Antioxidáns hatású természetes eredetű vegyületek szintézise

Antioxidáns hatású természetes eredetű vegyületek szintézise Doktori (PhD) értekezés tézisei Kónya Krisztina Témavezető: Prof. Dr. Antus Sándor Synthesis of natural compounds with antioxidant properties PhD theses Krisztina Kónya Supervisor: Prof. Dr. Sándor Antus Debreceni Egyetem, Természettudományi Kar Debrecen, 2005

Soha ne úgy gondolj tanulmányaidra, mint kötelességre, hanem mint irigylésre méltó lehetőségre, megismerni a szépség felszabadító erejét a szellem birodalmában saját kedvedre és a közösség hasznára, amelyhez későbbi munkád tartozik. Albert Einstein

1. Az értekezés előzményei és célkitűzései A növényi eredetű anyagokat már évszázadok óta használják betegségek kezelésére. Alkalmazásuk napjainkban jóllehet reneszánszászukat élik, mégis sok esetben a hatásért felelős molekulák szerkezetét pontosan nem ismerjük és így szerkezetük meghatározása, a szerkezet-hatás összefüggések felderítése a szerves és gyógyszerkémia fontos kutatási területe. A természetes eredetű vegyületek egyik farmakológiailag is értékes csoportját a neolignánok képezik. Szerkezetük alapján több mint tizenöt csoportba oszthatók, és ezeken belül további alcsoportokat is megkülönböztetnek. Az osztályozásuk hasonlóan a lignánokhoz az aril-propanoid egységek kapcsolódási pontja alapján történik. A legfontosabb csoportok az alábbiak (1. ábra): 9 8 7 6 1 2 4' 5' 5 4 3 3' 2' 1' 6' 7' 8' Ar 9 9' Ar' Ar 8 2' 3' 1' Ar 8 1' 9' (3,3')-neolignánok (9) (9,9')-neolignánok (10) (8,3')-neolignánok (11) (8,1')-neolignánok (12) 8 4' Ar 1' benzofuránok (13) dihidrobenzofuránok (14) (8..4')-neolignánok (15) 1 3 4' Ar 1' Ar 8 1' 7 3' (8,1'.7,3')-neolignánok (18) (3..4')-neolignánok (16) 5' 8 1' Ar 8 3' 7 Ar 7 1' 9' (8,5'.7,3')-neolignánok (19) 1,4-benzodioxánok (17) (8,1'.7,9')-neolignánok (20) 2 5 1' 1 2' (2,2'.5,1')-neolignánok (21) 1. ábra E változatos szerkezetű vegyületeknek figyelemre méltó biológiai hatásuk is van. Doktori munkám során a 14 típusú 2,3-dihidrobenzo[b]furán- és a 15 típusú 8..4 -vázas neolignánok, valamint a 17 típusú 1,4-benzodioxán származékok szintézisével és a 8..4 -vázas neolignánok esetében antioxidáns hatásuk vizsgálatával is foglalkoztam. 2. Az alkalmazott vizsgálati módszerek Szintetikus munkánk során a modern preparatív szerves kémia makro-, félmikro- és mikromódszereit egyaránt alkalmaztuk. A reakciók követésére, az anyagok tisztaságának ellenőrzésére kromatográfiát, míg a reakcióelegyek tisztítására a klasszikus és flash oszlopkromatográfiát, valamint preparatív 1

vékonyréteg kromatográfiát alkalmaztunk. Az előállított vegyületeink karakterizálására, azonosítására és szerkezetük igazolására a hagyományos analitikai eljárások (olvadáspont, és fajlagos forgatóképesség meghatározása) mellett rutinszerűen alkalmaztuk a modern PLC kromatográfiás, 1 -és 13 C-NM és CD spektroszkópiai módszereket. Vegyületeink antioxidáns hatásának vizsgálatához egészséges egyének véréből izolált polimorfonukleáris leukocitákon (PMNL) végeztük. Ezeket az E-vitamin átlagos vérplazma szintjének megfelelő végkoncentrációban (25 µm) 37ºC-on - vegyületeinkkel előinkubáltuk, majd forbolmirisztát-acetáttal történő aktiválást követően a 2 termelésüket citokróm C segítségével spektrofotometriásan mértük. 3. Az értekezés új tudományos eredményei 3.1. 8..4 -neolignánok szintézise és antioxidáns hatásuk vizsgálata A polifenolok családjába tartozó flavonolignánok szabadgyökfogó tulajdonságát már leírták az irodalomban, de érdekes módon a 8..4 -neolignánok ezen sajátságát eddig még nem vizsgálták meg. Minthogy szerkezetük alapján joggal feltételeztük, hogy a Silybum marianumból nyert 2,3- dihidrobenzo[b]furán és 1,4-benzodioxán vázas flavonolignánokhoz hasonlóan antioxidáns hatásúak, ezért a biológiailag aktív -heterociklusok körében végzett vizsgálatainkat folytatva a PMNL szuperoxid-anion ( 2 - ) termelésére kifejtett hatásuk vizsgálatához a természetben előforduló 91a-d,g eritro- és 92 g,h treo-8..4 -neolignán származékokat, valamint a hatás szerkezet összefüggések vizsgálatának szélesítése érdekében e származékok rokonvegyületeit (91e,f,h,i; 92a-f,i) állítottuk elő. Az irodalomban leírt racém α-bróm-propiofenon származékokat [(±)-87a-c] a megfelelő 85a-c nitril származékokból Grignard-reakciót követő brómozással nyertük. E vegyületeket a 88,89,24 fenolokkal kálium-karbonát jelenlétében, acetonban forralva a megfelelő (±)-90a-i ketonokhoz jutottunk, melyek sztereokontrollált lítium-alumínium-hidrides redukciója az eritro-(±)-91a-i alkoholokat adta többségi termékként (2.ábra). 2

1 CN 1.) EtBr / Mg 1 1 absz. éter Br 2 / CCl 3 2 2 2 Br 3 2.)Cl / 2 3 3 reflux 85a-c 86a-c (±)-87a-c 85-87 1 2 3 a C 3 C 3 b C 3 C 3 C 3 c -C 2-1 2 3 a vagy b 4 (±)-90a-i C 3 5 C 3 4 5 88,89,24 K 2 C 3 absz. aceton relfux 4 5 88 C 3 allil 89 allil 24 transz-propenil 1 3 2 9 1 7 8 C 3 4 1' 2' 5 6 3' 4' 5 5' 3 4 6' (±)-91a-i eritro 1 2 3 4 (±)-92a-i treo C 3 5 a: LiAl 4 / absz. éter (eritro : treo > 1) b: NaB 4-15-korona-5-éter / absz. Me/ 2-Pr (eritro : treo < 1) (±)-90-92 1 2 3 4 5 a C 3 C 3 C 3 allil b C 3 C 3 C 3 C 3 allil c -C 2 - C 3 allil d C 3 C 3 allil e C 3 C 3 C 3 allil f -C 2 - allil g C 3 C 3 transz-propenil h C 3 C 3 C 3 transz-propenil i -C 2 - transz-propenil 2. ábra A kisebb mennyiségben kapott treo-származékoktól [(±)-92a-i] való elválasztásukat preparatív rétegkromatográfiával oldottuk meg. A treo-alkoholok [(±)-92a-i] esetében a hidrid-reagens nátriumionját 15-korona-[5]-éterrel komplexálva a csupasz hidrid reagenst nyertük, melynek támadása a Cram-szabálynak megfelelően már a treo-alkoholt szolgáltatta (3. ábra). Al (M) 3 C C (L) Ar (S) Ar (M) 3 C C Ar Ar (S) (L) treo-alkohol eritro-alkohol 3. ábra Az így nyert vegyületek antioxidáns tulajdonságát humán polimorfonukleáris leukociták (PMNL) szuperoxid-anionon ( 2 - ) termelésére kifejtett hatásuk alapján tanulmányoztuk. Mint ismeretes a 3

humán keringési rendszerben a polimorfonukleáris leukociák (PMNL) a forbol-mirisztát-acetát (PMA) hatására a protein kináz C (PKC) és a NADP-oxidáz (redukált nikotinamid-adenin-dinukleotidfoszfát-oxidáz) enzimekre gyakorolt hatás révén 2 termelnek. - A 91,92a-i racém 8..4 -neolignánok, mint azt a 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliumbromid (MTT) beépülésének mérése mutatta, 25µM-os koncentrációban nem toxikusak és 100µM koncentrációban is csak 20-25%-kal csökkentették az MTT beépülést, így a 25µM-os koncentrációban végzett kísérleteknél a 2 - -termelés változása kizárólag vegyületeink antioxidáns tulajdonságával kapcsolatos (4. ábra). 100 MTT beépülés (a kontrol %-ban) 80 60 40 20 0 kontroll E-vitamin 91,92a 91,92b 91,92c 91,92d 91,92e 91,92f 91,92g 91,92h 91,92i 4. ábra A PMA-stimulálta 2 - -termelést 25µM-os koncentrációban valamennyi vegyület (91,92a-i) szignifikánsan csökkentette, és 10 perccel a stimulációt követően 25-70% közötti gátlást tapasztaltunk. A vegyületek antioxidáns kapacitása 30 perccel a stimulációt követően is még számottevő volt, de annak időbeni változása arra utalt, hogy a molekula szerkezete és antioxidáns hatása között egyértelmű összefüggés van. Az eritro- és a treo-sorozatba tartotó vegyületek szabadgyökfogó képessége ugyanis különbözött (5. ábra). Eritro (91) és treo (92) 8..4'-neolignánok szuperoxidanion termelés (a kontrol %-ban) 100 80 60 40 20 0 kontroll E vitamin 91,92a 91,92b 91,92c 91,92d 91,92e 91,92f 91,92g 91,92h 91,92i 5. ábra 4

A 92c treo-származék kivételével a treo-származékok bizonyultak a hatékonyabbaknak, és a gátlóhatás mértéke a 92a,b,e,f,g vegyületek esetében a 60%-ot is meghaladta. A leghatékonyabbnak a 92b származék bizonyult. Ez jó egyezésben a korábbi megfigyeléseinkkel arról tanúskodott, hogy a szuperoxidanion termelés gátlása és a vegyület lipidoldékonysága között összefüggés van. A metoxicsoportok számának növelése ugyanis fokozta a molekula lipidoldékonyságát és ezáltal megkönnyítette a sejtmembránba való behatolását, ahol a membránhoz kötött NADP-oxidáz hatására a szuperoxidanion termelődik. A 92e és 92h gátlóhatásban megmutatkozó szignifikáns különbség is arra utalt, hogy az allil-láncot tartalmazó vegyületek sejtmembránba való illeszkedése kedvezőbb. Mint ismeretes a racemátok biológiai hatása számottevően eltérhet az enantiomerjeikétől. Minthogy a racém 92a-i treo-8..4 -neolignánok antioxidáns hatása az E-vitaminéval összemérhetőnek bizonyult kézenfekvőnek látszott, hogy az enantiomerjeik hatását is megvizsgáljuk, azaz e vegyületcsalád rezolválásával és enantioszelektív szintézisével is behatóan foglalkozzunk. 3.2. 8..4 -neolignánok rezolválása és enantioszelektív szintézise A racém eritro- és treo-alkoholok rezolválását PLC-s körülmények között királis stacioner fázison (Chiralcel D) oldottuk meg. A kromatográfiás körülményeket optimalizálva n-hexán : 2-propanol = 90:10 eluens összetételnél 0.9, 0.5 ml/perc áramlásisebességnél a racemátok többségénél alapvonali elválást tapasztaltunk (1. táblázat). Vegyület t 1 k 1 t 2 k 2 α s 91a 20.81 3.94 21.77 4.17 1.06 0.91 92a 29.84 6.08 - - - - 91b 17.38 3.13 18.43 3.37 1.08 0.95 92b 22.49 4.34 32.93 6.82 1.57 5.32 91c 10.08 1.39 13.29 2.16 1.55 5.33 92c 14.40 2.42 17.39 3.13 1.29 3.49 91d 20.81 3.94 26.84 5.37 1.36 4.18 92d 24.84 4.90 37.92 8.00 1.63 6.28 91e 17.97 3.27 - - - - 92e 19.75 3.69 25.76 5.11 1.39 3.43 91f 10.97 1.60 12.89 2.06 1.28 3.24 92f 14.68 2.48 - - - - 91g 23.60 4.60 31.76 6.54 1.42 4.71 92g 27.31 5.48 36.25 7.6 1.39 3.67 91h 21.65 4.14 28.48 5.76 1.39 3.98 92h 23.11 4.48 30.25 6.18 1.38 4.00 91i 12.68 2.01 17.60 3.18 1.58 6.17 92i 15.35 2.64 16.15 2.83 1.07 1.07 91j a 19.75 3.11 20.93 3.36 1.03 1.42 92j a 19.79 3.12 21.52 3.48 1.12 1.84 91jAc a 11.47 1.39 12.77 1.66 1.20 2.24 92jAc a 12.13 1.53 - - - - 91fAc 8.46 0.76 8.84 0.84 1.10 0.99 92fAc 8.93 0.86 9.53 0.99 1.15 1.27 1. táblázat 5

Az online PLC-CD detektálási technikát használva vegyületeink (kivéve:91e,92a,92f) online PLC- CD kromatogramját is rögzítettük 230 és 245nm-en. Az áramlást a CD-jel maximumán állítottuk meg és 200-350 nm tartományban felvettük a vegyületek CD spektrumát, amely lehetővé tette e vegyületek egyértelmű abszolút konfigurációjának meghatározását (6. ábra). ε 9 6 3 0 91d (2. csúcs) 91c (2.csúcs) ε 6 3 0 91g (1. csúcs) transz-propenil-oldallánc 91h (1. csúcs) transz-propenil-oldallánc -3-3 -6-9 91d (1. csúcs) 91c (1. csúcs) -6-9 91d (1.csúcs) allil oldallánc batokróm eltolódás 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 wavelength (nm) 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 wavelength (nm) 6. ábra. A B A: Az 91d (folyamatos vonal) és 91c (pontozott vonal) enantiomerjeinek első és második eluálódó csúcsaihoz tartozó LC/CD spektumok. B: Az 91g (folyamatos vonal) és 91h (pontozott vonal) spektrumainak összehasonlítása az 91d (szaggatott vonal) spektrumával Az irodalomban 8..4 -neolignánok abszolút konfigurációját eddig vagy oreau vagy Mosher által leirt módon 1 -NM spektroszkópiával határozták meg. Úgy gondoltuk, hogy a Mosher-módszer preparatív léptékű változata nemcsak alkalmas lehet a 91a-i és 92a-i neolignánok enantiomerjeinek előállítására, hanem az -(-)-α-metoxi-fenilecetsavval képzett diasztereomerek 1 és 13 C-NM vizsgálata további bizonyítékul is szolgálhat a később említendő kiroptikai összefüggésünk helyességének igazolására is. Az eritro- és treo-neolignánok közül elkészítettük néhány (91c,92c,e,i) -(-)-α-metoxi-fenilecetsavval képzett diasztereomerét. A racém (±)-91c neolignánt ()-(-)-α-metoxifenilecetsavval [()-(-)-MPA, 125] reagáltatva a (7,8S)-(-)-127 és (7S,8)-(-)-127 diasztereomer észtereket állítottuk élő, melyek oszlopkromatográfiás elválasztása nem jelentett problémát (7. ábra). synperiplanar () 3 C () Ph (S) 3 C (7,8S)-( )-127 C 3 A A Ph C 3 C 3 3 C B B árnyékolt synperiplanar 3 C () (S) 3 C () Ph A B C 3 C 3 B C 3 C 3 Ph A árnyékolt (7S,8)-( )-127 7. ábra 6

A Mosher észterekből nyert neolignánszármazékok CD adatait elemezve megállapítottuk, hogy az eritro- és treo-8..4 -tipusú neolignánok abszolút konfigurációja és kiroptikai viselkedése között is egyszerű összefüggést fogalmazhatunk meg. Az A gyűrűt magába foglaló szubsztituált benzol kromofor 1 L a és 1 L b sávjaihoz tartozó Cotton-effektusok pozitívak (negatívak) az eritro-sorban 7,8S (7S,8), a treo-sorban pedig 7,8 (7S,8S) abszolút konfiguráció esetén. E szabály alapján több természetben előforduló 8..4 -típusú neolignán irodalomban leírt abszolút konfigurációját módosítanunk kellett (8. ábra). 2 1 C 3 C 3 3 (-)-129,(-)-130 129: 1 = Glc, 2 =, 3 = ; CD nm ( ε): 239 (1.94) 130: 1 =, 2 =, 3 = Glc; CD nm ( ε): 239 (1.76) 3 C Glc Ac Ac () (S) C 3 Ac 3 C Ac () (S) (-)-(7S,8)-131 CD (Et) nm ( ε): 220 (-2.36), 228 (-3.60) 235 (-1.75), 250 (-0.27). (-)-(7S,8)-132 C 3 CD (Et) nm ( ε): 224 (-2.42), 230 (-3.75), 240 (-2.03), 254 (-0.25). 8. ábra Így Matsuda és Kikuchi által a Lonireca graciliper var. glandulosa Maxim leveléből izolált (-)-129 és (-)-130 8..4 -neolignán származékét (7S,8 7,8S), valamint Greca és munkatársai által az Arum italicum-ból nyert, a B gyűrűn transz-propenil oldalláncú (-)-131 eritro-8..4 -neolignán és (-)-132 a 8..3 -neolignán származék konfigurációját (7,8S 7S,8) (8. ábra). 3.3. 2-idroximetil-1,4-benzodioxánok enzimkatalizált rezolválása Korábbi kutatásaink azt mutatták, hogy a 77b 1,4-benzodioxán származék alkalmas kiindulási anyag a májvédőhatású silybin-a, -B (pl. 77b 60a, 60b) szintéziséhez (9. ábra). Minthogy e többlépéses transzformáció egyes lépései az 1,4-benzodioxán gyűrűrendszer kiralitás centrumait nem érintették, így kézenfekvőnek látszott, hogy a silybin-a, -B-hez kapcsolódó hatás-szerkezet összefüggések alaposabb tisztázása érdekében e vegyület (77b) rezolválásával behatóbban foglalkozzunk. C 2 C 3 (±)-77b C 3 9. ábra 1 1' 2' 3' 2 3 (+)-60a 2,3,2'S,3'S (silybin-b) (+)-60b 2,3,2',3' (silybin-a) C 3 7

Az eneantiomerek [(-)77b és (+)-77b] hozzáférhetőségét Pseudomonas fluorescens lipáz enzim katalizálta kinetikus rezolválással kívántuk biztosítani. Meglepő módon a (±)-77b 1,4-benzodioxán származék nem volt szubsztrátja ennek az enzimnek, jóllehet a 2-hidroximetil-1,4-benzodioxán (133) esetében a visszamaradó (-)-133 alkoholt 99% optikai tisztasággal nyertük. Az enzim aktív centrumának alaposabb megismerése érdekében, ezért különféle 1,4-benzodioxán származék (136,137,140,141,142,143,158) enantioszelektív acilezési reakcióját tanulmányoztuk. A 136,137 észterek esetében absz. dioxánban vinil-acetáttal végzett acilezési kísérletek kromatográfiás követése azt mutatta, hogy a 2-hidroximetil-1,4-benzodioxán (133) esetében tapasztaltnál [(±)-133 (+)-133Ac: konverzió: 62%, reakcióidő: 13.5 óra)] számottevően lassabban, de a kívánt acetilszármazékok keletkeztek [136 (+)-138, 137 (+)-139] (10. ábra). 1 2 (±)-136,137 Ac absz.dioxán Pseudomonas fluorescens 1 1 2 (-)-2S-133,136,137,140,141 2 1 2 136,138 (E)C=CC 2 C 2 C 3 137,139 (E)C=CC 2 C 2 C 3 140 C 141 C 133 Ac (+)-2S-133Ac,138,139 Vegyület Idő Alkoholok Konverzió (%) Acetátok (óra) (136,137) ee (%) (138,139) ee (%) E 136,138 214 45 71 79 14 137,139 214 52 52 75 11 10. ábra A 45%-os konverziót ugyanis csak 214 óra után értük el. A visszamaradó alkoholokat [(-)-136,-137] a megfelelő acetilszármazékoktól oszlopkromatográfiával választottuk el. Az abszolút konfigurációjukat kémiai korrelációval, az optikai tisztaságukat, pedig Chiralcel J típusú kolonnán PLC-vel határoztuk meg. A szubsztituens térigényét csökkentve megvizsgáltuk, hogy milyen az enzim aktív centrumához való illeszkedés a 140 és 141 aldehid származékok esetében (11. ábra). 8

1 2 (±)-142,143 Ac absz.dioxán Pseudomonas fluorescens 1 1 2 (-)-2S-142,143 1 2 142,146 C 143,147 C 2 (+)-2S-146,147 Ac Vegyület Idő (óra) Konverzió (%) Alkoholok (142,143) ee (%) Acetátok (146,147) ee (%) 142 97 45 65 75 14 143 97 48 73 57 7,7 11. ábra Ezen kísérletek azt mutatták, hogy az 1 szubsztituens térkitöltésének csökkentése nem, míg az 2 szubsztituens esetében is csak csekély mértékben befolyásolta az enzim királis felismerését. Az enzim aktív centrumának topológiájáról további érdekes információt szolgáltattak a megfelelő biszhidroximetil-1,4-benzodioxánokkal [(±)-142, (±)-143] végzett kinetikus rezolválási kísérleteink is (12. és 13. ábra). (±)-142 Ac absz.dioxán Pseudomonas fluorescens E Ac (-)-2S-142 (+)-2S-146 S (+)-2S-147 Ac Ac Ac (-)-2S-146 (+)-2S-148 Ac Vegyület Idő (óra) Konverzió (%) Alkohol (142) ee (%) Monoacetát (146) ee (%) Diacetát (148) ee (%) 142 167 67 11 75 67 - (±)-146 167 50-76 61 9,2 12. ábra E 9

(±)-143 Ac absz.dioxán Pseudomonas fluorescens Ac Ac (-)-2S-143 (+)-2S-149 >> S (+)-2S-150 Ac (-)-2S-149 Ac (+)-2S-151 Ac Vegyület Idő (óra) Konverzió (%) Alkohol (143) ee (%) Monoacetát (149) ee (%) Diacetát (151) ee (%) E 143 167 66 33 42 87 - (±)-149 167 55-97 59 15 13. ábra E vegyületekkel (142,143) végzett kísérleteink egyrészt megerősítették a (±)-140,141 aldehidek esetében megfogalmazott megállapításainkat, másrészt rámutattak arra is, hogy a reakciócentrum és a kiralitás centrum közötti távolság növelésével az enzim enantiomer felismerése számottevően csökken. A vegyületeink abszolút konfigurációját (S) a kutatócsoportunk által megfogalmazott kiroptikai szabály [( 1 L b -CD (-) heterogyűrű helicitása M abszolút konfiguráció S)] alapján, optikai tisztaságukat pedig királis stacioner fázisú PLC-vel (Chiralcel J) határoztuk meg. Minthogy a fenti eredmények azt mutatták, hogy a (±)-77a,b esetében az 1,4-benzodioxángyűrű C-3- as szénatomjához kapcsolódó nagy térigényű 4-hidroxi-3-metoxifenil csoportja akadályozta meg az enzim-szubsztrát komplex kialakulását [(±)-77a (+)-134 vagy (±)-77b (+)-135], ezért célszerűnek látszott e szubsztituens térigény csökkentésének hatását is megvizsgálni. E vizsgálatokhoz a transz-2-hidroximetil-3-metil-1,4-benzodioxánt (158) az irodalomban leírt módon, 14. ábrán vázolt úton állítottuk elő. Br K 2 C 3 Br Br 159 160 161 162 C 3 C 3 LiAl C 4 3 C 3 C 3 C 3 163 164 158 165 14. ábra 10

A transz vegyület (158) esetében 25%-os konverziót csak 168 óra után sikerült elérnünk. Ez is azt igazolta, hogy az enzim-szubsztrát komplex kialakulását a C-3 helyzetű szénatomhoz kapcsolódó csoport térigénye jellemzően befolyásolja (15. ábra). C 3 (±)-158 Ac absz.dioxán Pseudomonas fluorescens C 3 C 3 Ac (-)-2S-158 (+)-2S-166 Vegyület Idő (óra) Konverzió (%) Alkohol (158) ee (%) Acetát (166) ee (%) 158 168 25 23 12 1.5 15. ábra A reakcióban keletkező acetilszármazék [(+)-2S-166] csekély optikai tisztasága (12%), pedig arra utalt, hogy az enzim aktív centrumához való illeszkedés meglehetősen kicsi. Kísérleteink eredményeit az irodalomban közöltekkel összevetve megállapítottuk, hogy az aromásgyűrű kölünböző térigényű és polaritású szubsztituensei nem akadályozzák meg ez enzim-szubsztrát komplex kialakulását és minden esetben az konfigurációjú enantiomer acileződik gyorsabban, de a szelektivitás mértéke erősen szubsztituens függő. Lényegesen nagyobb szubsztituens effektust az 1,4-dioxángyűrű C-3 szubsztituense esetében tapasztaltunk. A hidrogénatomnak metilcsoportra történő cseréje az E+S ES egyensúlyt erősen a szubsztrát irányába tolta el, míg a nagy térkitöltésű arilcsoport jelenlétekor az enzim-szubsztrát komplex már ki sem alakult. E 3.4. 3-idroximetil-benzo[b]furánok enzimkatalizált kinetikus rezolválása. A (+)-silychristin abszolút konfigurációjának meghatározása A 3-hidroximetil-2,3-dihidrobenzo[b]furán váz számos flavano- és neolignán származék építőeleme, így e szerkezeti elem a Legalon egyik hatóanyagában a (+)-silychristinben (62) és 3- dezoxiszármazékában a (+)-silyherminben (66) is felismerhető. Ez utóbbi vegyület racém formában történő előállítását a 80 aldehidszármazékból kiindulva a kutatócsoportunk oldotta meg. Úgy gondoltuk, hogy e vegyületnek enantiomertiszta (2,3S vagy/és 2S,3) formában történő előállítása megteremthetné a lehetőségét e természetes anyagok teljes szintézisének, valamint a feltételezett abszolút konfigurációjuk igazolásának. 11

C 3 absz. piridin C 3 (+)-silychristin (62) (-)-silyhermin (66) (+)-dehidrosilychristin (167) 16. ábra A kutatócsoportunk tapasztalatai alapján kézenfekvő volt, hogy az említett enantiomerek előállítását a 171 2,3-dihidrobenzo[b]furán aldehidszármazék enzimkatalizált kinetikus rezolválásával oldjuk meg. Az enzimkatalizált kísérleteinkhez e vegyületet és metiléterét [(±)-171,172] a ferrulasav metilészteréből (173) kiindulva a kutatócsoportunk által már leírt úton nyerhető racém 175 észterszármazékon keresztül állítottuk elő (17. ábra). C 3 173 C 3 Ag aceton : benzol 3:2 C 3 C 3 174 C 2 C 3 C 3 Ac 2 absz. piridin C 3 176 C 2 C 3 Ac C 3 1) s 4 absz. dioxán 2) NaI 4 / 2 C 3 C 3 175 C 2 C 3 Ac C 3 LiAl 4 absz. éter C 3 C 3 C 3 C 3 MeI C 3 K 2 C 3 177 absz. aceton 178 Mn 2 Jones-reagens Mn 2 C 3 C 3 171 171 C 169 17. ábra C 3 C 3 E vegyületek enzimkatalizált kinetikus rezolválását a (±)-169 2,3-dihidrobenzo[b]furán származékra optimalizált reakció körülményeket között kíséreltük meg. Az átalakulást folyadékkromatográfiás módszerrel is követtük. 172 C 3 12

C 3 (±)-171 CCL / diizopropiléter C 3 vinilacetát, rt. C 3 (-)-171 + C 3 C 3 (+)-179 Ac C 3 Vegyület Idő Alkohol Acetát Konverzió (%) (óra) (-)-169,171 ee (%)(+)-170,179 ee (%) E (±)-169 96 52 84 84 36 (±)-171 30 37 23 63 5,5 18. ábra Kísérleteink azt mutatták, hogy 30-40 órás reakcióidő után az enzim meglepő módon elveszítette az aktivitását és az átalakulás 30-40%-os konverziónál befejeződött. A visszamaradó balraforgató alkoholt a jobbraforgató acetilszármazéktól oszlopkromatográfiával választottuk el és a vegyületek optikai tisztaságát, valamint abszolút konfigurációját a Ziziphus jujuba-ból izolált az endotél sejtek prostaciklin termelését jelentősen (25%) fokozó (-)-2,3S-180 észterszármazékkal végzett kémiai korrelációval határoztuk meg (19. ábra). C 3 C 3 C 3 (-)-2,3S-180 [α]= -81 (C= 0.10, CCl 3 ), CD (C 2 Cl 2 ): Θ 376 +806, Θ 363 0, Θ 327-9884, Θ 276 0, Θ 255-4780, Θ 246 0, Θ 234 +9695 19. ábra Az acilezési kísérleteink arról tanúskodtak, hogy a formilcsoport bevitele számottevően meggátolta a szubsztrátumnak az enzim aktív centrumához való illeszkedését. Így a 171 aldehidszármazék enantiomerjeit optikailag tiszta formában előállítani nem tudtuk. Jóllehet a (+)-silychristin (62) és a (+)-silyhermin (66) enantiomerjeinek előállításáról ezért le kellett mondanunk, de a 172 aldehidszármazék 30-40%-os optikai tisztaságú enantiomerjeik felhasználásával szintetizált modell vegyületek [(+)- és (-)-188] a (+)-silychristin (62) kiroptikai spektroszkópiával történő abszolút konfiguráció meghatározását tették lehetővé. 13

C 3 C 3 C 3 184 C 3 C 3 C 3 K / Et 185 (-)-172 (+)-183 Ac (-)-185 (+)-185 1) Cl / Me / relfux 2) NaAc / reflux Ac C 3 C 3 C 3 Ac 2 / piridin C 3 C 3 C 3 Ac 187 NBS CCl 4 (C 6 5 C) 2 hν (-)-187-190 (+)-187-190 Ac Ac (-)-186 (+)-186 186 C 3 C 3 C 3 C 3 C 3 C 3 Ac 188 Ac 189 Ac Ac CD (AcCN) nm ( ε): 348 (0.55), 28 (-0.05), 253 (0.42), 238 (-0.46) C 3 C 3 C 3 Ac Ac 190 20. ábra A 20. ábrán feltüntet úton nyert (+)-188 flavonszármazék CD adatait összevetve a dehidrosilychristinével (167) megállapítottuk, hogy abszolút konfigurációja ellentétben a Zanarotti által megadottakkal nem 2,3,2,3 S hanem 2,3,2 S,3. 14

4. Publikációk / Publications Az értekezés alapjául szolgáló közlemények / Papers underlying the Theses 1. Kónya, K.; Varga, Zs.; Antus, S. Antioxidant properties of 8..4 -neolignans. Phytomedicine, 2001, 8, 454-459 2. Kónya, K.; Varga, Zs.; Antus, S. Egyszerű szintézisút az antioxidáns tulajdonságú 8..4 -típusú neolignánok előállítására. Magyar Kémikusok Lapja, 2002, 108, 273-275 3. Kónya, K.; Kiss-Szikszai, A.; Kurtán, T.; Antus, S. Enantiomeric separation of racemic neolignans on Chiralcel D and determination of their absolute configuration with online circular dichroism. Journal of Chromatographic Science, 2004, 42, 478-483 4. Kónya, K.; Kurtán, T.; Kiss-Szikszai, A.; Juhász, L.; Antus, S. A General CD Method for the Configurational Assignment of erythro-8..4 -Neolignans. Arkivoc, 2004, xiii, 72-78 (http://arkatusa.org) 5. Kónya, K.; Kiss-Szikszai, A.; Kurtán, T.; Antus, S. Kinetic resolution of 2-hydroximethyl-1,4- benzodioxanes. Tetrahedron Asymmetry, (közlemény összeállítás alatt) 6. Kónya, K.; Kiss-Szikszai, A.; Kurtán, T.; Antus, S. evision of absolute configuration of (+)- silychristin possessing liver protective activity. Tetrahedron Letters, (közlemény összeállítás alatt) Egyéb közlemények / ther papers 7. Krohn, K.; Elsasser, B.; Antus, S.; Kónya, K.; Ammermann, E. Synthesis and structure-activity relationship of antifungal coniothyriomycin analogues. Journal of Antibiotics; 2003, 56, 296-305 Tudományos rendezvényeken bemutatott munkák / Presentations at scientific meetings Előadások / ral lectures 1. Kónya, K. Kísérletek optikailag aktív 8..4 -típusú neolignánok enantioszelektív előállítására. Tudományos Diákköri Konferencia (Debrecen, 1998. április 23.) 2. Kónya, K.; Juhász, L.; Antus, S. Kísérletek 4,8-típusú neolignánok enantioszelektív szintézisére. MTA Flavonoidkémiai Munkabizottság előadóülése (Debrecen, 1998. november 2-3.) 3. Kónya, K. Kísérletek 8..4 -típusú neolignánok enantioszelektív előállítására. rszágos Diákköri Konferencia (Veszprém, 1999. április 7-9.) 4. Kónya K.; Czompa, A.; Újhelyi, L.; Kiss, A.; Balla, J.; Kakuk, Gy.; Antus, S.; Varga, Zs. A silybin hatása a protein kináz C transzlokációjára, a NADP-oxidáz aktivitására és az apoptózisra 15

a PMA stimulálta humán neutrofilekben. Gyógynövények kutatása és felhasználása 2002 (Kecskemét, 2002. november 13-15.) 5. Kónya, K.; Kiss-Szikszai, A.; Kurtán, T.; Antus, S. -heterociklusos vegyületek kinetikus rezolválása. MTA Flavonoidkémiai Munkabizottság Tudományos Előadóülése (Budapest, KKKI, 2003. december 3.) 6. Juhász, L.; Kónya, K.; Kurtán, T.; Antus, S.; Kinetikus rezolválás az -heterociklusok körében. Elméleti Szerveskémiai Munkabizottsági ülés (Budapest, KKKI, 2005. január 27.) Poszterek / Posters 1. Kónya, K. Enantioselective Synthesis of 8.,4 -type of neolignans. 37 th IUPAC Congress and 27 th GDCh General Meeting (Németország, Berlin, 1999. augusztus 14-19.) 2. Kónya, K.; Varga, Zs.; Antus, S. 8,4 -xyneolignán származékok hatása a neutrofilek PMA stimulálta szuperoxidanion (.- 2 ) termelésére. (MÉT, Szeged, 2001. június 6-8.) 3. Kónya, K.; Kiss-Szikszai, A. Synthesis, PLC and Antioxidant Properties of 8..4 -Neolignans. XXII Corso Avanzato in Chimica Farmaceutica e Seminario Nazionale per Dottoranti E. Duranti (Italy, Urbino, 2002, július 1-5.) 4. Kónya, K.; Antus S.; Varga Zs.; Kiss-Szikszai, A. 8..4'-Neolignanok szintézise, LPC-s tulajdonságaik és antioxidáns hatásuk vizsgálata. Gyógynövények kutatása és felhasználása 2002 (Kecskemét, 2002. november 13-15.) 5. Kónya, K.; Kiss-Szikszai, A.; Antus, S. idroximetil-1,4-benzodioxán származékok enzim katalizáltkinetikus rezolválása. Vegyészkonferencia 2003 (ajdúszoboszló, 2003. június 26-28.) 6. Kónya, K.; Kiss-Szikszai, A.; Kurtán, T.; Antus, S. Enzyme catalyzed kinetic resolution of ydroxymethyl-1,4-benzodioxane derivatives. 9 th International Conference on Circular Dichroism in Chemistry and Life Sciences (ELTE Kongresszusi Központ, Budapest, 2003. augusztus 31. szeptember 4.) 7. Kónya, K.; Kiss-Szikszai, A.; Kurtán, T.; Antus, S. Enzyme catalyzed kinetic resolution of hydroxymethyl-1,4-benzodioxane derivatives. First German-ungarian Workshop (annover, Leibnizhaus, 2004. július 5-6.) 8. Kurtán, T.; Kónya, K.; Juhász, L.; Antus, S. Lipase-catalysed kinetic resolution of hydroxymethyl- 1,4-benzodioxanes and dihydrobenzo[b]furans. XXIst Europian Colloquium on eterocyclic 16

Chemistry (Sopron, 2004. szeptember 12-15.) 9. Kónya, K.; Kiss-Szikszai, A.; Compa A.; Antus, S. Újabb adatok a Pszeudomonas fluorescens aktív centrumának topológiájáról. Vegyészkonferencia 2005 (ajdúszoboszló, 2005. június 28-30.) 17

Krisztina Kónya: Synthesis of natural compounds with antioxidant properties Theses 18