BUDAPESTI MŰSZAKI ÉS GAZDASÁGTUDMÁNYI EGYETEM rtogonális védőcsoport-stratégia heparin és heparán-szulfát oligoszacharidok szintézisére Doktori (Ph.D.) értekezés Készítette: Daragics Katalin Témavezető: Dr. Fügedi Péter Magyar Tudományos Akadémia Kémiai Kutatóközpont Biomolekuláris Kémiai Intézet Szénhidrátkémiai sztály 2010.
TARTALMJEGYZÉK RÖVIDITÉSEK JEGYZÉKE 1. BEVEZETÉS 5 2. IRDALMI ÁTTEKINTÉS 7 2.1. A heparin és a heparán-szulfát biológiai szerepe 7 2.1.1. A heparin és a heparán-szulfát szerkezete 7 2.1.2. A heparin és a heparán-szulfát fehérjékkel való kölcsönhatása 10 2.1.2.1. Kölcsönhatás antitrombin III fehérjével 11 2.1.2.2. Prion-fehérjék, a H/HS prion-fehérjékkel való kölcsönhatása 12 2.2. A heparin és heparán-szulfát oligoszacharidok szintézise 16 2.2.1. Szintézisstratégiák heparin és heparán-szulfát oligoszacharidok előállítására 16 2.2.2. Szintézisstratégiák GlcpA-GlcpN-GlcpA-GlcpNAc heparán-szulfát oligoszacharidok előállítására 22 2.3. Új metodikák oligoszacharidok szintézisére 25 2.3.1. 4,6--Benzilidén acetálok reduktív gyűrűnyitása 25 2.3.1.1. LiAlH 4 -AlCl 3 reagenssel történő redukció 26 2.3.1.2. NaCNBH 3 -HCl reagenssel történő regioszelektív gyűrűnyitás 28 2.3.1.3. Borán-amin komplexek és Lewis-savak kombinációjával történő gyűrűnyitás 2.3.1.4. Egyéb gyűrűnyitási módszerek 30 2.3.2. Védőcsoportok fejlesztése és bevezetése a mai szénhidrátkémiában 32 3. CÉLKITŰZÉS 35 4. SAJÁT VIZSGÁLATK 37 4.1. Új reduktív gyűrűnyitás kidolgozása, kiterjesztése más benzilidén típusú acetálokra 37 4.2. Prion kötődéséért felelős tetraszacharid szintézise 44 4.2.1. Monoszacharid építőegységek szintézise 44 4.2.1.1. N-Acetil-glükózamin akceptor szintézise 44 4.2.1.2. rtogonálisan védett D-glükóz donor szintézise 45 4.2.1.3. 2-Azido-2-dezoxi-glikozil akceptor szintézise 46 4.2.1.4. D-Glükuronsav donor szintézise 47 4.2.2. Glikozilezés: védett diszacharid építőegységek szintézise 47 4.2.3. Glikozilezés: védett tetraszacharid szintézise 49 1
4.2.4. Szabad heparán szulfát tetraszacharid szintézise 51 4.3. Új ortogonális védőcsoport-stratágia kidolgozása: heparin tetraszacharid vegyülettár előállítása 52 4.3.1. Monoszacharid építőegységek szintézise 54 4.3.1.1. A nemredukáló végi diszacharid D-glükuronsav tioglikozid egységének szintézise 54 4.3.1.2. A redukáló végi diszacharid D-glükuronsav tioglikozid egységének szintézise 4.3.1.3. 2-Azido-2-dezoxi-glikozil akceptor szintézise 56 4.3.1.4. D-Glükózamin akceptor szintézise 56 4.3.2. Glikozilezés: védett diszacharid donorok szintézise 57 4.3.3. Glikozilezés: védett diszacharid akceptorok szintézise 59 4.3.4. Glikozilezés: ortogonálisan védett tetraszacharidok szintézise 61 4.3.5. Új ortogonális védőcsoportok szelektív eltávolítása 63 4.3.6. Szabad, monoszulfatált heparin tetraszacharidok előállítása 65 4.4. Új védőcsoport bevezetése 67 4.4.1. Az új NPAc védőcsoport bevitele és reduktív eltávolítása 67 4.4.2. Az új NPAc védőcsoport kompatibilitása a leggyakrabban használt védőcsoportokkal 68 4.4.3. Az NPAc védőcsoport, mint új ortogonális védőcsoport 70 4.4.4. Glikozilezés: az új NPAc védőcsoport, mint résztvevő csoport 71 5. ÖSSZEFGLALÁS 73 6. SUMMARY 76 7. KÍSÉRLETI RÉSZ 79 8. A DLGZAT ALAPJÁUL SZLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK 127 9. IRDALMJEGYZÉK 128 2
RÖVIDITÉSEK JEGYZÉKE Ac acetil All allil ATIII antitrombin III Bn benzil Bz benzoil CAN cérium(iv)-ammónium-nitrát AcCl klóracetil CSA kámforszulfonsav d dublett DBU 1,8-diazabiciklo[5.4.0]undec-7-én DDQ 2,3-diklór-5,6-dicián-1,4-benzokinon DMAP 4-dimetilamino-piridin DMF N,N-dimetil-formamid DMTST dimetil-metiltio-szulfónium-triflát Et etil ekv ekvivalens FGF fibroblaszt növekedési faktor Fmoc (9-fluorenilmetoxi)karbonil GlcpA glükopiranoziluronsav GlcpN 2-amino-2-dezoxi-glükopiranóz (glükózamin) H heparin HDTC hidrazin-ditiokarbonát HM heparán mimetikum HS heparán-szulfát IdopA idopiranoziluronsav Lev levulinoil m multiplett Me metil MeTf metil-triflát MPh (4-metoxi)fenil 1 NAP (1-naftil)metil 1 Naph 1-naftil NBS N-bróm-szukcinimid NIS N-jód-szukcinimid NMR mágneses magrezonancia NPAc (2-nitrofenil)acetil op olvadáspont PDC piridinium-dikromát Ph fenil Phth ftaloil PrP c cellularis prion precursor protein, normális celluláris prion protein PrP sc scrapie prion protein, kóros priont Pyr piridin s szingulett SEM 2-trimetilszilil-etoximetil t tercier TBDMS terc-butildimetilszilil 3
TBDMSTf terc-butildimetilszilil-triflát TBDPS terc-butildifenilszilil TEMP 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi, szabad gyök TFA trifluorecetsav Tf 2 trifluormetánszulfonsav-anhidrid THF tetrahidrofurán TMSTf trimetilszilil-triflát TSE transmisszibilis spongioform encephalopathia, fertőző szivacsos agyvelősorvadás Tr tritil tbu terc-butil UDP uridin-difoszfát VRK vékonyréteg-kromatográfia Z benziloxikarbonil 4
1. BEVEZETÉS Az utóbbi időszakban a szénhidrátok biológiai szerepéről vallott korábbi felfogás jelentős átértékelődését tapasztalhattuk. Míg biokémiai szempontból a szénhidrátokat korábban szinte kizárólag energiaforrásnak és vázanyagnak tekintették, napjainkban a legkülönbözőbb területeken demonstrálják a szénhidrátoknak, mint specifikus információhordozó molekuláknak a jelentőségét 1. A szénhidrátoknak fontos szerepük van a legkülönfélébb biológiai felismerési folyamatokban is, így sejt-sejt (pl. baktériumok, vírusok kötődése sejtekhez) valamint sejten belüli kölcsönhatásokban. A biológiai rendszerekben a szénhidrátok elsősorban nem szabad állapotban, hanem más molekulákhoz kapcsolódva, glikokonjugátumok (glikolipidek, glikoproteinek, proteoglikánok) formájában vesznek részt. E biológiai felismerési folyamatok leggyakrabban specifikus szénhidrát-fehérje kölcsönhatásokon alapulnak. E kölcsönhatások során a fehérje a glikokonjugátum valamely kisebb oligoszacharid egységét ismeri fel, és ahhoz kötődik. A specifikus felismerési folyamatokban szerepet játszó oligoszacharidok azonosítása és kémiai szintézise mind a glikobiológiai alapkutatásoknak, mind azok gyógyszerkutatási alkalmazásának alapját képezi 2,3. A heparin a gyógyászatban véralvadásgátlóként széles körben használt heterogén szerkezetű poliszacharid 4. Az 1980-as években határozták meg a heparin antikoaguláns hatásáért felelős kisebb pentaszacharid egység szerkezetét 5, mely nem izolálható a természetes polimer kémiai vagy enzimatikus lebontásával, előállítását csak kémiai szintézissel lehetett megvalósítani 6. E pentaszacharidnak és szintetikus analógjainak hatásszerkezet vizsgálata egy szintetikus pentaszacharid gyógyszerként történő bevezetését eredményezte 7. A heparin véralvadásgátló hatása mellett fontos szerepet tölt be a sejtnövekedés és a sejtdifferenciálódás szabályozásában, az immunválasz kiváltásában, a rákos sejtek áttételében, a gyulladás, valamint a bakteriális és vírusos fertőzések gátlásában 8,9. Általánosan elfogadott, hogy az egyes fehérjékkel történő kölcsönhatásokért nem a heparin molekula egésze hanem annak különböző, kisebb oligoszacharid egységei felelősek 10,11. Az egyes fehérjék kötődéséért felelős szénhidrát epitópok azonosítása jelenleg többnyire a heparin degradációjával kapott oligoszacharid keverék szétválasztásával történik. Ez a módszer azonban a keverék komplexitása miatt rendkívül nagy nehézségekbe ütközik. Járhatóbb utat jelent a heparin oligoszacharidok előállítása kémiai szintézis segítségével. A kémiai szintézist nehezíti, hogy a szénhidrátok multifunkciós vegyületek lévén, a védőcsoportok nagymértékű 5
használata szelektív kémiai átalakítások megvalósítására elkerülhetetlen. Többirányú átalakítások esetén a szénhidrátkémiában igen nagy hangsúlyt kell fektetni a védőcsoportok variálhatóságára, ezek egymás mellett való szelektív eltávolítására, ortogonális védőcsoportstratégia kidolgozására. A heparin oligoszacharidok eddig ismert kémiai szintézismódszerei 12,13 általában egy védett oligoszacharidból egyetlen célvegyület előállítására korlátozódtak, így nagyszámú oligoszacharid szintézisére nem alkalmasak. Az MTA Kémiai Kutatóközpont Szénhidrátkémiai sztályán heparin oligoszacharidok előállítására olyan szintézismódszert dolgoztunk ki, mellyel egy központi vegyületből számos végtermék előállítható 10. Dolgozatomban beszámolok a ciklikus acetálok új kemo- és regioszelektív reduktív gyűrűnyitásának kidolgozásáról, melynek segítségével egyszerűsítettük a heparin oligoszacharidok építőegységeinek szintézisét, megalapozva egy heparin oligoszacharid vegyülettár sikeres előállíthatóságát. Kidolgoztunk egy új ortogonális védőcsoport-stratégiát heparin tetraszacharid vegyület könyvtár előállítására és megvalósítottuk néhány biológiailag aktív heparin és heparán-szulfát tetraszacharid szintézisét. Egy új hidroxil-védőcsoport bevezetésével bővítettük a jelenlegi ortogonális védőcsoport-kombinációk számát, ezáltal utat nyitottunk magasabb tagszámú heparin oligoszacharidok szintézise felé. Így lehetőség nyílik eddig még ismeretlen heparin-kötő fehérjék felfedezésére és a heparin biológiai szerepének még teljesebb megértésére, továbbá a hatás-szerkezet vizsgálatokban aktívnak bizonyult epitópok szerkezete, új szintetikus gyógyszerkészítmények kifejlesztésének lehet az alapja. 6
2. IRDALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. A glikózaminoglikánok biológiai szerepe A proteoglikánok fehérjékből és szénhidrátokból felépülő makromolekulák, melyek nagyszámú biológiai folyamatban játszanak jelentős szerepet, így például a véralvadásban, az új véredények kifejlődésében (angiogenézis), a sejtadhézióban, a növekedési faktorok szabályozásában és a vírusok megkötésében. A különböző proteoglikánok hatásukat általában szénhidrát részük, a glikózaminoglikánok (heparin, heparán-szulfát, dermatán-szulfát, kondroitin-szulfát, keratán-szulfát, hialuronsav) fehérjékkel való kölcsönhatása révén fejtik ki 4,9. 2.1.1. A heparin és a heparán-szulfát szerkezete A glikózaminoglikánok (GAG-ok) lineáris, nem elágazó heteropoliszacharidok, amelyek ismétlődő diszacharid egységekből épülnek fel. Legjelentősebb képviselői a heparin (H) és rokon vegyülete a heparán-szulfát (HS) váltakozó 2-amino-2-dezoxi-D-glükopiranóz (D-GlcpN) és hexuronsav egységekből felépülő lineáris poliszacharidok. A hexuronsav D- glükuronsav (D-GlcpA), vagy annak C-5 epimere, az L-iduronsav (L-IdopA). A D- glükuronsav β-(1 4), az L-iduronsav pedig α-(1 4) kötéssel kapcsolódik a D- glükózaminhoz, míg a D-glükózamin és a hexuronsavak között α-(1 4) kötés található 4,14. A szénhidrát lánc szubsztitúciójának következtében a heparin és a heparán-szulfát szerkezetére nagyfokú heterogenitás jellemző. A hidroxil csoportok közül a D-glükózamin - 3 és -6, míg az uronsavak -2 pozíciói szulfatálva lehetnek. A glükózamin általában N- acetilezett vagy N-szulfatált formában fordul elő, de az amino csoport állhat szubsztituálatlanul is. A heparin és a heparán-szulfát jellemző diszacharid egységeinek (1 és 2) szerkezete az 1. ábrán látható. H C 2 - R 3 R 2 R 4 R 1 HN 1 ->4)-β-D-GlcpA-(1->4)-α-D-GlcpN-(1-> R 3 H R 2 - R 2 C 1 HN R 4 2 ->4)-α-L-IdopA-(1->4)-α-D-GlcpN-(1-> R 1 = Ac vagy S 3 - vagy H; R 2 = H vagy S 3 - ; R 3 = H vagy S 3 - ; R 4 = H vagy S 3-1. ábra A heparin és a heparán-szulfát jellemző diszacharid egységei 7
A szulfát és a karboxil csoportok nagy száma miatt a H/HS anionos jellegű elektrolitok, a heparin átlagos töltése -75 9. Az egy diszacharidra jutó átlagosan 2,7 szulfát csoportnak köszönhetően a heparin a legnagyobb negatív töltéssűrűséggel rendelkező biológiailag aktív makromolekulának tekinthető. A heparin poliszacharidban az L-iduronsav és D-glükuronsav aránya 9:1. A heparán-szulfátban az N-szulfatált diszacharidok jellemzően egymás mellett, 3-9 diszacharid hosszú tartományokban (S-doménekben) találhatók 15, melyek hasonlítanak a heparin azonos doménjeire, csak kevesebb -szulfát csoporttal rendelkeznek. Az S- doméneket általában GlcpA-GlcpNAc szerkezetű nem szulfatált régiók választják el. Ennek köszönhetően a heparán-szulfátban az uronsavak közül a D-glükuronsav dominál és az egy diszacharidra jutó szulfát csoportok száma is csak átlagosan 1, illetve a HS átlagos molekulatömege (30 kda) is nagyobb, mint a hepariné (15 kda) 16. Az S-doméneknek a fehérjék felismerésében van fontos szerepük. A lineáris heparin és heparán-szulfát poliszacharidláncra a helikális másodlagos szerkezet jellemző a negatív töltésű csoportok miatt 17 (2. ábra). A fehérjékkel ellentétben a H/HS láncok egymással nem lépnek kölcsönhatásba, így nincs harmadlagos szerkezetük. 2. ábra A H/HS helikális másodlagos szerkezete A H/HS oligoszacharidok proteoglikánként bioszintetizálódnak 18. A proteoglikán fehérje része nagyszámú szerin és glicin aminosav egységet tartalmaz. Az endoplazmatikus retikulumban megy végbe a szerglicin vázprotein szintézise, míg a Golgi-készülékben történik a glikózaminoglikán (GAG) lánc szintézise és modifikációja. A lánc indításaként egy β-d-glcpa-(1 3)-β-D-Galp-(1 3)-β-D-Galp-(1 4)-β-D-Xylp tetraszacharid egység kötődik a proteoglikán vázfehérjéhez egy szerinen keresztül 9,10. 8
Ezt követően a fenti tetraszacharidhoz egy aminocukor kötődik. Ha ez az aminocukor D-glükózamin glükózaminoglikánról (heparin, heparán-szulfát), ha D-galaktózamin galaktózaminoglikánról (kondroitin-szulfát, dermatán-szulfát) beszélünk. A H/HS bioszintézisének részletei nagy részben tisztázottak 18. Ismert, hogy a lánchosszabítás során az első D-glükózaminhoz váltakozva D-glükuronsav és D-glükózamin egységek kapcsolódnak. Az építőkövek a megfelelő UDP-cukorról kerülnek a növekvő poliszacharidlánc nemredukáló végére, és megközelítőleg 300 monomeregység beépülése után fejeződik be a szénhidrát lánc elongációja. A glikozilációt egyetlen, kétféle glikozil transzferáz aktivitással (GlcpA-transzferáz és GlcpNAc-transzferáz) rendelkező enzimfehérje katalizálja. A poliszacharid lánc növekedésével párhuzamosan folyik a már megszintetizált lánc modifikációja (3. ábra). A folyamat során először egy N-dezacetiláz/N-szulfotranszferáz enzim hatására az N-acetil csoportok jelentős hányada N-szulfát csoportra cserélődik (3 4), majd a C-5 epimeráz katalizálja a D-glükuronsav L-iduronsavvá történő konverzióját (4 5). Ezt követően az uronsavak -2 (5 6), végül a glükózaminok -6 (6 7), illetve -3 (7 8) pozíciói a megfelelő szulfotranszferáz jelenlétében szulfatálódhatnak. - C 2 H H H H N-deacetiláz/ N-szulfotranszferáz C 2-3 NHAc H 4 H H H NHS 3 - C 5 -epimeráz - C 2 H H H 2--szulfotranszferáz - C H 2 H - NHS 3 - S 3 5 6 H H NHS 3-6--szulfotranszferáz - C 2 H - S 3 H S 3 - NHS 3-3--szulfotranszferáz - C 2 H - S 3 7 8 S 3 - S 3 - NHS 3-3. ábra. A heparin és a heparán-szulfát bioszintézise A fenti bioszintetikus lépések nem mennek végbe minden diszacharid egységen teljes mértékben, amely a heparin nagymértékű heterogenitásához vezet. Az 1. táblázatban látható a heparint felépítő 24 különböző diszacharid egység 8. 9
GlcpA GlcpNS 3 IdopA GlcpNS 3 GlcpA GlcpNS 3-6-S 4 IdopA GlcpNS 3-6-S 4 GlcpA GlcpNS 3-3-S 4 IdopA GlcpNS 3-3-S 4 GlcpA GlcpNS 3-3,6-di-S 4 IdopA GlcpNS 3-3,6-di-S 4 GlcpA-2-S 4 GlcpNAc IdopA-2-S 4 GlcpNAc GlcpA-2-S 4 GlcpNAc-6-S 4 IdopA-2-S 4 GlcpNAc-6-S 4 GlcpA-2-S 4 GlcpNS 3 IdopA-2-S 4 GlcpNS 3 GlcpA-2-S 4 GlcpNS 3-6-S 4 IdopA-2-S 4 GlcpNS 3-6-S 4 GlcpA-2-S 4 GlcpNS 3-3-S 4 IdopA-2-S 4 GlcpNS 3-3-S 4 GlcpA-2-S 4 GlcpNS 3-3,6-di-S 4 IdopA-2-S 4 GlcpNS 3-3,6-di-S 4 GlcpA GlcpNS 3 IdopA GlcpNS 3 GlcpA GlcpNS 3-6-S 4 IdopA GlcpNS 3-6-S 4 1. táblázat. A heparint és a heparán-szulfátot felépítő diszacharid egységek A 24 diszacharidból 576 különféle tetraszacharid jöhet létre, míg poliszacharid szinten a heparinban előforduló szerkezeti variációk száma csillagászati. A bioszintézis fenti tökéletlensége azonban nem véletlen, a bioszintézis során igen jelentős mértékben kontrollált a képződő heparin diverzitása 19,20. Az előbb ismertetett nagymértékű heterogenitás következtében a H/HS poliszacharidokból történő kisebb homogén fragmensek izolálása rendkívül nagy nehézségekkel jár. Ezért a biológiai hatásvizsgálathoz leggyakrabban kémiai szintézissel lehet előállítani a kívánt heparin és heparán-szulfát származékokat. 2.1.2. A heparin és a heparán-szulfát fehérjékkel való kölcsönhatása A heparin véralvadásgátló tulajdonsága miatt 21 az egyik leggyakrabban használt gyógyszer a thromboemboliás betegségek megelőzésében, illetve kezelésében 22. Azonban a H/HS a véralvadásgátlás mellett számos egyéb fiziológiai aktivitással is rendelkezik (pl. antivirális hatás, gyulladásgátló, antimetasztatikus hatás). E folyamatokban a H/HS különböző fehérjékhez kötődik és fontos szerepet játszik azok biológiai aktivitásának kifejtésében és annak szabályozásában. Napjainkig már több mint száz H/HS kötő fehérjét azonosítottak 8,9,23,24. Az egyes fehérjék a H/HS poliszacharidláncok különböző szerkezetű kisebb oligoszacharid egységeihez képesek kötődni, és ez a kölcsönhatás számos esetben rendkívül specifikus. A H/HS a különböző fehérjékhez történő kötődését elsősorban ionos 10
kölcsönhatások jellemzik a H/HS negatív töltésű szulfát és karboxil csoportjai, valamint az aminosavak bázikus csoportjai között 24, de sok esetben jelentős mértékű lehet a hidrogén kötés 25, vagy az, e rendkívül poláros vegyületektől nem várt, apoláros kölcsönhatás 26. Ennek következtében elengedhetetlen a H/HS negatív töltésű funkciós csoportjainak megfelelő orientációja az egyes fehérjék felismeréséhez. A különböző fehérjék kötődéséhez a poliszacharidláncon belül található L-iduronsav egységek konformációs flexibilitása nagyban hozzájárul 27,28. 2.1.2.1. Kölcsönhatás antitrombin III fehérjével A heparin jól ismert véralvadásgátló hatása a poliszacharidnak az antitrombin III (ATIII) fehérjével történő kölcsönhatásának az eredménye. Az ATIII, szerin proteáz inhibitor fehérje, önmagában nem túl hatékony inhibitor, azonban heparin jelenlétében megváltozik a konformációja, ezért az enzimgátlás akár a 2000-szeresére is megnőhet 29. Az ATIII kovalensen kötődik a véralvadási kaszkádban szereplő trombin, és az aktivált Xa faktor aktív centrumához, gátolva ezzel ezeket a fehérjéket. Az antitrombin aktiválásához nem szükséges a heparin molekula egésze. Az ATIIIhoz való kötődésért a poliszacharid egy kisebb pentaszacharid egysége a felelős 30, melynek szerkezetét az 1980-as években határozták meg 5 (4. ábra). A heparin-antitrombin kölcsönhatás nagymértékben specifikus, kis változtatások a pentaszacharid szerkezetében a biológiai aktivitás jelentős megváltozásához, esetenként teljes elvesztéséhez vezetnek 7,31. Az ATIII-kötő pentaszacharid azonosítása gyógyszerkutatási szempontból igen nagy jelentősséggel bírt, mivel ez vezetett a 10 szintetikus pentaszacharid gyógyszerként történő bevezetéséhez Arixtra (Fondaparinux sodium) néven 2001-ben 7 (4. ábra). A 9 pentaszacharid önmagában csak a Xa faktor - ATIII reakciót katalizálja. A trombin inaktiválásához a pentaszacharidot tartalmazó, legalább 16 monomeregységből álló heparin oligoszacharid szükséges, amelyhez egyszerre kötődik az ATIII és a trombin 32. A kialakult hármas komplexben jön létre a kovalens kötés a trombin és az ATIII között. A trombin-antitrombin komplexnek a heparinhoz való kis affinitása miatt, a heparin szabaddá válik és egy következő reakcióban felhasználódhat. 11
H H - S 3 R 2 HN - C 2 H H - S - 3 2 C - NHS 3-3 S H S 3 - H - 3 SHN - S 3 R 1 9 R 1 =H; R 2 =Ac 10 R 1 =Me; R 2 =S 3-4. ábra. Az ATIII-kötő pentaszacharid és az Arixtra szerkezete 2.1.2.2. Prion-fehérjék, a H/HS prion-fehérjékkel való kölcsönhatása Az agyvelő degeneratív elváltozásait okozó fertőző szivacsos agyvelősorvadás (transmisszible spongioform encephalopathy, TSE) számos állatfajban és az emberben is évtizedek óta ismert letális betegség. E neurodegeneratív betegségek az orvosbiológiai kutatások előterébe az 1985-ben kezdődő angliai BSE járvánnyal (bovine spongiform encephalopathy, szivacsos agyhártyagyulladás), majd 10 évvel később a BSE eredetűnek vélt Creutzfeldt-Jakob kór (CJB) emberi életeket követelő betegség terjedésével kerültek. Állatokban egy hasonló betegség, a juhok és a kecskék surlókórja (scrapie) kb. 1730 óta ismert. Az emberi prionbetegségeknek három formája különböztethető meg. A legismertebb forma a klasszikus sporadikus Creutzfeldt-Jakob betegség (CJB), amelyben évente átlagosan 1 millió lakosra számolva 1-2 ember betegszik meg 33. A következő csoport az ún. szerzett formák, amelyeknél ismert a betegség kialakulásának oka. Ide tartozik a "kuru"-betegség mellett az úgynevezett iatrogén (azaz orvosi beavatkozáshoz köthető) CJB. Ilyen eseteket szaruhártya, kemény agyhártya beültetése, idegsebészeti beavatkozás, valamint emberi agyalapi mirigyből készült hormonkészítmények adása után észleltek. Még ezeknél is ritkábbak az örökletes prionbetegségek, amelyek a prion fehérjét kódoló génen bekövetkező mutációk miatt alakulnak ki és családi halmozódást mutatnak, ilyen pl. Gerstmann-Sträussler- Scheinker-kór. A TSE betegségekkel kapcsolatban a legismertebb elmélet szerint, amely Prusiner Nobeldíjas kutató és munkatársai 34 nevéhez köthető, a kórokozó egy kis molekulatömegű (27-35 kda), kb. 250 aminosavból felépülő, határozott térszerkezetű fehérje (prion protein), amely a szervezet minden sejtjében legnagyobb mennyiségben az idegsejtekben folyamatosan termelődik. Néhány órán belül a sejtben lévő fehérjebontó enzimek (proteázok) építőköveire 12
hasítják és egészséges szervezetben a folyamat újraindul 35. Amennyiben a neuronok felszínén található normális celluláris prion protein (PrP c ) amely feltehetően a szinaptikus funkcióban vesz részt kórossá alakul génmutáció vagy a sejtbe kívülről bekerülő kóros, fertőző prion hatására, akkor elindul a kórfolyamat. A kóros priont (scrapie prion protein, PrP sc ), melynek a másodlagos szerkezete eltér a normálisan is jelenlévő prion fehérjétől (PrP c ) (5. ábra), az enzimek (proteázok) képtelenek lebontani, azok a sejtben (a citoplazmatikus vezikulumokban) felhalmozódnak, kicsapódnak és nyomásuk által elpusztítják azt. Továbbá, a kóros prionok képesek átlépni a szomszédos sejtbe is, ahol kórossá konvertálják a folyamatosan termelődő normális prionokat. 5. ábra. A PrP c és PrP sc szerkezete Gyakorlati szempontból további fontos tulajdonsága a kóros prion proteinnek (PrP sc ) a nagyfokú hőállóképessége (133 ºC, 20 perc, 3 atm), a fertőtlenítőszerekkel, formalinnal, dezinficiensekkel, UV sugárzással, ionizáló sugárzással szembeni fokozott ellenállóképessége és rossz oldhatósága (a normál prion protein csak α-hélixekből áll, míg a kóros nagy számban β-redőket is tartalmaz). A fertőző spongiform encephalopathiák nem gyógyíthatók sem az emberben, sem az állatokban. Mivel a szarvasmarhákban jelentkezett prion-betegség (BSE) feltételezhetően az emberre is átterjedhet (CJB), az állatok TSE fertőzése elleni védekezésnek, illetve a későbbiekben esetleges ellenszerek kutatását is megcélzó alapkutatásoknak rendkívüli jelentősége van. Az elmúlt években a különböző neurodegeneratív prionbetegségek (szivacsos agyhártyagyulladás, súrlókór, Creutzfeldt-Jacob-kór, stb.) terápiájának és megelőzésének kutatása során egy új biológiai hatással is összefüggésbe hozták a glikózaminoglikánokat. Kimutatták, hogy a glikózaminoglikánok kölcsönhatásba lépnek a különböző prionfehérjékkel 36, továbbá, hogy a heparán szulfát egyes specifikus szénhidrát szekvenciái szerepet játszhatnak a súrlókór patogenezisében és a prion-fehérjék metabolizmusában 37,38. 13
Erre a β-amiloid plakkok gazdag heparán-szulfát proteoglikán tartalmából is következtettek 36,37,39 Egyes szerzők publikációi szerint szulfatált glikánok variációja (alacsony móltömegű heparin és szuramin 40, valamint pentózán poliszulfát 41 és dextrán szulfát 42 ) csökkenti a kóros prionok (PrP Sc ) akkumulációját a ScN2a sejtekben. Taraboulus és munkatársai 43 kimutatták, hogy a PrP C kölcsönhatásba lép a heparán szulfáttal (HS) közvetlenül a fehérje heparin-kötő doménje által. Kísérleteik alapján a HS specifikus doménjeit mimikálva az anti-prion heparán mimetikumok (HM) rendkívül nagy szerkezeti specificitással tudnak versengeni ezen kölcsönhatásokért. A 6. ábrán látható 11 HM-5004 jelű vegyület megállította továbbá a proteáz-rezisztens PrP Sc képződését, és csökkentette a sejt-sejt infekciót, de nem csökkentette a jelenlévő PrP C mennyiségét. * R R NaCH 2 C R R Na 3 S R R BnHNCH 2 C R R 11 H * n 6. ábra HM-5004 szerkezete Ezen kutatásokhoz kapcsolódóan Leteux és munkatársai 44 kimutatták, hogy a prion fehérje patogén formája (PrP Sc ) által indukált monoklonális antitest kötődik a heparán szulfáthoz és e kötődésért a heparán-szulfát egy specifikus, nem szulfatált tetraszacharid egysége a felelős. A tetraszacharid szekvenciáját meghatározták: UpA-GlcpN-GlcpA- GlcpNAc. A fragmens alternáló uronsav és D-glükózamin egységekből áll, a redukáló végi glükózamin N-acetilezett formában van jelen, míg a közbenső glükózamin szabad aminofunkcióval rendelkezik. Mivel ezt a vegyületet a heparán szulfát heparin liáz III-mal történő parciális depolimerizációjával állították elő, és a szerkezetet tömegspektrometriásan azonosították, az uronsav konfigurációja elveszett. A négy lehetséges izomer szerkezet a 7. ábrán látható. Az irodalom alapján feltételezhetően a terminális uronsav D-glükuronsav és nem L-iduronsav (12, 13). 44 14
H H R 3 R 4 H H H H 2 N H R 1 R 2 H H H H NHAc 12 R 1 = C 2 H, R 2 = H, R 3 = C 2 H, R 4 = H 13 R 1 = H, R 2 = C 2 H, R 3 = C 2 H, R 4 = H 14 R 1 = C 2 H, R 2 = H, R 3 = H, R 4 = C 2 H 15 R 1 = H, R 2 = C 2 H, R 3 = H, R 4 = C 2 H 7. ábra Prion fehérjék kötődéséért felelőssé tehető lehetséges HS konfigurációk 15
2.2. A heparin és heparán-szulfát oligoszacharidok szintézise 2.2.1. Szintézisstratégiák heparin és heparán-szulfát oligoszacharidok előállítására Egy H/HS oligoszacharidokat tartalmazó vegyületkönyvtár igen hasznos eszköznek bizonyulhat a heparin-fehérje kölcsönhatások kutatásában. Segítségével meghatározható a poliszacharidláncon belül, a biológiai aktivitásért felelős minimális molekularészletek (epitópok) szerkezete, mely új szintetikus gyógyszerkészítmények kifejlesztésének lehet az alapja. A heparin szerkezeti komplexitása miatt a természetes poliszacharid kémiai vagy enzimatikus úton történő degradációja rendkívül bonyolult keverékhez vezet, melyből az egyes komponensek szétválasztása igen nagy nehézségekkel jár. Ezért a legtöbb heparin oligoszacharid esetén a kémiai szintézis jelenti az egyetlen előállítási lehetőséget. A H/HS oligoszacharidok kémiai szintézise során, a glikozilezési reakciók sztereoszelektív kivitelezése mellett, a legnagyobb kihívást a megfelelően szulfatált végtermék (szulfoforma) kialakítása jelenti. A következő szempontok figyelembevétele ajánlott az alkalmazott védőcsoportok kiválasztása során 12 : A glikozil donor uronsavegységek, -2 pozícióját résztvevő csoporttal szükséges ellátni, az 1,2-transz interglikozidos kötés kialakítása érdekében. A glükózamin egységek C-2 amino csoportját nem-résztvevő csoporttal kell védeni, illetve nem-résztvevő csoportként kell maszkírózni az 1,2-cisz kötés kialakítása miatt. A végtermékben a szulfatált, illetve nem szulfatált hidroxil csoportokat különböző védőcsoportokkal szükséges megkülönböztetni. A védőcsoportoknak kompatibiliseknek kell lenniük a szintézis során alkalmazott reakciókörülményekkel (pl. gyűrűnyitás, oxidáció, glikozilezés). A védőcsoportok eltávolíthatóak legyenek -szulfát funkció mellől, annak sérülése nélkül. A H/HS oligoszacharidok kémiai szintézisének első megvalósítása Sinaÿ és munkatársai nevéhez fűződik 6,45. Védőcsoportstratégiájuk értelmében a kívánt H/HS oligoszacharidot olyan védett formában állítják elő, amelyben a végtermékben szulfatált hidroxil csoportok acetilezve, míg a végtermékben nem szulfatált hidroxil csoportok benzilezve szerepelnek. E védőcsoportstratégia alapján a 16 antitrombinkötő pentaszacharidnak a 17 védett pentaszacharid feleltethető meg (8. ábra). 16
- S 3 H H - 3 SHN H Bn Bn Ac N 3 Bn C 2 - H C 2 Me Bn - S - 3 2 C - NHS 3-3 S 16 Ac Ac Me 2 C N 3 17 H - 3 S Bn Ac - S 3 H - 3 SHN H Ac Bn ZHN Bn 8. ábra Az első védőcsoportstratégia heparin oligoszacharidok szintézisére A 16 heparin pentaszacharidot Sinaÿ és Petitou különböző uronsav és glükózamin építőegységekből blokk-szintézis segítségével állították elő (9. ábra). A β-glikozidos kötést, 18 és 19 monomerek között oldhatatlan ezüst-karbonát promóter alkalmazásával alakították ki, így a glikozilezés során a donor α-oldalával orientálódik a promóter felületéhez, ennek következtében a nukleofil csak β-oldalról támadhat. Az így kapott 20 diszacharid acetolízisét követően 22 glikozil-bromiddá alakították. A glikozil akceptorként szereplő 26 diszacharid egységet 23 iduronsav-ortoészter donor és 24 akceptor kapcsolásával 2,6-dimetil-piridiniumperklorát jelenlétében, majd a C-4 helyzetben lévő ideiglenes klóracetil (ClAc) csoport eltávolításával (25 26) kapták. A két diszacharid szintézis blokk (22 és 26) kapcsolását követően, a 27 tetraszacharidot deklóracetilezték, az így kapott 28 akceptort a 29 donorral glikozilezve jutottak a 17 védett pentaszacharidhoz. A 17 védett pentaszacharidból az acetil védőcsoportok szelektív eltávolításával, majd kéntrioxid-piridin komplexszel történő -szulfatálással, ezt követően katalitikus hidrogénezéssel, és kemoszelektív N-szulfatálással, végül az észter funkciók lúgos hidrolízisével jutottak a 16 heparinszármazékhoz. A fentivel teljesen analóg módon történt az Arixtra első szintézise 45. 17
ClAc Bn C 2 Me Ac + Bn Br H N 3 18 19 ClAc Bn C 2 Me Bn 20 Ac N 3 ClAc Bn C 2 Me Ac Bn Ac 21 R 1 =Ac; R 2 =H 22 R 1 =H; R 2 =Br N 3 R 2 R 1 Bn Me 2 C tbu AcCl H Bn ZHN Ac 23 24 + Bn Me 2 C R Ac Bn Bn ZHN Bn Ac 25 R=AcCl 26 R=H 22 + 26 Bn Bn R Bn Ac N 3 Bn - S 3 H H - 3 SHN H Ac Bn Bn ZHN Bn Ac Ac Me 2 C C 2 Me N 3 Bn Ac 27 R=AcCl 28 R=H Ac Bn Bn Ac Me 2 C ZHN C 2 Me Bn N 3 Ac Bn Ac 17 - S 3 H - S 3 - H - 2 C C - 3 SHN 2 H - NHS - 3 H - S 3 3 S 16 Bn Bn 29 7 lépés Ac N 3 Br 9. ábra Az első védőcsoportstratégia heparin oligoszacharidok szintézisére A Sinaÿ és munkatársai által kidolgozott szintézisstratégia a későbbiekben általánosan elterjedt, szinte valamennyi heparin oligoszacharid előállítása ennek alapján történt 7,12,35,46,47,48. E szintézisek közös jellemzője, hogy egy védett oligoszacharidból csak egyetlen szulfatált oligoszacharid előállítását teszik lehetővé. E rendkívül munka- és időigényes módszer nyilvánvalóan nem alkalmas olyan esetekben, amikor nem egyetlen, meghatározott szerkezetű heparin oligoszacharid, hanem, mint a heparinkötő fehérjék oligoszacharid ligandumainak megállapításakor, egy H/HS oligoszacharid vegyülettár előállítása a cél. 18
Ilyen szintézisek kidolgozására napjainkig két konvergens szintézisstratégia ismert: a moduláris és az ortogonális szintézisstratégia. Boons és kutatócsoportja 49,50 moduláris szintézisstratégiát dolgoztak ki számos magasabb tagszámú H/HS oligoszacharid előállítására, amely húsz (30a-30t) megfelelően védett diszacharid építőegységből valósítható meg (10. ábra). A húsz diszacharid szintézismodul előállítása hat monomerből (31-36) kiindulva kivitelezhető. A diszacharid szintézis-modulok az -4 pozícióban (9-fluorenilmetoxi)karbonil (Fmoc), az -1 pozícióban allil (All) csoportot tartalmaznak, melyek szelektív eltávolítása révén a lánchosszabbításra nyílik lehetőség. Az -3, -6, és -2 pozíciók, amennyiben a végtermékben szulfatálva vannak levulinoil- (Lev), ellenkező esetben rendre benzil-, tercbutildifenilszilil- (TBDPS), illetve acetil (Ac) csoportként szerepelnek. Állandó védőcsoportként a jól bevált benzil csoportot alkalmazták. A módszer jellemzője, hogy az uronsavak kialakítása (oxidáció) a szintézis utolsó lépésében történik. A szelektív oxidációt katalitikus mennyiségű 2,2,6,6-tetrametil-piperidiniloxi (TEMP) és nátrium-hipoklorit elegyével oldották meg. A nagyszámú építőegység szintézise továbbra is rendkívül munkaigényes, így nem meglepő, hogy a húsz diszacharid szintézis-modulból napjainkig csak hat előállításáról számoltak be, és idáig mindössze néhány, alacsony tagszámú H/HS oligoszacharidot szintetizáltak 49,50. Fmoc Bn H R 2 Bn R 1 R 2 All R 3 N 3 TBDPS All N 3 31 R 2 =Bn 32 R 2 =Lev Fmoc Bn Bn R 3 33 R 3 =Ac 34 R 3 =Lev CCl 3 NH Szulfatált R 1 =Lev R 2 =Lev R 3 =Lev Bn 30a-30t Nem szulfatált R 1 =TBDPS R 2 =Bn R 3 =Ac Bn Fmoc R 3 NH CCl 3 35 R 3 =Ac 36 R 3 =Lev 10. ábra Moduláris védőcsoportstratégia heparin oligoszacharidok szintézisére Az MTA Kémiai Kutatóközpont Szénhidrátkémiai sztályán 51 olyan szintézismódszert dolgoztak ki, melynek segítségével egyetlen védett oligoszacharidból nagyszámú heparin oligoszacharid állítható elő. E szintézisstatégiában olyan védett oligoszacharidokat 19
szintetizáltak, melyek azon pozíciókban, ahol a H/HS szulfát csoportokat tartalmazhat, egymástól függetlenül, szelektíven eltávolítható úgynevezett ortogonális védőcsoportokat tartalmaznak. Az ortogonális védőcsoportok tetszés szerinti sorrendben történő eltávolítását követő szulfatálás révén, lehetőség van egyetlen védett vegyületből, az alapváz valamennyi lehetséges szulfatált formájának az előállítására. A kidolgozott szintézis-terv alapján a védett 37 diszacharid az egymáshoz képest ortogonális (4-metoxi)fenil (MPh), és benzoil (Bz) védőcsoportokat tartalmazza a D- glükózamin egység -6, illetve az L-iduronsav egység -2 pozíciójában (11. ábra). A benzoil csoport szelektív eltávolítását követően a szabaddá vált hidroxil csoportot szulfatálva, majd a további védőcsoportokat eltávolítva, végül kemoszelektív N-acetilezéssel, illetve N- szulfatálással a 38 és 39 diszacharidokhoz jutottak. Bn Bn C 2 tbu Bz 37 Bn ZHN MPh Me H H C 2 - R 1 R 2 H R 3 HN Me 38 R 1 - =S 3 R 2 =H R 3 =Ac 39 R 1 - =S 3 R 2 =H R 3 - =S 3 40 R 1 =H R 2 - =S 3 R 3 =Ac 41 R 1 =H R 2 - =S 3 R 3 - =S 3 42 R 1 - =S 3 R 2 - =S 3 R 3 =Ac 43 R 1 - =S 3 R 2 - =S 3 R 3 - =S 3 44 R 1 =H R 2 =H R 3 =Ac 45 R 1 =H R 2 = H R 3 - =S 3 11. ábra rtogonális védőcsoport-stratégia heparin oligoszacharidok szintézisére Hasonlóképpen, először a (4-metoxi)fenil csoportot eltávolítva a 37 diszacharidból a 40 és 41-6 szulfatált származékokat állították elő. Mindkét ortogonális védőcsoportot eltávolítva, di--szulfatálás után a 42 és 43 diszacharidokat, míg -szulfatálás nélkül a 44 és 45 diszacharidokat szintetizálták. Ezt az ortogonális védőcsoportstratégiát kiterjesztették L- iduronsav tartalmú diszacharid valamennyi lehetséges permutációjának megfelelő 47a-h heparin oligoszacharid szintézisére 52 (12. ábra), valamint a savas és bázikus fibroblaszt növekedési faktorok (FGF-1 és FGF-2) minimális HS triszacharid α-metil-ligandumainak (49, 50) szerkezetére 53 (13. ábra). 20
MPh Bn Bn tbu 2 C ZHN Me Bn Bz 46 Na 2 C H H R 2 H R 1 HN Me R 3 R 1 = Ac vagy S 3 Na 47a-47h R 2 =H vagy S 3 Na R 3 =H vagy S 3 Na 12. ábra rtogonális védőcsoport-stratégia L-iduronsav tartalmú heparin oligoszacharidok szintézisére tbu 2 C Bn Bn Bn Bz MPh tbu 2 C 48 N 3 Bn Bz Me Na 2 C H H H S 3 Na R Na 2 C NH S 3 Na H 49 R=S 3 Na 50 R=H Me S 3 Na 13. ábra A feltételezett FGF-1 és FGF-2 kötő heparin triszacharidok (57 és 58) szintézise Az MTA Kémiai Kutatóközpont Szénhidrátkémiai sztályon kidolgozott benzoil-és 4- metoxifenil ortogonális védőcsoportokat alkalmazó stratégiával párhuzamosan Wei és munkatársai 54 publikálták a terc-butildifenilszilil (TBDPS), levulinoil (Lev), 4-metoxi-benzil (PMB), 2-trimetilszilil-etoximetil (SEM) és acetil (Ac) csoportokat tartalmazó ortogonális védőcsoport-stratégia kidolgozását heparán-szulfát diszacharid ligandumok előállítására. Az ortogonálisan védett diszacharidból öt védett, mono -szulfatált és egy védett, N-szulfatált diszacharid szintézisét közölték 54 (51a-51f, 14. ábra) H Lev - S 3 N 3 SEM 51a CCH 3 Ac Me - 3 S H TBDPS N 3 SEM 51b CCH 3 Ac Me PMB - 3 S TBDPS AcHN SEM 51c CCH 3 Ac Me TBDPS PMB H - 3 SHN SEM 51d CCH 3 Ac Me PMB Lev TBDPS N 3 51e - 3 S CCH 3 H Me PMB Lev TBDPS CCH 3 N 3 H 51f - 3 S Me 14. ábra rtogonális védőcsoport-stratégia HS oligoszacharidok előállítására 21
A módszer jellemzője, hogy az uronsav észter kialakítását diszacharid szinten oldották meg, a megfelelő 52 lakton akceptor 53 tioglikozid donorral történő glikozilezését követő metanolízissel (15. ábra). PMB Lev 53 PMB Lev TBDPS STol N 3 TBDPS N 3 + SEM 54 H CCH 3 Ac 52 Ac Me Me 15. ábra rtogonálisan védett diszacharid szintézise A 2-trimetilszilil-etoximetil (SEM) éter védőcsoport bevitelére ezt követően került sor. Új eredmény, hogy a 54 ortogonálisan védett diszacharidból kiindulva valamennyi lehetséges permutációjának megfelelő HS oligoszacharid előállítható, mindezek ellenére idáig nem publikálták a szabad diszacharid vegyülettár szintézisét. 2.2.2. Szintézisstratégiák GlcpA-GlcpN-GlcpA-GlcpNAc heparán-szulfát oligoszacharidok előállítására A prion fehérjék kötődéséért felelőssé tehető heparán-szulfát ligandum szekvenciájára Leteux és munkatársai nemrégiben tettek javaslatot 44. Az egyik feltételezett, nem szulfatált tetraszacharid (12) alternáló D-glükuronsav és D-glükózamin egységekből áll, a redukáló végi glükózamin N-acetilezett, míg a láncközi glükózamin amino csoportja szubsztituálatlanul található. Célul tűztük ki e nem szulfatált GlcpA-GlcpN-GlcpA-GlcpNAc heparán-szulfát tetraszacharid α-metil-glikozidjának szintézisét, melynek előállítása az eddigiektől eltérő, egyedi szintézisstratégiát kíván. Annak ellenére, hogy az irodalomban ismert néhány olyan HS oligoszacharid kémiai szintézise, melyek mind N-acetilezett, mind N-szulfatált D-glükózamint tartalmaznak 55-56, ilyen módon megkülönböztetett D-glükózamin egységeket tartalmazó tetraszacharidok előállítása napjainkig kihívást jelent. A szintézis legkézenfekvőbb megoldásaként N-acetil-Dglükózamin megfelelő származékát lehetne alkalmazni akceptorként. 22
Ugyanakkor az N-acetil-D-glükózamin 4-es hidroxil-csoportja köztudottan rendkívül gyenge nukleofil glikozilezési reakciókban 57. Kompetíciós kísérletek alapján a 2-azido-2- dezoxi-d-glükóz C-4 pozícióban található hidroxil csoportja tízszer reaktívabbnak mutatkozott a megfelelő N-acetil akceptorhoz képest 58. Továbbá, az N-acetamid oxigénje kompetitív nukleofilként viselkedhet, amely instabil glikozil imidát melléktermékek képződéséhez vezet 59,60. Auzanneau és munkatársai 59 kimutatták a 56 diszacharid akceptor 55 triklóracetimidáttal történő glikozilezésekor, a korábban Lemieux és kutatócsoportja 61 által is feltételezett 57 glikozil imidát képződését (16. ábra). NH Ac Ac Ac 55 CCl 3 + Ac Ac Ac H Ac 56 AcHN Bn Me Ac Ac Ac Bn H Me Ac N CH 3 57 Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Bn Ac Ac AcHN Ac 58 Me 16. ábra Imidát képződés D-GlcpNAc tartalmú akceptor glikozilezésekor A reakcióhőmérséklet és az alkalmazott Lewis-sav mennyiségének növelésével a 57 imidát a termodinamikailag stabilabb 58 triszachariddá történő átrendeződését tapasztalták. Megjegyezzük ugyanakkor, hogy ezen imidátok átrendeződési hajlama nagy mértékben függ a donor szerkezetétől és a reakciókörülményektől. Az említett HS oligoszacharid szintézisét megnehezíti, hogy az N-acetil csoport nem csak a GlcNAc egységen érezteti hatását. Triklóracetimidát donorok alkalmazása esetén az N- acetil csoport irányító hatása folytán teljes reaktivitáscsökkenést tapasztaltak GlcNAc tartalmú diszacharid egység glikozilezésekor 62. A reaktivitási problémákat tovább súlyosbítja, hogy más monoszacharidokhoz képest, D-glükuronsav glikozil donorok csekély reaktivitással bírnak 63. D-Glükuronsav tartalmú donorokkal történő glikozilezés során gyakran alacsony hozammal izolálható a kívánt diszacharid, a képződő melléktermékek (ortoészter, acetilezett akceptor, stb) miatt. Ezért a β-d-glcpa-(1 4)-D-GlcpNAc kötés közvetlen kialakítása rendkívüli kihívást jelent 64. Legjobb tudomásunk szerint egyetlen példa ismert erre az irodalomban: a 17. ábrán látható 61 diszacharid szintézisét oldották meg így 65. 23
Ac Ac Me 2 C NH Ac CCl Ac 3 Ac H Ac + Ac Ac Ac AcHN Ac Me 2 C 59 60 61 Ac AcHN Ac 17. ábra Első sikeres β-d-glcpa-(1 4)-D-GlcpNAc kötés közvetlen kialakítása A GlcNAc tartalmú oligoszacharid szintézisek során általában az N-acetil csoport maszkírozásával kerülik ki a szintézis nehézségeit. Megjegyzendő ugyanakkor, hogy ezen védőcsoportok sikeres alkalmazása mellett, bázisérzékenységük, illetve néhány esetben savra való érzékenységük is, nem csak a hozam csökkenését okozhatja oligoszacharidok szintézise során, de az alkalmazható védőcsoportok számát is redukálja. Munkánkkal 66 párhuzamosan a szabad 12 és 13 tetraszacharidokat anomer keverékként közvetett úton előállították 67. Az -1-ről N-2-re történő acetil transzfer módszerrel oldották meg a szintézist 67, kikerülve ezzel az N-acetil-D-glükózamin okozta reaktivitásproblémát. A 12 és 13 szintetizált tetraszacharidokat neoglikolipid technológia segítségével tesztelték, eredményül a 10E4 antitest egyikhez sem kötődött 67. Ugyanakkor megjegyzendő, hogy ezen szabad redukáló végű tetraszacharidok nem a legmegfelelőbb ligandumok biológiai tesztre aldehid-szerű reaktivitásuk miatt 68. Ezen tetraszacharidok szintézise továbbra is megoldatlan, amennyiben blokkolt redukáló végi HS oligoszacharid előállítása a cél, amely biológiai tesztelésre alkalmasabb ligandumot biztosít. 24
2.3. Új metodikák oligoszacharidok szintézisére 2.3.1. 4,6--Benzilidén acetálok reduktív gyűrűnyitása Az általunk bevezetett ortogonális védőcsoportokkal funkcionalizált oligoszacharidok szintézise során, minél rövidebb szintézisút célszerű, mely jó hozammal szolgáltatja a megfelelő monomer építőegységeket. Az -4 és -6 pozíciók szelektív manipulációjára, azaz glikozilezésre, illetve oxidációra, ciklikus acetálok alkalmazása, és azok regioszelektív gyűrűnyitása kínálja a legjobb megoldást. Két megfelelő térhelyzetű hidroxilcsoport szimultán védelmére aldehidekkel vagy ketonokkal képzett acetálok használhatók. A szénhidrátok körében ciklikus acetálszármazékokat Emil Fischer állított elő először 1895-ben 69. Azóta ezek a vegyületek rendkívül nagy jelentőségre tettek szert. Polihidroxi vegyületekben lehetőség van 5-tagú (1,3- dioxolán) és 6-tagú (1,3-dioxán) gyűrűs ciklikus acetálok képződésére. Termodinamikai kontroll esetén az egyensúly ketonoknál az előbbi, aldehideknél az utóbbi felé van eltolva. Az acetálos szén kiralitása miatt mindig két diasztereomer acetál keletkezhet, de a 6- tagú acetáloknál (1,3-dioxánok) egyensúlyban gyakorlatilag csak a 62b termodinamikailag stabilabb termék, amely a nagy térkitöltésű fenil szubsztituenst ekvatoriális helyzetben tartalmazza, preparálható (18. ábra). R 1 H H R R 62a R R 1 R 62b R R 18. ábra 6-tagú acetálok termodinamikai egyensúlya Dioxolánoknál (5-tagú gyűrű) viszont a két izomer (64a, 64b) kb. 1:1 arányban keletkezik 70 (19. ábra). Me R Me H H 63 Me Me PhCH Me + Me ZnCl 2 R R 64a 64b Ph H H Ph 19. ábra 5-tagú acetálok termodinamikai egyensúlya A ciklikus acetálok általában stabilisak bázikus és semleges közegben, továbbá számos oxidációs és redukciós reakcióban. Eltávolításuk leggyakrabban savas hidrolízissel történik, 25
de a benzil éterekhez hasonlóan hasíthatók enyhe körülmények között katalitikus hidrogénezéssel, valamint oxidatív módszerrel is eltávolíthatók. A ciklikus acetálok között a benzilidén típusú acetálok igen gyakori használatának egyik oka, hogy ezen a vegyülettípuson a többi acetálra jellemző általános tulajdonságok mellett, speciális reakciók is végrehajthatók. A szénhidrátok benzilidén típusú acetáljainak benzil éterekké történő reduktív gyűrűnyitása egy hidroxil csoport egyidejű szabaddá tételével a parciálisan védett származékok egyik legfontosabb előállítása. 2.3.1.1. LiAlH 4 -AlCl 3 reagenssel történő redukció 4,6--Benzilidén-acetálok 4--benzil-éterré történő reduktív gyűrűnyitására gyakran alkalmazott módszer a LiAlH 4 -AlCl 3 os redukció. Ezt először Bhattarcherjee és Gorin 71,72 alkalmazták szénhidrátok acetál- és ortoészter-származékaira, majd Gorin és Finlayson 73 kiterjesztették a reakciót a glükózamin és galaktózamin 4,6--benzilidén származékaira is. A 4,6--benzilidén-hexopiranozidok redukciójánál figyelemre méltó szelektivitást Nánási és Lipták 74 észlelt először. A 65a fenil 2,3-di--benzil-4,6--benzilidén-β-Dglükopiranozid hidrogenolízisekor kizárólag 4--benzil-éter képződését észlelték, ezzel szemben a megfelelő 65c 3--metil- és 65d 2,3-di--metil-származék gyűrűnyitása során a 4--benzil-éter mellett (56%) jelentős mennyiségű 6--benzil-éter is képződött (2. táblázat). Benzilidén-acetál Hozam (%) 4--benzil 6--benzil 65a Ph Bn Bn Ph 89-65b Ph Bn Ph Me 82-65c Ph Me Ph Bn 56 28 65d Ph Me Ph Me 56 32 2. táblázat 26
A szelektivitásban mutatkozó különbséget úgy értelmezték, hogy az -3 nagy térkitöltésű benzil szubsztituense akadályozza a reagens kötődését az -4-en, míg a kis térkitöltésű metilcsoport ilyen hatást nem tud kifejteni. Később kiterjesztették vizsgálataikat mannóz- és galaktóz-származékokra 75, valamint diszacharidokra is 76. Fügedi, Lipták és Nánási 77,78 mélyrehatóbban vizsgálták a 4,6--benzilidénglükopiranozidok LiAlH 4 -AlCl 3 -dal történő reduktív gyűrűnyitás irányának a C-3 szubsztituenstől való függését. A korábbi tapasztalatokkal összhangban megállapították, hogy a 3-as helyzetben lévő szubsztituensek jelentősen befolyásolják a reakció irányát: a kis térkitöltésű szubsztituensek esetén keverék termék, míg nagy térkitöltésűeknél gyakorlatilag csak 4--benzil-éter képződik. A 2,3-di--alkil származékok (66a-d) esetén az alkilcsoportok méretének növekedésével a reakció regioszelektivitása nő (3. táblázat). Ph Benzilidén acetál R 2 R 1 Bn Termékarány Hozam (%) 4--Bn / 6--Bn 3. táblázat 4--benzil 6--benzil 66a R 1 = R 2 = Me 77 : 23 68 14 66b R 1 = R 2 = Et 91 : 9 75 7 66c R 1 = R 2 = Bn 93 : 7 91 4 66d R 1 = Me, R 2 = H 53 : 47 43 41 A szubsztituenseknek a reakció irányára gyakorolt hatása úgy értelmezhető, hogy azok térkitöltésüktől függően különböző mértékben akadályozzák a klór-alán kötődését -4-hez, ezáltal előtérbe kerül az alternatív reakcióút, az -6-on történő komplexképződés, ami 4-benzil-éterek képződéséhez vezet. A benzilidén-acetálok LiAlH 4 -AlCl 3 reagenssel történő gyűrűnyitását széles körben alkalmazzák parciálisan védett szénhidrátok előállítására. Meg kell említeni ugyanakkor, hogy a módszer kemoszelektivitása korlátozott. A használt reagens jellege miatt nem használható bázikus közegben labilis védőcsoportok, így pl. a gyakran használt acilcsoportok mellett. Nem alkalmazható a LiAlH 4 -AlCl 3 reagens az amino-cukrok esetén leggyakrabban használatos N-acetil-, N-ftaloil-, N-benziloxikarbonil-, illetve azidocsoportok, továbbá a dezoxi-cukrok szintéziseiben gyakran használt halogén szubsztituensek mellett sem. 27
2.3.1.2. NaCNBH 3 -HCl reagenssel történő regioszelektív gyűrűnyitás Garegg és munkatársai 79,80,81, Horne és Jordan 82 feniletilidén-acetálokon végzett regioszelektív gyűrűnyitási kísérletei alapján, vezették be a NaCNBH 3 -HCl reagenst szénhidrátok benzilidén acetáljainak reduktív gyűrűnyitására, amely módszer teljes mértékben regioszelektívnek mutatkozott, kizárólag 6--benzil-éter (68, 70) képződését tapasztalták (20.ábra). Ph R R 67 R = Bn 69 R = Bz Me NaCNBH 3 /HCl/THF H R Bn Me R 68 R = Bn : 87% 70 R = Bz : 95% 20. ábra 4,6--Benzilidén acetálok reduktív gyűrűnyitása NaCNBH 3 -HCl reagenssel Ennek a módszernek a regioszelektivitása nem függ a piranóz gyűrű szubsztituenseitől és a reakció kompatibilis acil típusú védőcsoportokkal, továbbá az aminocsoport korábban említett védőcsoportjaival is. Az 1,3-dioxolán gyűrűs benzilidén-acetálok esetében a módszer a LiAlH 4 -AlCl 3 esetén megállapított irányt követi, a reakció regioszelektivitása az acetálos szénatom konfigurációjától függ. Így például a 71 exo-fenil-benzilidén-acetálból kiindulva a NaCNBH 3 és HCl reagenssel történő reakcióban ugyanúgy 72 3--benzil-éterek képződtek, mint a LiAlH 4 -AlCl 3 -os gyűrűnyitás során (21. ábra). Ph H Ph Me NaCNBH 3 /HCl/THF Ph Bn 78 % 71 72 21. ábra 4,6--Benzilidén acetálok reduktív gyűrűnyitása NaCNBH 3 -HCl reagenssel H Me A NaCNBH 3 -HCl reagenssel történő redukció a szénhidrátkémiában használt legtöbb védő- és funkcióscsoport mellett is végrehajtható, ezért ezt a módszert bevezetése óta igen elterjedten alkalmazzák. 2.3.1.3. Borán-amin komplexek és Lewis-savak kombinációjával történő gyűrűnyitás A LiAlH 4 -AlCl 3 reagenssel történő reakciók kemoszelektivitásának növelésére Garegg és munkatársai 81,83 a LiAlH 4 -et borán-trimetil-amin komplexszel helyettesítették. A 4,6-- 28
benzilidén-acetálok borán-trimetil-amin és aluminium-klorid reagenssel végzett redukciója az oldószertől függő regioszelektivitást mutatott. Toluolban végrehajtva a reakciót 4--benzil-éterek (74a, 76a) képződtek közepes hozammal, míg tetrahidrofuránban 6--benzil-éterek (74b, 76b) voltak izolálhatók viszonylag jó termeléssel (22. ábra). A szelektivitásban mutatkozó különbség oka a Lewissav erősebb szolvatációja lehet éter típusú oldószerben. Ph R 73 R= Bn 75 R= Bz R Me BH 3.NMe 3 AlCl 3 toluol THF Bn R H R H Bn R Me R Me 74a R= Bn : 50% 76a R= Bz : 40% 74b R= Bn : 71% 76b R= Bz : 74% 22. ábra 4,6--Benzilidén acetálok gyűrűnyitása BH 3 NMe 3 -AlCl 3 reagenssel A BH 3 NMe 3 -AlCl 3 reagenssel toluolban végzett reduktív gyűrűnyitások jó regioszelektivitással adják a 4--benzil-étereket, azonban a hozamok a reakció során fellépő nagymértékű bomlás miatt általában alacsonyak. A 4--benzil-éterek hozamának növelésére Garegg és Fügedi 84 a redukciót a LiAlH 4 -AlCl 3 -os redukcióknál is használt diklórmetán-éter oldószerelegyben végezte. Ilyen körülmények között esetenként igen jó hozammal képződtek 4--benzil-éterek, így például a 77 diszacharid-acetálból 91%-os hozammal izolálták a 78 étert (23. ábra). Bz Ph Bz SMe BH 3.NMe 3 -AlCl Bz 3 Bn Bz Bz Bz Bz CH 2 Cl 2 -Et 2 Bz Bz 77 91% 78 23. ábra H Bz SMe ikawa és munkatársai 85 hidrid anion donorként borán-dimetil-amin komplexet, Lewissavként bórtrifluorid-éterátot használtak. Két eltérő oldószerben, acetonitrilben és diklórmetánban, vizsgálták D-glükóz- és D-glükózaminszármazékok gyűrűnyitását. Eredményeiket a 4. táblázatban foglaltam össze. Amennyiben a reakciót diklórmetánban hajtották végre és a 3-as helyzetben benzilcsoport volt 4--benzil-éterek (79b, 80b) voltak szelektíven izolálhatók. Ezzel szemben, acetonitrilben végezve a reakciót, a főtermék 6--benzil-éter (80a) volt, 29
amennyiben a 3-as pozícióban benziltől eltérő védőcsoportot alkalmaztak. Ez az eljárás 6-benzil-éterek előállítására kielégítő, 4--benzil-éterek viszont csak 3--benzilezett származékokból izolálhatók ily módon jó hozammal. Ph R 2 R 1 Me BH 3.Me 2 NH BF 3.Et 2 H R 2 Bn R 1 + Me Bn R 2 H R 1 Me ldószer R 2 R 1 Hozam (%) 6--Bn 4--Bn CH 3 CN CH 2 Cl 2 CH 3 CN CH 2 Cl 2 Bn H Bn NHCBn 4. táblázat 79a 30 3 80a 76 34 79b 55 73 80b 15 35 A borán-amin komplexek és Lewis-savak elegyével végzett redukciók, hiányosságaik ellenére, napjainkban szintén az elterjedt reduktív gyűrűnyitási módszerek közé tartoznak. 2.3.1.4. Egyéb gyűrűnyitási módszerek Az elmúlt években számos új, szelektív módszert fejlesztettek ki szénhidrátok 4,6-benzilidén acetáljainak reduktív gyűrűnyitására szilán-származékok és protikus sav vagy Lewis-sav kombinációjával. DeNinno és munkatársai 86 trietilszilán és trifluorecetsav (TFA) reagenssel diklórmetánban szelektíven 6--benzil-4-hidroxi-származékokat (82, 84) izoláltak, mind éter, mind acil típusú védőcsoportok mellett (24. ábra). Ph R R 81 R = Bn 83 R = Bz Me Et 3 SiH, TFA CH 2 Cl 2 H R Bn Me R 82 R = Bn : 81% 84 R = Ac : 98% 24. ábra 4,6--Benzilidén acetálok gyűrűnyitása Et 3 SiH-TFA reagenssel Trietil-szilán (Et 3 SiH) és BF 3.Et 2 87, illetve trifluormetánszulfonsav 88 esetében is hasonló szelektivitás tapasztalható, különböző glükóz-, mannóz- és glükóz-amin származékokon (85, 88 87) (25. ábra). Ugyanakkor Et 3 SiH-PhBCl 2 reagens-kombinációval ellentett regioszelektivitás figyelhető meg: 4--benzil éterek képződése mellett. 30