Réti Andrea. Sem mel weis Egye tem, Pa to ló giai Dok to ri Is ko la, Bu da pest

NEM-SZTEROID GYULLADÁSGÁTLÓK ALKALMAZÁSA AZ 5-FLUOROURACIL HATÉKONYSÁGÁNAK NÖVELÉSÉRE KÍSÉRLETES RENDSZEREKBEN Réti Andrea Sem mel weis Egye tem, Pa to ló giai Dok to ri Is ko la, Bu da pest A fo ko zott COX-2 -exp resszió szá mos úton be fo lyá sol ja a tu mo rok kiala ku lá sát és prog resszió ját. A COX- 2 -o ve rexp resszió a spo ra di kus co lo rec ta lis car ci no mák 80%-á ban iga zol ha tó. A COX-2 en zim a nem-szte - roid gyul la dás gát lók legis mer tebb mo le ku lá ris cél pont ja. A co lo rec ta lis rák gyógy sze res ke ze lé sé nek alap pil - lé rét több mint 40 éve az 5-flu o ro u ra cil je len ti. Az 5-FU te rá piás ha tá sá nak fo ko zá sá ra szá mos tö rek vés irá nyul más gyógy sze rek kel, il let ve bi o mo du lá to rok kal. Az 5-FU a szer ve zet be ke rül ve az ak ti vá lás mel lett igen gyors ka ta bo liz mu son megy ke resz tül. A le bom lás el sô, se bes ség meg ha tá ro zó en zi me a di hid ro pi ri mi - din- de hid ro ge náz (DPD). Az int ra tu mo rá lis DPD ha mar a kli ni kai ér dek lô dés kö zép pont já ba ke rült, mi vel az emel ke dett DPD-ak ti vi tás az 5-FU ci to to xi kus ha tá sá nak csök ke né sét okoz hat ja. Kí sér le teink leg fôbb cél - ja a COX-2 gát lók és az 5-FU kom bi nált ke ze lé sek ha tá sá nak vizs gá la ta kí sér le ti rend sze re ken. Eh hez HCA-7 és HT-29 hu mán co lon ade no car ci no ma sejt vo na la kat és HT-29 sej tek bôl kiala kí tott xe no graf to kat hasz nál tunk. Kí sér le teink so rán vizs gál tuk, hogy a ma gas COX-2 -exp resszió, va la mint a COX-2 -exp - resszió gát lá sa nem-sze lek tív COX-2- gát ló in do me tha cin nal és sze lek tív COX-2- gát ló NS-398-cal be fo lyá - sol ja-e az 5-FU ci to to xi kus, il let ve tu mor gát ló ha tá sát. To váb bá, hogy az 5-FU ha té kony sá gá nak NSA ID - ok út ján tör té nô fo ko zá sá ban mi lyen me cha niz mu sok ját sza nak sze re pet. Ered mé nyeink alap ján el mond ha tó, hogy a COX-2 -exp resszió be fo lyá sol ja az 5-FU- ke ze lés sel szem ben mu ta tott ér zé keny sé get HCA-7 és kol la gén-in du kált HT-29 sej tek ben, va la mint HT-29 xe no graf tok ban, amely nek va ló szí nû sít he - tô oka el sô sor ban a COX-2 és a DPD en zi mek ko exp resszi ó ja. Az in do me tha cin és NS-398 szig ni fi kán san és szi ner gi sta mó don fo koz ta az 5-FU -ér zé keny sé get és a ci to to xi kus ha tást ma gas COX-2 -exp resszi ót mu - ta tó sejt vo na la kon és xe no graft mo del len azál tal, hogy a COX-2 -ak ti vi tás csök ken té se mel lett pár hu za mo - san gá tol ta a DPD en zim mrns-exp resszi ó ját és ak ti vi tá sát. Mindez a to váb biak ban fel ve ti olyan át fo gó, nagy be teg szá mú pros pek tív kli ni kai vizs gá lat szük sé gét, amely ben az 5-FU -a la pú ke mo te rá piák ese tén a tu mo rok COX-2- stá tu sza mel lett fi gye lem be ven nék a da ga na tos fáj dal mak vagy egyéb okok miatt al kal ma - zott nem-szte roid gyul la dás gát lók al kal ma zá sát. Ma gyar On ko ló gia 54: 377 381, 2010 Köz lés re ér ke zett: 2010. szep tem ber 14. El fo gad va: 2010. szep tem ber 30. Le ve le zé si cím: Dr. Ré ti And rea Or szá gos On ko ló giai In té zet Kli ni kai Kí sér le ti La bo ra tó riu mi Osz tály 1122 Bu da pest Ráth György u. 7 9. Te le fon: (06-1) 224-8600/1347 Fax: (06-1) 224-8620 E- ma il: and re a. re ti@on col. hu Té ma ve ze tô: Dr. Kra lo vánsz ky Ju dit Kulcs sza vak: cik loo xi ge náz-2, di hid ro pi ri mi din- de hid ro ge náz, 5-flu o ro u ra cil, in do me tha cin, NS-398 The elevated cyclooxygenase-2 (COX-2) expression has been shown to affect the carcinogenesis and tumor progression processes, including cell proliferation, motility and angiogenesis. COX-2 is overexpressed in approximately 80% of sporadic colorectal carcinomas and COX-2 enzyme is the best defined target of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs). In the chemotherapy of colorectal carcinomas 5-fluorouracil (5-FU) has been the most important of the basic drugs for more than 40 years. In order to improve the effectiveness of 5-FU therapy different biological modifiers i.e. inhibitors of its catabolism or activators of anabolism have been studied recently. The rate-limiting enzyme of 5-FU catabolism is dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) since more than 80% of the administered 5-FU is catabolized by DPD. Tumoral DPD has become of clinical interest because elevated intratumoral DPD can decrease the tumor response to 5-FU therapy. The main purpose of our experiments was to investigate the effect of COX inhibitors on the efficacy of 5-FU on high and low COX-2 expressing HCA-7 and HT- 29 human colon adenocarcinoma cell lines, respectively, and also on xenografts derived from HT-29 cells. The cytotoxic and antitumor effects of 5-FU in the presence of low doses of indomethacin (non-selective COX-2 inhibitor) and that of NS-398 (highly selective COX-2 inhibitor) on HT-29 and HCA-7 cells and also on the HT-29 xenograft were investigated. In addition, our intention was to understand the mechanism(s) by which NSAIDs could enhance the cytotoxic effect of 5-FU. Our data indicated that the elevated COX-2 expression of HCA-7, the collagen-induced HT-29-C cells and of the HT-29 xenograft were associated with reduced 5-FU sensitivity. Based on the fact that at the same time DPD activity was also increased it might be conceivable that a possible explanation for the decrease of 5-FU 377

R TI sensitivity is the co-existence of high COX-2 and DPD activity. Indomethacin or NS-398 enhanced in a simultaneous and significant manner the sensitivity and cytotoxic effect of 5-FU on high COX-2 expressing cells and xenografts through the modulation of DPD decrease of its mrna expression and/or enzyme activity. Based on our results it could be presumable that 5-FU efficacy is limited by the COX- 2 associated high DPD expression and activity in patients with colorectal cancer as well, therefore further clinical studies are warranted to decide if NSAIDs in the therapeutic protocol might improve the antitumor potency of 5-FU. Réti A. Application of non-steroidal anti-inflammatory drugs to enhance 5-fluorouracil efficacy in experimental systems. Hungarian Oncology 54: 377 381, 2010 Keywords: cyclooxygenase-2, dihydropyrimidine dehydrogenase, 5-fluorouracil, indomethacin, NS-398 BE VE ZE TÉS A vas tag- és vég bél rák ma is az egész ség ügy egyik leg - sú lyo sabb, megol dat lan prob lé má ja, vi lág szer te éven te 1 mil lió új co lo rec ta lis da ga na tot diag nosz ti zál nak. A co lo rec ta lis da ga na tok kiala ku lá sá ban kör nye ze ti és ge ne ti kai fak to rok egyaránt sze re pet ját sza nak. A co lo - rec ta lis da ga na tok meg je le né se az ese tek több sé gé ben (88 94%) spo ra di kus és csak 5 10% az örök lô dô for ma. A vas tag bél rák ke ze lé sé ben al kal ma zott gyógy sze rek kö re az el múlt év ti ze dek ben je len tô sen ki bô vült, de to - vább ra is az 5-flu o ro u ra cil (5-FU) ké pe zi e da ga nat tí pus te rá piá já nak ge rin cét. Az 5-FU ha tá sát nuk le o ti dok ká tör té nô ak ti vá lá sa után a ti mi di lát szin táz en zim gát lá - sá val, a DNS-be és az RNS-be va ló beépü lé sé vel fej ti ki. Az 5-FU a szer ve zet be ke rül ve az ak ti vá lás mel lett igen gyors ka ta bo liz mu son megy ke resz tül. Az al kal ma zott dó zis több mint 80%-a le bom lik. A le bom lás el sô, se bes - ség meg ha tá ro zó en zi me a di hid ro pi ri mi din- de hid ro ge - náz (DPD), amely az 5-FU-t inak tív di hid ro-f lu o ro u ra - cil lá (H 2 FU) ala kít ja át. Az 5-FU szûk te rá piás ab la ka miatt ha tá sá nak fo ko zá sá ra szá mos tö rek vés irá nyul más gyógy sze rek kel, il let ve bio ló giai vá lasz mó do sí tók - kal va ló kom bi ná ció for má já ban. Szá mos pa to fi zio ló giás fo lya mat ban iga zol ták a COX-2 ove rexp resszi ó ját, töb bek kö zött kü lön bö zô da - ga na tok ban, pél dául em lô-, tü dô-, nye lô csô- és vas tag - bél rá kok ban. Co lo rec ta lis da ga na tok ban össze füg gést ta lál tak a ma gas COX-2 -exp resszió, va la mint a na gyobb tu mor mé ret, a mé lyebb in vá zió és a nyi rok cso mó át té - tek szá ma kö zött. Szá mos ta nul mány ban be szá mol nak az emel ke dett COX-2 -exp resszió ked ve zôt len prog - nosz ti kai ha tá sá ról. A COX-2 fo ko zott exp resszi ó ja a prosz ta no i dok, el sô sor ban a PGE 2 ak ku mu lá ció já val jár. A PGE 2 szá mos úton be fo lyá sol ja a tu mo rok kiala ku lá - sát és prog resszió ját: pl. a sejtp ro li fe rá ció, a mo ti li tás, az an gi o ge ne zis fo ko zá sa stb. Már régóta is me re tes, hogy az asz pi rin, vagy más nem-szte roid gyul la dás csök ken tôk (NSA ID -ok) hosszú idôn át tar tó és rend sze res hasz ná la ta 30 50%-kal csök - ken tet te a co lo rec ta lis rák ri zi kó ját, az ade no ma to sus po li pok szá mát és mé re tét, va la mint a da ga na tos ha lá - lo zást. Az NSA ID -ok ke mop re ven tív ha tá sa a COX-2- gát lás nak és a prosz tag lan din szint csök ken té sé nek tu - laj do nít ha tó. A COX en zi mek az NSA ID -ok legis mer - tebb mo le ku lá ris cél pont jai. Szá mos ex pe ri men tá lis mun ká ban azt ta lál ták, hogy az NSA ID -ok fo koz zák a ha gyo má nyos ke mo te rá piás sze rek ha té kony sá gát. Azon ban meg kell je gyez ni, hogy a vizs gá la tok dön tô több sé gé ben az NSA ID -o kat a COX-2 -ak ti vi tás gát lá sá hoz szük sé ges nél ma ga sabb kon cent rá ció ban al kal maz ták, így COX-2- tôl füg get len ha tá saik is meg nyil vá nul nak. CÉL KI TÛ ZÉ SEK Mun kám ban a COX-2- gát lók és az 5-FU kom bi nált ha - tá sá nak kí sér le ti rend sze re ken tör té nô vizs gá la tát he - lyez tem kö zép pont ba, az zal a cél lal, hogy megál la pít - sam a kö vet ke zô ket: 1. Van-e össze füg gés a COX-2-t kons ti tu tí van exp - resszá ló HCA-7 és a COX-2-t ala cso nyan exp resszá ló HT-29 sejt vo na lak és a be lô lük kiala kí tott xe no graf - tok COX-2 -exp resszi ó ja és az 5-FU ci to to xi kus, ill. tu - mor gát ló ha tá sa kö zött? 2. A COX-2 gát lá sa a sze lek tív COX-2- gát ló NS-398-cal és a nem sze lek tív COX-2- gát ló in do me tha cin nal fo - koz za-e az 5-FU ha té kony sá gát a fent em lí tett sejt vo - na la kon és xe no graf to kon? 3. Mi lyen me cha niz mu sok ját sza nak sze re pet az 5-FU ha té kony sá gá nak NSA ID -ok út ján tör té nô fo ko zá sá - ban? A fel tett kér dé sek meg vá la szo lá sá hoz az aláb bi felada - tok megol dá sát tûz tük ki cé lul: 1a) A HCA-7 és HT-29 co lon ade no car ci no ma sejt vo na - lak és a be lô lük kiala kí tott xe no graf tok jel lem zé se az 5-FU- szen zi ti vi tás fôbb far ma ko ge ne ti kai és far - ma ko bi o ké mi ai pa ra mé te rei ti mi di lát szin táz (TS) és 5,10-me ti lén tet ra hid ro fo lát- re duk táz (MTHFR) gén po li mor fiz mu sok és a DPD-ak ti vi tás meg ha tá - ro zá sa alap ján. 1b) Össze füg gés ke re sé se a sejt vo na lak és xe no graf tok COX-2 fe hér je -exp resszi ó ja (IHC, Wes tern blot és im - munf lu o resz cen cia) és az 5-FU ha té kony sá ga kö zött. 2a) A sejt vo na la kon és a xe no graft tu mo ro kon az 5-FU, a nem-szte roid gyul la dás csök ken tôk és kom bi ná - ció juk an tip ro li fe ra tív (IC 50 ér té kek) és tu mor gát ló ha tá sá nak (re la tív tu mor nö ve ke dés-gát lás) vizs gá la ta. 2b) Ha tó anyag-köl csön ha tás vizs gá la ta az 5-FU+NSAID kom bi nált ke ze lé sek ese té ben. 378

NSA ID -OK HA T SA AZ 5-FU- KE ZE L S RE 3a) A sejt élet cik lus fá zi sai nak megosz lá sa és az apop tó - zis vál to zá sa 5-FU, NSA ID -ok és kom bi nált ke ze lé - sek ha tá sá ra (FACS ana lí zis). 3b) Az 5-FU, az NSA ID -ok és kom bi ná ció juk ha tá sa a COX-2 fe hér je exp resszi ó já ra és en zim ak ti vi tá sá ra sejt vo na la kon és xe no graf ton (IHC, WB, ELI SA). 3c) A COX-2- és a DPD-en zi mak ti vi tás és mrns-exp - resszió vál to zá sa az 5-FU, az NSA ID -ok és kom bi - nált al kal ma zá suk ha tá sá ra (ELI SA, DPD-ak ti vi tás meg ha tá ro zá sa, RT-PCR). ANYA GOK ÉS MÓD SZE REK Az 5-FU- szen zi ti vi tás far ma ko ge ne ti kai jel lem zé se. HCA-7 és HT-29 sejt vo na la kon és xe no graf to kon az 5-FU -ér zé - keny ség meg ha tá ro zá sa cél já ból a TS 5 TSER és 3 TSUTR po li mor fiz mu sok vizs gá la ta PCR-a na lí zis sel, az MTHFR C677T po li mor fiz mus vizs gá la ta PCR-RFLP mód szer rel tör tént. Az 5-FU IC 50 ér té ke ket nem-li neá ris dó zis-ha tás gör be fel vé te lé vel ha tá roz tuk meg. Im munf lu o resz cens fes tés, im mun hisz to ké mia és Wes tern blot ana lí zis. A vizs gá la to kat a COX-2 pro tein exp resszi - ó já nak ki mu ta tá sa cél já ból vé gez tük. Prosz tag lan din E 2 (PGE 2 ) kon cent rá ció meg ha tá ro zá sa. A PGE 2 mé ré sét ELI SA- kit tel vé gez tük, sejt te nyé sze tek ese tén a táp fo lya dék ból vett min ták ból, xe no graft tu - mo rok ese tén ci to szol ból. Sejt nö ve ke dés vizs gá la ta. Az 5-FU, az NSA ID -ok, il let - ve az 5-FU+NSA ID ke ze lé sek sejtp ro li fe rá ci ó ra gya ko - rolt ha tá sá nak vizs gá la tá hoz szul fo ro da min B (SRB) ko - lo ri met riás tesz tet hasz nál tunk. Kol la gén IV ha tá sá nak vizs gá la ta HT-29 sej te ken. Hat- és 96 lyu kú te nyész tô le me ze ken, ill. üveg fe dô le me ze ken IV-es tí pu sú hu mán kol la gén nel be vo na tot ké pez tünk. A HT-29 sej te ket, ame lye ket a ke let ke zett be vo na ton 4 órán ke resz tül te nyész tet tünk, HT-29-C sej tek nek ne - vez tük. DPD-en zi mak ti vi tás meg ha tá ro zá sa. A DPD-ak ti vi tás meg ha tá ro zá sa ra di o en zi ma ti kus mé rés sel tör tént A ci to - szólt [6-14 C] 5-FU- val, mint szubszt rát tal in ku bál tuk. Az 5-FU-t és a ke let ke zett H 2 FU-t HPLC-vel vá lasz tot tuk szét. A ra dioak ti vi tást Bi os can de tek tor ral mér tük. A DPD-ak ti vi tást 1 mg fe hér jé re vo nat koz ta tott per cen - ként ke let ke zett ka ta bo lit, a di hid ro-5-f lu o ro u ra cil (H 2 FU) mennyi sé gé vel jel le mez tük (pmol/min/mg pro tein). Ke ze lé sek. A vizs gá la tok so rán a HCA-7 és a HT-29 sej te ket az 5-FU- val az ál ta lunk meg ha tá ro zott IC 50 kon - cent rá ción ke zel tük. Alap ve tôen fon tos nak tar tot tuk, hogy a COX-2 -en zi mak ti vi tás 50%-os gát lá sá hoz szük - sé ges kon cent rá ción dol goz zunk. Iro dal mi ada tok ra ala poz va az in vit ro vizs gá la tok so rán a nem-sze lek tív COX-2- gát ló in do me tha cin kon cent rá ció ja 10 µm, a sze - lek tív COX-2- gát ló NS-398 ese té ben pe dig 1,77 µm volt. Sejt fá zis-megosz lás és apop tó zis vizs gá la ta. Az 5-FU, az NSA ID -ok és a kom bi nált ke ze lé sek ha tá sá nak vizs gá - la tát a sejt cik lus ra és az apop tó zis ra FACS can áram lá si ci to mé ter rel vé gez tük. Kvan ti ta tív va lós-i de jû PCR. A DPD és COX-2 mrnsexp resszi ók meg ha tá ro zá sa RT-PCR tech ni ká val tör tént. Hu mán tu mor xe no graft kiala kí tá sa és ke ze lé se. A HCA- 7, il let ve a HT-29 sej te ket 6 hetes nôs tény SCID ege rek hát bô re alá (sc.) ol tot tuk. A tu mo ros ál la to kat 2 nagy vizs gá la ti cso port ra osz tot tuk: 1.) Az 5-FU és az 5-FU + in do me tha cin, ill. az 5-FU + NS-398 ke ze lé sek da ga nat - el le nes ha tá sá nak vizs gá la ta. A ke ze lé sek 5 na pig tar tot - tak. Az NSA ID -ok ha tá sát egy ala csony (6 mg/kg/nap) és egy ma gas (30 mg/kg/nap) 5-FU- dó zis sal tör tént kom bi ná ció ese tén vizs gál tuk. A tu mor gát ló ha tást a re - la tív tu mor nö ve ke dés vál to zá sa alap ján ál la pí tot tuk meg. 2.) A 3 x 5 na pig tar tó in do me tha cin- és NS-398- ke ze lé sek COX-2- és DPD-ak ti vi tás ra gya ko rolt ha tá sá - nak vizs gá la ta. Az 5-FU és az in do me tha cin, illet ve NS-398 kö zöt ti ha - tó anyag-köl csön ha tá sok vizs gá la ta. Az 5-FU és az in do - me tha cin, ill. az NS-398 kom bi ná ciók köl csön ha tá sá - nak vizs gá la tát Kern és mtsai leírá sa alap ján (1988) vé gez tük. ERED MÉ NYEK A HCA-7 és HT-29 sejt vo na lak és xe no graf tok jel lem zé se az 5-FU- szen zi ti vi tás és a COX-2 -exp resszió alap ján A HCA-7 sejt vo nal igen mér sé kelt ér zé keny sé get mu ta - tott az 5-FU- val szem ben (IC 50 =1,1 mm). Az ered mé - nyek össze füg gést mu tat tak a far ma ko bi o ló gi ai pa ra - mé te rek kel, azaz a 5 TSER 3R ho mo zi gó ta, az MTHFR C677T he te ro zi gó ta ge no tí pus és a ma gas DPD-en zim - ak ti vi tás fel té te lez he tôen hoz zá já rul a HCA-7 5-FU- val szem ben mu ta tott csök kent ér zé keny sé gé hez. HT-29 sej tek ese té ben a 5 TSER ré gió ban ta lált 2R ho mo zi gó ta ge no tí pus, va la mint a gén 3 UTR ré gió já ban meg fi gyelt 6 bp ho mo zi gó ta ge no tí pus az ala cso nyabb TS-exp - resszi ót, az MTHFR T ho mo zi gó ta mu táns ge no tí pus, va la mint az ala csony DPD-ak ti vi tás a ma ga sabb 5-FU - ér zé keny sé get jel zik (IC 50 =10 µm). A HCA-7 sej te ken ma gas, a HT-29 sej te ken ala csony COX-2 fe hér je -exp resszi ót fi gyel tünk meg. A HT-29 xe - no graf tok ese té ben a sej tek hez ké pest ma ga sabb COX- 2 -exp resszi ót ta pasz tal tunk. COX-2 -ak ti vi tást a PGE 2 - kon cent rá ci ó val jel le mez tük, amely mind a sejt vo na lak, mind a xe no graf tok ese té ben össze vet he tô volt a COX- 2 fe hér je exp resszi ó já val. Az 5-FU és NSA ID ke ze lé sek ci to to xi kus és tu mor gát ló ha - tá sá nak vizs gá la ta sejt vo na la kon és xe no graf ton A ma gas COX-2 -exp resszi ót mu ta tó HCA-7 sej tek ese té ben az in do me tha cin és az NS-398 48 órás ke ze lés so rán szig ni fi kán san fo koz ták az 5-FU pro li fe rá ci ó gát ló ha tá sát. Az ala csony COX-2 -exp resszi ót mu ta tó HT-29 sej tek ese tén az 5-FU + NSA ID kom bi nált ke ze lé sek pro li fe rá ci ó gát ló ha tá sa azo nos volt az ön ál ló 5-FU- ke - ze lé sé vel. 379

R TI A COX-2 -exp resszi ót mu ta tó HT-29 xe no graf to kon a 6 mg/kg/nap 5-FU ci to to xi kus ha tá sát mind az in do - me tha cin, mind az NS-398 szig ni fi kán san fo koz ta. A 6 mg/kg/nap 5-FU + NSA ID kom bi nált ke ze lé sek ál tal ki vál tott tu mor nö ve ke dés-gát lás össze vet he tô volt a nagy dó zi sú (30 mg/kg/nap) 5-FU- mo no te rá pia ci to to - xi kus ha tá sá val. Az NSA ID -ok a 30 mg/kg/nap dó zi sú 5-FU ci to to xi kus ha tá sát nem fo koz ták to vább. A ha tó anyag-köl csön ha tás meg ha tá ro zá sá val ka pott ered mé nyeink sze rint a ma gas COX-2 -exp resszi ót mu - ta tó HCA-7 sej tek és HT-29 xe no graf tok ese tén az 5-FU + NSA ID köl csön ha tás tí pu sa erô sen szi ner gi sta, míg az ala csony COX-2 -exp resszi ót mu ta tó HT-29 sej tek ese tén a köl csön ha tás a gyen gén an ta go nis ta és az ad di - tív ha tás kö zött volt. Az 5-FU + NSA ID kom bi ná ció fo ko zott ci to to xi kus ha tá sá ban sze re pet ját szó me cha niz mu sok Az 5-FU, az NSA ID -ok és kom bi ná ció juk ha tá sa a sejt cik lus - ra és az apop tó zis ra. HCA-7 sej te ken a 48 órás 5-FU + NSA ID kom bi nált ke ze lé sek szig ni fi kán san meg nö vel - ték az S-fá zi sú sej tek ará nyát és az apop to ti kus sej tek szá mát az ön ál ló 5-FU- ke ze lé shez ké pest. Ez zel szem - ben HT-29-sej te ken 48 órás ke ze lés ese tén az ön ál ló 5- FU- ke ze lés je len tô sebb S-fá zis-fel hal mo zó dást oko zott, míg a kom bi nált ke ze lé sek nem vol tak ha tás sal a sej tek cik lu son be lü li elosz lá sá ra az 5-FU- mo no te rá pi á hoz vi - szo nyít va. A kom bi nált ke ze lé sek nem be fo lyá sol ták az apop to ti kus sej tek szá mát. Az 5-FU, az NSA ID -ok és kom bi ná ció juk ha tá sa a COX- 2 fe hér je exp resszi ó já ra. Megál la pí tot tuk, hogy a ma gas COX-2 -exp resszi ót mu ta tó HCA-7 sej te ken és a HT-29 xe no graf to kon az NSA ID- ke ze lé sek nem a COX-2 pro - tein exp resszi ó já nak be fo lyá so lá sán ke resz tül fo koz ták az 5-FU ci to to xi kus ha tá sát. Az NSA ID- ke ze lé sek ha tá sa a PGE 2 - kon cent rá ci ó ra és a DPD-en zi mak ti vi tás ra. Vizs gá la taink ból ar ra a kö vet kez - te tés re ju tot tunk, hogy az NSA ID -ok nem a COX-2 fe - hér je exp resszi ó já nak meg vál toz ta tá sán ke resz tül fo - koz ták az 5-FU ci to to xi ci tá sát, így fel me rült a kér dés, hogy eset leg be fo lyá sol ják-e az 5-FU me ta bo liz mu sát. A to váb biak ban vizs gál tuk az NSA ID -ok ha tá sát a DPD en zim ak ti vi tá sá ra. A ma gas COX-2 -exp resszi ót mu ta tó HCA-7 sej te ken és HT-29 xe no graf to kon az in do me tha cin és NS-398 szi - mul tán csök ken tet te a COX-2- és DPD-ak ti vi tást, amely a HCA-7 sej tek ese tén már 24 órás NSA ID ke ze lés után meg fi gyel he tô. Az NSA ID- ke ze lé sek szig ni fi káns csök - ke nést okoz tak a COX-2 és DPD en zim mrns-exp - resszi ó já ban a kont roll hoz vi szo nyít va. A COX-2 és a DPD en zi mek ko exp resszi ó já nak vizs gá la ta kol la gén-in du kált HT-29 sej te ken. A két en zim ko exp - resszi ó já nak vizs gá la tá ra HT-29 sej tek ben kol la gén nel in du kál tuk a COX-2 -exp resszi ót, amely nek ered mé nye - ként a COX-2 vál to zá sá val pár hu za mo san a DPD fe hér - je- és mrns-exp resszi ó ja, va la mint en zim ak ti vi tá sa is emel ke dett a kol la gén-in du kált HT-29 (HT-29-C) sej tek - ben az ere de ti sej tek hez ké pest. A fen ti ered mé nye ket megerô sí ti az a tény is, hogy az ere de ti HT-29 sej tek nél ala csony PGE 2 - kon cent rá ci ót és DPD-ak ti vi tást ta lál - tunk. Meg fi gyel tük to váb bá, hogy a kol la gén nel in du kált COX-2- és DPD-exp resszió a HT-29-C sej te ken csök ken - ti az 5-FU -ér zé keny sé get, mi köz ben az NSA ID -ok fo - koz zák az 5-FU ci to to xi kus ha tá sát. Az ered mé nyek ha - son lóak a kons ti tu tí van ma gas COX-2 -exp resszi ót mu ta tó HCA-7 sej te ken az 5-FU + NSA ID kom bi ná - ciók nál már ko ráb ban meg fi gyel tek hez, ahol a szig ni fi - káns ha tás lét re jöt té hez 48 órás ke ze lés szük sé ges. HT- 29-C sej tek nél vi szont, ahol in du kál tuk a COX-2- és DPD-ak ti vi tást, az NSA ID -ok már 8 órás ke ze lés után szig ni fi kán san fo koz zák az 5-FU ha tá sát. Az 5-FU és az NSA ID -ok kö zöt ti ha tó anyag-köl csön - ha tást vizs gál va megál la pí tot tuk, hogy a HT-29-C sej te - ken, ha son lóan a szin tén ma gas COX-2 -exp resszi ót mu - ta tó HCA-7 sej tek hez és HT-29 xe no graf tok hoz, az 5-FU + NSA ID kom bi ná ciók ese tén mind az in do me tha cin, mind az NS-398 szi ner gi sta mó don fo koz ta az 5-FU pro li fe rá ci ó gát ló ha tá sát. Az 5-FU és NSA ID ke ze lé sek ha tá sa a DPD mrns-exp - resszi ó ra és -en zim ak ti vi tás ra HT-29-C és HCA-7 sej te ken va la mint HT-29 xe no graf ton. Megál la pí tot tuk, hogy a ma - gas COX-2 -ex pesszi ót mu ta tó HCA-7 és HT-29-C sej te - ken és HT-29 xe no graft tu mo ro kon egyaránt, az 5-FU + NSA ID kom bi nált ke ze lé sek ha tá sá ra a DPD en zim - ak ti vi tá sa és mrns-exp resszi ó ja szig ni fi kán san le csök - kent az ön ál ló 5-FU- ke ze lé shez vi szo nyít va, amely nek oka az in do me tha cin és NS-398 ál tal oko zott szi mul tán COX-2- és DPD-en zi mak ti vi tás- gát lás. KÖ VET KEZ TE TÉ SEK, ÚJ MEGÁL LA PÍ TÁ SOK 1. A HCA-7 és HT-29 co lon tu mor sej tek és xe no graf tok ese tén for dí tott össze füg gés van a COX-2 -exp resszió és az 5-flu o ro u ra cil -ér zé keny ség kö zött, amely fel ve ti an nak szük sé ges sé gét, hogy a ke mo te rá piák ter ve zé - se kor ve gyék fi gye lem be a tu mo rok COX-2- stá tu szát. 2. Az in do me tha cin és NS-398 szig ni fi kán san fo koz ták az 5-FU -ér zé keny sé get és a ci to to xi kus ha tást ma gas COX-2 -exp resszi ót mu ta tó sejt vo na la kon és xe no - graft mo del len. 3. Ta nul má nyunk ban el sô ként fi gyel tük meg a COX-2 és DPD en zi mek ko exp resszi ó ját sejt vo na la kon és xe no - graf ton, ame lyet mo dell kí sér let ben is bi zo nyí tot tunk, mi vel HT-29 sej te ken kol la gén IV ha tá sá ra a COX-2 in - duk ció ja pár hu za mo san emel ke dett DPD-ak ti vi tást ered mé nye zett. To váb bi vizs gá la tok szük sé ge sek, hogy megerô sít sük meg fi gye lé sün ket, to váb bá, hogy a két en zim ko exp resszi ó já nak me cha niz mu sát fel tár juk. 4. A in do me tha cin és NS-398 a COX-2 gát lá sa mel lett csök ken ti az 5-FU le bon tá sá ban je len tôs sze re pet ját - szó DPD en zim ak ti vi tá sát, ami kor re lá ciót mu tat az 5-FU ha té kony sá gá nak fo ko zó dá sá val. Az in do me - 380

NSA ID -OK HA T SA AZ 5-FU- KE ZE L S RE tha cin és NS-398 ál tal oko zott szi mul tán COX-2- és DPD-en zi mak ti vi tás- gát lás ma gya ráz hat ja az 5-FU ci to to xi kus ha tá sá nak fo ko zó dá sát, és fel ve ti a nemszte roid gyul la dás gát lók 5-FU- mo du lá tor ként va ló al kal ma zá sát el sô sor ban a COX-2-t ma ga san exp - resszá ló da ga na tok ban. KÖ SZÖ NET NYIL VÁ NÍ TÁS Kö szö net tel tar to zom Prof. Dr. Kás ler Mik lós egye te mi ta nár nak, az Or szá gos On ko ló giai In té zet Fô igaz ga tó já - nak, hogy mun ká mat le he tô vé tet te és tá mo gat ta. Kiemel ke dôen há lás kö szö ne te met sze ret ném ki fe - jez ni té ma ve ze tôm nek, Dr. Kra lo vánsz ky Ju dit tu do má - nyos osz tály ve ze tô nek, aki mun kám so rán mind vé gig nagy oda fi gye lés sel irá nyí tott, mind szak mai lag, mind em be ri leg ma xi má li san tá mo ga tott és biz to sí tot ta a le - he tô sé get, hogy a la bo ra tó riu má ban dol goz zam. Kö szö ne tet sze ret nék mon da ni Dr. Bu dai Bar na mun ka tár sam nak az egész ku ta tás alatt nyúj tott szak - mai se gít sé gért. A mun kám so rán fel me rü lô kér dé sek kö zös meg vi ta tá sá ból ren ge te get ta nul tam. Kü lön kö - szö nöm Pap Éva mun ka tár sam nak a DPD-ak ti vi tás mé - ré sé ben nyúj tott se gít sé gét, pre cíz mun ka vég zé se pél - da mu ta tó szá mom ra. Há lás va gyok Dr. Ad leff Vil mos mun ka tár sam nak, aki hasznos tu do má nyos ta ná csai val és szé les kö rû kí sér le ti ta pasz ta la tai val szá mos ne héz sé - gen se gí tett át. Sze ret ném meg kö szön ni a Sem mel weis Egye tem I. sz. Pa to ló giai In té ze té bôl Dr. Je ney And rás egye te mi ta nár nak, hogy se gít sé gé re, ér té kes ta ná csai ra min dig szá mít hat tam. Kö szö nöm to váb bá Dr. Za lat nai At ti la egye te mi do cens nek az im mun hisz to ké mi ai vizs gá la - tok ban nyúj tott se gít sé gét, Dr. Bar na Gá bor tu do má - nyos mun ka társ nak az áram lá si ci to mé ter rel vég zett vizs gá la to kat, Oláh Lász ló né gyógy sze rész nek se gít sé - gét és gya kor la ti ta ná csait. Kö szö net tel tar to zom Dr. Ga ál De zsô osz tály ve ze tô - nek és Dr. Pé ter Ilo na osz tály ve ze tô-he lyet tes nek (Or - szá gos On ko ló giai In té zet) a mun kám hoz nyúj tott ér té - kes se gít sé gü kért. Mun ka cso por tunk va la mennyi, ed dig nem em lí tett tag já nak Kút völ gyi Fe renc né, Ma kács né Po lé nyi Csil - la, Mo u sá né Éber And rea, Nagy At ti la, Osz ta fin Sán dor - né sze ret ném meg kö szön ni, hogy a kí sér le tek ki vi te le - zé se so rán nyúj tott se gít sé gük re min dig szá mít hat tam, to váb bá az ál lat kí sér le tek so rán nyúj tott ér té kes se gít sé - gü kért kö szö net tel tar to zom Szto do la And rás és Bor za A. Mó ni ka mun ka tár sak nak (Sem mel weis Egye tem I. sz. Pa to ló giai In té zet). Vé gül, de nem utol só sor ban há lás va gyok Csa lá - dom nak, hogy cél jaim eléré sé ben tá mo gat tak, és sze re - te tük re, megér té sük re min dig tá masz kod hat tam. SA JÁT KÖZ LE MÉ NYEK Az ér te ke zés té má já val kap cso la tos köz le mé nyek 1. Ré ti A, Bar na G, Pap E, et al. En han ce ment of 5-flu o - ro u ra cil ef fi ca cy on high COX-2 exp res sing HCA-7 cells by low do se in do me tha cin and NS-398 but not on low COX-2 exp res sing HT-29 cells. Pa thol On col Res15:335 344, 2009 2. Ré ti A, Pap E, Za lat nai A, et al. Co -in hi bi ti on of cyc - loo xy ge na se-2 and di hyd ro py ri mi di ne de hyd ro ge - na se by non- ste ro i dal an ti -inf lam ma to ry drugs in tu mor cells and xe no grafts. An ti can cer Res 29:3095 3101, 2009 3. Ré ti A, Pap E, Ad leff V, et al. En han ced 5-flu o ro u ra - cil cy to to xi city in high cyc loo xy ge na se-2 exp res sing co lo rec tal can cer cells and xe no grafts in du ced by non- ste ro i dal an ti -inf lam ma to ry drugs via down re - gu la ti on of di hyd ro py ri mi di ne de hyd ro ge na se. Can - cer Che mo ther Phar ma col 66:219 227, 2010 Egyéb on ko ló giai té má jú köz le mé nyek 1. Kra lo vánsz ky J, Ad leff V, Ré ti A, et al. Far ma ko ge - ne ti kai vizs gá la tok a flu o ro pi ri mi dint tar tal ma zó ad - ju váns ke ze lés ha té kony sá gá nak és to xi ci tá sá nak elô - re jel zé sé re co lo rec ta lis da ga na tok ban. Ma gyar On ko ló gia 51:113 125, 2007 2. Szo bosz lai N, Ré ti A, Bu dai B, et al. Di rect ele men tal analy sis of can cer cell li nes by to tal ref lec ti on X-ray flu o res cen ce. Spect ro chi mi ca Ac ta Part B: Ato mic Spect ros co py 63:1480 1484, 2008 Az ér te ke zés té má já hoz kap cso ló dó idéz he tô abszt rak tok 1. Ré ti A, Bu dai B, Kom ló si V, et al. A COX-2- gát lás sze - re pe az 5-FU ke ze lés ha té kony sá gá ban sejt vo na la kon és xe no graft tu mo ron. Ma gyar On ko ló gia 49(35):75, 2005 2. Ré ti A, Bu dai B, Kom ló si V, et al The combined effect of non-selective cyclooxygenase-2 inhibitor indomethacin and 5-fluorouracil treatment on colorectal cancer cell lines and xenografts. Eur J Cancer 5(Suppl):72, 2007 3. Réti A, Budai B, Komlósi V, et al. The combined effect of a non selective and a selective cyclooxygenase-2 inhibitor and 5-fluorouracil treatment on HCA-7 human colorectal carcinoma cell line. Eur J Cancer 6(Suppl):30, 2008 4. Ré ti A, Pap É, Bu dai B, et al. Cik loo xi ge náz-2 (COX- 2) és di hid ro pi ri mi din de hid ro ge náz (DPD) együt tes gát lá sa nem szte roid gyul la dás gát lók kal ma gas COX-2 exp resszi ót mu ta tó sejt vo na lon és xe no graf - ton. Ma gyar On ko ló gia 53(Suppl):102, 2009 381