AZ MDMA NEURONKÁROSíTÓ HATÁSA ÉS AZ AZT KÖVETŐ REGENERÁCIÓ HOSSZÚ TÁVÚ VIZSGÁLATA: A SZEROTONIN TRANSZPORTER EXPRESSZIÓJA ÉS ELOSZLÁSA PATKÁNY AGYBAN

AZ MDMA NEURONKÁROSíTÓ HATÁSA ÉS AZ AZT KÖVETŐ REGENERÁCIÓ HOSSZÚ TÁVÚ VIZSGÁLATA: A SZEROTONIN TRANSZPORTER EXPRESSZIÓJA ÉS ELOSZLÁSA PATKÁNY AGYBAN Doktori értekezés tézisei KIRILLY ESZTER SEMMELWEIS EGYETEM SZENTÁGOTHAI JÁNOS IDEGTUDOMÁNYI DOKTORI ISKOLA Témavezető: Hivatalos bírálók: Prof. Dr. Bagdy György Dr. Fekete Márton Dr. Tímár Júlia Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai: Prof. Dr. Török Tamás Dr. Lévay György Dr. Riba Pál Budapest 2009

1. BEVEZETÉS Az illegális rekreációs kábítószerek közé tartozó ecstasy fő hatóanyaga a (±)3,4- metiléndioxi-metamfetamin (MDMA), mely kémiai szerkezetét tekintve gyűrűn szubsztituált amfetaminszármazék. Pszichostimuláns, entaktogén és enyhe hallucinogén tulajdonságának köszönhetően használata a hazai és európai fiatalok körében egyre nő, a második legnépszerűbb kábítószer a cannabis után. Egyedülálló pszichofarmakológiai tulajdonságai abból erednek, hogy akutan főként a szerotonin (5-HT) felszabadulását fokozza, de hatással van a dopamin, noradrenalin és acetilkolin felszabadulására is számos agyterületen. Az MDMA hatása kétfázisú. A korai, mintegy 24 órán át tartó szakaszban, gyors 5-HT felszabadulást okoz. Ezt követi hosszú távon a 5-HT és az 5-hidroxi-indolecetsav (5-HIAA) koncentrációjának és a szerotonin transzporter (5-HTT) denzitásának a csökkenése kísérleti állatokban. Hatásai hozzávetőleg 12 hónapig (esetleg hosszabb ideig) állnak fenn, de számos kísérletben kimutatták, hogy az MDMA kezelés után hónapokkal akár a szerotonerg axonok részleges regenerációja is bekövetkezhet. A 5-HTT fehérje egyrészt célpontja az MDMA-nak, másfelől markere is a létrejött károsodásnak. Jól ismert, hogy a 5-HTT alapvető szerepet játszik az agyi 5-HT transzmisszióban, mely kapcsolatban áll a hangulat, szorongás, alvás, cirkadián ritmus, impulzivitás, agresszió, memória, étvágy, motoros aktivitás, testhőmérséklet és endokrin működés szabályozásával. Az agyi képalkotó eljárások eredményei alapján az MDMA használat hosszú távon csökkent szerotonin transzporter denzitást eredményez. Jóllehet az MDMA okozta neuronkárosító hatás funkcionális következményei még nem teljesen tisztázottak, egyre több adat szól amellett, hogy a drogot fogyasztó személyekben pszichiátriai, vegetatív, neuroendokrin és kognitív zavarok alakulhatnak ki. Az MDMA lebontásáért a debrizoquin-4-hidroxiláz vagy citokróm P450 (CYP) 2D6 enzim felelős. Az európai népesség 5-9%-ában a CYP2D6 működése genetikailag csökkent, melynek következtében ebben a populációban feltehetőleg az MDMA toxicitása és a klinikai komplikációk valószínűsége is nagyobb. Patkányokban az MDMA metabolizációja ezzel analóg enzimmel, a CYP2D1-gyel történik. Kísérleteinkben speciális állatmodellt, a Dark Agouti patkánytörzset alkalmaztuk, mely csökkent enzimaktivitása következtében megfelelő modellje a genetikai okok vagy egyéb körülmények miatt lassan metabolizáló humán fenotípusnak. 2

2. CÉLKITŰZÉSEK Számos állatkísérlet és humán vizsgálat eredménye támasztja alá az MDMA neuronkárosító hatását, azonban a részletes morfometriai analízis és az ezzel párhuzamos funkcionális vizsgálatok a szerotonerg rendszer károsodása és részleges regenerációja alatt még nem állnak rendelkezésre. Dolgozatomban különös hangsúlyt fektettem az egyszeri dózisban alkalmazott MDMA tartós morfológiai hatásaira az agytörzstől egészen az agykéregig. Feltételeztük, hogy a szerotonerg rendszer károsodása egyes alvásparaméterek megváltozásával is jár. Továbbá megvizsgáltuk az MDMA hatását az agresszív viselkedésre. A munkám során a következő kérdésekre kerestem a választ: 1. Hogyan változik meg a 5-HTT mrns expressziója a különböző raphe magok területén az MDMA kezelést követő 6 hónapban? 2. Kimutatható-e eltérés a nucleus raphe dorsalisban (DR) és a nucleus raphe medianusban (MR) történt változásokban? 3. Hogyan változik meg a 5-HTT rost denzitása az agy különböző területein? 4. Eltérő érzékenységet mutatnak-e az általunk vizsgált agyterületek MDMA kezelés után? 5. Hat hónappal az MDMA kezelést követően milyen mértékű regeneráció tapasztalható? 6. Hogyan változnak meg az egyes alvásparaméterek MDMA kezelést követően? 7. Mely alvásparaméterek változnak hasonlóan a depresszióban leírtakhoz és melyek ellentétesen? 8. Hogyan változtatja meg az MDMA kezelés az agresszív magatartást? 3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1 Kísérleti állatok és anyagok Kísérleteink megfeleltek a magyar (243/1998-as Állatvédelmi Törvény) és az európai (86/609 EEC) előírásoknak. A vizsgálatokat 6-7 hetes hím Dark Agouti patkányokon végeztük (Harlan, Olac Ltd, Egyesült Királyság), csoportonként 5-9 állatot alkalmaztunk. A 3

standard körülmények között tartott állatok (4\ ketrec) a szokásos tápot és vizet szabadon fogyaszthatták. A helyiségek állandó hőmérséklete (21±1 o C) és 12 órás sötét/fény periodicitása (fény reggel 10 és este 10 között volt) biztosítva volt. Az állatok egyszeri intraperitoneális MDMA (15mg\kg) vagy fiziológiás sóoldat (1ml\kg) kezelést kaptak akutan, 3, 7, 21 vagy 180 nappal a kísérlet előtt. Kivéve a rezidens betolakodó teszt esetében, ahol az egyik csoport 21 nappal korábban előkezelést és 20 perccel a kísérlet előtt akut kezelést is kapott. 3.2 Morfológiai vizsgálatok 3.2.1 In situ hibridizáció Az MDMA vagy fiziológiás sóoldattal való kezelés után 3, 7, 21 vagy 180 nappal dekapitáltuk az állatokat. A patkányagyakból 12μm-es koronális metszeteket készítettünk. A 5-HTT mrns expresszióját az agytörzsi [DR és MR] és a nyúltvelői [nucleus raphe magnus (RMg), pallidus (RPa) és obscurus (ROb)] raphe magok területén in situ hibridizációval mértük. A DNS templátot patkány cdns-ből T7 promoter és egy génspecifikus szekvencia (antiszenz) alkalmazásával PCR-ral állítottuk elő. Az adott RNS szekvenciát felismerő antiszenz próbát [ 35 S]-UTP és T7 polimeráz felhasználásával jelöltük meg. A metszetekre a jelerősség függvényében 6-13 napra filmet (Imaging Plate) helyeztünk. Kvantifikálásra az NIH ImageJ szoftvert használtuk. A filmről való értékelés esetében a DR és MR felett mértük az in situ szignál (mean grey value) denzitását. A háttér megállapításához a denzitást 5-HTT mrns-t nem expresszáló területen mértük le. A numerikus denzitás értékét a kettő különbségéből számoltuk. A 5-HTT mrns expresszió pontosabb meghatározása céljából és az RMg, RPa és ROb esetében a hibridizációs jelet NTB-3 autoradiográfiás emulzióval is láthatóvá tettük. A metszeteket 1 hónapos 4 o C-on való inkubáció után hívtuk elő az emulzióból, majd szárítás után Giemsa-magfestést végeztünk. A mért átlagos szemcsesűrűség értékek tükrözték az egyes sejtek 5-HTT mrns expresszióját. A RPa és ROb esetében manuálisan számoltuk meg a sejtszámot és az egyes sejtek felett található ezüstszemcsék számát. 4

3.2.2. Immunhisztokémia Az állatokat az MDMA kezelést követően 7, 21 vagy 180 nappal altatás után Zambonifixálóoldattal intrakardiálisan perfundáltuk. Az eltávolított agyakat további 24 órán át 4 o C-os fixálóoldatban utófixáltuk. Krioprotekciót követően 4 sorozatban koronális síkban 40μm-es metszeteket készítettünk. A 5-HTT rostdenzitás meghatározása immunhisztokémiával történt. A reakciókat DAKO peroxidase\ DAB (3,3 -diaminobenzidin) kittel végeztük (En Vision TM, DAKO). A jel kimutatására nyúl ellen termelt poliklonális 5-HTT (1:3000) antitestet használtunk (Oncogene). Az egyes agyterületekről 4-6 nem átfedő felvételt készítettünk: frontális kéreg 1.-2. réteg (szomatoszenzoros, szomatomotoros és parietális kéreg), hippocampus (gyrus dentatus, CA1, CA2 és CA3), hypothalamus (area praeoptica posteroventralis, lateralis hypothalamus, nucleus hypothalamicus posterior, nucleus paraventricularis, nucleus suprachiasmatis, nucleus tuberomamillaris), periaqueductalis szürkeállomány (ventrolateralis rész, dorsomedialis rész, nucleus tegmentalis pedunculopontinus, nucleus reticularis pontis oralis, substantia nigra, limbikus kérgi területek (cinguláris és piriform kéreg), striatum (caudatus-putamen, globus pallidus, dorsomedialis striatum és ventrolateralis striatum), nucleus interstitialis striae terminalis, amygdala (centralis és medialis), nucleus medialis dorsalis thalami, nucleus arcuatus, nucleus hypothalamicus anterior, nucleus praeopticus medialis, nucleus septalis lateralis. A szerotonerg rostdenzitás kvantitatív meghatározására az analysis programot használtuk. Mértük, hogy az adott terület hány százaléka tartalmaz pozitívan festődött rostot. Állatonként és agyterületenként 6 értéket átlagoltunk. 3.3 Rezidens betolakodó teszt Az agresszív magatartást a rezidens-betolakodó tesztben vizsgáltuk. A territórium kialakítása céljából a rezidens patkányokat a teszt előtt két héttel egyesével külön ketrecbe tettük. A betolakodó kisebb hím patkánynak a rezidens állat ketrecébe való helyezését követően az állatok magatartásáról 15 perces felvételeket készítettünk. Pontoztuk az impulzívagresszív viselkedések, azaz a harapások, ütések és a rúgások számát, valamint kiszámoltuk ezek gyakoriságát és összegét. Az egyes paraméterek latenciáját szintén meghatároztuk. Agresszív viselkedésként értékeltük továbbá a birkózások gyakoriságát és latenciáját. 5

Pontoztuk ezen kívül a szociális magatartást, sztereotíp mosakodást, a motoros aktivitást és a felderítő magatartást. 3.4 Alvásvizsgálatok Krónikusan beültetett elektródák (epiduralis EEG-elektródák fronto-parietalisan, valamint izomelektródák a hátsó nyaki izomban) segítségével 24 órás poligráfiás (EEG, EMG és motoros aktivitás) felvételeket készítettünk az állatokról. Az alváskiértékelés az irodalomban meghatározott kritériumoknak megfelelően a SleepSign for Animal (Kissei Comtec America, Inc., Egyesült Államok) alváselemző program segítségével és vizuális kiértékelé ssel történt. A vizsgált alvásparaméterek 4 csoportra oszthatóak: paradox alvás (rapid eye movement - REM), lassú hullámú alvás (non- rapid eye movement - NREM), ébrenléti mutatók és az alvástöredezettség. A REM alvásparaméterek közül meghatároztuk a REM latenciát, a REM gyakoriságot az első órában, a REM maximumot és a REM összeget a világos fázisban. A NREM paraméterek a következőek voltak NREM latencia, NREM az első és a második órában, a felületes (SWS-1)- és mélyalvás (SWS-2) latencia, SWS-1 és SWS-2 összege a világos periódusban. Ébrenléti mutatóként értékeltük az aktivitás kezdetét és az aktivitás kezdete előtti passzív ébrenlétet. Az alvástöredezettséget azon ébredések (passzív és aktív ébrenlét) számával definiáltuk, melyeket nem szakít meg semmilyen alvásfázis. A NREM alvás kvantitatív értékelését, az EEG teljesítménysűrűség meghatározását az SWS-1 és SWS-2 fázisban is elvégeztük. 3.5 Statisztikai módszerek A statisztikai elemzéseket a Statistica 7.0 (Statsoft Inc., Tulsa, OK) és a GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) programmal végeztük. Az adatokat egy-, kétszempontos vagy többváltozós varianciaanalízissel (ANOVA), t-próbával és Kruskal-Wallis nemparaméteres próbával dolgoztuk fel. A post-hoc összehasonlításhoz a Mann-Whitney u és a Newman-Keuls tesztet használtuk. A statisztikai szignifikancia határát minden esetben p<0.05-nél húztuk meg. 6

4. EREDMÉNYEK 4.1 5-HTT mrns expressziójának változása az agytörzsi (DR és MR) és nyúltvelői (RMg, RPa és ROb) raphe magok területén a szerotonerg rendszer károsodása, majd részleges regenerációja alatt Kísérleteim során részletesebben vizsgáltuk a két agytörzsi raphe magban tapasztalt változásokat. Összességében elmondható, hogy a felszálló raphe magokban az átmeneti növekedést átmeneti csökkenés, majd 180 napnál normalizáció követi. Hét nappal az MDMA kezelést követően a DR-ben szignifikáns növekedést (+24%, p=0.008), a MR-ben 21 nappal a kezelés után pedig szignifikáns csökkenést (-27%, p= 0.016) találtunk. A pontosabb értékelés céljából 7 és 21 nappal az MDMA kezelést követően az egyes sejtek 5-HTT mrns expresszióját is meghatároztuk. A 5-HTT mrns expressziója mindkét magban 7 napnál szignifikánsan emelkedett (DR: +53%, p= 0.033 és MR: +43%, p= 0.049), míg 21 napnál szignifikánsan csökkent (DR: -22%, p= 0.025 és MR: -18%, p= 0.016). A leszálló raphe magokban 7 nappal az MDMA kezelést követően szintén megnövekedett a 5-HTT mrns expressziója. Az átlagos növekedés a RMg-ben 24% (p= 0.101), a RPa-ban 35% (p= 0.003) és a ROb-ban 10% (p= 0.012) volt. A nucleus raphe magnus 3 régiója közül (rostralis, középső, caudalis) csak a középső terület mutatott szignifikáns növekedést (46%, p= 0.019). A kezelést követő 180. napra az összes területen normalizálódott a 5-HTT mrns expressziója, így feltételezhető, hogy számottevő regeneráció következett be. 4.2 Az alvással és az agresszióval összefüggő agyterületeken a 5-HTT rostdenzitás változásának vizsgálata a szerotonerg rendszer károsodása, majd részleges regenerációja alatt Immunhisztokémiai módszerrel vizsgálva az 5-HTT fehérje mennyisége 7 és 21 nappal a kezelést követően a legtöbb általunk vizsgált agyterületen jelentős csökkenést mutatott. A vizsgált kérgi és hippocampális területek szinte mindegyike és a hypothalamus számos régiója sérülést mutatott, azonban az agytörzsi területek közül csak némelyik esetében volt megfigyelhető károsodás (Táblázat 1). Az MDMA kezelést követően 180 nap múlva szinte az összes általunk mért agyterületen normalizálódott az 5-HTT rostdenzitás, kivéve 7

néhány agyterületet, amelyek közül kiemelendő a hippocampus, ahol még fél év után is markáns csökkenést tapasztaltunk. Táblázat 1. Néhány vizsgált agyterület 5-HTT rostdenzitása 7, 21 és 180 nappal az MDMA (15mg\kg) kezelést követően Dark Agouti patkányban Agyterület 7nap 21nap 180nap Változás (%) Frontális kéreg Szomatoszenzoros kéreg -31 * -33* -15 Szomatomotoros kéreg -36 * -32 * -14 Hippocampus CA1-26 * -37 * -36 * CA2-35 * -41 * -32 * CA3-33 * -46 * -31 * Gyrus dentatus -24-35 -19 Hypothalamus Area preoptica posteroventralis -11-17 -2 Lateralis hypothalamus -12-19 -8 Nucleus hypothalamicus posterior -22 * -38 * -30 * Nucleus paraventricularis -2-6 -3 Nucleus suprachiasmatis -30 * -35 * -17 Nucleus tuberomamillaris -19 * -35 * -23 * Agytörzs Nucleus tegmentalis pedunculopontinus -7-12 -7 Nucleus reticularis pontis oralis -3-14 -5 Periaqueductalis szürkeállomány Ventrolateralis rész -15-30 * -15 Dorsomedialis rész -17-38 * -16 (* - szignifikáns változás, p< 0.05) 4.3 Az MDMA hatásai az alvásparaméterekre A morfológiai adatokkal párhuzamosan a vizsgált alvásparaméterek közül 7 és 21 nappal az MDMA adagolását követően a REM latencia szignifikáns csökkenését találtuk (- 55% és -53%, 7 illetve 21 nap). Ezzel párhuzamosan 21 napnál a REM mennyisége az első órában megemelkedett (+245%). A többi REM paraméterben nem tudtunk változást 8

kimutatni. A 9 vizsgált NREM paraméter közül mindössze három esetében mutattunk ki szignifikáns változást, de időben ezek sem követték a szerotonerg károsodásban megfigyelt változásokat. A delta hullámok (delta EEG teljesítmény-sűrűség) aránya 7 és 21 nappal az MDMA kezelést követően megnövekedett mind az SWS-1, mind pedig az SWS-2 fázisban. A változás markánsabb volt az alacsonyabb frekvenciatartományban (1 és 2 Hz). Továbbá 21 napnál az SWS-1 mennyisége a passzív fázisban csökkenést mutatott (-51%). Hét napnál fokozódott alvástöredezettséget találtunk (+83%), amely a kimutatott szerotonerg károsodás ellenére 21 napra normalizálódott. A vizsgált raphe magok 5-HTT mrns expressziójával és a különböző agyterületeken talált 5-HTT rostdenzitás regenerációjával párhuzamosan 180 napra szinte az összes általunk vizsgált alvásparaméter normalizálódott. 4.4 Az MDMA hatásai az agresszióra Az akut MDMA kezelést követően mind az előkezelt mind a nem előkezelt állatokban az összes általunk vizsgált paraméter jelentős csökkenését tapasztaltuk. Csökkent a harapások (H=12.749, p=0.009), ütések (H=19.829, p<0.001) és rúgások (H=18.912, p=0.317) gyakorisága, valamint ezen paraméterek összege (H=21.602, p<0.001) és latenciája (H=15.832, p<0.001). Nemcsak az agressziót mutató viselkedésformák, hanem a szociális magatartás (H=24.340, p=0.001) és a mosakodás (H=24.473, p<0.001) időtartama is csökkenést mutatott. A fiziológiás sóoldattal előkezelt csoportban a fokozódott motoros aktivitás (H=20.541, p=0.002) és felderítő magatartás (H=20.957, p=0.002) akut MDMA kezelés hatására csökkent. Az MDMA előkezelt állatokban az MDMA összes akut hatása megmaradt. Eredményeink megerősítik a korábbi feltételezést, mely szerint az akut MDMA kezelés csökkenti az agresszív viselkedést. Annak ellenére, hogy 21 napnál számos, az agresszió szabályozásában résztvevő agyterületen a 5-HTT rostdenzitás szignifikáns csökkenését találtuk, az agresszív magatartásban nem sikerült alapvető változást kimutatni. A 21 nappal korábbi MDMA kezelés fokozta a rúgások előfordulásának gyakoriságát (H=18.912, p=0.010) és kismértékben csökkentette a szociális magatartás (H=24.473, p= 0.008) és mosakodás (H=24.340, p=0.006) időtartamát. A lokomotoros aktivitás és a felderítő magatartás változatlan maradt a 21 nappal korábban MDMA kezelt állatokban. 9

5. KÖVETKEZTETÉSEK Az egyszeri dózis MDMA adagolását követő neuronkárosító hatások és az azt követő regeneráció hosszú távú vizsgálatának eredményei az alábbiakban foglalhatóak össze: 1. Mivel az 5-HTT mrns expressziójában és a rostdenzitásban talált változások egyaránt a szerotonerg rendszer tartós károsodására utalnak, eredményeink alapján a lassan metabolizáló személyek már egyszeri fogyasztás után is komoly veszélynek vannak kitéve, amely számos funkció pl. tanulás, memória, hangulat, alvás-ébrenlét ciklus zavarához, egyensúlyának felbomlásához vezethet. 2. Szakirodalmi adatok alapján számos amfetamin származék toxikusabb a nucleus raphe dorsalisból eredő vékony rosthálózatra, mint a nucleus raphe medianusból eredő vastag rosthálózatra. Későbbi anatómiai és biokémiai adatok szerint azonban nem feltétlenül mutatható ki szelektivitás a károsító hatásban. Kimutattuk, hogy a két magban talált változások mind nagyságrendileg, mind pedig időtartamilag hasonlóak, amit immunhisztokémiai adataink is alátámasztanak. A nucleus suprachiasmatisba futó rostok eredete szinte kizárólagosan a nucleus raphe medianus, valamint a hippocampus területét is behálózzák az innen eredő rostok és mindkét területet meglehetősen érintettnek találtuk MDMA kezelést követően. 3. Az agy különböző területei nem egyformán károsodtak az MDMA kezelés következtében. Ezen megfigyelésünk alátámasztja azon irodalmi adatokat, hogy az MDMA neuronkárosító hatása agyterületfüggő és a hippocampus sokkal kevésbé képes a regenerálódásra. Ennek magyarázata lehet a hippocampális neuronok specifikus hierarchiája és\vagy a neurotrofikus faktorok szintézisének és metabolizmusának a megváltozása. A hippocampus tartós károsodása valószínűleg összefügg azzal az adattal, hogy a krónikus ecstasyfogyasztókban kognitív- és memóriaproblémák jelentkeznek. 4. Eredményeink alátámasztják azon adatokat, mely szerint a REM alvás és a NREM delta hullámok kiváltása szerotonerg szabályozás alatt áll. A csökkent REM latenciával párhuzamosan szignifikáns károsodást mutattunk ki két, az 10

alvásszabályozásban jelentős szerepet játszó agyterület, a nucleus suprachiasmatis és a nucleus tuberomamillaris területén. Ezzel szemben nem találtunk változást az agytörzsi REM-on neuronok, a nucleus reticularis pontis oralis és a nucleus tegmentalis pedunculopontinus területén, ezért nem valószínű, hogy a csökkent REM latenciát ezen területek szerotonerg rendszerének megváltozása okozta. 5. Szakirodalomból ismert, hogy a depresszió egyik vezető tünete az alvás megváltozása. A depressziós betegek több mint 90%-a panaszkodik valamilyen alvásproblémára pl. elalvási nehézségek, gyakori ébredés, korai felkelés, csökkent REM latencia és az alvástöredezettség. Egyszeri dózis MDMA kezelés után számottevő változásokat találtunk az alvásparaméterekben. Eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy a vizsgált alvásparaméterek közül két hatás a csökkent REM-latencia és az alvástöredezettség egybeesik azzal, amit depressziós betegeken leírtak, ezzel szemben más alvásparaméterek pl. NREM nem követték a depressziós betegeken megfigyelt változásokat. Azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a depresszióban előforduló alvászavarok nem mindegyike magyarázható a szerotonerg rendszer ilyen jellegű károsodásával, illetve a depresszió során észlelt szerotonerg eltérések csak részben hasonlóak az MDMA-által kiváltott hatásokhoz, ezért feltételezhető, hogy a depresszió patomechanizmusában egyéb eltérések valamint más neurotranszmitter rendszerek is részt vesznek. 6. Kimutattuk, hogy az akut MDMA kezelés csökkenti az agresszív magatartást, ezzel szemben az MDMA előkezelés és az agresszió szabályozásában résztevevő agyterületeken talált szerotonerg károsodás nem fokozza az agresszív magatartást. A megnövekedett agresszív magatartás hiánya többféleképpen magyarázható. A rezidens- betolakodó tesztben az állatok eleve magasabb agresszivitással rendelkeznek, ezért feltételezhető, hogy további kisfokú növekedés nem érzékelhető. Továbbá a rezidens állatok esetében nélkülözhetetlen a krónikus szociális izoláció, amely eleve csökkent 5-HT szintet eredményez, mely szintén hozzájárulhat az alap agresszivitási szint megnövekedéséhez. 11

7. Eredményeink felhívják a figyelmet az ecstasy használat hosszútávú következményeire, különösen a genetikailag vagy egyéb körülmények miatt lassan metabolizáló személyek esetében. ÚJ EREDETI MEGFIGYELÉSEK 1. Először vizsgáltuk a 5-HTT mrns expresszióját a nyúltvelői és agytörzsi raphe magok területén egyszeri dózis MDMA kezelést követően. Elsőként mutattuk ki, hogy a nucleus raphe dorsalisban és medianusban talált változások mind mértékükben, mind időbeni lefutásukban hasonlóak. 2. Először írtuk le az irodalomban, hogy a 5-HTT mrns expressziója a vizsgált raphe magokban átmenetileg megemelkedik, melyet egy átmeneti csökkenés, majd 180 napnál normalizáció követ. 3. Elsőként vizsgáltuk ilyen részletesen és ilyen hosszú időn át immunhisztokémiai módszerrel az MDMA hatásait, kísérleteink az agy szinte minden területére kiterjedtek. A vizsgált 32 agyterület 5-HTT rostdenzitása alapján elmondható, hogy az MDMA kezelést követő 7 és 21 napnál a legtöbb területen csökkenést, 180 napnál néhány kivételtől eltekintve regenerációt találtunk. 4. A szakirodalomban elsőként jellemeztük az MDMA tartós alváshatásait, 16 paraméter változását mértük a 3 időpontban. Legfontosabb eredményeink a csökkent REM latencia, a fokozódott alvástöredezettség, valamint a delta EEG teljesítménysűrűségének változásai. 5. Elsőként vizsgáltuk az MDMA alvásra és agresszióra való hatásait párhuzamosan az alvás- és agressziószabályozásban résztvevő agyterületek 5-HTT rostdenzitásával. 12

6. PUBLIKÁCIÓK 6.1 A disszertációhoz kapcsolódó publikációk 6.1.1 Folyóiratcikkek 1. Kirilly E., Molnar E., Balogh B., Kantor S., Hansson S. R., Palkovits M., Bagdy G.: Decrease in REM latency and changes in sleep quality parallel serotonergic damage after MDMA: a longitudinal study over 180 days. The International Journal of Neuropsychopharmacology (2008), 11: 795-809 IF: 4.895 2. Kirilly E., Benko A., Ferrington L., Ando R.D., Kelly P.A.T., Bagdy, G., Acute and long-term effects of a single dose of MDMA on aggression in Dark Agouti rats. The International Journal of Neuropsychopharmacology, (2006), 9(1):63-76 IF: 5.184 3. Ferrington L., Kirilly E., McBean D.E., Olverman H.J., Bagdy G., Kelly P.A.T.: Persistent cerebrovascular effects of MDMA and acute responses to the drug, European Journal of Neuroscience, (2006), 24: 509-519 IF: 3.709 4. Ando R.D., Benko A., Ferrington L., Kirilly E., Kelly P.A.T., Bagdy G.: Partial lesion of the serotonergic system by a single dose of MDMA results in behavioural disinhibition and enhances acute MDMA-induced social behaviour on the social interaction test. Neuropharmacology, (2006), 50: 884-896 IF: 3.860 5. Kovács G.G., Andó R.D., Ádori C., Kirilly E., Benedek A., Palkovits M., Bagdy G.: Single dose of MDMA causes extensive decrement of serotoninergic fibre density without blockage of axonal transport in Dark Agouti rat brain and spinal cord. Neuropathology and Applied Neurobiology (2007), Apr;33(2): 193-203 IF: 2.860 13

6. Gyongyosi N., Balogh B., Kirilly E., Kitka T., Kantor S., Bagdy G.: MDMA treatment 6 months earlier attenuates the effects of CP-94,253, a 5-HT(1B) receptor agonist, on motor control but not sleep inhibition. Brain Research (2008), Sep 22;1231:34-46 IF(2007): 2.218 6.1.2 Előadások és poszterek 7. Kirilly E., Ando R.D., Palkovits M., Bagdy G.: MDMA (Ecstasy) causes longterm changes in the expression of the serotonin transporter. 11th of Congress of the Hungarian Society of Neuroscience, Pécs, Hungary, January 26-29, 2005., Clinical Neuroscience 58, 1. különszám, P. 50, 2005 8. Kirilly E., Ando R.D., Palkovits M., Bagdy G.: Serotonin transporter mrna expression in raphe nuclei after MDMA treatment. Spring Symposium of the Hungarian Society for Experimental and Clinical Pharmacology, June 6-7 2005, Budapest, Hungary, Inflammopharmacology Vol. 13, No. 5-6, pp 501 9. Kirilly E., Palkovits M., Bagdy G.: Effects of ecstasy on serotonin transporter in the rat brain, 8th Congress of Hungarian Association of Psychopharmacology, October 6-8 2005, Tihany, Hungary, Neuropsychopharmacologia Hungarica, VII, Suppl.1, 2005, pp. 37-38. 10. Kirilly E., Palkovits M., Bagdy G.: Time-course of molecular events of MDMAinduced neuronal damage in the serotonergic system, Semi-centennial conference of Semmelweis University, October 12-14, 2005, Budapest, Hungary, Pharmacy: Smart Molecules for Therapy: Programme book of abstracts, P-52 11. Kirilly E., Tóth Z.E., Gerber G., Palkovits M., Bagdy G.: 3,4- methylenedioxymethamphetamine (MDMA) modulates serotonin transporter mrna expression in the rat brainstem, Society for Neuroscience 35th Annual Meeting, November 12-16 2005, Washington DC, P111.12 14

12. Kirilly E., Palkovits M., Bagdy G.: Egyszeri MDMA ( ecstasy ) kezelést követő tartós szerotonerg idegkárosodás Dark Agouti patkányban, PhD Tudományos Napok 2006, Budapest, 2006.április 13-14. 13. Kirilly E., Steinbusch H.W.M., Palkovits M., Bagdy G.: Damage and recovery after a single dose of ecstasy: a 6-months follow-up study, CINP 2006 Chicago Congress, Chicago, 9-13 July 2006, The International Journal of Neuropsychopharmacology, Vol. 9, Suppl. 1, July 2006, P02.019 14. Kirilly E., Molnar E., Palkovits M., Bagdy G.: Persistent effects of a single dose of ecstasy on sleep and brain serotonin transporter density in Dark Agouti rats, 9th Congress of Hungarian Association of Psychopharmacology, October 5-7 2006, Tihany, Hungary, Neuropsychopharmacologia Hungarica, VIII, Suppl.2, 2006, pp. 33-34. 15. Kirilly E., Palkovits M., Bagdy G.: Long-term effects of a single dose of ecstasy on aggression in Dark Agouti rats, 10th Congress of Hungarian Association of Psychopharmacology, October 4-6 2007, Tihany, Hungary, Neuropsychopharmacologia Hungarica, IX. Suppl.3, 2007, pp. 32-33. 16. Kirilly E., Molnar E., Balogh B., Katai Z., Palkovits M., Bagdy G.: Neuronal damage and recovery induced by a single dose of MDMA: morphological studies correlation with sleep parameters, ECNP, AEP Seminar in Neuropsychopharmacology, April 10-12 2008, Siofok, Hungary 17. Kirilly E., Molnar E., Katai Z., Pap D., Harry W.M. Steinbusch, Palkovits M., Bagdy G.: Diurnal rhythm and sleep parameters during neuronal damage and recovery after (+/-) 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA), XXVI. CINP Congress, Münich, 13-17 July 2008, The International Journal of Neuropsychopharmacology, Vol. 11, Suppl. 1, July 2008, P11.16 15

6.2 Egyéb publikációk 6.2.1 Folyóiratcikkek 18. Tóth Z., Zelena D., Mergl Z., Kirilly E., Várnai P., Mezey E., Makara G., Palkovits M.: Chronic repeated restraint stress increases prolactin-releasing peptide/tyrosine-hydroxylase ratio with gender-related differences in the rat brain. Journal of Neurochemistry (2008), 104(3):653-66 IF (2007): 4.451 19. Heinzlmann A., Kirilly E., Meltzer K., Szabó E., Baba A., Hashimoto H., Köves K.: PACAP is transiently expressed in anterior pituitary gland of rats: in situ hybridization and cell immunoblot assay studies. Peptides (2008), 29(4):571-7 IF(2007): 2.368 Összesített IF: 29.545 6.2.2 Előadások és poszterek 20. Ando R.D., Adori C., Kirilly E., Moszkovkin G., Kovacs G.G., Bagdy G.: Persistent neurotoxic effects of a single dose of MDMA (Ecstasy) on serotonergic axons. 11th of Congress of the Hungarian Society of Neuroscience, Pécs, Hungary, January 26-29, 2005. Clinical Neuroscience 58, 1. különszám, P. 6, 2005 21. Ando R.D., Adori C., Kirilly E., Moszkovkin G., Kovacs G.G., Bagdy G.: Persistent impairment of serotonergic axons after a single dose of MDMA (Ecstasy). Spring Symposium of the Hungarian Society for Clinical and Experimental Pharmacology, June 6-7 2005, Budapest, Hungary, Inflammopharmacology Vol. 13, No. 5-6, pp 501 22. Bagdy G., Kovacs G.G., Adori C., Ando R.D., Kirilly E..: Behavioural consequences of ecstasy-induced damage of serotonergic neurons: focus on 16

anxiety and impulsivity, 8th Congress of Hungarian Association of Psychopharmacology, October 6-8 2005, Tihany, Hungary, Neuropsychopharmacologia Hungarica, VII, Suppl.1, 2005, pp. 13. 23. Ando R.D., Adori C., Kovacs G.G., Kirilly E., Palkovits M., Bagdy G.: Serotonergic axonal damage in the spinal cord after a single dose of Ecstasy (MDMA, 3,4-methylenedioxymethamphetamine), International IBRO Workshop Budapest, Hungary, 26-28 January 2006, Clinical Neuroscience, P- 165 24. Kirilly E., Gonda X., Andó R.D., Bagdy G.: Drogok tisztasága a feketepiacon: az ecstasy tabletták összetétele, CPhH XIII. Budapest, 2006. május 25-27. 25. Ando R.D., Adori C., Kirilly E., Kovacs G.G., Benko A., Bagdy G.: Fluoxetineinduced acute anxiogenic effects is attenuated six months after a serotonergic damage caused by MDMA despite recovery of neocortical areas but not hippocampus, 9th Congress of Hungarian Association of Psychopharmacology, October 5-7 2006, Tihany, Hungary, Neuropsychopharmacologia Hungarica, VIII, Suppl.2, 2006, pp. 15. 26. Gonda X., Kirilly E., Bagdy G.: Gyógyszerválasztás genetikai markerek alapján: A szerotonin transzporter gén és a depresszió összefüggései, CPhH XIII. Budapest, 2006. május 25-27. 27. Toth Z.E., Zelena D., Mergl Z., Kirilly E., Borhegyine Holderith N., Makara G. B., Palkovits M.: Changes in prolactin-releasing peptide mrna expression int he brain of male and female rats after chronic restraint stress, Society for Neuroscience 35th Annual Meeting, November 12-16 2005, Washington DC, P639.12 28. Toth Z.E., Zelena D., Mergl Z., Kirilly E., Borhegyine Holderith N., Makara G. B., Palkovits M.: Effect of repeated restraint stress on prolactin-releasing 17

peptide mrna expression in the rat brain, International IBRO Workshop Budapest, Hungary, 26-28 January 2006, Clinical Neuroscience, P-95 29. Bagdy György, Kirilly Eszter, Katai Zita, Gonda Xenia, Kitka Tamas, Balogh Brigitta: Az antidepresszívumok hatásaiban mutatkozó különbségek összefüggése a szerotonin transzporter genetikai és neurokémiai eltérésével, 10th Congress of Hungarian Association of Psychopharmacology, October 4-6 2007, Tihany, Hungary, Neuropsychopharmacologia Hungarica, IX. Suppl.3, 2007, pp. 16-17. 30. Katai Zita, Balogh Brigitta, Kitka Tamás, Kirilly Eszter, Bagdy György, Acute effects of citalopram on REM sleep in control and MDMA pretreated rats using cosinor analysis, 10th Congress of Hungarian Association of Psychopharmacology, October 4-6 2007, Tihany, Hungary, Neuropsychopharmacologia Hungarica, IX. Suppl.3, 2007, pp. 31-32. 31. Papp R.S., Kirilly E., Kitka T., Bagdy G., Szabó-Meltzer K., Tóth Z. E., Prolactin- Releasing Peptide Expressing Neurons in the Dorsomedial Nucleus of the Hypothalamus Influence the Orexinergic System via Direct Connections with MCH and Orexin Producing Cells, PhD Tudományos Napok, Budapest, April 10-11 2008 32. Ando R.D., Adori C., Kirilly E., Kovacs G.G., Benko A., Bagdy G.: Fluoxetineinduced acute anxiogenic effect is attenuated six months after a serotonergic damage caused by MDMA despite recovery of neocortical areas but not hippocampus, ECNP, AEP Seminar in Neuropsychopharmacology, April 10-12 2008, Siofok, Hungary 33. Katai Z., Garay T., Balogh B., Kitka T., Kirilly E., Bagdy G.: Altered sleep effects of acutely administered citalopram after partial serotonergic damage by MDMA, ECNP, AEP Seminar in Neuropsychopharmacology, April 10-12 2008, Siofok, Hungary 18

34. Heinzlmann A., Kirilly E., Meltzer K., Szabó E., Akemichi B., Hitoshi H., Köves K. A PACAP átmenetileg expresszálódik a hypophysis mellső lebenyében: in situ hybridizációs és cell immunoblot assay (ciba) tanulmány, Magyar Endokrinológiai és Anyagcsere Társaság XXII. Kongresszusa, 2008 június 5-7., Eger, Hungary 35. Tóth Zs. E, Mergl Zs., Kirilly E., Szabó-Meltzer K., Zelena D. Elevated PrRP mrna Expression in Brattleboro Rats Does not Affect the Response to Acute Stress, 12th Meeting of the Hungarian Neuroscience Society, 22-24 January, 2009 Budapest, Hungary, P038 6.3 Könyvfejezetek 36. Gonda X, Kirilly E. Az ecstasy története. Fogyasztási szokások a népesség körében. In: Bagdy G. (ed), Amit az ecstasyról tudni kell. Akadémiai Kiadó, Budapest: 2006:11-20. 37. Kirilly E., Lazáry J. Mit tartalmaz az ecstasy tabletta? In: Bagdy G. (ed), Amit az ecstasyról tudni kell. Akadémiai Kiadó, Budapest: 2006: 20-36. 38. Kirilly E., Lazáry J. Az ecstasy mint lehetséges gyógyszer? In: Bagdy G. (ed), Amit az ecstasyról tudni kell. Akadémiai Kiadó, Budapest: 2006:171-177. 7. KÖSZÖNETNYíLVÁNíTÁS Köszönettel tartozom mindazoknak, akik az értekezésem alapjául szolgáló munka során a segítségemre voltak. Mindenekelőtt hálával tartozom témavezetőmnek Prof. Dr. Bagdy Györgynek, aki lehetőséget adott, hogy a munkacsoportjában dolgozzam, és aki szakmai tanácsaival és kutatási tapasztalatainak átadásával mindvégig irányította a munkámat. Nagyon nagy hálával és köszönettel tartozom Prof. Dr. Palkovits Miklósnak, amiért az Anatómiai, Szövet- és Fejlődéstani Intézet, Neuromorfológiai- és Neuroendokrin Kutatócsoportjában végezhettem a kísérleteim jelentős részét, valamint számtalan értékes elméleti és gyakorlati segítséget és tanácsot kaptam. Hálás vagyok Dr. Tóth Zsuzsannának, 19

akivel az első pillanattól kezdve nagyon jól megértettük egymást, megtanított engem számos metodikára és annak részleteire, bármikor bármilyen problémával tudtam felé fordulni. Nagyon sok önzetlen segítséget, támogatást és értékes tanácsokat kaptam Dr. Gonda Xéniától, amelyeket ezúttal köszönöm. Szeretnék köszönetet mondani a laboratórium többi munkatársának Dr. Ádori Csabának, Andó Rómeónak, Molnár Eszternek, Benkő Anitának, Kitka Tamásnak, Dr. Balogh Brigittának, Dr. Juhász Gabriellának, Dr. Gráf Mártonnak és Dr. Lazáry Juditnak a mindenkori támogatásukért és barátságukért. Dr. Anheuer Egonnénak (Zsuzsa), Dr. Módosné Ányok Editnek és Nagy Rezsőnének (Nóra) köszönöm kedvességüket, odafigyelésüket és technikai segítségüket. A Palkovits laborátórium összes munkatársának Dr. Gallatz Katalinnak, Papp Rege Sugárkának, Meltzer Kingának, Dr. Dobolyi Árpádnak, Dobolyiné Renner Évának, Helfferich Frigyesnének (Judit), Kézdi Dorottyának, Deák Szilviának, Kasztner Magdolnának és Kiss Melittának - is szeretnék köszönetet mondani, akik mindannyian mindvégig úgy tekintettek rám, mint a laboratórium tagja és tőlük is rengeteg segítséget kaptam, mindannyian hozzájárultak ahhoz, hogy az itt töltött időm kellemes és hasznos legyen. Prof. Dr. Réthelyi Miklósnak, a Szentágothai János Idegtudományi Doktori Iskola vezetőjének köszönöm szépen, hogy PhD tanulmányaimat elkezdhettem. Köszönöm Prof. Dr. Tekes Kornéliának a dolgozatom házi bírálatát és javaslatait. Szeretném megköszönni Prof. Dr. Gaszner Péternek, aki számtalan lehetőséget biztosított számomra, hogy eredményeimet bemutassam. Végül, de nem utolsó sorban külön köszönettel és hálával tartozom családomnak: Szüleimnek, Férjemnek, Kisfiamnak és Testvéremnek, akik az évek során mindvégig kitartó türelemmel, szeretettel és támogatásukkal mellettem álltak, és akik segítsége nélkül nem tudtam volna ezt a munkát befejezni. A munka az EU V. (QLG3-CT- 2002-00809) és VI. (LSHM-CT-2004-503474) Keretprogram, az Egészségügyi, Szociális és Családügyi Minisztérium tárcaszintű kutatási támogatásával (058/2003 és 460/2006), az OMFB 01926/2002, az OTKA T020500, valamint az Oktatási Minisztérium PhD. ösztöndíja támogatásával készült. 20