információt egészen az utóbbi évekig egyetlen aktív transzportfehérjérol sem írtak le. A legutóbbi évek eredménye, hogy meghatározták a szarko/endoplazmás retikulum típusú Ca 2+ ATPáz 1a izoformájának (SERCA1a) kristályszerkezetét az E1 illetve E2 konformációs állapotban (97,98,48). A kalciumkötött forma (E1Ca 2+ ), illetve a thapsigargin (TG) gátlószerrel stabilizált, kalciumot nem kötött forma (E2(TG)) szerkezetének ismeretébol következtetni lehet a Ca 2+ transzport mechanizmusának egyes lépéseire. A SERCA transzmembrán régiója 10 különbözo hosszúságú és dolésu? hélixbol épül fel (M1-M10). A két Ca 2+ -köto hely a transzmembrán régióban egymástól 5,7 Å távolságra helyezkedik el. Az ún. I. Ca 2+ -köto helyet az M5, M6 és M8 hélixeken található aminosavak megfelelo koordinációban elhelyezkedo oxigénatomjai hozzák létre (Asn 768, Glu 771 (M5), Thr 799, Asp 800 (M6), Glu 908 (M8)). Az ún. II. Ca 2+ -köto helyet döntoen az M4 hélixen található aminosavak alakítják ki (Val 304, Ala 305, Ile 307, Glu 309 (M4), Asn 796, Asp 800 (M6)). A megfelelo geometriai felépítést a kötohelyek kialakításában résztvevo aminosavak, illetve más hélixeken elhelyezkedo aminosavak közötti hidrogénkötések stabilizálják. A SERCA nagy citoplazmatikus feje E1Ca 2+ konformációban 3 jól elkülönítheto doménre tagolódik (4. ábra): a foszforilációs P-domén, a nukleotidköto N-domén és transzdukciós doménként vagy aktivátorként ismert A-domén. Az enzim citoplazmatikus doménjei közül a központi helyet a P-domén foglalja el, amely tartalmazza az enzimciklus során foszforilálódó aszparaginsavat (Asp 351 ). A P- domén szoros kapcsolatban áll több transzmembrán hélixszel. A ~60 Å hosszúságú M5 hélix a membrán luminális felszínétol egészen a P-domén közepéig tart. Ezenkívül a P- domén hidrogénhidak segítségével kapcsolódik az M3, M4 és M6 hélixekhez. Ezek a kapcsolatok fontos szerepet játszhatnak az egymástól ~50 Å távolságra elhelyezkedo foszforilációs hely és a Ca 2+ -köto helyek közötti kommunikációban. Az N-domén köti az ATP adenozin csoportját. Ez a legnagyobb a három citoplazmatikus domén közül, amelyet egy vékony ún. csukló régió kapcsol össze a P-doménnel. 12

Az A domén a legkisebb citoplazmatikus domén, amely hosszú peptidszakaszokon keresztül kapcsolódik az M2 és M3 hélixszekhez. A B 110 o A-domén N-domén 90 o D351 30 o P-domén D351 5 5 4 3 4 6 1 9 1 6 10 Ca 2+ 2 10 Ca2+ 2 9 8 Ca 2+ 8 7 4 4 3 7 1 E2 E1Ca 2+ 4. ábra A SERCA harmadlagos szerkezete A, E2 konformációban a három citoplazmatikus domén zárt struktúrát alkot. A P-doménen belül található az enzim foszforilációs helye (D351, piros kör). Narancssárga körök a Ca 2+ ionok kötésében résztvevo aminosavakat jelölnek az M4, M5, M6 és M8 hélixeken. Az M2 és M3 hélixeken poláris vagy negatív töltésu aminosavak (sárga körök) egy lehetséges a citoszolból a transzmembrán régióba vezeto Ca 2+ belépési utat határoznak meg. B, E1Ca 2+ forma. Az E2 állapothoz képest a citoplazmatikus domének egymástól eltávolodnak (a doménmozgásokat nyilak jelölik), így a citoplazmatikus régió szerkezete tagolttá válik. (Green és mtsai alapján (48)) A három citoplazmatikus domén, amely a fehérje E1Ca 2+ állapotában jól elkülönül egymástól, E2 konformációban lényegesen zártabb struktúrát alkot (4. ábra). A E2 forma zárt konformációját az A-N és az A-P domének határfelülete között kialakult hidrogénhidak stabilizálják. A szerkezeti vizsgálatok felfedték, hogy mindhárom domén jelentos mozgást végez az E2? E1 állapotváltozás során. Az N-domén közel 90 o -ot hajlik el a membránhoz 13

viszonyítva, így a felso része több mint 50 Å-nyi mozgást végez. A domén mozgása két részbol tevodik össze, egyrészt a P-domén mozgásából, másrészt az N-domén P- doménhez viszonyított mozgásából. A P-domén 30 o -os elhajlását nagyrészt a transzmembrán hélixek (foleg M5) billenése okozza. Az A-domén kb. 110 o -ot csavarodik horizontálisan. A nagy térbeli elmozdulások ellenére a domének szerkezete alig változik. A transzmembrán régióban foleg az elso hat hélix (M1-M6) elrendezodésében szintén jelentos változások következnek be a Ca 2+ ionok megkötése közben. Az átrendezodés igen változatos a különbözo hélixek esetében, és nem csak a Ca 2+ -köto helyek környezetére korlátozódik. A membránhoz viszonyítva mind felfelé a citoplazma felé, mind lefelé, illetve laterálisan mozdulnak el hélixek, és a legtöbb esetben változik a dolésszögük is. Központi lépés az M5 hélix felso citoplazma felé eso billenése, amely nagyrészt felelos a P-domén elhajlásáért. Mivel a P-domén összeköttetésben áll az M3-M6 hélixekkel, az M5 hélix felso részének elhajlása a P- doménen keresztül elbillenti az M3-M6 hélixeket is, amely további mozgásokat generál a transzmembrán illetve a citoplazmatikus régiókban. Összefoglalva: az E2? E1 állapotváltozás a Ca 2+ ionok megkötésével kezdodik, ami megváltoztatja a transzmembrán régió elrendezodését. A P-domén közvetítésével a szerkezeti változások kiterjednek az egész fehérjére. Az A-domén rotációja, az A-N és az A-P határfelületek közötti kölcsönhatások megszunése lehetové teszi az N-domén és a P-domén elhajlását, kialakul az E1Ca 2+ formára jellemzo nyitott szerkezet. A foszforilált SERCA intermedierek (E1Ca 2+ -P, E2-P) igen labilisak, szerkezetük nem ismert, így az enzimciklus további lépéseire csak következtetni lehet. Az E1Ca 2+ konformációban a foszforilációs hely több mint 25 Å távolságra helyezkedik el az enzimhez kötött nukleotidtól. Ez azt jelenti, hogy az ATP hidrolízis során az N-domén további elhajlása szükséges ahhoz, hogy a megkötött ATP? foszfátja elérje a P- doménben található foszforilációs helyet. A foszforilációt követoen valószínuleg az egész fehérje szerkezetére kiterjedo konformációváltozás következik be. Ennek eredményeként kialakul az E2-P forma, lecsökken a fehérje Ca 2+ iránti affinitása, és az extracelluláris oldalon felszabadul a Ca 2+. 4.4 A plazmamembrán típusú Ca 2+ ATPázok Az eukarióta sejtek egyik legfontosabb nagy affinitású Ca 2+ eltávolító mechanizmusát a plazmamembrán típusú Ca 2+ ATPázok alkotják. Dönto szerepük van a 14

nyugalmi intracelluláris Ca 2+ -koncentráció fenntartásában, és a Ca 2+ jelátvitel során bekövetkezo átmeneti Ca 2+ szint emelkedések ellensúlyozásában (79,80). A plazmamembrán Ca 2+ ATPázt 4 gén kódolja (PMCA1-4). E négy génrol átíródott pre-mrns-rol, két helyen bekövetkezo alternatív splicing során több mint 20 különbözo izoforma keletkezhet (94). Az alternatív splicing a molekula egy kis részét érinti az enzim szabályozásában szerepet játszó két régiókban, és nem befolyásolja alapvetoen a fehérje katalitikus ciklusban résztvevo doménjeinek szerkezetét. A PMCA1 és 4 izoformák szinte minden szövetféleségben elofordulnak, míg a másik két gén (PMCA2 és 3) termékei foként ideg-, váz- és szívizomsejtekben expresszálódnak (92). A PMCA4b a legelterjedtebb a különbözo izoformák között. Mivel vörösvérsejtben ahonnan könnyen és nagy mennyiségben nyerheto ki a fehérje szintén ez a forma domináns, sokáig a PMCA4b izoforma biokémiai jellemzése jelentette a plazmamembrán típusú Ca 2+ ATPáz vizsgálatát (37,95). Számítógépes modellezés és szekvencia analízis alapján a transzmembrán hélixek és az intracelluláris domének elrendezodése meglepoen hasonló a különbözo P- típusú ATPázok között. Igaz, a szubdomének méretében szerkezetében, térbeli orientációjában vannak olyan különbségek, amelyek a kation specificitásért illetve az egyes transzporterek eltéro szabályozásáért felelosek. Annak ellenére, hogy a SERCA és a PMCA fehérjék elsodleges szerkezetének mindössze 32%-a azonos, különösen a magasabb hasonlóságot mutató két citoplazmatikus hurok, valamint az M1-M6 transzmembrán hélixek doménszerkezete feltehetoen megegyezik a két fehérjecsalád esetében. Ezzel szemben lényeges eltérés van a két kalcium pumpa között a C- terminális régióban. Ez a régió sokkal rövidebb a SERCA (20-50 aminosav), mint a PMCA esetében (70-200 aminosav). 4.4.1 A katalitikus ciklusban résztvevo domének A katalitikus ciklusban résztvevo domének alkotják a PMCA pumpának azt a részét (megközelítoleg az elso 1100 aminosav), amely szükséges az enzim Ca 2+ transzportáló aktivitásához. A SERCA és a PMCA elsodleges szerkezetében mutatkozó hasonlóságok lehetové tették, hogy a SERCA kristályszerkezete alapján létrehozzuk a PMCA fehérje aktív centrumát alkotó részének homológia modelljét (5. ábra). Ez alapján a kis hurok, és a rövid N-terminális peptidszakasz alkotja az A-domént. A másik két citoplazmatikus domént pedig a nagy hurok hozza létre úgy, hogy a hurok két szélén 15

található, egymástól távol eso régió alakítja ki a P-domént, míg e két peptidszakaszt összeköto régió alkotja az N-domént. 4.4.1.1 Kis hurok A kis intracelluláris hurkon található a PMCA egyik regulátor régiója. Ezen a helyen bekövetkezo alternatív splicing az egyes PMCA gének esetében eltéro mértékben növeli e peptidszakasz variabilitását. A PMCA2 gén esetében jöhet létre a legtöbb variáns (8 lehetséges forma), amelyekbol emlosökben 4, emberben 3 izoformát ( w, x, y variánsok) detektáltak mrns szinten. Az izoformák közül a PMCA2w tartalmazza a leghosszabb inzertálódott peptidszakaszt. Savanyú foszfolipidek (pl. foszfatidilinozitol-bifoszfát (PIP 2 )) a kis hurok lipid-köto helyein keresztül lépnek kölcsönhatásba a Ca 2+ ATPázzal, és szabályozzák a pumpa aktivitását (13). Itt található az a régió is, amely az enzim inaktív állapotában kölcsönhatásba lép a fe hérje C- terminális részén található kalmodulin-köto szekvenciával, és ezzel részt vesz a belso gátlás kialakításában (42). Az alternatív splicing hely e között a két szabályozó régió között helyezkedik el (5.ábra). A különbözo hosszúságú és aminosav sorrendu szakaszok inzertálódása a két régió közé, valószínuleg megváltoztatja a foszfolipid-köto helynek és az A-domén belso gátlás kialakításában résztvevo régiójának térbeli kapcsolatát. A kis hurokban bekövetkezo splicingnak eddig egyetlen funkcionális hatását írták le. Chicka és mtsai vizsgálták, hogy polarizált kutya vese epitélsejtekben (MDCK sejtek) a különbözo PMCA2 izoformák milyen membránkompartmentben helyezkednek el (24). Arra a meglepo eredményre jutottak, hogy a kis hurkot befolyásoló alternatív splicing határozza meg az izoformavariánsok lokalizációját. A PMCA2w az apikális, míg a 2x és a 2z variáns a bazolaterális membránban helyezkedik el. Ezeket az eredményeket igazolja, hogy a halló és a vesztibuláris rendszer szorsejtjeinek illetve a laktáló emlo epitélsejtjeinek apikális membránjában PMCA2w izoforma található. Az alternatív splicing két lehetséges módon szólhat bele a pumpafehérje lokalizációjába. Mivel ez a splicing hely közvetlenül az enzim lipid-köto régiója után helyezkedik el, a splicing hatására megváltozhat a lipid-szenzitív peptidszakasz környezetének szerkezete, és ezáltal a Ca 2+ ATPáz képessé válhat arra, hogy olyan lipidekhez kapcsolódjon, amelyek foleg az apikális membránban fordulnak elo. Másrészrol az is lehetséges, hogy a splicing során inzertálódott peptidszakasz más fehérjékkel lép kölcsönhatásba, és ez irányítja a PMCA-t a megfelelo membránkompartmentbe. 16

Egyelore azonban még nem azonosították az(oka)t a molekulapartner(eke)t, amely(ek) az apikális lokalizációért felelos(ek). A COOH kalmodulin-köto szekvencia B N-domén alternatív splicing hely alternatív splicing hely A-domén N NH 2 L P P-domén 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 extracelluláris tér 5. ábra A PMCA szerkezete A, A PMCA szerkezetének sematikus modellje. A kis hurkon és a C- terminális régió kalmodulin-köto szekvenciáján belül található a két alternatív splicing hely (fekete kör). A kis hurok tartalmazza a lipid-köto helyet (L), a nagy hurok az enzim foszforilációs helyét (P) és az ATP-köto régiót (N). Mindkét hurokban megvastagított vonal jelöli azt a peptidszakaszt, amellyel a kalmodulin-köto szekvencia kölcsönhatásba lép az enzim inaktív állapotában. B, A PMCA homológia modellje (a SERCA kristályszerkezete (1EUL.pdb) alapján) a fehérje 6. transzmembrán hélixének C-terminálisáig állítható elo. Az A-domént a kis hurok (kék) és az N-terminális régió (lila), míg az N-domént (zöld) és a P-domént (piros) pedig a nagy hurok alakítja ki. 4.4.1.2 Nagy hurok A kb. 400 aminosavból álló nagy hurok tartalmazza a legfontosabb katalitikus doméneket. Ezek közé tartozik az ATP-köto hely, amely meghatározott távolságra helyezkedik el attól az igen konzervatív D*KTGT szekvenciától, amely az enzimciklus során foszforilálódó aszparaginsavat tartalmazza (D*). A PMCA homológia modellben a SERCA pumpának megfeleloen az ATP-köto régió az N-domén, míg a foszforilációs hely a P-domén része (5. ábra). Hasonlóan a kis hurokhoz, a nagy hurok is tartalmaz egy olyan régiót, amely a C- terminális régió kalmodulin-köto szekvenciájával lép kölcsönhatásba, és így részt vesz a 17

belso gátlás kialakításában (41). Ez a régió a foszfoenzim képzésében szerepet játszó aszparaginsavtól C-terminálisan található, és a PMCA homológia modelljében a nukleotid-köto N-domén egy részét alkotja. 2.4.1.3 Transzmembrán régió A SERCA szerkezeti vizsgálatai során két Ca 2+ -köto helyet határoztak meg, amelyeket az M4, M5, M6 és M8 hélixeken elhelyezkedo aminosavak alakítanak ki. Ha a SERCA I. Ca 2+ -köto helyét összehasonlítjuk a PMCA megfelelo doménjével, azt láthatjuk, hogy ez utóbbiban három olyan aminosavat, amelyek oldalláncát alkotó oxigénatomok a SERCA-ban részt vesznek a Ca 2+ ion kötésében, olyan aminosavak helyettesítenek, amelyek oldalláncai nem tartalmaznak oxigénatomot (50). A SERCA II. Ca 2+ -köto helye és a PMCA ennek megfelelo doménje között viszont nincs számottevo különbség. Amikor a PMCA fehérjében a SERCA II. Ca 2+ -köto helyét kialakító aminosavak megfeleloit (PMCA4b izoforma: Asn 879, Asp 883 ) más aminosavra cserélték, a mutáns enzim teljesen inaktív volt még akkor is, amikor a szubsztitúció minimális változtatást okozott (aszparaginsav? aszparagin csere) (2,49). Hasonló aminosavcsere az I. helynek megfelelo régióban kismértékben befolyásolta, de nem gátolta teljesen a Ca 2+ transzportot. Ezek alapján a PMCA feltételezhetoen egyetlen, a SERCA fehérjénél azonosított, M4 és M6 hélixek által kialakított, ún. II. aktív helyének megfelelo Ca 2+ - köto hellyel rendelkezik. 4.4.2 A C-terminális regulátor régió A PMCA-t kiemeli a P-típusú ATPázok családjából az a tulajdonsága, hogy rendkívül sokoldalúan szabályozható a muködése. A PMCA utolsó transzmembrán hélixe után elhelyezkedo C-terminális rész a pumpa fo szabályozó régiója. Ezen a régión keresztül befolyásolja az enzim aktivitását a Ca 2+ -kalmodulin komplex, különbözo enzimek által katalizált foszforiláció, proteolízis, illetve fehérje-fehérje kölcsönhatások. 4.4.2.1 Kalmodulin-köto szekvencia A PMCA legfontosabb aktivátora a Ca 2+ -kalmodulin komplex, amely az enzim kalmodulin-köto szekvenciájához kötodik (54). Ez a szekvencia a pumpa C-terminális régiójában található, és kb. 40 aminosav választja el az utolsó transzmembrán hélixtol 18

(40,99). Ca 2+ -kalmodulin komplex hiányában ez a fehérjeszakasz autoinhibítorként muködik. Jelölt peptidekkel végzett keresztkötési kísérletek alapján feltételezzük, hogy a kalmodulin-köto szekvencia intramolekuláris kölcsönhatásba lép a pumpa két különbözo régiójával a kis és a nagy hurkon belül (5. ábra). Ezek a régiók a PMCA homológia modell szerint a citoplazmatikus A-doménen és a nukleotid-köto N-doménen találhatóak (6. ábra). A SERCA struktúrális vizsgálatai felfedték, hogy mindkét domén jelentos mozgást végez az enzimciklus során. A-domén N-domén P-domén E2 E1Ca 2+ 6. ábra A kalmodulin-köto szekvenciával kölcsönhatásba lépo régiók mozgása az E2? E1 állapotváltozás során Az E2 illetve E1Ca 2+ konformációjú SERCA fehérje szerkezete (1IWO.pdb, 1EUL.pdb): Az A- (kék) és az N-doménban (zöld) található fekete színnel jelölt régiók megfelelnek azoknak a PMCA peptidszakaszoknak, amelyek az enzim inaktív állapotában a kalmodulin-köto szekvenciával intramolekuláris kapcsolatba lépnek. Az intramolekuláris kölcsönhatás valószínuleg akadályozza az enzimciklus során a konformációváltozásokat (E2? E1). Inaktív állapotban Ca 2+ -kalmodulin komplex hiányában azonban a C-terminális régió és a katalitikus centrum kölcsönhatása gátolja a szerkezeti változásokat, ezzel feltehetoen lassítja az enzimciklus muködését, és a pumpát inaktív állapotban tartja. 19

Amennyiben a citoszol Ca 2+ -koncentrációja megemelkedik, a Ca 2+ -kalmodulin komplex nagy affinitással kötodik a PMCA kalmodulin-köto szekvenciájához, így a pumpa felszabadul a gátlás alól. Ez a szabályozási mechanizmus nagyon hasonló más Ca 2+ - kalmodulin-függo enzim esetében is (miozin könnyulánc-kináz, Ca 2+ -kalmodulin-függo protein-kináz I). A Ca 2+ -kalmodulin-függo protein-kináz I esetében az inaktív enzim kristályszerkezete alapján igazolták, hogy a C-terminális regulátor régió, amely tartalmazza a kalmodulin-köto domént, több helyen kapcsolódik a katalitikus centrumhoz meggátolva ezzel a szubsztrát és az ATP kötodését (47). A különbözo izoformák az alternatív splicing-nak köszönhetoen C-terminális régiójukban rendkívül változatosak. Ezen a helyen mind a négy PMCA gén által kódolt pre-mrns-en bekövetkezik alternatív splicing. Bár a különbözo gének esetében különbözo számú variáns jön létre (PMCAa-f), minden esetben keletkezik a és b izoforma. A splicing hely a kalmodulin-köto szekvencia közepén, egy nagyon konzervatív szekvenciától C-terminálisan található (5. ábra) (34). Az utána következo szakasz attól függoen változik, hogy tartalmaz-e egy nagy (154-175 bp) exont ( a variáns), vagy nem ( b variáns) (60,32). Amennyiben az exon nem vágódik ki, megváltozik a kalmodulin-köto szekvencia C-terminális fele, valamint kereteltolódás miatt az egész hátralévo C-terminális régió. Az alternatív splicing hatását a PMCA4a és 4b izoformák esetében tanulmányozták a legalaposabban. A PMCA4b kalmodulin-köto szekvenciája 28 aminosavból áll. A PMCA4a esetében ez a régió hosszabb, kb. 49 aminosavból épül fel, és két, a kalmodulin kötésében szerepet játszó szakaszra oszlik, amelyeket egy rövid, nem köto szakasz kapcsol össze (100). A kalmodulin-köto szekvenciában jelenlévo eltérések okozzák, hogy a PMCA4b izoformának magasabb a kalmodulin iránti affinitása, mint a PMCA4a izoformának. A kalmodulin iránti affinitásbeli különbségek megváltoztatják az enzim Ca 2+ iránti affinitását, a pumpa egyik fontos fiziológiás paraméterét. Peptideken végzett kísérletek bizonyítják, hogy a kalmodulin-köto szekvencia N-terminális felében található konzervatív triptofán (Trp 1093 ) fontos szerepet játszik mind a kalmodulin kötésében, mind a Ca 2+ ATPáz belso gátlásának kialakításában (40). Penheiter és mtsai olyan PMCA4b mutáns kinetikai jellemzoit vizsgálták, ahol ezt a triptofánt alaninra cserélték (Trp 1093? Ala mutáns) (78). Korábbi, szintetikus peptidekkel végzett kísérleteknek megfeleloen a Trp 1093? Ala mutáns C-terminális régiója kevésbé gátolja az enzim aktivitását, mint a vad típusúé. Míg a PMCA4b alapaktivitása alacsony (kb. 10-20%-a a kalmodulin mellett mérheto maximális aktivitásnak), addig a mutánsé lényegesen magasabb (kb 50%-a a maximális 20

aktivitásnak). Feltehetoen a nyitottabb szerkezet következménye, hogy a Ca 2+ - kalmodulin komplex számára könnyebben hozzáférheto a kalmodulin-köto szekvencia, és a mutáns enzim kalmodulinnal 2-3- szor gyorsabban aktiválódik, mint a vad típusú fehérje. A legnagyobb eltérés a két fehérje között az inaktiválódás sebességében van: a vad típushoz képest a Trp 1093? Ala mutáns 350-szer gyorsabban inaktiválódik. A Trp 1093 aminosav tehát lényeges szerepet játszik az enzim-kalmodulin komplex stabilizálásában, hiszen mutációja a kalmodulin disszociációját nagy mértékben befolyásolja. A Trp 1093 mutációja kisebb mértékben növeli az enzim aktiválódásának sebességét, mivel az aktiválódás kezdeti lépéseit valószínuleg olyan szerkezeti jellemzok határozzák meg, amelyek biztosítják a Ca 2+ -kalmodulin komplex számára a megfelelo régiók felismerését, és a kalmodulin-köto szekvenciához történo hozzáférést. 4.4.2.2 Másodlagos autoinhibítor régió A PMCA4b izoforma belso gátlásáért a többi izoformától eltéroen nem csak a kalmodulin-köto szekvencia felelos (99). A fehérje rendelkezik ugyanis egy ún. másodlagos autoinhibítor régióval (Ser 1113 és Asp 1157 aminosavak közötti szakasz), mely az elsodleges autoinhibítor régiótól C-terminális irányban helyezkedik el (39). Ez a két szakasz együtt felelos kb. 3/4-1/4 arányban a kalmodulin-köto szekvencia illetve a másodlagos autoinhibítor régió a 4b formára jellemzo igen alacsony alapaktivitásért. 4.4.2.3 Foszforilációs helyek A PMCA izoformák C-terminális régiója nagyon gazdag szerinben és treoninban. Az alternatív splicing-nak köszönhetoen azonban a potenciálisan foszforilálható aminosavak eloszlása és pozíciója nagymértékben különbözik az egyes izoformák esetében. A protein-kináz C (PKC) több izoformát is képes foszforilálni. A PMCA4b variáns esetében a foszforilálható aminosav(ak) a kalmodulin-köto szekvenciától C-terminálisan található(ak) (39). Az itt bekövetkezo foszforiláció az enzim részleges aktivációját okozza azáltal, hogy gyengíti a fehérje intramolekuláris kölcsönhatásait. A PKC foszforilálja ezen kívül a 2a, a 3a és a 4a izoformákat is. A 2a és a 3a izoforma esetében a PKC foszforiláció nem változtatja meg az enzim alapaktivitását, sot, azáltal hogy gátolja a Ca 2+ -kalmodulin komplex kötodését a kalmodulin-köto szekvenciához, csökkenti a pumpa Ca 2+ -kalmodulin komplexszel történo aktiválhatóságát (33). 21

Másrészrol a már kötodött Ca 2+ -kalmodulin komplex gátolja a Ca 2+ ATPáz foszforilációját. Ez a helyzet a 4a formánál is azzal a különbséggel, hogy a PKC foszforiláció nem befolyásolja a Ca 2+ -kalmodulin kötodését (101). Ebben az esetben a foszforilálható szerin a kalmodulin-köto szekvenciának azon a részén helyezkedik el, amelyik nem játszik szerepet a kalmodulin kötésében. A camp-függo protein-kináz (PKA) valószínuleg csak néhány PMCA izoformát foszforilál. Eddig csak a PMCA1b variáns esetében bizonyították, hogy a PKA foszforilálja a pumpa C-terminális régióját (55). Ezenkívül a PMCA2b forma C- terminális régiójában találtak egy nem teljesen konszenzus PKA szubsztrát szekvenciát. In vitro a PKA foszforiláció emeli a PMCA1b aktivitását. In vivo csak szívizom sejtekben bizonyították, hogy a PKA stimuláció aktiválja a PMCA-t (30,75). A legtöbb szövetben, ahol PMCA1b expresszálódik, a PKA stimuláció nincs hatással a PMCA muködésére. Ennek oka valószínuleg az, hogy más szabályozó mechanizmusok befolyásolják a Ca 2+ ATPáz PKA enzimmel történo foszforilációját. Dean és mtsai kimutatták, hogy tirozin foszforiláció is befolyásolhatja a PMCA muködését (27). Emberi vörösvérsejtekben a pp60 src kináz foszforilálja a PMCA4b izoformát a C-terminális régióban, és ez a foszforiláció gátolja az enzim aktivitását. 4.4.2.4 Hasítási helyek A C-terminális szabályozó régió egy-egy részének eltávolítása különbözo hatással lehet a Ca 2+ ATPáz muködésére, attól függoen, hogy a proteáz mekkora és milyen funkciót ellátó szakaszt hasít le. Vörösvérsejt plazmamembrán Ca 2+ ATPáz amely nagyrészt PMCA4b és kisrészt 1b izoforma esetében bizonyították, hogy a kalpain, amely egy Ca 2+ -függo, intracelluláris proteáz, képes az enzimet aktiválni azáltal, hogy lehasítja a C-terminális szabályozó szakasz egy részét. Wang és mtsai megállapították, hogy a vörösvérsejt Ca 2+ ATPáz kalpainos fragmentációját befolyásolja a kalmodulin jelenléte (102,103). Tisztított vörösvérsejt Ca 2+ ATPáz esetében kalmodulin hiányában egy 124-125 kda molekulatömegu fragmentcsoport képzodését írták le, amelybol a 125 kda-os fragment képes volt Ca 2+ -kalmodulin komplexet kötni, míg a 124 kda-os fragment nem. Ezzel szemben kalmodulin jelenlétében egy nagyobb molekulatömegu, 127 kda-os fragment keletkezett. Ez a fragment hasonlóan a 125 kda-os fragmenthez megtartotta a Ca 2+ - kalmodulin komplex-köto képességét. 22

Ezzel szemben James és mtsai tisztított vörösvérsejt kalcium pumpán végzett kalpainos emésztési kísérleteikben csak egy, megközelítoleg 124 kda molekulatömegu fragment képzodését észlelték, függetlenül attól, hogy jelen volt-e a kalmodulin vagy nem. (56). Megállapították, hogy a kísérleti körülmények változatásával (pl. kalpain-koncentráció, homérséklet) változik a fragment Ca 2+ -kalmodulin komplex-köto képessége. Ebbol arra következtettek, hogy a kalpain a körülményektol függoen több, egymáshoz közel található helyen hasítja a pumpát, és így a 124 kda-os fragment valójában több nagyon hasonló méretu fragment összessége. A tisztított vörösvérsejt Ca 2+ ATPáz kalmodulin hiányában történo fragmentációját vizsgálva két hasítási helyet határoztak meg a pumpa kalmodulin-köto szekvenciáján belül (a szekvencia közepén illetve az N-terminális felé eso végén). Kalmodulin jelenlétében történo fragmentációt a kalmodulin-köto szekvenciát reprezentáló szintetikus peptiden vizsgálták (7. ábra). Azt tapasztalták, hogy amennyiben a kalmodulin-köto peptidhez Ca 2+ -kalmodulin komplex kapcsolódik, a domén közepén található ha sítási hely nem elérheto a proteáz számára. Ebben az esetben a kalpain egy újabb hasítási helyen a kalmodulin-köto szekvencia C-terminálisán hasít elsodlegesen. másodlagos hasítási hely elsodleges hasítási helyek kalmodulin hiányában vagy jelenlétében kalmodulin hiányában kalmodulin jelenlétében LRRGQILW FRGLNRIQTQIKVVNAFHSS 7. ábra James és mtsai által meghatározott kalpainos hasítási helyek a kalmodulin-köto szintetikus peptiden Munkacsoportunk nemrég kimutatta, hogy a PMCA4b izoforma C-terminális régióját a kaszpáz-3 cisztein proteáz is hasítja az apoptózis korai szakaszában (77). A kaszpáz-3 általában a DEXD konszenzus szekvencia után hasít. Ilyen konzenszus szekvencia található a PMCA4b pumpa kalmodulin-köto szekvenciájától N-terminálisan ( 1077 DEID 1080 ). Olyan mutánsok segítségével, amelyekben a konszenzus szekvenciát alkotó aszparaginsava(ka)t alaninra cseréltük, sikerült bizonyítani, hogy a hasítás az 1080. aszparaginsav után következik be. A PMCA4b kaszpáz-3-mal történo emésztése 23

során így egy kb. 120 kda-os fragment képzodik, amelynek hiányzik a teljes regulátor régiója, így kalmodulin hiányában is maximálisan aktív. A PMCA szerkezetének vizsgálata során gyakran használnak extracelluláris proteázokat, pl. tripszint vagy kimotripszint. A vörösvérsejt kalcium pumpa tripszines emésztése során eloször egy 90 kda molekulatömegu fragment képzodik (85,108). Ez a fragment kalmodulin-szenzitív, alacsony aktivitású enzim, ami azt mutatja, hogy a pumpa a C-terminális regulátor régióját megtartotta. Hosszabb ideig tartó emésztés hatására ugyanakkor lehasad a C-terminális regulátor régió, és egy teljesen aktív 81 kda-os fragment keletkezik. A kimotripszin aromás aminosavak mellett hasít, tehát nagyon sok potenciális hasítási hely található a pumpán belül, amelyek közül feltehetoen a fehérje szerkezeti állapota határozza meg, hogy melyik helyen következik be a hasítás. A kimotripszin a vörösvérsejt kalcium pumpa C-terminális régióját kezdi emészteni (35). Az egyik tipikus kimotripszines fragment a kalmodulinra nem érzékeny, kb. 125 kda-os fragment. A 81 kda-os tripszines hasítási termékhez hasonlóan ennek a fragmentnek is nagy a Ca 2+ iránti affinitása és a transzport aktivitása. Az emésztési kísérletek többnyire alacsony homérsékleten, magas proteáz/fehérje arány mellett, sokszor vörövérsejtbol izolált fehérjén történtek. Ezek a körülmények nem feltétlenül kedveztek a fehérje natív állapotának. 4.4.2.5 PDZ-köto szekvencia A C-terminális régióban bekövetkezo alternatív splicing hatására kialakuló két fo PMCA variáns az a és a b forma. A fehérje C-terminálisán található utolsó négy aminosav a b variánsok esetében igen konzervatív, és ezen belül a PMCA4b izoforma C-terminális szekvenciája (ETSV) megfelel a I. típusú PDZ doménhez kötodo fehérjék konszenzus szekvenciájának (E- T/S-X-V). A PMCA1b, 2b és 3b variáns is hasonló C- terminális szekvenciával rendelkezik azzal a különbséggel, hogy az utolsó aminosav ebben az esetben valin helyett leucin (ETSL). A PDZ domén több különbözo fehérjében megtalálható általános intermolekuláris kapcsolatot kialakító motívum. Fehérje-fehérje kölcsönhatások révén multiprotein komplexek létrehozásában játszanak szerepet, gyakran úgy, hogy membránfehérjéket kapcsolnak szubcelluláris struktúrákhoz, illetve a citoszkeletális hálózathoz. A PMCA4b és a 2b izoforma esetében kimutatták, hogy a PDZ-köto szekvencián keresztül a membrán-asszociált-guanilát-kináz (MAGUK) család több tagjához is 24

képesek kapcsolódni (29). A MAGUK család tagjai (SAP90, PSD93, SAP97, SAP102) sejt-sejt kapcsolatok kialakításában és fenntartásában, illetve jelátviteli folyamatokban játszanak szerepet. Míg a SAP90, a PSD93 és a SAP97 mind a PMCA2b, mind a 4b izoformához nagy affinitással kötodik, addig a SAP102 szelektíven csak a 4b variánshoz. A SAP97 és egyéb MAGUK fehérjék a kortikális aktin citoszkeletonnal kapcsolódnak. Konfokális mikroszkópos kísérletek bizonyítják, hogy kutya vese epitél sejtekben (MDCK sejtek) mind a PMCA4b, mind a SAP97 a bazolaterális membránban lokalizálódik. Vese és bél epitélsejtekben a PMCA bazolaterális elhelyezkedése a transzcelluláris vektoriális Ca 2+ transzport kialakításában játszik fontos szerepet (62). Az elso PDZ domént tartalmazó fehérje, amelyrol bizonyították, hogy a PMCA2b izoforma C-terminálisához kötodik, de a PMCA4b variánshoz nem, a Na + /H + csere regulátor faktor-2 (NHERF-2) (28). Annak ellenére, hogy MDCK sejtben mind a PMCA2b, mind a NHERF-2 az apikális membránban található és a NHERF-2 számos fehérje pl. CFTR megfelelo sejtkompartmentbe történo irányításában részt vesz, a kísérletek azt bizonyítják, hogy a PMCA2b esetében az NHERF-2 nem szükséges az apikális lokalizációhoz. Így azt a feltételezést, hogy a C-terminális PDZ-köto szekvencia segítségével jut el a Ca 2+ pumpa egy polarizált sejt megfelelo kompartmentjébe, eddig még nem sikerült alátámasztani. Amennyiben a PMCA olyan enzimmel lokalizálódik egy helyen, amely muködése függ a Ca 2+ -koncentrációtól, akkor a Ca 2+ pumpa a lokális Ca 2+ szint szabályozásával olyan mikrokörnyezetet teremthet a partner fehérje számára, amellyel befolyásolja az aktivitását. Eddig két olyan Ca 2+ -kalmodulin komplex által regulált enzimet azonosítottak a nitrogén-oxid szintetáz-i-t (NOS-I) (88) és a Ca 2+ -kalmodulin-függo szerin protein-kinázt (CASK) (87), amelyek a PDZ doménjükön keresztül a PMCA4b izoforma C-terminális PDZ-köto szekvenciájához kötodnek. Ha a NOS-I fehérjéhez fizikailag közel helyezkedik el a PMCA4b enzim, akkor az általa fenntartott lokálisan alacsony Ca 2+ -koncentráció csökkenti a NOS-I aktivitását. A CASK neuronális szinapszisokban található, és számos fehérjével képes kölcsönhatásba lépni. Muködése még nem teljesen tisztázott, de valószínu, hogy a Ca 2+ -kalmodulin komplex kötodése olyan konformációs változásokat eredményez a fehérje szerkezetében, amelynek hatására képes lesz a Tbr-1 transzkipciós faktor megkötésére. A kialakult CASK-Tbr-1 komplex a magba transzlokálódik, és a transzkripció szabályozásában vesz részt. A PMCA4b által fenntartott lokálisan alacsony Ca 2+ szint hasonlóan a NOS-I szabályozásához gátolja a CASK muködését, mivel lokálisan csökkenti a Ca 2+ - kalmodulin komplex koncentrációját. Ily módon, a CASK enzim mikrokörnyezetének 25

befolyásolásán keresztül a plazmamembrán Ca 2+ ATPáz a sejt transzkripciós aktivitását képes befolyásolni. Valószínu, hogy a fehérje-fehérje kölcsönhatások dinamikusan változnak a sejtmuködés során. Míg a trombinnal aktivált vérlemezkékben a Ca 2+ ATPáz (PMCA1b és 4b) a PDZköto szekvencián keresztül a citoszkeletális hálózathoz kapcsolódik, addig a nem aktivált trombocitákban a citoszkeletonhoz kötodött Ca 2+ pumpa aránya nem jelentos (107). Feltételezhetoen a PDZ kölcsönhatás rövid távú szabályozásában a foszforilációnak van szerepe, mivel foszforilálható aminosavak minden izoforma PDZköto szekvenciájában megtalálhatóak. Ugyanakkor a kölcsönhatás hosszú távú szabályozását a megfelelo C-terminális szekvenciával rendelkezo variáns expressziója teszi lehetové. 4.4.3 A különbözo izoformák aktivitásának kinetikai jellemzoi Scharff és mtsai mutatták ki eloször, hogy a vörösvérsejt Ca 2+ ATPáz kalmodulinnal történo aktiválódása lassú, és az aktiválódás sebessége függ a Ca 2+ - koncentrációtól (86). A plazmamembrán Ca 2+ ATPáznak az a tulajdonsága, hogy a Ca 2+ tüske kialakulására képes idoben késve reagálni, egyedülálló a Ca 2+ -ot eltávolító mechanizmusok között. A SERCA és Na + /Ca 2+ cseretranszporter esetében a Ca 2+ ionok kötodése közvetlenül aktiválja a fehérjét. A PMCA aktiválódásához azonban szükség van arra, hogy eloször egy másik Ca 2+ -köto fehérje, a kalmodulin kötodjön a pumpa C- terminális szabályozó régiójához. A PMCA pumpa Ca 2+ -mal és kalmodulinnal történo aktiválódása így legalább négy lépésbol áll: 1., a kalmodulin megköti a Ca 2+ ionokat, 2., a kialakult Ca 2+ -kalmodulin komplex kötodik a PMCA-hoz, 3., a Ca 2+ -kalmodulin komplex kötodése gyengíti a kölcsönhatást az enzim katalitikus centruma és a kalmodulin-köto szekvenciát is magába foglaló C-terminális régió között, 4., Ca 2+ ion kötodik a PMCA transzmembrán régiójában található transzport Ca 2+ -köto helyhez. Mivel sejten belül a citoplazma kalmodulin koncentrációja megközelítoleg állandó, a Ca 2+ szint változása határozza meg a Ca 2+ -kalmodulin komplex kötodését illetve disszociációját, és ezáltal a Ca 2+ ATPáz aktivitását. A Ca 2+ -koncentráció hirtelen megemelkedését követoen az egyes izoformák eltéro sebességgel aktiválódnak, és ez alapján három csoportba sorolhatjuk oket (21). Az izoformák közül leglassabban a PMCA4b izoforma aktiválódik. Gyorsan eléri a maximális aktivitását a 3f és a 2a izoforma, illetve közepes sebességel aktiválódik a 2b és a 4a forma. Az aktiválódás sebességére nem lehet egyszeruen az egyensúlyi affinitás mérésekbol következtetni. A 26

4a izoforma Ca 2+ -kalmodulin komplex iránti affinitása például kisebb mint a 4b izoformáé, mégis gyorsabban aktiválódik. Ebben az esetben azonban a gyors aktiválódást gyors inaktiválódás is követi szemben a PMCA4b lassú inaktiválódási sebességével. Amennyiben eltávolítjuk a PMCA4b izoforma kalmodulin-köto szekvenciáját is magába foglaló C-terminális régióját, a pumpa aktivitását csak a Ca 2+ koncentrációja befolyásolja, annak növekedésével gyorsan aktiválódik. Ez azt bizonyítja, hogy a Ca 2+ - kalmodulin komplexszel történo lassú allosztérikus aktiválódás felelos a PMCA4b izoforma lassú aktiválódásáért. Olyan deléciós mutáns segítségével, amely a kalmodulin-köto szekvenciát még tartalmazza, de az attól C-terminálisan elhelyezkedo másodlagos autoinhibítor régiót már nem, megállapították, hogy a másodlagos autoinhibítor régió is lényeges szerepet játszik a lassú aktiválódásban (20). A lassú aktiválódásnak tehát szerkezeti okai lehetnek. Valószínu, hogy a PMCA4b izoforma esetében a C-terminális régió és a katalitikus centrum kölcsönhatása erosebb mint a többi izoforma esetében, és a Ca 2+ -kalmodulin komplex nehezen fér hozzá a kalmodulin-köto szekvenciához. Ez magyarázza a 4b izoformára jellemzo igen alacsony alapaktivitást és a pumpa lassú aktiválódását. A másodlagos autoinhibítor régiót nem tartalmazó deléciós mutáns aktivitása, kinetikai jellemzoi pedig azt támasztják alá, hogy az intramolekuláris kölcsönhatásban a C-terminális régió kalmodulin-köto szekvenciáján kívül lényeges szerepet játszik az attól C-terminálisan elhelyezkedo másodlagos autoinhibítor régió is. A funkcionálisan eltéro izoformák szöveti eloszlása különbözo, és szoros korrelációt lehet felfedezni az adott sejttípusban jelenlévo PMCA izoforma aktiválódásának sebessége és az adott sejttípus Ca 2+ jelátvitelének sebessége között. Szív és harántcsíkolt izom Ca 2+ jelei nagyon gyorsan lecsengenek (10-100 ms). Ezek a szövetek expresszálják a gyors izoformákat. A harántcsíkolt izomban foleg a 3f izoforma található (45), a szívizomban (patkány) a 2a izoforma domináns. A belso fül szorsejtjeiben, ahol ugyancsak a 2a forma expresszálódik, szintén gyorsan cseng le a Ca 2+ jel. Másrészt vörösvérsejtben és Jurkat sejtben, ahol nagyságrendekkel lassabban csökken a Ca 2+ -koncentráció, szinte kizárólag 4b izoforma expresszálódik. Caride és mtsai vizsgálták a különbözo izoformák inaktiválódását azt követoen, hogy a kalmodulint a miozin könnyulánc-kináz kalmodulin-köto szekvenciáját reprezentáló peptid segítségével eltávolították a reakcióelegybol (22). A miozin könnyulánc-kináz kalmodulin-köto peptidjének igen nagy a kalmodulin iránti affinitása, de nem kötodik a PMCA katalitikus centrumához (36). Az inaktiválódás tekintetében az aktiválódás 27

vizsgálatakor nyert adatokhoz hasonlóan szintén nagy különbségek vannak az egyes izoformák között. A PMCA4b inaktiválódása lassú, lényegesen lassabb, mint például a 4a izoformáé. A PMCA2b izoforma azonban még ennél is lassabban inaktiválódik. A lassú inaktiválódás oka, hogy a kalmodulin hosszú ideig kötve marad a pumpa C- terminális régiójához, így feltehetoen a Ca 2+ szignált követoen sokáig aktív marad. A lassú aktiválódás és a lassú inaktiválódás hatására az enzim késve válaszol a Ca 2+ - koncentráció változásaira. Az elobbi kinetikai jellemzo képessé teszi a PMCA izoformákat, hogy befolyásolják a Ca 2+ jel amplitúdóját, alakját és idotartamát. A lassú inaktiválódás akkor jut lényeges szerephez, amikor nem egy Ca 2+ jel éri a sejtet, hanem legalább két Ca 2+ tüske, amelyeket néhány másodpercnyi alacsony Ca 2+ -koncentráció választ el. Ez történik a Ca 2+ oszcilláció esetében is. Ha megfeleloen lassan inaktiválódik az enzim, akkor a második Ca 2+ tüske kialakulásakor még a kalmodulin kötve lehet a pumpák egy részéhez, és így az enzim sokkal gyorsabban képes aktiválódni az újra megemelkedo Ca 2+ -koncentráció hatására, mintha már a teljesen gátolt állapot kialakult volna ( memória effektus ). Az izoformák lokalizációja és az inaktiválódásuk sebessége között szintén lehet összefüggést találni. A PMCA4b bár ubikviter forma elsosorban a hematopoietikus ossejtbol származó sejtekben, vörösvérsejtekben és egyéb vérsejtekben található nagyobb mennyiségben. A 2b variáns viszont kizárólag a gyorsabban reagáló sejtekben, pl. különbözo idegsejtekben expresszálódik. Az utóbbi esetben a sejtek muködése során fontos szabályozó tényezo az ún. long-term potentation és inhibition, amelyek kialakulására hatással lehet egy hosszabb memóriával rendelkezo Ca 2+ ATPáz izoforma. A memória effektus valószínuleg kevésbé jelentos azokban a sejtekben, ahol a 4b forma expresszálódik, mivel ezeknek a sejteknek a muködése kevésbé függ Ca 2+ tüskék sorozatától. A PMCA izoformák más-más kinetikai jellemzokkel rendelkezo Ca 2+ ATPázok, amelyek sejt- és szövetspecifikusan expresszálódnak, és a fehérje-fehérje valamint a lipidkölcsönhatásban szerepet játszó régiók (PDZ-köto szekvencia, kis hurok) segítségével a megfelelo szubcelluláris kompartmentekbe irányíthatóak. Egy adott helyen funkcionáló izoforma pedig rendkívül sokoldalúan szabályozható. A PMCA tehát egy olyan citoszolikus Ca 2+ szintet csökkento plazmamembrán fehérje, amely segítségével a Ca 2+ jelnek mind az idobeli lefolyása, mind térbeli mintázata igen finoman szabályozható. 28

5 Célkituzések A PMCA sokrétu szabályozhatóságának szerkezeti alapját a katalitikus centrum és a C-terminális régió intramolekuláris kölcsönhatása képezi. Az intramolekuláris kapcsolat konformációja valószínuleg dinamikusan változik az enzim muködése során. Kísérleteink célja a humán PMCA4b izoforma (hpmca4b) intramolekuláris kölcsönhatásainak, illetve a konformációváltozások során ebben a régióban bekövetkezo szerkezeti változásoknak a vizsgálata volt. A hpmca4b DNS-ével transzfektált COS-7 majom vese sejtekbol preparált mikroszómális membrán segítségével a Ca 2+ pumpát in situ a membránban vizsgáltuk. 1. A C-terminális autoinhibítor régióban hasító proteázok (kaszpáz-3, kalpain, kimotripszin) segítségével tanulmányozni kívántuk a C-terminális régió szerkezeti jellegzetességeit. Ennek során a következo célok, illetve kérdések merültek fel:? A kalpainos hasítási helyek meghatározása in situ a membránban, csonkolt mutánsok segítségével.? Kimotripszin esetében olyan kísérleti körülmények beállítása, amelyek mellett az általunk vizsgált autoinhibítor régióban tanulmányozható a fragmentáció.? A PMCA muködése során a fehérje szerkezete folyamatosan változik. Ezért vizsgálni kívántuk a kalcium pumpa fragmentációját különbözo konformációs állapotokban. 2. A PMCA4b izoforma kalmodulin-köto szekvenciájában található triptofánról (Trp 1093 ) kimutatták, hogy fontos szerepet játszik az enzim belso gátlásában. A C- terminális régióban hasító proteázok segítségével vizsgálni kívántuk, hogy a Trp 1093 mutációjának milyen hatása van a PMCA4b intramolekuláris kölcsönhatásaira. 3. Vizsgálni kívántuk, hogy a kalmodulin-köto szekvenciától N-terminálisan elhelyezkedo, ún. csukló régióban található aszparginsav (Asp 1080 ) mutációja milyen hatással van az enzim aktivitására. 29

6 Metodikák 6.1 A kísérletekben felhasznált DNS konstrukciók A humán PMCA4b és a Trp 1093? Ala mutáns John T. Penniston professzor (Mayo Clinic, Rochester, MN, USA) ajándéka volt (78). A humán PMCA4b Asp 1080 és Asp 1077 mutánsainak létrehozása: A mutáns fehérjék DNS-ét kettos PCR technikával állítottuk elo. Az elso PCR termék: egy PMCA4b szekvenciát amplifikáltunk olyan primereket használva, amelyek tartalmazzák a kívánt mutációt és egy olyan restrikciós hasítási helyet (BamHI), amely a szekvenciában is jelen van. Ezekután ezt a PCR terméket használtuk fel primerként a második PCR-ban egy olyan primerrel, amely egy másik páratlan restrikciós hasítási helyet (NsiI) tartalmazott. A PCR termékeket Blunt PCR cloning kit segítségével klónoztuk. A NsiI- BamHI darabot kivágtuk, majd a vad típusú hpmca4b DNS-t tartalmazó psp72 vektorba helyeztük. Végül a teljes hosszúságú mutáns PMCA4b-t tartalmazó SalI-KpnI darabot kivágtuk a psp72 vektorból, és a pmm2 expressziós vektorba helyeztük (1). 6.2 Sejtkultúra és transzfekció A COS-7 sejteket 10% fetális szarvasmarha szérummal, 100 U/ml penicillinnel, 0,1 mg/ml streptomicinnel és 2 mm L-glutaminnal kiegészített DMEM médiumban tenyésztettük. A sejteket 37 o C-on CO 2 termosztában (5% CO 2 ) inkubáltuk. A transzfekciót Lipofectamine (Gibco-BRL) segítségével, a gyártó utasításainak megfeleloen végeztük. A 70-80%-ban konfluens sejteket a DNS-lipofectamine komplex-szel OPTI-MEM szérum-mentes médiumban 5 órán keresztül 37 o C-on inkubáltuk CO 2 termosztátban, majd kiegészítettük 20% FBS-t tartalmazó médiummal. A transzfekciót követo 24. órában a sejtek friss DMEM médiumot kaptak, majd újabb 24 óra elteltével a sejtekbol membránpreparátumot készítettünk. 6.3 Membránpreparálás COS-7 sejtekbol COS 7 sejtekbol Enyedi és mtsai szerint (38) készítettünk membránpreparátumot a következo módosításokkal: A sejteket jéghideg foszfát-puffer tartalmú sóoldattal mostuk, majd ebbe a médiumba (kiegészítve: 0,1 mm fenilmetilszulfonil fluoriddal, 6? g/ml aprotininnel, 2,2? g/ml leupeptinnel és 1 mm EGTA-val (ph7,4)) gyujtöttük össze. Centrifugálás (2000g, 10 perc) után a sejteket jéghideg hipotóniás oldatban (10 mm Tris-HCl (ph 7,4), 1 mm MgCl 2, 0,5 mm EGTA, 30

4?g/ml aprotinin, 2? g/ml leupeptin, 4 mm dithiotreitol) szuszpendáltuk. A lizálás, a homogenizálás (homogenizáló oldat: 0,5 M szukróz, 0,3 M KCl, 10 mm Tris-HCl (ph 7,4), 4 mm dithiotreitol, 4? g/ml aprotinin, 2? g/ml leupeptin) és a centrifugálás (100000g, 40 perc) után a membránt 0,25 M szukróz, 0,15 M KCl, 10 mm Tris-HCl (ph 7,4), 2 mm dithiotreitol, 20?M CaCl 2 összetételu oldatban szuszpendáltuk, majd folyékony nitrogénben tároltuk. 6.4 Kalpainos és kimotripszines emésztés A reakcióközeg tartalmazott 50?g/ml membránfehérjét, 100 mm KCl-t, 25 mm TES-trietanolamint (ph 7,2), szükség szerint 0,2 mm CaCl 2 -t (100?M szabad Ca 2+ ), 0,1 mm EGTA-t, 5 mm dithiothreitolt, 1 mm MgCl 2 -t, 0,05% Tritont, és szükség szerint 485 nm kalmodulint. A membránt a reakcióközegben 37 o C-on 3 percig inkubáltuk, majd az emésztést 5? g/ml?-kalpain (Calbiochem) vagy 0,05? g/ml? - kimotripszin (Sigma Chemical Co.) hozzáadásával kezdtük. A proteolízist 0 o C-os triklórecetsav (TCA) hozzáadásával állítottuk le (végso koncentráció: 6%), majd 100? g szarvasmarha szérum albuminnal (BSA) kiegészítettük, és a membránt 20 percre jégre helyeztük. A kicsapódott fehérjét 15 percig 3000 rpm fordulatszámon ülepítettük, a felülúszó eltávolítása után egyszer mostuk desztillált vízzel, majd a fehérjét mintafelvevo pufferben -70 o C-on tároltuk. A mintafelvevo puffer tartalmazott 62,5 mm Tris-HCl-t (ph 6,8), 2% SDS-t, 10% glicerolt, 5 mm EDTA-t, 125 mg/ml ureát és frissen hozzáadott 100 mm dithiotreitolt. 6.5 Emésztés kaszpáz-3-mal A reakcióközeg tartalmazott 50?g/ml membránfehérjét, 100 mm KCl-t, 25 mm TES-trietanolamint (ph 7,2), 8,5% szukrózt, 0,09 mm EGTA-t, 5 mm dithiothreitolt, 20?g/ml aprotinint, 20? g/ml leupeptint, 0,1% CHAPS-t, szükség szerint 0,1 mm CaCl 2 -t (10?M szabad Ca 2+ ), illetve szükség szerint 485 nm kalmodulint. A membránt a reakcióközegben 37 o C-on 3 percig inkubáltuk, majd az emésztést 0,25? g rekombináns kaszpáz-3 (Upstate Biotechnology Inc.) hozzáadásával kezdtük. A proteolízist 0 o C-os triklórecetsav (TCA) hozzáadásával állítottuk le (végso koncentráció: 6%), majd 100? g BSA-val kiegészítettük, és a membránt 20 percre jégre helyeztük. A kicsapódott fehérjét 15 percig 3000 rpm sebességgel ülepítettük, a felülúszó eltávolítása után egyszer mostuk desztillált vízzel, majd a fehérjét mintafelvevo pufferben -70 o C-on tároltuk. A mintafelvevo puffer tartalmazott 62,5 mm 31

Tris-HCl-t (ph 6,8), 2% SDS-t, 10% glicerolt, 5 mm EDTA-t, 125 mg/ml ureát és frissen hozzáadott 100 mm dithiotreitolt. 6.6 Gélelektroforézis és elektrotranszfer A mintákat 7,5%-os SDS-poliakrilamid gélen futtattuk Laemmli módszere szerint, majd PVDF membránra blottoltuk 25 mm Tris, 0,7 M glicint tartalmazó blot pufferben 250 ma áramerosség mellett 2 óra alatt BioRad miniblot készüléken. A mintákat tartalmazó membránt immunfestéssel és ECL (Enhanced Chemiluminescence) technika segítségével tettük láthatóvá. Felhasznált elsodleges ellenanyagok (ea): 5F10 monoklonális ea pan-anti-pmca, epitóp a 719-738 aminosavak között JA9 monoklonális ea anti-pmca4, epitóp az 51-75 aminosavak között JA3 monoklonális ea anti-pmca4b, epitóp az 1156-1180 aminosavak között A fehérjék mennyiségi megoszlását a BioRad Chemiluminescence Imaging System segítségével határoztuk meg. Eredményeinket a Molecular Analyst és a GraphPad Prism programokkal értékeltük ki. 6.7 Ca 2+ transzport mérés Ca 2+ transzport mérés során a membránvezikulák 45 Ca 2+ izotóppal jelzett Ca 2+ - felvételét mértük (39). A reakcióközeg tartalmazott 100 mm KCl-t, 25 mm TEStrietanolamint (ph 7,2), 7 mm MgCl 2 -t, 0,1 mm CaCl 2 -t ( 45 Ca 2+ izotóppal jelzett), 40 mm KH 2 PO 4 /K 2 HPO 4 -t (ph7,2), 200 nm thapsigargint, 4? g/ml oligomicint, és a kívánt szabad Ca 2+ -koncentrációhoz szükséges EGTA-t. Szükség esetén kalmodulint is tettünk a közegbe az ábrákon feltüntetett mennyiségben. A reakcióközeghez 20? g/ml membránfehérjét adtunk, 37 o C-on 3 percig inkubáltuk, majd a reakciót 5 mm ATP hozzáadásával indítottuk. A reakció végét Millipore membránfilteren (pórusméret: 0,45? m) történo gyors szurés jelentette. A vezikulák 45 Ca 2+ -tartalmát folyadékszcintillációs számlálóban (Beckman LS 6000) mértük meg. 6.8 Az ATPáz aktivitás méréséhez szükséges tisztított PMCA eloállítása 100-200?g fehérjét tartalmazó COS-7 sejt membránt 80? l 4 o C-os szolubilizáló pufferben szuszpendáltuk (20). A puffer tartalmazott 240 mm KCl-t, 60 mm TEStrietanolamint (ph 7,2), 10 mm MgCl 2 -t, 10 mm NaN 3 -t, 2 mm dithiothreitolt, 1 mm ouabaint, 400 nm thapsigargint, 8? g/ml oligomicint, 4? g/ml aprotinint, 1? g/ml 32

leupeptint, 400? M EGTA-t és 0,5% Triton X-100-t. A szuszpenziót 4 o C-on 4 percig állni hagytuk, majd 320? l higító puffert adtunk hozzá (összetétele megegyezett a szolubilizáló pufferével, kivéve, hogy a Triton X-100 helyett 0,5 mg/ml foszfatidilkolint tartalmazott). Rögtön ezután 200 mg Bio-Beads SM-2 gyöngyöt adunk hozzá, amely megköti a Triton X-100-t. A mintákat 1 órán keresztül 4 o C-on ráztuk, majd a Bio-Beads gyöngyöket centrifugálással eltávolítottuk. 6.9 A PMCA aktiválódásának kinetikai analízise A tisztított PMCA fehérje aktiválódásának sebességét 37 o C-on kapcsolt enzimreakción keresztül Beckman DU70 spektrofotométer segítségével határoztuk meg (20). A reakcióközeg 120 mm KCl-t, 30 mm TES-trietanolamint (ph 7,2), 5 mm MgCl 2 -t, 2,5 mm ATP-t, 5 mm NaN 3 -t, 1 mm dithiothreitolt, 0,5 mm ouabaint, 200 nm thapsigargint, 4? g/ml oligomicint, 2?g/ml aprotinint, 0,5?g/ml leupeptint, 200?M EGTA-t, annyi CaCl 2 -t, amennyi a 0,5?M szabad Ca 2+ -koncentrációhoz szükséges, szükség szerint 235 nm kalmodulint, 0,2 mm 2-amino-6-merkapto-7-metil-purin ribonukleozidot (MESG) és 1 U/ml purin-nukleozid-foszforilázt tartalmazott. Spektrofotométerrel a MESG foszforolízisének hatására 360 nm-en bekövetkezo abszorpció változást detektáltuk. Az adatokra a GraphPad Prism program segítségével a következo egyenest illesztettük: Y(t)=Y 0 -v c /k+(v 0 +v c )t+(v c /k)exp(-kt), ahol Y 0 a nulla idopontban mért optikai denzitás, v 0 az optikai denzitás növekedésének sebessége egyensúlyi állapotban, amennyiben nincs kalmodulin a közegben, és v 0 +v c az optikai denzitás növekedésének sebessége egyensúlyi állapotban 235 nm kalmodulin jelenlétében. 6.10 A PMCA inaktiválódásának kinetikai analízise A kalmodulin disszociációját követo inaktiválódás kinetikai analízise során ugyanolyan összetételu reakcióközeget használtunk, mint a kalmodulinnal történo aktiválódás vizsgálata során. Eloször megvártuk, hogy az enzim aktivitása 0,5?M szabad Ca 2+ és 235 nm kalmodulin mellett stacionárius állapotot érjen el, majd 10?M kalmodulin-köto peptidet (RRKWQKTGHAVRAIGRLSS) adtunk hozzá. Ez a kalmodulin-köto peptid a csirke simaizom miozin könnyulánc-kináz kalmodulin-köto szekvenciájának felel meg, mely nagy affinitással köti a kalmodulint, de nincs hatással a PMCA4b kalmodulin nélküli aktivitására. Az adatokra a GraphPad Prism program segítségével a következo egyenest illesztettük: Y(t)=Y 0 -v 0 t+(v c /k -1 )(1-exp(-k -1 t)). 33

6.11 PMCA4b szerkezeti modellje A PMCA4b szekvenciáját a SERCA1a fehérje szekvenciájával hasonlítottuk össze számítógépes analízissel. Felhasználtuk azokat az ismereteket, amelyek a polipeptidlánc különbözo részéirol rendelkezésünkre állnak. Ezután a MODELLER 6v2 programmal a SERCA1a szerkezeti adatait (Protein Data Bank: 1EUL.pdb SERCA E1, 1IWO.pdb SERCA E2) felhasználva elkészítettük a PMCA4b fehérje E1 és E2 konformációjú homológia modelljét. 34

7 Eredmények 7.1 A hpmca4b izoforma intramolekuláris kölcsönhatásainak vizsgálata limitált proteolízissel A plazmamembrán Ca 2+ ATPáz jellegzetessége, hogy nyugvó sejtben a C- terminális szabályozó régiója gátolja az enzim aktivitását azáltal, hogy kölcsönhatásba lép az enzim katalitikus centrumával. Megemelkedett Ca 2+ -koncentráció mellett, a képzodo Ca 2+ -kalmodulin komplex kötodik a fehérjéhez, az intramolekuláris kölcsönhatás gyengül, és az enzim feltehetoen nyitottabb szerkezetet vesz fel. Ennek hatására a pumpa aktivitása és Ca 2+ iránti affinitása megno. A reakcióciklus során a pumpa folyamatos konformációváltozáson megy át, a katalitikus centrumot is magába foglaló citoplazmatikus domének jelentos mozgásokat végeznek. Aktív és inaktív állapotban azonban nagy különbségek lehetnek az enzimciklus sebességében, mivel inaktív állapotban a C-terminális régió és a katalitikus centrum kölcsönhatása lassítja a konformációváltozásokat. In vitro körülmények között, ATP hiányában az enzimciklus áll, az E2 és E1 konformációjú fehérje között egyensúly alakul ki. Ca 2+ kötodése a fehérjéhez az egyensúlyt az E1 állapot felé tolja, míg a Ca 2+ hiánya az E2 konformációs állapotnak kedvez. A C-terminális régió fragmentációjának vizsgálata során az alapján, hogy egy proteáz számára mennyire hozzáférheto egy adott hasítási hely az enzim intramolekuláris kölcsönhatásairól illetve annak erosségérol kaphatunk információt. Az, hogy bizonyos a proteáz aktivitását nem befolyásoló körülmények megváltoztatásával egy proteáz kevésbé képes hasítani egy adott helyen, arra utal, hogy a hasítási hely környezete szorosabb kölcsönhatásba került a fehérje más részével, és emiatt nem elérheto az enzim számára. Míg a Ca 2+ ATPáz aktivitásának vizsgálatából átfogó képet kaphatunk a C-terminális régió és a katalitikus centrum kölcsönhatásáról, addig különbözo hasítási helyeken ható proteázok felhasználásával lokálisan (az adott hasítási hely környezetében) vizsgálhatjuk a C-terminális régió szerkezetét. 7.1.1 Hasítási helyek a hpmca4b C-terminális régiójában Vizsgálatainkhoz három olyan eltéro szubsztrátspecificitású proteázt választottunk, amelyek a PMCA4b izoforma C-terminális régiójában hasítanak elsodlegesen. Régóta ismert, hogy a kalpain, amely egy Ca 2+ -függo intracelluláris 35

proteáz, hasítja a plazmamembrán Ca 2+ ATPázt (102,103,56). Bár bizonyított, hogy a C- terminális régióban hasít, a hasítási helyek pontosabb behatárolása során eddig egymásnak ellentmondó eredmények születtek. Pontosan ismerjük viszont egy apoptotikus proteáz, a kaszpáz-3 hasítási helyét a PMCA4b kalmodulin-köto szekvenciájától N-terminálisan (77). A két intracelluláris proteáz mellett harmadikként a kimotripszint használtuk a PMCA4b C-terminális régiójának vizsgálatára. 7.1.1.1 A PMCA4b fragmentációja kalpainnal A molekuláris biológiai és a biokémiai módszerek fejlodése lehetové tette, hogy az egyes PMCA izoformák kalpainos fragmentációját in situ a membránban az enzim természetes állapotához közel álló rendszerben tanulmányozzuk. A hpmca4b izoforma kalpainos hasítását 37 o C-on, a fehérje cdns-ével transzfektált COS-7 sejtekbol preparált membránokon végeztük a fehérje inaktív (kalmodulin nélkül) és aktív (kalmodulin mellett) állapotában. Az emésztést követoen a fehérjéket SDSgélelektroforézis segítségével választottuk szét, majd 5F10 ellenanyaggal festettük meg. Az 5F10 egy olyan lineáris epitópot ismer fel a 719-738 aminosavak között, amely minden PMCA izoformában közös. A pumpa inaktív állapotában, amikor nem tettünk kalmodulint a közegbe, két fragment képzodését figyeltük meg (8. ábra). ct92 PMCA4b +kalpain PMCA4b +kimotripszin ct71 ct120 PMCA4b +kaszpáz-3 hpmca4b 8. ábra A hpmca4b izoforma emésztése kalpainnal, kimotripszinnel és kaszpáz-3-mal PMCA4b-vel transzfektált COS-7 sejtekbol izolált mikroszómális membránt emésztettünk Ca 2+ jelenlétében kalpainnal, kimotripszinnel és kaszpáz-3- mal a Metodikák fejezetben leírtak szerint. A mintákat és a C-terminálisan csonkolt mutánsokat 5F10 ellenanyaggal festettük meg. A Western blot analízist végrehajtottuk a PMCA4 specifikus JA9, illetve a PMCA4b specifikus JA3 monoklonális ellenanyagokkal is. A JA9 ellenanyag az enzim N- terminális végén az 51-75 aminosavak között ismeri fel a fehérjét, míg a JA3 ellenanyag 36

a C-terminális régióhoz kötodik az 1156-1180 aminosavak között. Az emésztés során keletkezo fragmenteket mind az 5F10, mind a JA9 ellenanyag felismerte, a JA3 ellenanyaggal viszont nem lehetett a fragmenteket detektálni. Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy a kalpain a PMCA4b izoforma C-terminális régióját hasítja a JA3 epitóptól N-terminálisan. A hasítás helyeit C-terminálisan csonkolt mutánsok segítségével határoltuk be. A ct71, ct92 és ct120 mutánsok esetében 71, 92 illetve 120 aminosav hiányzik a hpmca4b izoforma C-terminálisáról. A 126 kda molekulatömegu ct71 tartalmazza a kalmodulinköto szekvenciát és a másodlagos autoinhibítor régió egy részét is. A ct92 mutáns C- terminálisa a kalmodulin-köto szekvencia C-terminálisával egyezik meg, molekulatömege 124 kda. A 120 kda molekulatömegu ct120 mutáns esetében pedig a teljes kalmodulin-köto szekvencia, illetve az attól C-terminális irányba eso régió hiányzik. Úgy találtuk, hogy a kalpain hatására képzodött két fragment hasonló távolságra vándorolt, mint a ct71 és ct92 mutánsok (9. ábra). Az ép PMCA4b fehérje (134 kda) és a csonkolt mutánsok molekulatömegének ismeretében az elektroforetikus mobilitás alapján a fragmentek molekulatömege 125 illetve 124 kda. 0,8 0,7 0,6 0,5 hpmca4b hpmca4b kalpainos fragmentjei 0,4 0,3 0,2 0,1 0 2 2,4 2,8 3,2 3,6 4 4,4 4,8 5,2 5,6 6 6,4 6,8 7,2 7,6 8 8,4 8,8 9,2 ct71 9,6 10 10,4 10,8 11,2 ct92 ct120 11,6 12 12,4 12,8 13,2 13,6 14 14,4 14,8 15,2 15,6 16 9. ábra A kalpainos fragmentek és a C-terminálisan csonkolt mutánsok elektroforetikus vándorlásának összehasonlítása A PMCA4b és a kalpainos fragmentek ugyanabban a gélben történo migrációját a Bio-Rad Molecular Imager System segítségével analizáltuk. A kemilumineszcencia intenzitását ábrázoltuk a megtett távolság függvényében. A folytonos vonal az ép PMCA4b és a fragmentek migrációját, a szaggatott vonalak a csonkolt mutánsok migrációját jelölik. A fenti eredmények alapján az egyik kalpainos hasítási hely a kalmodulin-köto szekvencia C-terminálisának közelében található, míg a másik hasítási hely ettol C- terminálisan kb. 20 aminosav távolságra van (10. ábra). 37

ct120 kalmodulin-köto szekvencia ct92 ct71 M10-..LDEIDHAEME LRRGQ I LWFRGLNRIQTQIKVVKAFHSS LHESIQKPYNQKSIHSFMTHPEFAIEE..-COOH Kaszpáz-3 (120 kda) 2. 1. 3. Trp 1093 Kalpain (124 kda) Kimotripszin Kalpain (124,5 kda) (125 kda) 10. ábra A hpmca4b izoforma C-terminális régiójának elsodleges szerkezete Az általunk meghatározott kalpain, kaszpáz-3, illetve kimotripszin hasítási helyeket fekete nyilak jelzik. A szürke nyilak James és mtsai által meghatározott kalpainos hasítási helyeket jelzik (1. nyíl: kalmodulin hiányában, 2. nyíl: kalmodulin hiányában és jelenlétében, 3. nyíl: kalmodulin jelenlétében észlelt hasítási hely). A ct120, ct92 és ct71 mutánsok C-terminálisát szintén nyilak jelzik. Amennyiben az emésztést aktív állapotú enzimen kalmodulin jelenlétében végeztük, csak a 125 kda-os fragment képzodését figyeltük meg. A 124 kda-os fragment hiányát nagy valószínuséggel a Ca 2+ -kalmodulin komplex kötodése okozza, mivel ilyenkor a kalmodulin-köto régióban a hasítási hely(ek) nem elérheto(ek) a proteáz számára. A bevezetoben ismertettük, hogy James és mtsai az izolált vörösvérsejt Ca 2+ ATPáz (foleg PMCA4b) kalmodulin hiányában történo kalpainos emésztése során képzodött fragmentek C-terminális szekvenálása alapján két hasítási helyet határoztak meg a kalmodulin-köto szekvencián belül (7. ábra, 10. ábra) (56). Ezekben a kísérletekben a kalpainos kezelést jégen, a mi vizsgálatainknál jóval hosszabb ideig végezték. Amennyiben membránhoz kötött vörösvérsejt Ca 2+ ATPázt emésztettünk a mi kísérleteinknek megfelelo körülmények mellett, a COS-7 sejtekben expresszált PMCA4b kalpainos fragmentációjának megfelelo mintázatot kaptunk. Tovább vizsgáltuk annak okát, miért nem látjuk a James és mtsai által leírt fragmenteket. Mi is tanulmányoztuk a kalcium pumpa fragmentációját jégen, 30 percig tartó kalpainos kezelést követoen. Ilyen körülmények mellett több ct90-nél kisebb, de ct120-nál nagyobb fragmentet detektáltunk. Úgy tunik tehát, hogy a kalmodulin-köto szekvencián belül található hasítási helyek alacsonyabb homérsékleten jobban elérhetoek a proteáz számára, mint 37 o C-on. Kalmodulin jelenlétében végzett emésztést követoen még 0 o C- on sem figyeltük meg a ct92-nél kisebb fragmentek képzodését, mivel a kalmodulin kötodése ezeknek a fragmenteknek a kialakulását gátolta. Azokban a kísérletekben, ahol James és mtsai a hasítási helyeket kalmodulin jelenlétében vizsgálták, az emésztést a 38

kalmodulin-köto szekvenciát reprezentáló szintetikus peptiden végezték. Mivel a szintetikus peptidrol az általunk meghatározott természetes hasítási helyek hiányoznak, egyértelmu, hogy csak ezen a szekvencián belül figyelhettek meg hasítást. 7.1.1.2 A hpmca4b fragmentációja kaszpáz-3-mal Munkacsoportunk bizonyította elsoként, hogy kaszpáz-3 az apoptózis korai szakaszában hasítja a PMCA4b izoformát (77). Kimutattuk, hogy a kaszpáz-3 közvetlenül a 10. transzmembrán hélix és a kalmodulin-köto szekvencia között elhelyezkedo 1077 DEID 1080 szekvencia után hasít. (10. ábra). A hasítás eltávolítja a teljes kalmodulin-köto szekvenciát, és így a képzodo 120 kda-os fragment kalmodulin nélkül is maximálisan aktív. Hogy kontrollált körülmények között tanulmányozhassuk a különbözo konformációjú PMCA4b izoforma fragmentációját, a PMCA4b-vel transzfektált COS-7 sejtekbol izolált mikroszómális membránt in vitro rekombináns kaszpáz-3-mal emésztettük. Az in vivo kísérleteknek megfeleloen a kalmodulin jelenlététol függetlenül egyetlen 120 kdaos fragment képzodött (a 8. ábra a kalmodulin nélkül észlelt fragmentációt, a 11. ábra a fragment és a C-terminálisan csonkolt mutánsok elektroforetikus vándorlását mutatja). Ez is igazolja, hogy a kaszpáz-3 hasítási hely nem vesz részt a kalmodulin kötésében. 0,8 hpmca4b 0,7 0,6 0,5 hpmca4b kaszpáz-3 fragmentje 0,4 0,3 0,2 0,1 0 2 2,4 2,8 3,2 3,6 4 4,4 4,8 5,2 5,6 6 6,4 6,8 7,2 7,6 8 8,4 8,8 9,2 ct71 9,6 10 10,4 10,8 11,2 ct92 ct120 11,6 12 12,4 12,8 13,2 13,6 14 14,4 14,8 15,2 15,6 16 11. ábra A kaszpáz-3 proteáz hatására képzodött fragment és a C-terminálisan csonkolt mutánsok elektroforetikus vándorlásának összehasonlítása A PMCA4b és a kaszpáz-3 hatására képzodött fragment ugyanabban a gélben történo migrációját a Bio-Rad Molecular Imager System segítségével analizáltuk. A kemilumineszcencia intenzitását ábrázoltuk a megtett távolság függvényében. A folytonos vonal az ép PMCA4b és a fragment migrációját, a szaggatott vonalak a csonkolt mutánsok migrációját jelölik. 39

7.1.1.3 A hpmca4b fragmentációja kimotripszinnel A PMCA4b izoforma kimotripszines hasítását, hasonlóan az elozo két proteázzal végrehajtott kísérletekhez, transzfektált COS-7 sejtekbol preparált membránokon 37 o C- on végeztük. Azt tapasztaltuk, hogy a kimotripszin a C-terminális régióban kezdi fragmentálni a Ca 2+ ATPázt, majd a létrejött fragmenteket tovább hasítja. Olyan kísérleti körülményeket állítottunk be, amelyek mellett a vizsgált idointervallumban minimalizáltuk a másodlagos hasításokat. A fehérjéket SDS-gélelektroforézis segítségével választottuk szét, majd az anti-pmca 5F10, illetve a PMCA4 specifikus JA9 és JA3 monoklonális ellenanyagokkal festettük. Az emésztés során keletkezo fragmenteket az 5F10 és a JA9 ellenanyag felismerte, míg a JA3 ellenanyag nem. Ez azt bizonyítja, hogy a kimotripszin hasonlóan a kalpainhoz és a kaszpáz-3-hoz - a PMCA4b izoforma C-terminális régióját hasítja a JA3 epitóptól N-terminálisan. A kimotripszin aktivitása nem függ a Ca 2+ koncentrációtól, így a PMCA4b izoforma hasítását Ca 2+ hiányában, és Ca 2+ illetve Ca 2+ és kalmodulin jelenlétében is vizsgálhattuk. A fragmentáció mintázatában egyik esetben sem láttunk eltérést, mindig egy domináns N-terminális fragment képzodött (8. ábra), ami valamivel kisebb volt a ct71 deléciós mutánsnál, és valamivel nagyobb a ct92-nél (12. ábra). 0,8 0,7 0,6 0,5 hpmca4b kimotripszines fragmentje 0,4 0,3 hpmca4b 0,2 0,1 0 2 2,4 2,8 3,2 3,6 4 4,4 4,8 5,2 5,6 6 6,4 6,8 7,2 7,6 8 8,4 8,8 9,2 ct71 9,6 10 10,4 10,8 11,2 ct92 11,6 12 12,4 ct120 12,8 13,2 13,6 14 14,4 14,8 15,2 15,6 16 12. ábra A kimotripszines fragment és a C-terminálisan csonkolt mutánsok elektroforetikus vándorlásának összehasonlítása A PMCA4b és a kimotripszines fragment ugyanabban a gélben történo migrációját a Bio-Rad Molecular Imager System segítségével analizáltuk. A kemilumineszcencia intenzitását ábrázoltuk a megtett távolság függvényében. A folytonos vonal az ép PMCA4b és a fragment migrációját, a szaggatott vonalak a csonkolt mutánsok migrációját jelölik. 40

Ez alapján a hasítási hely a kalmodulin-köto szekvenciától C-terminálisan a ct71 és a ct92 mutáns C-terminálisai között található (1113. szerin és 1134. prolin között). A fragment elektroforetikus mobilitása alapján számolt molekulatömege ~124,5 kda. Ismert, hogy a kimotripszin aromás aminosavak mellett hasít. Megvizsgálva a behatárolt terület aminosav szekvenciáját és figyelembe véve a fragment molekulatömegét, valószínu, hogy a kimotripszin az 1122. tirozin után hasítja a C- terminális régiót (10. ábra). 7.1.2 Különbözo konformációs állapotok hatása a PMCA4b degradációjára Ta láltunk tehát három olyan eltéro szubsztrátspecificitású proteázt, amelyek közül ketto (kalpain, kimotripszin) a kalmodulin-köto szekvenciától C-terminális irányban (a másodlagos autoinhibítor régióban), egy pedig (kaszpáz-3) ettol N- terminálisan a 10. transzmembrán hélix és a kalmodulin-köto szekvencia között hasít. Az egyes hasítási helyek környezetének szerkezeti változásait úgy vizsgáltuk, hogy különbözo feltételek mellett (Ca 2+, kalmodulin) idoben követtük a megfelelo fragmentek képzodését. Három különbözo szerkezeti állapotban vizsgáltuk a PMCA4b izoformát. Amennyiben Ca 2+ -ot és kalmodulint is tettünk a közegbe, a fehérje aktív, így feltehetoen a C-terminális régió és a katalitikus centrum közötti kölcsönhatás gyenge. Kalmodulin hiányában a fehérje inaktív és az intramolekuláris kölcsönhatás a C- terminális régió és a katalitikus centrum között eros. Ez utóbbi esetben még két további formában tanulmányozhattuk a kalcium pumpa hasítását, mivel a Ca 2+ hozzáadásával illetve elvonásával a katalitikus centrum szerkezete E1 vagy E2 konformáció felé tolódik. A PMCA4b izoformával transzfektált COS-7 sejtekbol preparált membránokat különbözo ideig emésztettük az egyes proteázokkal. A fehérjéket SDSgélelektroforézissel szeparáltuk, majd immunfestéssel tettük láthatóvá. A fragmentek mennyiségének idobeli alakulását a BioRad Chemiluminescence Imaging System segítségével értékeltük ki, minden esetben úgy, hogy a 0 idopontban mért ép PMCA4b fehérje mennyiségét vettük 100%-nak. A kaszpáz-3 és a kimotripszin nem Ca 2+ -függo enzimek, így ezekkel a proteázokkal Ca 2+ hiányában (EGTA mellett) is emésztettük a fehérjét. A PMCA4b kaszpáz-3-mal történo fragmentációját mutatja a 13. ábra. Ca 2+ hiányában a 120 kda-os fragment alig képzodik, ami azt mutatja hogy a hasítási hely nem elérheto a proteáz számára. Amennyiben a közeg Ca 2+ -ot is tartalmaz, megno az azonos ido alatt képzodött fragment mennyisége. Ennek ellenére a fehérjének csak 30-41

40%-a fragmentálódott, ami azt mutatja, hogy a pumpa 60-70%-a védett marad a kaszpáz-3-mal szemben. Amennyiben Ca 2+ -kalmodulin komplex kötodik a Ca 2+ ATPázhoz, a hasítási hely teljesen hozzáférhetové válik a proteáz számára, így maximális fragmentképzodés alakul ki. A PMCA4b EGTA 120 kda B 120 kda-os fragment Ido (perc): 0 15 30 60 120 180 Ca 2+ PMCA4b Ido (perc): 0 15 30 60 120 180 Ca 2+ + kalmodulin PMCA4b Ido (perc): 0 15 30 60 120 180 120 kda 120 kda % 100 80 60 40 20 Ca 2+ + kalmodulin Ca 2+ EGTA 0 0 30 60 90 120 150 180 perc 13. ábra PMCA4b degradációja kaszpáz-3-mal PMCA4b-vel transzfektált COS-7 sejtekbol preparált mikroszómális membránt különbözo ideig emésztettünk kaszpáz-3-mal Ca 2+ hiányában (EGTA), Ca 2+ jelenlétében (Ca 2+ ) és Ca 2+ -kalmodulin komplex jelenlétében (Ca 2+ + kalmodulin). A, A mintákat 5F10 ellenanyaggal festettük meg. B, A 120 kda-os fragment mennyiségét Bio-Rad Molecular Imager System segítségével értékeltük ki. A 120 kda-os fragment képzodését Ca 2+ - kalmodulin komplex (kör), Ca 2+ (háromszög) és EGTA (négyzet) jelenlétében az ido függvényében ábrázoltuk. A feltüntetett adatok három független kísérlet alapján számolt átlagok ± S.E. Kimotripszin esetében a 124,5 kda-os fragment képzodése hasonló jellegzetességet mutat (14. ábra). Ca 2+ hiányában alig keletkezik a fragment. Bár Ca 2+ jelenléte már önmagában is szignifikánsan emeli a detektált fragment mennyiségét, a legtöbb fragment képzodését a Ca 2+ - kalmodulin komplex hozzáadásával lehetett elérni. Ebben az esetben az általunk használt körülmények mellett az ép fehérjének kb. 60%-a alakul át 124,5 kda-os fragmentté. Mivel a fehérje több kimotripszines hasítási helyet is tartalmaz, így ez a fragment feltehetoen tovább degradálódik. 42

A kimotripszines hasítási hely tehát a kaszpáz-3 hasítási helyhez hasonlóan akkor a leghozzáférhetobb a proteáz számára, ha a pumpafehérje a Ca 2+ -kalmodulin komplex kötodésének hatására aktív szerkezetet vesz fel. A EGTA B PMCA4b Ido (perc): 0 0.5 1 1.5 2 3 4 5 Ca 2+ 124,5kDa 60 124,5 kda-os fragment Ca 2+ + kalmodulin PMCA4b 124,5kDa % 40 Ca 2+ Ido (perc): 0 0.5 1 1.5 2 3 4 5 20 EGTA PMCA4b Ca 2+ + kalmodulin 124,5kDa 0 0 1 2 3 4 5 perc Ido (perc): 0 0.5 1 1.5 2 3 4 5 14. ábra PMCA4b degradációja kimotripszinnel PMCA4b-vel transzfektált COS-7 sejtekbol preparált mikroszómális membránt különbözo ideig emésztettünk kimotripszinnel Ca 2+ hiányában (EGTA), Ca 2+ jelenlétében (Ca 2+ ) és Ca 2+ -kalmodulin komplex jelenlétében (Ca 2+ + kalmodulin). A, A mintákat 5F10 ellenanyaggal festettük meg. B, A 124,5 kda-os fragment mennyiségét Bio-Rad Molecular Imager System segítségével értékeltük ki. A 124,5 kda-os fragment képzodését Ca 2+ - kalmodulin komplex (kör), Ca 2+ (háromszög) és EGTA (négyzet) jelenlétében az ido függvényében ábrázoltuk. A feltüntetett adatok három független kísérlet alapján számolt átlagok ± S.E. A kalpain Ca 2+ -függo enzim, ezért a PMCA4b emésztése során csak a Ca 2+ - kalmodulin komplex hatását vizsgáltuk (15. ábra). Ca 2+ -kalmodulin komplex hiányában két fragment képzodött (124 és 125 kda), mindemellett a fehérje fragmentációja nem volt teljes. Ca 2+ -kalmodulin komplex jelenlétében a 124 kda-os fragment nem képzodött, a 125 kda-os fragment képzodése viszont sokkal kifejezettebb lett, és az emésztés végén alig maradt detektálható ép PMCA4b fehérje. Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy a Ca 2+ -kalmodulin komplex kötodésének hatására annak ellenére, hogy a komplex kötodése megakadályozza az egyik fragment képzodését a 125 kda- 43

os fragmentet eredményezo hasítási hely elérhetobbé válik a kalpain számára és a pumpa intenzívebben degradálódik. A B Ca 2+ 125 kda-os fragment PMCA4b 125kDa 60 Ca 2+ + kalmodulin Ido (perc): 0 0.5 1 1.5 2 3 4 5 % 40 PMCA4b Ca 2+ + kalmodulin Ido (perc): 0 0.5 1 1.5 2 3 4 5 125kDa 20 Ca 2+ 0 0 1 2 3 4 5 perc 15. ábra PMCA4b degradációja kalpainnal PMCA4b-vel transzfektált COS-7 sejtekbol preparált mikroszómális membránt különbözo ideig emésztettünk kalpainnal Ca 2+ jelenlétében (Ca 2+ ) és Ca 2+ -kalmodulin komplex jelenlétében (Ca 2+ + kalmodulin). A, A mintákat 5F10 ellenanyaggal festettük meg. B, A 125 kda-os fragment mennyiségét Bio-Rad Molecular Imager System segítségével értékeltük ki. A 125 kda-os fragment képzodését Ca 2+ -kalmodulin komplex (kör) és Ca 2+ (háromszög) jelenlétében az ido függvényében ábrázoltuk. A feltüntetett adatok három független kísérlet alapján számolt átlagok ± S.E. Összefoglalva tehát, a PMCA4b C-terminális régióban bekövetkezo fragmentációja nagy mértékben függ a fehérje konformációs állapotától. Ca 2+ - kalmodulin komplex hiányában a C-terminális régió és a katalitikus centrum kölcsönhatása feltehetoen szoros. Ebben az esetben a katalitikus centrum konformációja (E2? E1) befolyásolja a C-terminális régió fragmentációját. Ca 2+ hiányában (EGTA jelenlétében), amikor az E2-E1 konformációs egyensúly az E2 állapot felé van eltolva, a Ca 2+ ATPáz védett a proteázokkal szemben. Ca 2+ jelenlétében, E1 konformáció mellett a hasítási helyek hozzáférhetobbé válnak, a pumpa részlegesen fragmentálódik. Ca 2+ -kalmodulin jelenlétében pedig, amikor az intramolekuláris kölcsönhatások gyengék, a hasítási helyek sokkal elérhetobbek mindhárom proteáz számára, így a PMCA4b intenzíven degradálódik. 44

7.2 A kalmodulin-köto szekvenciában található Trp 1093 mutációjának hatása a PMCA4b intramolekuláris kölcsönhatásaira A PMCA4b izoforma kalmodulin-köto szekvenciájában található triptofánról (Trp 1093 ) kimutatták, hogy mind az enzim belso gátlásában, mind a kalmodulin kötésében kitüntetett szerepet játszik (40). Penheiter és mtsai vizsgálták annak a mutánsnak a kinetikai jellemzoit, amelyben ezt a triptofánt alaninra cserélték (Trp 1093? Ala mutáns) (78). Kimutatták, hogy a mutáció hatására megemelkedik a Ca 2+ ATPáz kalmodulin nélkül mért alapaktivitása, ami arra utal, hogy a Trp 1093? Ala mutáns nyitottabb szerkezettel rendelkezik, mint a vad típusú PMCA4b fehérje. Célunk az volt, hogy a mutáció következtében megváltozott intramolekuláris kölcsönhatást a C- terminális régióban a Trp 1093 környezetében hasító proteázok segítségével is megvizsgáljuk. Limitált proteolízissel a kalmodulin-köto szekvenciától mind C-terminálisan (kalpain, kimotripszin), mind N-terminálisan (kaszpáz-3) vizsgáltuk, hogy a Trp 1093 mutációja befolyásolja-e a megfelelo hasítási helyek környezetének szerkezetét. PMCA4b Ca 2+ Ca 2+ + kalmodulin Trp 1093? Ala Ca 2+ Ca 2+ + kalmodulin 125 kda 124 kda 125 kda 124 kda 16. ábra A hpmca4b és a Trp 1093? Ala mutáns fragmentációja kalpainnal PMCA4b-vel és a Trp 1093? Ala mutánssal transzfektált COS-7 sejtekbol izolált mikroszómális membránt kalpainnal emésztettük Ca 2+ és Ca 2+ - kalmodulin jelenlétében. A mintákat 5F10 ellenanyaggal festettük meg. A kalpainos degradációt Ca 2+ -kalmodulin jelenlétében illetve hiányában tanulmányoztuk. Ca 2+ -kalmodulin komplex hiányában a Trp 1093? Ala mutáns valamivel nagyobb mértékben degradálódott, mint a vad típusú PMCA4b, és igen látványos eltérés volt megfigyelheto a fragmentáció mintázatában. Az 16. ábra a vad típus és a mutáns fehérje 3 perces kalpainos emésztésének eredményét mutatja. A PMCA4b esetében a 45

125 kda-os fragment képzodik nagyobb mennyiségben. Ezzel szemben a Trp 1093? Ala mutáns esetében a 124 kda-os fragment dominál, ami azt mutatja, hogy ez a hasítási hely jobban hozzáférheto a mutáns fehérjében. Ha a 125 és a 124 kda-os fragmentek alakulását az ido függvényében ábrázoljuk (17. ábra), látható, hogy a vad típusú PMCA4b kalmodulin hozzáadása nélkül kapott kalpainos emésztése során csak kis mennyiségben keletkezik a 124 kda-os fragment (~10%-a a kiindulási Ca 2+ ATPáz mennyiségének). A 125 kda-os fragment képzodése ennél valamivel nagyobb mértéku (~20%). A Trp 1093 mutációja kb. háromszorosára növeli az adott ido alatt keletkezett 124 kda-os fragment mennyiségét, de nem befolyásolja vagy kissé csökkenti a 125 kda-os fragment képzodését. PMCA4b Trp 1093? Ala % 40 20 125 kda 124 kda % 40 20 124 kda 125 kda 0 0 1 2 3 4 5 perc 0 0 1 2 3 4 5 perc 17. ábra A 125 és a 124 kda-os kalpainos fragmentek képzodése az ido függvényében a vad típusú PMCA4b és a Trp 1093? Ala mutáns esetében PMCA4b-vel és a Trp 1093? Ala mutánssal transzfektált COS-7 sejtekbol izolált mikroszómális membránt emésztettünk kalpainnal Ca 2+ jelenlétében. A, A vad típusú PMCA4b illetve B, a Trp 1093? Ala mutáns emésztése során képzodött 125 kda-os (háromszög) és a 124 kda-os fragment (négyzet) mennyiségét Bio-Rad Molecular Imager System segítségével értékeltük ki. A feltüntetett adatok három független kísérlet alapján számolt átlagok ± S.E. A Trp 1093? Ala mutáns kimotripszines fragmentációját Ca 2+ hiányában, Ca 2+ illetve Ca 2+ -kalmodulin komplex jelenlétében is tanulmányoztuk. Kalmodulin hiányában a kalpainhoz hasonlóan lényeges különbséget tapasztaltunk a vad típusú és a mutáns fehérje fragmentációjának mintázatában (18. ábra). A Trp 1093? Ala mutáns kimotripszinnel történo emésztése során új fragment megjelenését detektáltuk, azaz a 46

mutáció olyan hasítási helyet hozott a fehérje felszínére, amely egyébként elérhetetlen a proteáz számára. Az új fragment elektroforetikus migráció alapján számolt molekulatömege ~123 kda, valamivel kisebb mint a ct92 mutánsé. Valószínu, hogy a kimotripszin a kalmodulin-köto szekvencia N-terminális felében található fenilalanin (Phe 1094 ) után hasítja a mutáns fehérjét. Amint a 18. ábrán látható a Ca 2+ -kalmodulin komplex kötodése megvédi ezt a hasítási helyet kimotripszinnel szemben igazolva, hogy az új hasítási hely a kalmodulin-köto szekvencián belül helyezkedik el. A vad típusra jellemzo 124,5 kda-os fragment keletkezését a Trp 1093 befolyásolta jelentosen. mutációja nem PMCA4b EGTA Ca 2+ Ca 2+ + kalmodulin Trp 1093? Ala EGTA Ca 2+ Ca 2+ + kalmodulin 124.5 kda 123 kda 18. ábra A hpmca4b és a Trp 1093? Ala mutáns fragmentációja kimotripszinnel PMCA4b-vel és a Trp 1093? Ala mutánssal transzfektált COS-7 sejtekbol izolált mikroszómális membránt kimotripszinnel emésztettük Ca 2+ és Ca 2+ - kalmodulin jelenlétében, valamint Ca 2+ hiányában (EGTA). A mintákat 5F10 ellenanyaggal festettük. A kalpainos és a kimotripszines kísérletekbol nyert eredmények azt bizonyítják, hogy a Trp 1093 mutációja nem befolyásolja a kalmodulin-köto szekvenciától C-terminális irányba eso hasítási helyek hozzáférhetoségét, de jobban elérhetové teszi a kalmodulinköto szekvencián belül található hasítási helyeket. A Trp 1093? Ala mutáns kaszpáz-3-mal történo fragmentációjának vizsgálata során nem találtunk szignifikáns eltérést a vad típusú és a mutáns fehérje degradációja között, ami azt bizonyítja, hogy a Trp 1093 mutációja nem befolyásolja a kaszpáz-3 hasítási hely hozzáférhetoségét. Összefoglalva, a triptofán? alanin csere tehát csak a mutáns aminosav közvetlen környezetében növeli meg a hasítási helyek hozzáférhetoségét; a mutációtól akár C-terminális, akár N-terminális irányba eso, távolabbi hasítási helyek nem váltak elérhetobbé a proteázok számára (19. ábra). 47

Trp 1093? Ala kalmodulin-köto szekvencia TM10-..LDEIDHAEME LRRGQ I LA 1093 FRGLNRIQTQIKVVKAFHSS LHESIQKPYNQKSIHSFMTHPEF..-COOH Kaszpáz-3 (120 kda) Kimotripszin (123 kda) Kalpain (124 kda) Kimotripszin (124,5 kda) Kalpain (125 kda) 19. ábra Hasítási helyek a Trp 1093? Ala mutáns C-terminális régiójában A mutáns fehérje kalmodulin-köto régiójában található triptofánt alanin (A 1093 ) helyettesíti. Fekete nyilak jelzik azokat a hasítási helyeket, amelyek jobban hozzáférhetoek a Trp 1093? Ala mutánsban, mint a vad típusú PMCA4b fehérjében. A szürke nyilak azokat a hasítási helyeket jelölik, amelyek a Trp 1093 mutáció hatására nem elérhetobbek a proteázok számára. 7.3 Az autoinhibítor régiótól N-terminálisan található aszparaginsav (Asp 1080 ) szerepe a hpmca4b izoforma belso gátlásában Inaktív állapotban a PMCA4b izoforma aktivitásának gátlásáért a kalmodulinköto szekvencia és a másodlagos autoinhibítor régió felelosek. Amennyiben a kalmodulin-köto szekvencia N-terminális irányba eso végétol (Leu 1086 ) eltávolítjuk a C- terminális régiót, az enzim maximálisan aktív, és aktivitása kalmodulin hozzáadásával sem fokozható (38). Az a polipeptidlánc, amely a 10. transzmembrán hélixet a Leu 1086 - tól kezdodo kalmodulin-köto szekvenciával köti össze, nem tartozik sem a katalitikus centrumhoz, sem az autoinhibítor régióhoz. Ebben az összeköto vagy csukló régióban a kalmodulin-köto szekvencia N-terminálisához nagyon közel található a kaszpáz-3 hasítási hely (Asp 1080 ) (77). A 6.1. fejezetben leírtuk, hogy a kaszpáz-3 proteázzal vizsgált csukló régió fragmentációja jelentosen függ az enzim konformációjától, azaz az intramolekuláris kölcsönhatás erosségétol. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a csukló szerepet játszhat az enzim inaktív (zárt) szerkezetének kialakításában. Ezért vizsgáltuk, milyen hatással van a kaszpáz-3 hasítási hely mutációja a pumpa aktivitására. Vizsgálatainkhoz olyan mutánsokat készítettünk, ahol az 1080. aszparaginsavat alaninra (Asp 1080? Ala), lizinre (Asp 1080? Lys) illetve aszparaginra (Asp 1080? Asn) cseréltük. Ezután mértük a 48

mutáns cdns-ekkel transzfektált COS-7 sejtekbol készített membránvezikulák Ca 2+ - felvételét telítési Ca 2+ -koncentrációnál kalmodulin jelenlétében illetve hiányában. A 20. ábra mutatja, hogy minden Asp 1080 mutáns kalmodulin hiányában mért alapaktivitása magasabb mint a vad típusú pumpáé. Az Asp 1080? Ala és az Asp 1080? Lys mutánsok kalmodulin nélkül is majdnem teljesen aktívak, aktivitásukat a kalmodulin csak kis mértékben fokozza. Jelentosebb aktiválódást csak az Asp 1080? Asn mutáns esetében tapasztaltunk. Megvizsgáltuk a PMCA4b kaszpáz-3 konszenzus szekvenciáját alkotó másik aszparaginsav (Asp 1077 ) szerepét is a belso gátlásban. Az 1080. aszparaginsavval ellentétben azonban az 1077. aszparaginsav mutációja (Asp 1077? Ala) nem okozott jelentos változást az enzim alapaktivitásában, ami arra utal hogy az Asp 1080 mutáció hatása specifikus. maximális aktivitás %-a 100 80 60 40 20 0 vt D 1077 A DN DA DK 20. ábra Az Asp 1080 mutációja megemeli a PMCA alapaktivitását A vad típusú PMCA4b (vt) és az Asp 1080 és Asp 1077 mutánsok (Asp 1080? Ala (DA), Asp 1080? Lys (DK), Asp 1080? Asn (DN), Asp 1077? Ala (D 1077 A) kalmodulin hiányában mért alapaktivititását a kalmodulin jelenlétében mért maximális aktivitás %-ában ábrázoltuk. A feltüntetett adatok három független kísérlet alapján számolt átlagok ± S.E. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a 10. transzmembrán hélixet és a kalmodulinköto szekvenciát összeköto régió fontos szerepet tölt be az enzim belso gátlásában, és hogy az Asp 1080 meghatározó aminosav a pumpa inaktív konformációjának kialakításában. Mivel az Asp 1080 mutációja megvédi a fehérjét a kaszpáz-3 enzimmel szemben, proteolízis segítségével csak a kalpainos illetve a kimotripszines hasítási hely szerkezetében bekövetkezo változásokat tanulmányozhattuk. A vad típusú enzim és az Asp 1080? Ala mutáns kalpainos illetve kimotripszines fragmentációjában azonban nem 49