HASZNÁLATI UTASÍTÁSOK HASZNÁLATRA KÉSZ TÁPTALAJOK PA-254035.05 Változat: Sep 2011 BD Mueller Hinton Chocolate Agar HASZNÁLATI JAVASLAT A BD Mueller Hinton Chocolate Agar táptalajt a klinikai mintákból származó érzékeny baktériumok izolálására és tenyésztésére használják. Használják még a Neisseria gonorrhoeae antibiotikumérzékenységének vizsgálatára is. AZ ELJÁRÁS ELVE ÉS MAGYARÁZATA Mikrobiológiai módszer. Mivel a mikrobiológiai laboratóriumok a 1960-as évek elején rengeteg féle módszert használtak a baktériumoknak az antibiotikumokkal és más hatóanyagokkal szembeni érzékenységét, Bauer, Kirby és munkatársaik kidolgoztak egy standard eljárást, melyben a Mueller Hinton Agart, egy amúgy gonococcusok izolálására kifejlesztett táptalajt, választottak teszttáptalajnak. 1-4 Azt követően, egy nemzetközi együttműködésben elvégzett tanulmány megerősítette ezt a választást, mert a Mueller Hinton Agar egy viszonylag jól reprodukálható táptalaj, receptúrája egyszerű, és eddigi alkalmazása során már bőséges adatbázis gyűlt össze vele kapcsolatban. 5 Az CLSI-nek megfelelően a Streptococcus pneumoniae korong diffúziós antibiotikumérzékenység vizsgálatához ajánlott táptalaj a Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood. A Haemophilus influenzae esetében az ajánlott táptalaj a Haemophilus Test Medium (HTM) Agar. Az interpretive kritériumokat az CLSI Document M100 (M2) tartalmazza, mely a CLSI Document M2, Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests, 7th ed.; Approved Standard része. 6 Neisseria gonorrhoeae esetében az ajánlott táptalaj egy GC Agar, a meghatározott növekedési tényeőkkel kiegészítve. Más adatoknak megfeleloen a heminnel ás Iso-VitaleX-szel dúsított Mueller Hinton Agar-t a N. gonorrhoeae rutin penicillin és spectomycin érzékenységének vizsgálatára is használják. 7 A DB Mueller Hinton Chocolate Agart, hőkezelt vérrel vagy hemogliobinnal és növekedési faktorokkal (pl. BD IsoVitaleX ) kiegészítve, írják elő, mint nem szelektáló táptalajt, a Neisseria és Haemophilus izolálására. A DB Mueller Hinton Chocolate Agar-ban húskivonat és kazein peptonok biztosítják a tápanyagokat. A keményítő felszívja a toxikus anyagokat, pl. a vatta mintavevő pálcikáról származó zsírsavakat. A hemoglobin biztosítja az X-faktort. A BD IsoVitaleX biztosítja a vitaminokat és a növekedési faktorokat, beleértve a V-faktort (=NAD), mely feltétlenül szükséges a Haemophilus influenzae növekedéséhez. REAGENSEK DB Mueller Hinton Chocolate Agar 1 liter szűrt vízre vonatkoztatva* Húskivonat 2,0 g Kazein savas hidrolizátuma 17,5 Keményítő 1,5 Hemoglobin 10,0 IsoVitaleX 10,0 ml Agar 17,0 g ph 7,3 ± -0,2 *Úgy beállítva és/vagy összekeverve, hogy megfeleljen a működési követelményeknek. PA-254035.05-1 -
A BD IsoVitalex Enrichment a következő növekedési faktorokat tartalmazza (1 liter szűrt vízre vonatkoztatva*): B 12 vitamin 0,01 g L-glutamin 10,0 Adenin 1,0 Guanin-hidroklorid 0,03 p-aminobenzoesav 0,013 Nikotinamid adenin dinukleotid (NAD) 0,25 Tiamin pirofoszfát 0,1 Vas-(III)-nitrát 0,02 Tiamin-hidroklorid 0,003 Cisztein-hidroklorid 25,9 L-cisztin 1,1 Glükóz 100,0 *Úgy beállítva és/vagy összekeverve, hogy megfeleljen a működési követelményeknek. FIGYELMEZTETÉS. Használata szakértelmet igényel. Ne használja a lemezeket, ha azon mikrobiális szennyeződés, kiszáradás és betöredezés, illetve a károsodás bármilyen más jelét észleli. Amennyiben ez a táptalaj kiszáradás miatt erosen zsugorodott, úgy az hamis eredményekhez vezethet. A steril munkával, a biológiai veszélyekkel és a használt termékek hulladékként való kezelésével kapcsolatban olvassa el az ÁLTALÁNOS HASZNÁLATI ÚTMUTATÓT. TÁROLÁS ÉS ELTARTHATÓSÁG Átvétel után felhasználásig, a lemezeket sötét helyen, 2-8 C-on az eredeti lezárt tasakban tárolja. Kerülni kell a lemezek megfagyását, illetve túlmelegedését. A lemezeket a lejárati időn belül kell inokulálni (lásd: csomagolás címkéje) és az előírt inkubációs időt be kell tartani. A felbontott 10-es csomagolás lemezeit, tiszta helyen, 2-8 C-on tárolva, egy héten belül fel kell használni. FELHASZNÁLÓI MINŐSÉGI ELLENŐRZÉS Inokulálja a reprezentatív mintát a következő törzsekkel (a részletekért, lásd: ÁLTALÁNOS HASZNÁLATI ÚTMUTATÓT). Az inokulált lemezeket 35 ± 2 C-on, széndioxiddal dúsított, aerob körülmények között inkubálja. A lemezeket 18-24 óra és 42-48 óra inkubáció után értékelje. Törzsek Várt eredmény Haemophilus influenzae ATCC 10211 Jó kiváló növekedés Neisseria gonorrhoeae ATCC 43069 Elégséges kiváló növekedés Neisseria meningitidis ATCC 13090 Jó kiváló növekedés Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 Nem inokulált Jó kiváló növekedés Csokoládé barna; átlátszatlan; enyhén inhomogén lehet Az antibiotikumérzékenységi tesztekhez szükséges inokuláció és inkubációt lásd: Eljárás kivitelezése. Teszt törzsek Antibiotikumérzékenys ég-mérő korongok Gátlási zóna mérete* (mm) Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 Penicillin P-01 33-40 Spectinomycin SPT-100 25-31 * Három különböző BD Mueller Hinton Chocolate Agar tételből származó gátlási zóna méretek alapján PA-254035.05-2 -
ELJÁRÁS Szállított anyagok BD Mueller Hinton Chocolate Agar (90 mm Stacker lemezek). Mikrobiológiailag ellenőrzött Nem szállított anyagok Kiegészítő táptalajok, reagensek, laboratóriumi eszközök, az előírásoknak megfelelően. Minták típusa A BD Mueller Hinton Chocolate Agar táptalajt elvileg minden olyan fertőzött mintához lehet használni, melyben vélhetőleg érzékeny mikroorganizmusok találhatók, különösképpen, de nem kizárólag eredetileg steril testüregekből (pl. gerincvelői folyadék, tályogok) származó mintákhoz, valamint a vérkultúrák szubkultúráinak táptalajaként. Elsősorban a Neisseria, Haemophilus és más olyan baktériumok nem szelektív izolálására használják, melyek a rutinszerűen használt véres agarokon (pl. Columbia Agar with 5% Sheep Blood) nem mindig nőnek,. (Lásd még TELJESÍTMÉNY JELLEMZŐK ÉS AZ ELJÁRÁS KORLÁTAI) Ahhoz, hogy ezen a táptalajon rutinszerűen tesztelhessék a Neisseria gonorrhoeae penicillin G és Spectinomycin érzékenységét, tiszta tenyészeteket kell használni. Az antibiotikumérzékenységi vizsgálathoz soha se közvetlenül a mintával inokuláljon! Minták gyűjtése és szállítása A Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis, Haemophilus és más érzékeny mikroorganizmusok érzékenyen reagálnak a kedvezőtlen környezeti tényezőkre. Ezért az összes minta szállításához megfelelő transzportközeget kell használni. A mintákat a lehető leghamarabb el kell juttatni a laboratóriumba és még akkor sem lehetnek 24 óránál régebbiek, ha transzportközegben szállítják azokat. Az optimális szállítási hőmérséklet 20-25 C. A mintákat ne hűtse! 9,10 A teszt kivitelezése Az érzékeny mikroorganizmusok izolálásához, a mintát a laboratóriumba való beérkezés után a lehető leghamarabb szélessze. A szélesztett lemez elsősorban a vegyes flórájú mintákból való elsődleges tiszta tenyészetek izolálására szolgál. Amennyiben a tenyésztést közvetlenül a mintavételi pálcáról indítja, forgassa meg a pálcát a táptalaj kis felületén, majd onnét, szélesztéssel inokulálja a lemezt. Amennyiben a mintát egy normál flórájú testüregből vették, úgy azt, annak függvényében, hogy milyen patogén ágenst kíván izoláni, a megfelelő szelektív táptalajra is inokulálni kell. A Neisseria gonorrhoeae esetében a BD Martin-Lewis Agar, modified vagy a BD GC-Lect Agar táptalajt, Haemophilus esetében pedig a BD Chocolate Agar with IsoVitaleX and Bacitracin táptalajt kell alkalmazni. Az inokulált lemezeket 35 ± 2 C-on, széndioxiddal dúsított, aerob körülmények között inkubálja. A lemezeket 18-24 óra és 42-48 óra inkubáció után értékelje. A N. gonorrhoeae rutinszerű antibiotikumérzékenység teszteléséhez, az izolátumot, mely tiszta tenyézet kell hogy legyen, a 0,5 MacFarland-os standard turbitás eléréséhez BD Trypticase Soy Broth táplevesben szuszpendálja. Legfeljebb 15 perccel az inokulum turbiditásának beállítása után, merítsen bele egy steril mintavételi pálcikát a pontosan hígított inokulumba, majd néhányszor görgesse meg azt a kémcso felso részéhez nyomva, hogy a felesleges nedvességet kipréselje. A lemezen az agar teljes felületét három alkalommal inokulája úgy, hogy az egyenleetes szélesztés érdekében minden inokulálás után 60 -os szögben fordítsa el a lemezt. Egy antimikrobiális korong elosztóval helyezze el a korongokat, ügyeljen a sterilitásra. A korongokat úgy helyezze el, hogy azok középpontja egymástól 24 mm-re legyen. A penicillin korongokat tanácsos úgy elhelyezni, hogy szélük a Petri-csésze peremétől legalább 10 mm-re legyen. Miután a korongokat elhelyezte a táptalajon, annak biztosítására, hogy teljes felületükkel érintkeznek, nyomkodja le azokat egy steril tű vagy csipesz segítségével. Ezt a lépést, amennyiben egy 6-8 férőhelyes ön-tamponáló BD Sensi-Disc elosztót használ, kihagyhatja. A korongok felhelyezése után, 15 percen belül, fordítsa fel a lemezeket és inkubálja azokat5% széndioxiddal dúsított légkörben, aerob körülmények között, 35-37 C-on, 2-24 óráig. PA-254035.05-3 -
Eredmények A telepek jellegzetes morfológiája BD Mueller Hinton Chocolate Agar-on a következő: Haemophilus influenzae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae Kicsi, nedves, gyöngyházfényű, jellegzetes egér szaggal Kis méretű, szürkésfehér-színtelen, nyálkás Közepes-nagy, kék-szürke, nyálkás Kicsi, lapos vagy nagyobb, nyálkásan zöld telepek, a telepek körül táptalaj zöldes lehet Antibiotikum-érzékenységi tesztek: A gátlási zónákat felülről nézve kell leolvasni. A penicillin érzékenységet meg kell erősíteni egy béta-laktamáz teszttel, pl. egy BD Cefinase teszttel. TELJESÍTMÉNY JELLEMZŐK ÉS AZ ELJÁRÁS KORLÁTAI A BD Mueller Hinton Chocolate Agar táptalaj, egy dúsított, nem szelektáló táptalaj, melyen érzékeny és nem érzékeny baktériumok, beleérve a normál flórát, növekednek. Ezért, tanácsos a mintákat a megfelelő szelektáló táptalajokra is kioltani. Az érzékeny baktérium fogalom olyan baktériumokat takar, melyek nem, vagy csak gyengén nőnek általános, juhvért tartalmazó táptalajokon, például Haemophilus, patogén Neisseria és néhány más mikroorganizmus. Részletes leírást, hogy mely mintákat kell ezen a táptalajon vizsgálni és mely mikroorganizmusok izolálásához lehet ezt a táptalajt használni, az ide vonatkozó hivatkozásokban találhat. 10,11 Nem vizsgálták, hogy ez a táptalaj, támogatja-e a streptococcusok tápanyagvariánsainak növekedését. Számos fertőző ágensnek számító baktérium faj és típus létezik. Ezért, mielőtt ezt a táptalajt rutinszerűen használnák ritkán izolált vagy újonnan leírt mikroorganizmusokhoz, a felhasználónak a célorganizmus tiszta tenyészetei segítségével a táptalajok alkalmasságáról meg kell győződnie. Az ezen a táptalajon mért gátlási zóna átmérők nem egyeznek meg teljesen a CLSI Standard M2 -ben megadottakkal, mivel azokat a meghatározott növekedési faktorokat tartalmazó GC Chocolate Agaron mérték. IRODALOMJEGYZÉK 1. Bauer, A.W., W.M.M. Kirby, J.C. Sherris, and M. Turck. 1966. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45: 493-496. 2. Ryan, K.J., F.D. Schoenknecht, and W.M.M. Kirby. 1970. Disc sensitivity testing. Hospital Practice 5:91-100. 3. Mueller, J.H., and J. Hinton. 1941. A protein-free medium for primary isolation of the gonococcus and meningococcus. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 48: 330-333. 4. Barry, A.L., F. Garcia, and L.D. Thrupp. 1970. An improved single-disk method for testing the antibiotic susceptibility of rapidly-growing pathogens. Am. J. Clin. Pathol. 53: 149-158. 5. Ericsson, H.M., and J.C. Sherris. 1971. Antibiotic sensitivity testing. Report of an international collaborative study. Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sec. B, Suppl. 217. 6. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved standard: M2. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at www.clsi.org 7. Berger, U. 1992. Neisseriaceae. In: Mikrobiologische Diagnostik (F. Burkhardt, ed.). Thieme Verlag, Stuttgart, Germany. 8. Nash, P., and M.M. Krenz. Culture media. In: Manual of clinical microbiology, (Balows, A., et al., eds.). 5 th edition. American Society for Microbiology, Washington, D.C., USA. 9. Miller, J.M., and H.T. Holmes. 1995. Specimen collection, transport, and storage. In: Murray, P. R., E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 10. Forbes, B.A., and P.A. Granato. 1995. Processing specimens for bacteria. In: P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. PA-254035.05-4 -
11. P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.). 1995. Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. KISZERELÉSEK DB Mueller Hinton Chocolate Agar Kat. 254035 Használatra kész táptalajok, 20-as csomag Kat. 254082 Használatra kész táptalajok, 120-as csomag TOVÁBBI INFORMÁCIÓK További információkért forduljon a BD helyi képviselőjéhez. Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 12 D-69126 Heidelberg/Germany Phone: +49-62 21-30 50 Fax: +49-62 21-30 52 16 Reception_Germany@europe.bd.com http://www.bd.com http://www.bd.com/europe/regulatory/ ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and all other trademarks are the property of Becton, Dickinson and Company. 2011 BD PA-254035.05-5 -