Klónozási technikák
Mik a klónok? Genetikailag azonos élılények, identikus ikrek
Mik a klónok? Genetikailag azonos élılények, identikus ikrek: létrejöhetnek természetes úton,
Identikus ikrek keletkezése természetes úton
Mik a klónok? Genetikailag azonos élılények, identikus ikrek: vagy mesterséges módon elıállítva. Ivartalan szaporítási módok a növénytermesztésben évezredek óta Klon görög szó ágacska, dugvány
BIOLÓGIAI KÉRDÉS: MEDDIG TOTIPOTENS EGY EMBRIONÁLIS SEJT? TOTIPOTENSSÉ TEHETİ-E EGY DIFFERENCIÁLÓDOTT SEJT?
a. b. c. Embrióosztás
Tetra embrióosztás, 2000
EMBRIÓFELEZÉS
Hans Spemann FANTASZTIKUS KÍSÉRLET 1914 1935 Orvosi Nobel díj
a. a. b. A. b. B. C. Briggs and King (1952) D. SEJTMAGÁTÜLTETÉS
A klónozás elsı szakasza
Enukleáció: a petesejt mag DNS eltávolítása citoplaszt Donor sejt injektálása a perivitellináris térbe
Sejt fúzió 2 kv/cm 2 x 16 microsec 0.28M Mannitol solution wo Ca ion donorsejt citoplaszt
DOGMA Sejtmag-átültetés ET
Embrionális sejt
A klónozás második szakasza
1984 Élı bárány embrionális sejtbıl 1986 Korai embriósejtekbıl szarvasmarha 1993 Tenyésztett embrionális sejtekbıl szarvasmarha utódok Megan 5LL2 és Morag 5LL5 1995 Megan & Morag, tenyésztett embrionális sejtekbıl (Roslin Intézet) 1996 Dolly testi sejtbıl (emlısejt tenyészet) klónozva 1997 Transzgénikus testi sejtbıl klónozott juh - Polly Dolly http://www.cnn.com/2001/world/europe/08/06/clone.critics/index.html
Ian Wilmuth Bill Ritchie Keith Campbell Lamb 6LL3
Bonnie Dolly
2003 1996
A klónozás harmadik szakasza
Wakayama Yanagimachi Cumulina, 1998 Hawai, Japan
Transzgénikus klónozott állatok elıállítása A. B. DNS 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Klónozott állatok elıállításának módszerei Embrió felezés (+ 40-70% utód) Korai embriók több részre bontása Sejtmagátültetéses klónozás Embriókból (több lépcsıben, < 25 utód) Sejtvonalakból Embrió-eredető Magzati Felnıtt
Minden állat egyenlı, de vannak akik egyenlıbbek
A klónozás elınyei 1. Értékes állatok gyors elszaporítása A genetikai elırehaladás gyorsítása Klónozott hímek természetes szaporításhoz Heterózis tenyésztés lehetısége Termelı csoportok gyors elıállítása Szabványos termékek Veszélyeztetett fajok/fajták megmentése
A klónozás elınyei 2. Kutatási célokra Genetikailag megegyezı egyedek kísérleti célokra (immunológia, takarmányozás, tenyészérték becsléshez ) A maganyag újraprogramozásának alapkutatása Labor- és haszonállatok genetikai módosítása Transzgénikus állatok elıállítása és elszaporítása Génkiütéses módszerek
A klónozáshoz gyakorlati sikerét biztosító szaporodásbiológiai módszerek In vitro petesejt érlelés In vitro embrió-elıállítás Embrió mélyhőtés Petesejt mélyhőtés Embrió beültetés A vemhesség és az újszülöttek nyomon követése
Alapvetı klónozási problémák Alacsony hatékonyság sejtvonalak és típus
Alapvetı klónozási problémák Alacsony hatékonyság sejtvonalak és típus Magzati/újszülött rendellenességek genetikai okok, X-kromoszóma inaktiválódás rendellenességei,metilációs változások, rendellenességek viszonya
A klónozott állatok fejlıdési problémái Nagy újszülöttek Légzési problémák Placenta problémák Magzati rendellenességek: máj megnagyobbodás epidermiszben vérzések egyéb elváltozások
Klónok fejlıdési vesztesége Yanagimachi, R. 2002. "Cloning: experience from the mouse and other animals." Molecular and Cellular Endocrinology. 21 March, 187.
Alapvetı klónozási problémák Alacsony hatékonyság sejtvonalak és típus Magzati/újszülött rendellenességek genetikai okok, X-kromoszóma inaktiválódás rendellenességei, metilációs változások, rendellenességek viszonya Kivitelezése bonyolult kémiai mageltávolítás, sejt injektálás, vagy fúzió A genetikai újraprogramozás folyamatának megértése
George and Charlie, 1998, USA ACT klónok, USA
21 éves bika Second Chance, 1999
Japán, 1998-2001 Kamitakafuku, 21 éves bika Saburo Sho-zaburo Klónozás klónozott állatból
1998 Cumulina F1 F2 Az elsı klónozott egér utódgenerációi
Yangyang, 2000 Kecskeklón, Kína
Tetra embrióosztás, 2000 ES klónok
CC CopyCat (carbon copy)
Rainbow CC Genetic Savings & Clone 2006-ig üzemelı klónozó cég A világ elsı klónozott macskája CC - 2001 A világ elsı kereskedelmi célból klónozott háziállata Little Nicky, 2004 50000 USD
Veszélyeztett faj modell Jazz Afrikai vadmacska Mélyhőtött embrió, Házimacska recipiens Ditteaux, 2003 Klónozott vadmacska USA
Snuppy Dél Korea, USA 2005
Idaho Gem, öszvér 2003, USA http://www.uidaho.edu/cloning/
Dewey, 2003 USA http://www.cvm.tamu.edu/news/releases/2003/deer_clone.shtml
Ralph, 2003
Prometea, 2003 Lóklón, Olaszország
2002, kumuluszsejtekbıl klónozott nyúl (Franciaország) 2007, fibroblasztsejtekbıl klónozott nyúl (Kína)
Klónozott sertések Japán 2000. márc. 5-15 USA, UK Elsı transzgénikus klónozott sertés, USA
Magyar klónozott állatok Dr. Dinnyés András kutatócsoportja, MBK Kumuluszsejtekbıl klónozott állatok Klonilla B6D2 F1 klónegér 2006 Tapsilla HyCole klónnyúl 2007
NT utódok Nagy placenta Akit nem fogadtak el 2006. okt.26. Akit igen Klonilla 2006. november 6, 18:30 PM
Klónozás különbözı fajokban blasztomer Juh + + Szarvasmarha + + Egér + + Kecske + + Sertés + + Nyúl + + Gaur, muflon - + Macska - + Majom + - Kutya - + Patkány - + testi sejt
Egyformák-e a klónok? Fenotípus: genotípus + környezeti tényezık Genotípusos eltérések okai: Genetikai változások a sejttenyésztés során (ESsejtekben!) Mitokondriális DNS Sejtmag újraprogramozása: epigenetikus változások X-kromoszóma inaktiválódás Környezeti eltérések: A petesejt citoplazma A befogadó méh A születés utáni környezet
A klónozás várható alkalmazásai Humán orvosi célú állat klónozás Összehasonlító állat kísérletek funkcionális genomika Emberi betegségek állatmodelljei atherosclerosis, neurodegenerativ, mitochondriális, cisztás fibrózis Gyógyszer elıállítás tejben,vérben Gyógyszer tesztek Xenotranszplantáció
Xenotranszplantáció: állati szervek emberi beültetésre Sejtfelszíni antigének megváltoztatása: a xenograft ellen nem alakul ki hiperakut immunválasz Klónozás humán terápiás célból
A klónozás várható alkalmazásai Humán orvosi célú állat klónozás Összehasonlító állat kísérletek funkcionális genomika Emberi betegségek állatmodelljei atherosclerosis, neurodegenerativ, mitochondriális, cisztás fibrózis Gyógyszer elıállítás tejben,vérben Gyógyszer tesztek Xenotranszplantáció Gyógyhatású táplálékok Állategészségügyi Betegség rezisztencia Homogén vakcinázás Állati termékek mennyiségi és minıségi javítása
KLÓNOZÁS REPRODUKTÍV TERÁPIÁS
http://easyweb.easynet.co.uk/~sfl/rlb3a.jpg HUMÁN TERÁPIÁS KLÓNOZÁS
İssejtek elıállítása klónozással
Enukleáció CZB-Hepes + CB
FIBROBLASZT CITOPLASZT ES --- HM1 Sejt ragasztás PHA in CZB-Hepes PVA
Sejt fúzió 2 kv/cm 2 x 16 microsec 0.28M Mannitol solution wo Ca ion
Embrió tenyésztés - WOW CZB-IVC
110 97,82 98,00 90 82,74 74,09 70 63,28 50 30 16,29 10-10 enukl% constr% fus% act% cl% bl% NT lépések hatékonysága Fejlıdési adatok
Petesejt: B6D2 F1 Donorsejt: GFP+ B6D2 F1 ES GFP+ B6D2 F1 Fibro ICM GFP trg F1 ES sejtbıl klónozott blasztociszta
ES sejtvonal alapítása hólyagcsíra állapotú egérembriókból
Kontroll embrió NT embrió IMPLANTÁCIÓS IN VITRO MODELL
In vitro pluripotencia vizsgálat DAPI AP SSEA-1-Cy3 Oct-4-FITC
Clonefactory Teamwork!
http://www.physics.ohio-state.edu/~wilkins/writing/assign/topics/cloning/cloning-nytmag2-4-01.html http://www.rael.org/hungarian/ Akik igent mondanak a humán reproduktív klónozásra 1.
Antinori 2004-2005 az elsı klónozott emberi embriók UK, Dél Korea Akik igent mondanak a humán reproduktív klónozásra 2.
Boba Fetts Lama Su
http://www.sl.kvl.dk/cloninginpublic/ http://robby.nstemp.com/index.html http://www.crystalinks.com/cloning.html Az elıadás részben támaszkodott dr. Dinnyés András és Dr. Bodó Szilárd MSc és PhD kurzusainak anyagára