A biotechnológia alapjai és egyes termékei 1 A BITELÓGIA ALAPJAI É EGYE TERMÉKEI 1. Bevezetés A biotechnológia definiciója Biokémiai, mikrobiológiai és vegyészmérnöki ismeretek integrált alkalmazása mikroorganizmusok, növényi vagy állati szövetek, vagy részeinek technológiai felhasználása hasznos termékek előállítása céljából. Tudományos integrációja az adott területen: Biológiai tudományok: biológia, mikrobiológia, genetika, biokémia, enzimológia és immunológia Mérnöki tudományok: Kémia, Vegyipari Művelettan, Géptan, Méréstechnika, Irányítástechnika. A biotechnológia alkalmazási területei: Gyógyszeripar: + Antibiotikumok és vírus ellenes szerek + Enzimek, aminosavak, vitaminok, peptidek és szteroidok előállítása Élelmiszeripar: + Keményítők, cukrok + Illat és színanyagok + ör- és alkoholos italok előállítása Mezőgazdaság: + Állat- és növényegészségügy + Takarmánykiegészítők + Vitaminok, adalékanyagok + Embriómanipuiláció (génsebészet) Biometallurgia + Biológiai ásványfelhasználás (Meddő kőzetek hasznosítása, amelyek hagyományos módon nem dolgozhatók fel) Fermentáció Definiciója: Mikroorganizmusok optimális körülmények melletti tenyésztése és metabolitok hasznos metabolitok előállítása. Alkalmazása pl.: + zövettenyésztés + Rögzített sejtek, enzimek alkalmazása gyógyszerek stb. előállítására Vegyipar: + Etanol, szerves savak, mosószerek, biopolimerek stb. előállítása. 2. A biokatalizátorok alaptípusai A biokatalizátorok bizonyos fokig úgy kezelhetők mint a szervetlen, vagy szerves ill. fémorganikus katalizátorok. Azonban ez a megközelítés csak a termodinamika szempontjából helytálló, szerkezetükben, működésükben és kezelésükben már rendkívül különbözőek.
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 2 Két nagy csoportjuk különböztethető meg: Izolált katalizátorok, enzimek: Jól definiált, izolált, kristályos fehérjemolekula. A gyakorlatban a tiszta enzim előállítása rendkívül költséges, így tisztított enzimeket alkalmaznak. Alkalmazásánál fontos követelmény a fehérjestruktúra fenntartása. Mikroorganizmusok: Úgynevezett multi-enzim rendszerek Metabolizmus (anyagcsere) Katalízis (bikémiai reakciók sorozatának eredménye) Az ipari jelentőségű mikroorganizmusok típusai: - Baktériumok és aktinomeciták, - Élesztők - Penészek 2.1 Enzimek Definició: Fajlagos, katalitikus aktivitású fehérjék, (fajlagosság szempontjából sokkal specifikusabbak, mint bármely fém ill. elemorganikus katalizátor) Elnevezésük: + zubsztrát alapján pl.: Ureáz, xidáz + Reakció alapján pl.: Alkohol-dehidrogenáz + Triviális név pl.: Pepszin, Tripszin sztályozási rendszerük: 1. xidoreduktázok (e -, p + átvitel reakciói) 2. Transzferázok (csoportátvitel pl.:foszfát) 3. idrolázok (hidrolizist katalizáló enzimek pl.: ureáz) 4. Liázok (kettős kötésre történő addició katalízise) 5. Izomerázok (molekulán belüli átrendezdés) 6. Ligázok (ATP átmenet reakciói) Fajlagosság szerint két nagy csoportot különböztetünk meg: + zubsztrátfajlagosság, amely lehet: 1. soportfajlagosság: kifejezetten egy csoport kezelésére alkalmasak, pl.: lipázok, glicerinészterek bontása (Az észter csoportot alakítja át de a zsirsav szénatomszáma már közömbös): 2 2 R 1 R 2 + 3 2 glicerin + R 1,2,3 R 3 2. Abszolút fajlagosság Kifejezetten egy reakciót katalizál: 2 + 2 Ureáz 2 pontán ( 4 ) 2 3 + 2 + 2 2 4 3. ztereokémiai fajlagosság: ptikai aktivitás biológiai aktivitás
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 3 Az enzim képes megkülönböztetni a R illetve izomereket. Ezen katalizátorok specifitása > 98% R R' 2 Amino-aciláz R R' 2 + R + 2 2 R' D,L-acil-aminosav racém elegy D-acil-aminosav racém elegy L-aminosav Acilezõ sav + atásfajlagosság: sak az adott reakciót katalizálja és csak egy adot anyag keletkezik (tehát abszolút fajlagosság is fennáll): 2 + FAD GD 2 2 + FAD 2 2 2 beta-d-glükóz D-glukonsav D-glukonsav FAD: Flavin-Adenin-Dinukleotid GD: Glükóz-oxidáz pecifitás: ka: Fehérjeszerkezet Primer-zekunder-Tercier-Kvaterner Enzimszerkezetek: + Apoenzim: az önálló fehérjemolekula. + Koenzim: Működéshez szükséges nem fehérje rész. + oloenzim: Enzim-szubsztrát komplex, ez a szerkezet a katalízis kulcsa. 2.2 Az enzimreakciók mechanizmusa és kinetikája A mechanizmus sematikus megközelítése: zár-kulcs elmélet, a reakció az ún. aktív centrumokon játszódik le. P E E E E (E) x E + P Az emzimkatalizis több lépésben játszódik le, általánosan a reakcióegyenlet: Ahol: + E (E) x 1 (E) x 2... (EP)x P + E E enzin (E) x enzim-szubsztrát komplex szubsztrátum P termék
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 4 Az ureáz ezmim működési mechanizmusán bemutatva: + + 2 2 Az enzim az aktív centrumán megköti a reagenseket............. Az eredeti kötések lazulása.............. Új kötések kialakulása 3 3 A reakciók kinetikája: 1913-ban MIAELI METE értelmezték először az enzimreakciók kinetikáját. A reakciók jellemzőit három pontban foglalhatjuk össze: + Az enzimek csak a termodinamikailag lehetséges, szabadenergia csökkenéssel járó reakciókat katalizálnak. + Az enzimek a reakciók egyensúlyi állapotát nem változtatják meg, csak ezen állapot elérését siettetik. + Az enzimek fehérje természete teszi lehetővé a specifikus aktív centrumok kialakulását. Ebből következik a p- és hőmérsékletérzékenység, ill. optimum is. Az általános reakcióegyenlet: k +1 2 + E E P + E k -1 A reakció felírásánál feltételeztük, hogy a második lépés irreverzibilis, továbbá, hogy a teljes enzimkoncentráció állandó: (E t ) = (E) + (E) (1) ahol: (E t ): teljes enzimkoncentráció. (E): szabad állapotban lévő enzimkoncentráció. (E): komplex formájában kötött enzimkoncentráció. Felírható négy differenciálegyenlet: d( P ) = k 2( E ) (2) dt ( E) d dt ( E) d dt = k + 1( E)( ) k 1( E) k2( E) = k + 1( E)( ) ( k 1 + k2 )( E) (3) k + 1( E)( ) + k 1( E) + k2( E) (4) = ( ) = k E)( ) k ( ) (5) d dt + 1( + 1 E Bizonyos egyszerűsítéseket alkalmazunk a megoldáshoz: - elhanyagolható a k -2 - (E) állandósul állapotban van, azaz d(e)/dt=0 - >> E k 2
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 5 a a (3) egyenletbe behelyettesítjük a (1)-t és fenti feltételezések alkalmazzuk: d( E) = 0 = k 1( Et )( ) [ k 1( ) + k 1 + k2 ]( E) (6) + + dt ebből: k + 1 ( Et )( ) ( Et )( ) ( Et )( ) ( E) = = (7) k + 1( ) + k 1 + k2 k + k ( ) + K 1 2 m ( ) + k + 1 Ahol K m az enzim-szubsztrát komplex állandósult állapotú disszociációs konstansa, vagy másnéven Michaelis-Menten állandó. A (2) és a (7) egyenletet kombinálva megkapjuk a sebességre vonatkozó végeredményt: v k ( 2 Et )( ) K + ( ) = (8) m A fenti (8) egyenletet vizsgálva: o Feltételezve, hogy () >> K m esetben a nevezőben K m elhanyagolható így: v = k 2 (E) = v maximális azaz nagy szubsztrátkoncentráció esetén az enzim teljes mennyisége komplexben van, így a reakciósebesség maximális és a rendszer 0-ad rendű kinetikával jellemezhető. A (8) egyenlet ennek megfelelően: vmax( ) v = (9) K ( ) m + o a = K m akkor v = v max / 2 (Ez lehetőséget ad K m numerikus értékének meghatározásához) o a () << K m akkor a (9) egyenlet nevezőjében () elhanyagolható, így: v max v = ( ) = k' ( ) (10) K m A fenti három szempont figyelembevételével elkészíthető az enzimreakciók szubsztrátkoncentrációfüggésének általános alakja: v v max /2 Lineáris tartomány elsőrendű kinetika Telítési tartomány 0-ad rendű kinetika ()=K m ()
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 6 A (2) - (5) egyenletek alapján a rendszerben lévő komponensek koncentrációinak időbeli alakulása: [X] [] [P] [E] [E] 2.3 Enzimmodulációk Enzimmoduláció alatt aktivációs és inhibiciós mechanizmusokat értünk, melyek lehetnek károsak ill. hatékonyak. Általánosan: Modulátorok t Aktivátorok Inhibitorok Kompetitív em kompetitív Az inhibitorok kétféleképpen gátolhatják az enzimműködést: + A kompetitív inhibitorok helyettesítik a szubsztrátumot az aktív centrumon, így inaktiválódik. A molekula alakja kísértetiesen hasonlít a szubsztrátumra, megtéveszti az enzimet. + A nem kompetitív inhibítorok nem az aktív centrumon, hanem a fehérje más részén, vagy annak szerkezetében fejtenek ki roncsoló hatást (a konformációt támadják), így az enzim-jelleg megszűnéséhez vezetnek. Ilyenek pl.: oxidálószerek, nehézfémek (a u, g pl.: a - csoportokat támadja) Egy enzimen bemutatva : zubsztrátum Kompetitív inhibítor Enzimfehérje em kompetitív inhibítor 2.4 Az enzimek gyakorlati felhasználása A megfelelő enzimaktivitás gyakorlati megvalósításához jól definiált és pontosan szintentartott körülmények szükségesek. A legfontosabb hatást az enzimműködésre a hőmérséklet és a p gyakorol: o A hőmérséklet hatása: optimumot kell keresni az aktivitás és a reakciósebesség között:
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 7 reakciósebesség aktivitás Magas hőmérsékleten a molekularezgések dezaktiválódás megváltoztatják a konformációt, megszűnik az enzim-jelleg, alacsony hőmérsékleten pedig alacsony a reakciósebesség: T [K] ( E = A k A exp ). RT o A p hatása Lehetnek savas ill. bázikus résztvevői a reakciónak (pl.: aminosavak különböző oldallánccal) Az aktív centrum töltése miatt lehet érzékeny, a fehérjemolekula pl.: a - hidak miatt. A p-ban már egy egységnyi változás is megölheti a biokatalizátort. A legtöb enzim semleges p-n működik optimálisan, bár vannak extrém kivételek pl.: pepszin a gyomorban aktivitás 1 ~7 14 p 2.5 Enzimrögzítés Rögzítés: fizikai elhatárolás él: - A vízoldható enzim elválasztható legyen a terméktől - A biokatalitikus hatás megmaradjon + Térben: Magában a bioreaktorban + Időben: Minél tovább tartsa az aktivitását Megoldás: Az enzimeket valamilyen módon rögzíteni kell. Ezek néhány alternatívája: + Keresztkötések létrehozása az enzimmolekulák között (polimerizáció): pl: Glutáraldehid hálóra felfűzni az enzimeket: Biomassza (enzim) + Glutáraldehid! Formázás! zárítás: Enzimet tartalmazó töltetet lehet előállítani. A módszer hátránya: nehéz a konformáció megtartása + Kovalens kötés szilárd szemcséhez (szilikát, ioncserélő gyanta vagy molekulaszűrő) rögzíteni, ez már gyakrabban alkalmazott megoldás. + Adszorpciós technika: a fehérjén található poláris csoportok jelenlétének kihasználása. Leginkább időbeni stabilitást ad. + Ionos kölcsönhatás a hordozó és az enzim között
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 8 + Gélbezárás: az enzimet gélgyöngyökbe zárják. Ez bizonyos körülmények között folyadékként ill. szilárd anyagként jelenik meg. Előnye: könnyű szeparálni. + zemipermiábilis hártya mögé történő elzárás: Az enzim nem, de a termék és a szubsztrát átfér a hártyán. sak térbeli stabilitást ad. A rögzítés előnyei: - Folyamatos üzemű bioreaktorokat tudnak üzemeltetni - ő a fehérje stabilitása - osszabb élettartam A rögzítés hátrányai: - Diffúziós gátlás lép fel, az enzim és a szubsztrátum nehezebben mozog. ebességmeghatározó lehet! - Drága, nagy költségnövekedés - Aktivitás csökkenésével kell számolni az eredeti enzimtömeghez képest: Aktív centrum ordozó ordozó E Inaktiválódás 3. Mikroorganizmusok alkalmazása vagy E Az aktiv centrum leárnyékolása A fermentációs techniak során a mikroorganizmusok segítségével állítunk elő számunkra fontos anyagokat. Ezekben a reakciókban leggyakrabban gombák és baktériumok vesznek részt. A mikroorganizmusok növekedési rátájának lehetséges típusai: 1. Batch-fermentáció (szakaszos fermentáció): Ez a fermentációtípus képezi az összes ma alkalmazott technika alapját, így a mennyiségi összefüggéseket ez alapján mutatjuk be A paraméterek többségére nézve zárt rendszer. Lépései: + A sterilezett tápoldat beoltása mikrobatenyészettel, optimális fiziológiai körülmények között + Levegő adaolása + Egyéb szükséges anyagok pl.: habzásgátlók, sav-lúg adagolása + ptimális körülmények további fenntartása A mikroorganzmusok növekedési rátája: x 10 8 10 4 D E F A B t
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 9 ahol: x sejtszám A lag periódus, a beoltás után az új környezethez történő alkalmazkodás B Gyors növekedési szakasz Állandó növekedési, vagy logaritmukis szakasz (log-fázis) D Lassú növekedési szakasz E Állandósult állapot, (szaporodás = pusztulás) F Elhalási szakasz t idő A szakasz elérésével a sejtek adaptálódtak az új körülményekhez. A növekedés, ami a sejttömeg megtöbszöröződését jelenti, az élesztőknél és a baktériumoknál a sejtek számának a generációs idő alatti megkétszereződésével, a gombáknál pedig a biomassza időegység alatti megkétszereződésével fejezhető ki. a a mikroorganizmusok számát logaritmikus skálán ábrázoljuk akkor ez közel egyenesnek tekinthető, innen ered a logaritmikus szakasz (log-fázis) elnevezés. a µ x a specifikus növekedési sebesség, t az idő és x a sejtszám akkor: dx = µ x X (11) dt asonlóan a Michaelis-Menten kinetikához: µ x µ max és ( ) µ = µ (12) max K ( ) s + ahol: K s : telítési állandó agyszámban elterjedt technika, a feed-batch fermentációval azonban kicsit csökkent a jelentősége. 2. Feed-batch (rátáplálásos) fermentáció A paraméterekre névze félig-nyitott rendszer + Kezdetben nem az összes mikroorganizmust tápláljuk be, hanem szakaszosan rátáplálunk + A paraméterek követik a tápanyagtartalmat 3. Folyamatos fermentáció Folyamatos tápoldat bevezetés, és termékelvétel A paraméterekre nézve nyilt rendszer Megvalósítása: + Kemosztátban. + Turbidosztátban. + Plug-flow reaktorban.
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 10 4. Bioreaktorok lyan tartályok, amelyekben a kiindulási anyagokat biológiailag alakítjuk át megfelelő termékekké, mikrobákat, állati-, növényi, vagy emberi sejteket ill. enzimeket alkalmazva. A nagy produktivitás feltétele: + Megfelelő energiabevitel + ptimális reakciókörülmények, p, T, p, c oxigén + terilitás, eredmény: bonyolult szerelvényezés Többfázisú rendszerek sztályozásuk az oxigén, mint szubsztrát bevitele szempontjából: + Aerob reaktorok, amelyeke négy nagy csoportba sorolhatóak: - Gázelosztás beépített mozgó alkatrészekkel: levegőelvezetés levegőbevezetés 1. Turbina keverőmű 2. Vezetőcsöves keverő 3. Önfelszívó keverő - Gázelosztás szivattyúkkal: levegőbevezetés 4. Buborékoszlop kényszerkörforgással 5. ajtósugárhurok 6. zabad sugaras szellőztető
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 11 - Gázelosztás a gáz előnyomásával: levegőbevezetés 7. buborékoszlop 8. Mammut-hurok reaktor 9. Airlift reaktor - Folyamatos gázfázis biztosítása: 8. Permetező hártyás reaktor + Anaerob reaktorok peciális többfázisú reaktorok: ezekben a szilárd fázis makroméretben van jelen. Másszóval, reaktorok rögzített biokatalizátorokkal. Ezel lehetnek: kevert tank, töltött oszlop, fluidizációs oszlop, membránszeparátorral kombinált reaktor. A bioreaktorok leggyakoribb alkatrészei és segédberendezései: + Reaktortartály, és annak állványzata + űtő ill. fűtőszerelvények + Levegőztető rendszer + terilező rendszer + Keverőrendszer + zabályozó és vezérlőredszer + Mikroorganizmusok előkészítő és adagoló rendszere + Termékelvételi rendszer A bioreaktorok szerelvényi rendkivüli pontosságot követelnek a megfelelő reakciókörülmények és a sterilitás fenntartása érdekében.
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 12 5. Ipari mikrobiológiai műveletek kivitelezése A mikrobiológiai iparok termékeinek előállítása, történjen az enzimek vagy mikroorganizmusok segítségével, a következő részlépések sororzatából áll: 1. ltótenyészet készítése: 2. Tápoldat készítése 3. terilezés 4. Fermentáció levezetése 5. Termékek elkülönítése 6. Termékek további feldolgozása 5.1 ltótenéyszet készítése Fokozatos méretnöveléssel érik el az üzemi fermentor legjobb kapacitásához szükséges mikroorganizmus mennyiséget. A külön tenyésztést sok esetben indokolja, hogy mikroorganizmusok megfelelő növekedéséhez más körülmények kellenek, mint amelyen a kívánt biokémiai reakció lejátszódik. Egy fermentációs folyamat lépései az oltótenyészet utja szerint: űrített levegő Kémcső tenyészet (10 ml) 5.2 Tápoldat készítése Rázott lombikos tenyészet (100 ml) Labor fermentoros tenyészet (10 l) Inokulum fermentoros tenyészet (2-3 m 3 ) Üzemi fermentor (50-150 m 3 ) A tápoldat készítése az alapanyagok előkészítéséből, oldásából, szükség szerint az oldat tisztításából és sterilezéséből, majd a fermentáció szempontjából kedvező paraméterek (koncentráció, p, hőmérséklet) beállításából áll. 5.3 terilezés terilezésre elvileg minden olyan behatás alkalmas, ami a mikrooragnizmusok pusztulását okozza, vagy távoltartja azokat. A sterilezési módszer kiválasztásánál figyelembe kell venni, hogy a művelet után nem maradjon vissza olyan tényező, amely a hasznos mikroorganizmusokra káros hatással lenne, vagy elpusztítja azokat ill. a reaktor berendezéseibe kár tesz. Leggyakrabban alkalmazott sterilezési módok: + Az élő szervezetek elpusztítása, inaktiválása vegyszerrel, besugárzással, hőkezeléssel + A sejtszerkezet szétroncsolása erős oxidálószerekkel + Minden élő szervezet eltávolítása fizikai módszerekkel A folyamat lefutását az elhalási görbe jelzi: Elsőrendő kinetika:
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 13 d dt 0 t = k = k( ) ln = kt 0 ahol :k - specifikus elölési állandó, t - idő 0 kiindulási sejtszám, t - aktuális sejtszám Tápoldatok sterilezése + Besugárzással (UV, X-ray, γ) bár ezeknek ipari jelentősége csekély + Kémiai eljárások + sírák mechanikus eltávolítása + Gőzsterilezés: Vegetatív sejtek és spórák pusztítása zakaszos sterilezés + Minden egyes berendezést külön ki kell sterilezni, hátrány: rendkívüli idői- és energiaigény + terilezőszer: 1,5-3bar nyomású gőz Folyamatos sterilezés + A szakaszos sterilezés hátrányit kiküszöbölik + terilezőszer: szintén gőzbefúvatás + átránya lehet: A nagy hőmérsékletkülönbség miatt sók csapódhatnak ki. A fermentációs levegőáram sterilezése A mikroorganimusokra a legnagyobb veszélyt a levegővel bekerülő szennyeződések jelentik, ezért ennek sterilitására különösen kell figyelni. Meoldások: + zűrés, besugárzás, hőkezelés + Régebben mélyszűrők (üveggyapot) + Ma: üvegszálbetétes szűrőpatronok + Mai napig megoldatlan a bakteriofágok eltávolítása Fermentációs laboratóriumok sterilezése Fertőtlenítőszerek alkalmazása (70%-os etil-alkohol oldat, formaldehid, 3%-os formalin, klórmész ) folyamatos légszűrés mellett Reaktortartozékok sterilezése: Túltelített gőzzel 5.4 A fermentáció levezetése és termékelválasztás (biotechnológiai feldolgozás) A megfelelően előkészített bioeaktorban a sejtek működéséhez optimális körülmények fenntartásával vezetik le a fermentációt. A fermentáció levezetése után a kapott biomasszát fel kell dolgozni, attól a célterméket el kell különíteni. Biotechnológiai feldolgozáson azokat a folyamatokat, eljárásokat, lépéseket értjük, amelyek a fermentációs oldatból a céltermékhez vezetnek. A biokémiai reakciók után a fermentációs közeg feldolgozásának módja attól függ, hogy a
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 14 végtermék a mikroorganizmuson kívüli folyadékfázisban található (extracellulárisan), vagy a hatóanyagot a mikroorganizmus test tartalmazza (intracellulárisan). Extracelluláris eset Intracelluláris eset - Antibiotikumok - Vitaminok (B 12 ) - Enzimek - zteroidok - Poliszacharidok - Élesztő - Aminosavak - Proteinek génsebészeti úton előállított baktériumokkal Az utóbbi esetben a sejtet fel kell tárni, hogy a hatóanyag át tudjon oldódni a folyadékfázisba, majd a felszabadított hatóanyagot meg kell kötni egy alkalmas adszorbensen. A fermentációs közegben több olyan melléktermék (sejtmaradványok, anyagcsere melléktermékek stb.) található, amely a hatóanyaggal párhuzamosan megkötődik az adszorbens felületén csökkentve ezzel annak adszorpciós kapacitását. Ezért szükséges az adszorbens regenerálása, amelynek során olyan anyagot vagy elegyet alkalmaznak, amely szelektíven deszorbeálja a felületről az aktív hatóanyagot és a különböző szennyeződéseket. A bioszeparációs műveletek során tehát az első lépés -ha a hatóanyagot a mikroorganizmus tartalmazza- a sejt feltárása. A sejtek mechanikai szilárdságát a protein, lipopoliszacharid polimer és peptidoglycan rétegek biztosítják, a feltárás tulajdonképpen ezen rétegek roncsolását jelenti, amely történhet fizikai, kémiai-biológiai úton. Fizikai sejtfeltárási módszerek Termikus kezelés során a fermentációs közeget hirtelen hőmérsékletváltozásnak vetik alá, amely során a cellák belső nyomása ugrásszerűen megnövekszik, és a sejtfal szétreped, fontos azonban, hogy ezen műveletek során az előállított hatóanyag nem szenvedhet kémiai átalakulást. yomásnövekedést előidézhetünk még ozmotikus folyamatokkal is, a sejtet tiszta vízbe helyezve fellép az ozmózisnyomás és ez eredményezi a sejtfal repedését. Mechanikai módszerek közül legelterjedtebb a nagynyomású (600-800bar) folyadéksugár alkalmazása, melynek során a sejteket tartalmazó folyadékot nagy sebességgel sikfelületre lövik és a hirtelen ütközés okozza a sejtfal széttörését. A legmodernebb feltáró módszerek közé tartozik a sejtfal ultrahangos roncsolása. Kémiai, biológiai módszerek A szervetlen lúgok heves reakciója során olyan átalakulások mennek végbe, amelyek lehetővé teszik az aktív hatóanyag kioldódását, azonban ügyelni kell arra, hogy a lúg a céltermékkel ne lépjen reakcióba. A hidrolízis történhet savakkal is, azonban itt nagyobb a hatóanyag roncsolódásának veszélye. Kíméletesebb feltárási módszer a detergensek alkalmazása. A felületaktív anyagok amfipatikus molekulái a ardy-arkins elvnek megfelelően mind a vízzel, mind a lipidekkel kölcsönhatásba lépnek és ezáltal oldhatóvá teszik azt. A sejtfalat szerves oldószerekkel is feltárhatjuk, bizonyos oldószerek kioldják a sejtfal lipid tartalmát, duzzasztják a sejtfalat, amely ennek hatására felrepedezik. A leghatékonyabb és legszelektívebb módszer azonban az enzimes feltárás, azonban az enzimek ára miatt csak kritikusabb esetekben alkalmazzák.
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 15 Izolálás, dúsítás Extracelluláris hatóanyagtartalom esetén a sejtek és egyéb szennyeződések, roncsolás után pedig a sejtmaradványok szeparációjára szűrési, centrifugálási műveleteket alkalmaznak. A szűrést 1-2µm sejtméret alatt alkalmazzák, felette a centrifugálás gazdaságosabb. Az izolálás és termékdúsítás legfontosabb műveletei: ultraszűrés, mikroszűrés, lecsapás, adszorpció fluid rétegen, folyadék-folyadék-szilárd extrakció, bepárlás és kristályosítás. Ezen műveletek közül a leglényegesebbek az adszorpció jelenségén alapuló kromastográfiás eljárások (adszorpciós-, gél-, affinitási-, királis kromatográfia), amely nemcsak az izolálás de a terméktisztítás műveletében is kitűnik. Tisztítási műveletek közül nagy jelentősége van az elektroforézis, a dialízis és az elektrodialízis módszerének is. A kromatográfiás műveletek során a szétválasztandó komponensek egy álló és egy mozgó fázis között oszlanak meg. Az elektroforézis során elektromos térben választják külön a folyadék elektromosan töltött részecskéket. Dialízis során olyan anyagokat választanak szét egymástól vagy kolloidoktól egy szemipermiábilis hártya segítségével, amelyek molekulasúlya jelentősen eltér egymástól. A dialízis a két oldott anyag relatív diffúziós sebességétől függ és ezért legelőnyösebben akkor alkalmazható, ha a kis molekulasúlyú oldott anyagot nagy molekulasúlyú anyagtól kívánnak elválasztani. Tökéletes elkülönítés csak akkor lehetséges, ha ez utóbbi anyagok molekulái túl nagyok ahhoz, hogy a membrán pórusain áthatoljanak. Az elektrodializist a vízben disszociált molekulák elválasztására alkalmazzák elektromos térben, de a szeparáció során membrán közbeiktatása is gyakori. 6. A biotechnológiai ipar végtermékei 6.1 A fermentációs technológiák főbb termékcsoportjai Alkoholok (etanol, butanol, glicerin, alkoholos oldatok sör, ). zerves savak (Ecetsav, citromsav, glukonsav, tejsav, ). Aminosavak (Glu, Lys, Arg, Try, ). Enzimek (Amilázok, katalázok, ). Vitaminok (B x, β-karotin). Antibiotikumok (penicillinek). zteroidok (fogamzásgátló intermedierek). Poliszacharidok. 6.2 zeszgyártás Etanol: szintelen, kellemes illatú, égető ízű, gyúlékony folyadék. Vízzel és a legtöbb szerves oldószerrel korlátlanul elegyeik. Gőze a levegővel robbanóelegyet képez. A szesztermelés (etanoltermelés) 2/3 részét világviszonylatban fermentációval végzik. Felhasználása: Élvezeti cikk, technikai etanol, energiaforrás Ipari etanolforrások: + Burgonya, elsősorban ipari szesz előállítására, + hulladék gyümölcs, főként pálinkafélék készítésére, + gabona, főként whisky és vodka előállítása.
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 16 1 tonna burgonyából átlagosan 83liter, rozsból és tengeriből 300, melaszból 250 és barackból 45 liter ~95%-os szesz állítható elő. zeszes erjedés: + Az élesztők a cukrokat anearob körülmények között úgy erjesztik, hogy termékként etanol és szén-dioxid keletkezik. A bruttó reakció: 6 12 6 = 2 2 5 + 2 2 + Az alkalmazott mikroorganizmusok: " örélesztő (accharomysec cerevisiae) szesz és sörgyártás " Borélesztő (accharomyces ellipsoideus) borászat + A szeszes erjedés során kis mennyiségben mindig keletkeznek melléktermékek: glicerin, aldehidek, savak (tejsav, borostyánkősav), észreke és nagyobb szénatomszámú alkoholok (butil- és amilalkohol). Az erjesztéses szeszgyártás műveletei: a 2+ (Az enzim működéséhez szükséges) Tápoldat készítés Felmelegítés 100-140 sterilezés céljából α-amiláz, vagy elfolyósító enzim Bevitel: csíráztatott árpa yomáscsökkentés, hűtés Elfolyósítás 60-80 Elcukrosítás Levegőn tenyésztett aerob előkultúra Anaerob fermentáció 30-35, p=4,5-5,5 24-48óra, 48-72óra (nyersanyagtól függően) zeparáció, sejtek elválasztása a fermentlétől ejtanyag Desztilláció Etanol + Tápoldat előkészítés (cefrézés): Attól függ, hogy erjeszthető cukrokat használnak, vagy keményítőt tartalmazó nyersanyagot. " Erjeszthető cukrok esetén, olyan tápoldatot kell készíteni, melyben a cukor koncentrációja nem haladja meg a 14-18%-ot. " Keményítő tartalmazó termények esetén több műveletet kell alkalmazni. A keméynítőt nem izolálják, hanem megfelelő előkészítés után egyeben használják fel tápoldat készítésre. Előnye, hogy olcsó, és a terménnyel hasznos plussz anyagok is jutnak a tápoldatba.
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 17 + Elfolyósítás, cukrosítás: efrefőzőkádakban, vagy közvetlenül az erjesztőkádakban végzik. Az enzimkatalizált (α-amiláz) művelet kb. 40-50 percet vesz igénybe 60-65 -on játszódik le és eredményeként a keményítő 75-80%-a bomlik le maltózzá, 20-25%-a pedig dextrinekké. Minthogy az enzimek a fermentáció során is aktívak maradnak, a dektrinek tovább bomlanak maltózzá, (a cefre hőfoka ezért nem mehet 70 fölé). A cukrosítás után a fermentáció hőmérsékletére hűtik a rendszert. + Fermentáció: " A művelet a mikroorganizmusok szempontjából három részből áll: szaporodás, etanoltermelés és utószakasz. " Egyaránt ismeretes a szakaszos és a folyamatos erjesztés. - zakaszos erjesztésnél, hasonlóan a többi fermentációs technikához oltótörzset készítenek, majd ezzel oltják be a termelő fermentort: oltótörzs injektálás cefre bevezetés gázelvezetés gázelvezetés Inukulum fermentor Termelő fermentor termék elvezetés Kritikus alkoholtolerancia: A bacik sem szeretika sok alkoholt elven, folyamatosan ellenőrizni kell a főfermentor alkoholtartalmát. 5v/v%-nál leáll a mikrobák szaporodása, 10v/v%-nál puszutlás ami a termelés leállását eredméyenzi. - Folyamatos erjesztés esetén a cefrét átvágják : Amikor a cefre főerjedésben van, akkor bizonyos mennyiségét egy következő fermentorba vezetik, és ezzel indítják meg az újabb adag cefre erjedését, egyidejűleg az első kádat pedig friss tápoldattal töltik fel. árom reaktor alkalmazásával a megvalósítható a folyamatos üzem, melyel időt és oltóanyagot takarítanak meg.
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 18 + Desztilláció ( szeszfőzés ): Két lépésben végzik: fermentlé 1. fokozat nyersszesz 2. fokozat elő- és utópárlat finomszesz szeszmoslék kozmaolaj Az elő és utópárlatot denaturált szesz készítésére, a kozmaolajat oldószerként értékesítik vagy észterelőállítás alapanyagaként hasznosítják. + A vizes etanol desztillációjakor max. 95,5 m/m%-os alkohol állítható elő. További töményítés csak kombnált műveletek segítségével lehet. 6.5 örgyártás A sör a maláta cukrosított vizes kivonatának szeszes erjesztésével készült, komlóval ízesített, kis alkoholtartalmú és viszonylag nagy szárazanyagtartlmú, szénsavdús ital. Leggyakoribb összetevői: + 1,5 6 % Etil-alkohol + 0,25 0,4 % aldott szén-dioxid + 3 10 % nem illó extrakt anyag (dextrinek, sók, cukrok, aminosavak, polipeptidek, fehérjék, szinező és zamatanagok) Jelentős a tápértéke, 1liter átlagos minőségű sör megfelel : + 150g kenyérnek szénhidráttartalmat tekintve. + 120g tejnek, + 25g húsnak nitrogéntartalmat tekintve. Gyártásának menete vázlatosan: Maláta készítése sörárpából Őrlés ukrosítás Víz zűrés Főzés Erjesztés Érlelés Komló nyers sörlé (ászokolás) Palackozás
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 19 + Malátagyártás: A csíráztatást megelőzően a sörárpát áztatókádakban 10-12 hőmérsékleten vízben 2-3 napig áztatják, többszöri vízcsere (levegőztetés) mellett. A szemek 44-46% vizet vesznek fel, kiázik a kellemetlen izt adó csersavak nagyrésze és megindul a magok élettevékenysége. A következő fázis a csíráztatás: 5-30 közötti hőmérsékleten a magok kicsíráznak és olyan enzimek keletkezése indul meg, melyeknek hatására a keményítőt tartalmazó sejtek közötti vázanyagok feloldódnak, megindul a tartalék tápanyagok lebontása és a sejtlégzés. A keletkező enzimek közül " Az amilázok (cukrosítás), " peptidázok és proteázok (fehérjehidrolízis) a legfontosabbak. A világossör gyártásnál a csíráztatás általában 6-8 napig tart, ügyelni kell a enzimek keletkezésére, ugyanakkor arra is, hogy a szénhidráttartalom ne csökkenjen jelentősen (a szeszmalátánál csak az enzimtartalom a fontos!). A malátaaszalás a következő lépés, melyben a kicsirázott gabonát 40-45 -on szárítják, majd majd magasab hőmérsékleten aszalják. Eközben enimatikus folyamatok lévén íz és színezőanyagok keletkeznek. Az aszalt malátáról a megszáradt csírát forgó dobokban letördelik, szitálással eltávolítják, majd nagy tápértáke miatt takarmányozási céloka használják. + ukrosítás vagy cefrézés: A megőrölt sörmalátát vízzel keverik és a kívánt enzimes folyamatok számára kedvező körülmények biztosításával, a malátában lévő keményítőt maltózzá és dextrinekké, a fehérjék egy részét pedig aminosavakká és polipeptidekké alakítják. A többi műveletet már a főzőház -ban végzik: cefrézőüst páraelvezető kürtő szűrőkád gőz melegvíz sörmaláta............ törköly megszűrt cefere gőz komlófőző üst cefrézőkád A cefrézőkádban vízzel elkeverik a sörmalátát, azután a cefre egy részét a cefrézőüstbe szivattyúzzák, felforralják, majd visszavezetik a törzscefréhez, és ezzel annak hőmérsékletét 50 -ra emelik. A cefrét ezen a hőmérsékleten pihentetik (~1óra), majd a műveletet még kétszer ismétlik. Ily módon a cefre hőmérséklete a 2. lépcsőben 60-65 -ra emelkedik,a 3. lépcsőben 70-75 -ra. A cefrézés után a
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 20 törkölyt a szűrőkádban leválasztják, majd takarmányozásra feldolgozzák. A komlófőzéshez a szűrőből a szürletet a főzőüstbe vezetik, majd átlagosan 1hl sörre számolva 0,1-0,17kg komlót adnak hozzá, ezután felfőzik. A főzés után kapjuk a sörlét. + Erjesztés: A lehűtött és megzűrt lét a sörgyárak saját kultúrélesztőiket használják, melyek alkalmazkodtak a sörgyártás sajátos körülményeihez. Az erjesztés alacsonyabb hőfokon, lassan, gyakran nyitott kádakban végzik. A gyakran betonból készült kádakat paraffinszurok védőréteggel vonják be, azonban alkalmaznak aluminium, vas és zománcozott kádakat is. + Érlelés: Az erjesztésből kikerült sör (fickó) kellemetlen ízű, zavaros folyadék, ezér hordókban nyomás alatt 1-2 hónapon át, 0-3 hőmérsékleten érlelik. Ilyen körülméynek között lassú utóerjedés játszódik le, a sör kitisztul, kialakul végső állaga és telítődik szén-dioxiddal. A kész sör nyomás alatt szűrik majd palackozzák. 6.6 iromsavgyártás Általában a trikarbonsavak, így a citromsav is jó hozammal állíthatók elő fermentációs úton Az alábbi törzsek viszonylag kevés melléktermékkel állítják elő a citromsavat: + Aspergillus niger + Aspergillus wentii Az éves citromsavtermelés ~350 000 t Felhsználása: + Élelmiszeripar (ízesítő, konzerválószer) + Gyógyszeripar (Fe-citrát, vasbevitelre) + Vegyipar (abzásgátló, lágyító anyag, detergensek előállítása P 3-4 helyett.) Előállítása: + Tápoldatok: Burgonykeményítő, glükózszirup, szacharóz szirup + Termelőeljárások: " Felületi eljárás, amely lehet szilárd, vagy folyadék táptalajos. Lényege, hogy a táptalaj tálcákon van elhelyezve a reaktorba, növelve ezzel a folyadék-gáz fázisérintkeztetést. A spóraszaporítás kb. 12-14 nap, fermentációs időtartam: 8-12 nap, aktivizálásuk előfermentorban történik. Az eljárás előnye: kevésbé energiaigényes ezáltal olcsóbb, egyszerűbb technikai megoldások szükségesek. átránya: maximum 60m 3 lehet a térfogat. " zubmerz eljárás, amely a hagyományos fermentációs technikán alapul, a mikroorganizmusok kevert bioreaktorban dolgoznak. Átlagos reaktortérfogat 120-200m 3, amely lehet kevert fermentor vagy air lift reaktor.
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 21 6.7 Gyógyszerek Vitaminok és előállításuk A vitaminok olyan szerves vegyületek, melyeket általában az emberi szervezet nem tud előállítani (szintetizálni), energiát nem szolgáltatnak, de az anyag- és energiaforgalom lebonyolításában kis mennyiségben is nélkülözhetetlenek. soportosításuk: + ldhatóság: zsíroldható, vízoldható + Biokémiai szerep + Kémiai szerkezet A legfntosabb ismert vitaminok: Zsírban oldódóak: A, D, E és K Vízben oldódóak: B 1 -(tiamin), B 2 -(ribofalvin), B 3 -(pantoténsav), B 5 -(nikorinsavamid), B 6 - (piridoxin), B 7 -(biotin), B 10 -(folsav), B 12 -(cianokobalaminok), B 15 -(pangaminsav), -(aszkorbinsav), P-(citrin) és U-(-metil-metionin) A vitaminok előállítására szintetikus és biotechnológiai eljárásokat (legtöbbször ezek kombinációit) dolgoztak ki. Manapság a korszerű génsebészeti eljárásokkal olyan mikroorganizmusok állíthatók elő, melyek már nagyobb mennyiségben és jobb kihozatallal termelnek mint őseik. éhány vitamin előállítása: + B 1 -vitamin szintézise: 2 3 + 2 -Et 3 2 2 Pd 3 2 2 2 + 2 + 3 3 2 l - 2 + 3 3 2 2 l 2 2 3 2 2 + B 2 -vitamin szintézise A gyógyászati célokra felhasznált B 2 -vitamint szintézissel, állattakarmányozás céljára fermentációval állítják elő. A clostridium és candida élesztők által termelt 500-1000 mg/liter koncentrációjú fermentlé a vitamint flavin-adenindinukleotid formában tartalmazza: 2 2 3 3 P P 2 2 Adenozin-foszfát
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 22 + -vitamin A -vitamin előállítására többféle ipari szintézis ismeretes, de csak a D- glükózból kiindulónak van ipari jelentősége. A REITE és GRÜER által 1934-ben kidolgozott eljárás: 2 2 aszkorbinsav 2 Raney-i sav 2 2 2 3 3 3 2 Acetobacter 3 KMn 4-2 2 3 2 Aceton 3 3 3 2 + B 12 -vitamin iánya a vészes vérszegénységet eredményezi. A molekultát 1948-ban sikerült először elkülöníteni (egy tonna nyers májból 20mg-ot!) A szerkezetét 1955-ben röntgenkrisztallográfiás adatok alapján DGKI határozta meg. Kémiai szintézisét 1973-ban végezték le először, de ipari jelentősége nincs. apjainkban fermentációs úton állítanak elő B 12 vitamint (Richter Gedeon Rt.): Rhodopseudomonas protamicus protoplaszt fúzióval előállított rekombináns baktérium 135 mg/liter koncentrációju fermentlét ad, megfelelő szubsztrát és aktivátor anyagok mellett. A termék szeparációját extrakcióval és adszorpcióval, tisztítását preparatí kromatográfiás módszerekkel végzik. 6.7 Gyógyszerek - Antibiotikumok előállítása Az antibiotikumok elnevezést 1945-ben fogalmazódott meg WAKMA, számos antibiotikum (szteptomicin, aktinomicin ) felfedezője által: Antibiotikum minden olyan kémiai anyag, melyet mikroorganizmusok termelnek és (minimális koncentrációban) gátolják más mikroorganizmusok növekedését, vagy elpusztítják azokat. A jelenlegi legtágabb definició: Antibiotikumnak tekintünk minden olyan anyagot, melyek élő organizmusok termékei (mikro- és makroorganizmusok, ill. prokarióták és eukarióták, beleértve tehát a magasabb rendű növényeket és az állati organizmusokat is), melyek biokémiai mechanizmuson keresztül gátolják (befolyásolják) más élő szervezetek (pl.: vírusok, ráksejtek, növények ) növekedését. Az antibiotikumok kutatása közel 150 évre vezethető viszza, PATEUR és kortársai már megfigyelték a különböző mikroorganizmusok gombák és baktériumok közötti kölcsönös gátlóhatását az ún. antagonizmus jelenségét.
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 23 A leghíresebb felfedezés 1928-ban esett, amikor FLEMIG észrevette, hogy egy penészgomba (Penicillium notatum) baktériumölő hatással bír. A fenti felfedezés és a II. világháboró miatt bekövetkező gyógyszerszükséglet vezetett a penicillin nagyipari fermentációs eljárásának kidolgozásához, és vetette meg a mai korszerű antibiotikumgyártás alpjait. apainkban a legfontosabb antibiotikumforrások, amelyekből a forgalmazott gyógyszerek hatóanyagait nyerik : + ugárgombák (Actinomycetales rend), különös tekintettel a treptimycesekre + Mikroszkópikus gombák + Baktériumok apjainkban a fenti három mikroorganizmus család segítségével előállított ismert antibiotikumok száma ~12 000. soportosításuk: + Termelő organizmus szerint: Termelő organizmus típusa Ismert antibiotikumok száma ugárgomba 5 500 Mikroszkópikus gomba 1 500 Baktérium 1000 Alga 300 Zuzmó 100 övény (magasabb rendű) 3 000 Állati szervezetek 1 000 Összesen 12 400 + Félszintetikus antibiotikum családok: Antibiotikum család efalosporinok Penicillinek Egyéb β-laktámok Aminoglikozidok Tetraciklinek Makrolidok Anzamicinek Antraciklinek Peptidek Kloramfenikolok Egyéb antibiotikumok összesen Közelítő szám 40 000 30 000 7 000 4 000 3 000 2 500 1 500 1 000 1 000 800 3 000 Azoknak a természetes antibiotikumoknak a száma, melyeket a gyógyászatban aktívan alkalmaznak (elsősorban mint baktérium-, gomba- és rákellenes szerek kb. 100 körül mozog, az igazi nagy antibiotikumok száma amelyek a bakteriális fertőzés ellen alkalmaznak csupán 10-15-re tehető. apjainkban egy új antibiotikum bevezetése kb. 10 évi munkába és 50-100 millió dollárba kerül.
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 24 Előállításuk az alkalmazott mikrobiológia legfontosabb területe: + Az általános folyamat: ltóanyag (inokulum) tenyésztés Mikroorganizmus liofilizátum Agar tenyészet Rázott kultúra 0,1-2 liter 25-30 3-6 nap Előfermentorok (inokulumok) levegő levegő hűtés/fűtés zűrő Termelő fermentor levegő Feldolgozás: Extrakció Ioncsere Adszorpció... + Fermentor anyaga: K-36 saválló acél, üveg, i-r ötvözet + Irányítástechnika: Teljes folyamatirányitás + Elkülönítés szeparálás: " Extrakció " Adszorpció Kromatográfiás eljárások (PPL) (Preparative igh Pressure Liquid romatography) " Ioncsere " Lecsapásos eljárások " A fentiek kombinációja + Az elkülönítés hozama átlagosan 65-70%. apjainkban forgalmazott néhány közismert antibiotikum: + emicillin + Amoxicillin + Aktil + Doxicillin
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 25 6.8 Pennicilinek és előállításuk A penicillin egyike a ma legtöbbet használt antibiotikumoknak. A pennicilin név valójában egy vegyületcsoportot jelöl, melynek alapváza: 1 R 3 5 6 2 3-4 3 Eltérés egyedül az R szubsztituensben lehetséges, néhány fontosabb példa: R csoport szerkezete Készítmény neve R csoport szerkezete Készítmény neve 3 pheneticillin 2 amoxicillin 2 5 ampicillin propicillin 2 6 5 phenbenicillin 2 epicillin l l Me clometocillin 2 2 betacin Me methicillin 2 metampicillin Me Vízben és több szerves oldószerben jól oldódik. zobahőfokon vizes oldata 5.5-7.5-es p érték között a legállandóbb. avas és lúgos oldatokban csak alacsony hőfokon és rövid ideig tartható bomlás nélkül.
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 26 Előállítási folyamatábrája: habzásgátló anyag prekurzorok levegőbevezetés tápoldat oldás levegőszűrő levegőszűrő előfermentorba csíráztatott spóraszuszpenzió áramlásmérő áramlásmérő hűtő hűtőkeverék előfermentor oltótenyészet betöltése (sterilvezeték) nyomószűrő hűtés (vízzel) hűtőtartály sterilező gőz termelő fermentor termék szivattyú + Gyártási célra csak a Penicillium otatum újabban Penicillium hrysogenum képes + A gyártási célra kiválasztott törzset liofilizálva szárítják és fagyasztva tárolják. + A tápoldat összetétele a gyártás során nemcsak a termelés mennyiségére van hatással, hanem többé kevésbé meghatározza azt is, hogy melyik penicillin keletkezik. + A gyakorlati szempontból legfontosabb G-penicillin (R=benzil) gyártásánál a tápoldatot az alábbiakból állítják össze: Laktóz (3-4%), kukoricalekvár (3-4%), glükóz (1%), kálium-dihidrogénfoszfát (kb. 0.4%) és kalcium-karbonát (kb. 1%). + A tápoldat p értéke 5.5 6 között ingadozhat (ez a legkedvezőbb a penész szaporodásához). + A termelő fermentorba steril tiszta levegőt vezetnek be, az átlagos levegőszükséglet 0,5-1 liter levegő/liter tápoldat/perc.
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 27 + A termelés hőfokoptimuma 25, ezt max. 2 fok eltéréssel tartani kell. + A fermentáció időtartama ~40óra, ebből a generációs idő ~6óra.(tipikus feed-batch eljárás). + A művelet kinetikája: sejtszaporodás kinetikája termelés kinetikája t + A fermentáció levezetése után a végterméket legtöbbször alacsony hőmérsékletű (bomlás visszaszorítása miatt) folyadék-folyadék extrakcióval szeparálják: A penicillint a vizes oldatból szerves fázisba viszik át. Ezután vizes pufferodattal újra szerves fázisba viszik. Alkalmazott oldószer leggyakrabban az amil-acetát. Ezt a folyamatot addig ismétlik amig a további feldolgozáshoz szükséges koncentrációt és a kívánt tisztaságot el nem érik. A nyersterméket többszöri átkristályosítással tisztítják. Vizes fázis Amil-acetát + savanyítás Extrakció zerves fázis lúgos kémhatású vizes puffer Extrakció ajnos a természetes penicillinekkel szemen több olyan probléma merült fel, amely alkalmazási korlátokat szabott, azonban ezek a problémák vetették meg a félszintetikus penicillinek kifejlesztésének alapjait. 6.7.1 Félszintetikus penicillinek A természetes penicilliekkel gyógyászati alkalmazása során a következő problémák merültek fe: + zük antibiotikus spektrum, csak Gram-pozitív sejtekre gyakorol hatást. + A G-penicillin alkáli sók savérzékenyek per os (szájon át) nem szedhetők. + Allergén hatások, melyeket antihisztaminokkal sem siekrült kiküszöbölni + A kórokózók penicillinekkel szemben kialakult rezisztenciája
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 28 A félszintetikus penicillinek azon antibiotikumok, melyek hatóanyagának előállításánál, az alapmolekulát (penicillin-nukleusz, vagy 6-AP: 6-aminopenicillánsav) mikroorganizmus állítja elő, azonban ehhez szintetikus úton olyan oldalláncot kapcsolnak, amelyekre fermentációs úton nem nincs lehetőség. A 6-AP + Az AP felfedezése gyakorlati szempontból vetekszik a penicillin felfedezésével. 1950-ben AKAGUI és MURA közölte először, hogy a P. chysogenum micéliumában egy enzim, a penicillin-amidáz (gyakran penicillin-aciláznak is nevezik) a benzil-penicillinből 6-AP-t képez. + Az 1953-ban igazolt reakció: 2 G-penicillin penicillin-aciláz + 2 p=7.5 2 + 2 + A 60-as években több ipari eljárás született a G-penicillin oldalláncának eltávolítására. A aciláz enzim termelésére számos mikroorganizmus (Escherichis, Bordatella ) képes, azonban a módszer hátránya, hogy 5% szubsztrátkoncentráció felett a aciláz enzim aktivitása jelentősen csökken továbbá más nemkívánatos enzimek jelenlétével is számolni kell. A tisztított enzim alkalmazása azonban irreálisan megnöveli az előállítási költségeket. Megoldás: Rögzített enzimek alkalmazása + A 6-amino-penicillánsav acilezése A félszintetikus antibiotikumok alőállítására olyan peptidkötés-kiépítési módszerek használhatók, melyek a penicillinmolekula sajátosságait is figyelembe veszik. Az egyik legegyszerűbb és legrégebbi eljárás a savkloriddal történő aciilezés: 2 + R L l - 5 --L l Másik széles körben alkalmazott acilezési módszer a vegyeskarbonsavanhidrides eljárás. Ezt az uat követték a D-a-amino-benzil-penicillin (Ampicillin) szintézisénél, melyet nálunk emicillin néven forgalmaznak. R A félszintetikus készítmények részben orvosolták a Gram-negatív sejtek problémáját, azonban az allergén tünetek kizárása a mai napig megoldatlan.
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 29 További fontos félszintetikus penicillinszármazékok: + Penicillin-észterek pl.: G-penicillin-acetoxi-metilészter (Maripen) 2 + 6-a-szusztituált származékok pl.: Temocillin a 3 a 2 3 6.8 efalosporinok A penicillinhez hasonló vegyületek Az alapvegyület: R3 1 R R 2 7-AA: (7-amino-cefalosporánsav) A legfonotsabb származékok: 1. R 1 R 2 2 Ac 2 R 3 név készítmény cefalotin már nincs 3 2 cefalexin Pyassan 2 2 3 cefazolin külföldön 2. 2 3 cefamandol Mandokef 3 2 2 cefuroxim Zinacef 2 2 2 3 cefoxitin Mefoxin 3. 2 2 2 cefotaxim laforan 3 3 2 ceftriaxon Rocephin 3 3 2 ceftazidim Fortum
A biotechnológia alapjai és egyes termékei 30 Pennicillinérzékenység esetén: + Eritomicin: 3 3 2 3 3 3 3 3 ( 3 ) 2 3 3 3 3 + treptomicin (csak életveszélyes helyzetekben adják a hatékony és a toxikus koncentráció között kicsi a különbség): 2 2 streptidin 3 streptóz 3 L-glukózamin 2 6.9 Aminosavak Az aminosavak erjesztés útján történő előállítása az ipari mikroiológia legfiatalabb és legjobban fejlődő területe. Ezidáig jól bevált ipari eljárásokat dolgoztak ki: + L-lizin, + L-glutaminsav előállítására Az irodalmi adatok alapján biztató eredményeket értek el: + L-valin, + L-aszparaginsav, + L-riptofán előállításának területén. A műveletek legfőbb problémája: Igaz, hogy aminosavakat valamennyi mikroorganizmus termel, de azokat azonnal felhasználja fehérjeszintézisre. Megfigyelték ugyan, hogy egyes mikrorganizmusok a környezet felé is kiválasztanak aminosavakat, de sajnos jelentéktelen mennyiségben. Megoldás: Mesterséges mutánsok alkalmazása, de ez is csak adott aminosavszintézisre hasznosítható. A bioszintézis rendkívüli előnye, hogy optikailag tiszta aminosav keletkezik. Az L-glutaminsav előállítása: + Micrococcus glutamicus baktérium segítségével, + Tápoldat: glükóztartalmú oldatok, + itrogénforrás: karbamid, + zabályozó : Megfelelő mennyiségben adagolt biotin. zükséges a baktérium fejlődéséhez, de nagy mennyiségben sok baktérium fejlődik, ami hátráltatja a savtermelést, + Rekaciókürölmények: 30, 8-as p érték, + Az átalakulás maximálsi mértéke: ~50%, + A maximálisan elérhető glutaminsav koncentráció: 3g/100ml.