Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és tissue engineering 9. Előadás SCAFFOLD -OK ELŐÁLLÍTÁSA
Scaffold előállítás - Alapvető kritériumok I. TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Biokompatibilitás immunreakciók elkerülése Felszíni kémia sejtfunkciók támogatása Egymással összeköttetésben lévő pórusok kialakítása sejtek egyenletes eloszlásának és erek képződésének támogatása Ellenőrzött biodegradáció az új szövet kialakulásának lehetővé tétele
Scaffold előállítás - Alapvető kritériumok II. TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Mechanikai tulajdonságok a szerkezet és funkció stabilitása a beültetés után illetve a szöveti újraképződés során Lehetőség különböző gyógyszermolekulák illetve bioaktív anyagok beágyazására és szabályozott felszabadulására ECM interakció beültetés után az ECM kialakulásának támogatása Beültetés után az ECM helyettesítése
A scaffold -ok tulajdonságainak jelentősége Biztosítják a sejtek számára a 3D környezetet Beültetés után átmenetileg az ECM-t helyettesíti Közvetlenül irányítják a sejtek differenciálódását Szerkezetük meghatározza az előállított szövetkonstrukciók tápanyagellátását
Öntéses-kioldásos módszer (SCPL) I. Az oldószerben feloldott scaffold -anyagot pórusképző részecskékkel töltött öntőformába öntik Oldószer elpárologtatása Pórusképző részecskék kioldása Scaffold bevonat: az öntőformát a feloldott scaffold anyagba mártják Egyszerű, könnyű, olcsó technika Nem igényel speciális laboratóriumi felszerelést A használt szerves oldószerek gyakran mérgezőek, maradványaik nehezen eltávolíthatóak
Öntéses-kioldásos módszer (SCPL) II. Oldószer Polimer Öntőforma Porogén Porózus szerkezetet kapunk Oldószer elpárologtatása Porogén kioldása
Fázis szeparációs módszerek A polimert két, egymással nem elegyedő oldószer keverékében oldják fel A telített oldatot melegítik A magas illetve alacsony polimer-tartalmú fázisok elkülönülnek egymástól A hőmérséklet csökkentésével a polimer kiválik a fázishatáron a túltelített oldatokból Az oldószert eltávolítják (kivonás, elpárologtatás, szublimáció)
Nyomás P (bar) Magasszintű technikák Gázhabosítás TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Speciális felszerelést igényel A scaffold anyagát nyomásálló kamrába töltik A scaffold anyagát szuperkritikus állapotú széndioxidban oldják fel A hőmérséklet csökkentésével gáz halmazállapotúvá válik A fázishatáron kicsapódik a feloldott polimer 10 000 1 000 100 10 1 szilárd folyadék hármas pont gáz 200 250 300 350 400 Hőmérséklet T (K) szuperkritikus állapot kritikus pont
Elektroszövés I. Polimer vagy kompozit oldat Injektor Fémtű Magasfeszültségű áramforrás V Elektromosan töltött szál Gyűjtőlemez
Elektroszövés II. Speciális felszerelést igényel Sokoldalú, flexibilis technika Nincs szükség extrém körülményekre (hő, koaguláció) Többféle polimer használható, pl.: PLA, PLGA, selyem fibroin, chitosan, kollagén Szálvastagság, pórusméret, szálorientáció könnyedén szabályozható
Magasszintű technikák Szövött biotextíliák TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Speciális felszereltséget igényel Az így előállított scaffold szabályos, szövött szálakat tartalmaz 2D illetve 3D scaffold szerkezet is előállítható A pórusméret könnyen szabályozható Sokoldalú technika, a scaffold anyag széles körben alkalmazható és kombinálható
Szövött biotextília TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Magasszintű technikák Spontán összeszerelődés TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Spontán összeszerelődés a molekulák spontán összeállása rendezett struktúrává Oldott állapotban az amfofil peptidek nem-kovalens kötésekkel összekapcsolódnak
Amfofil peptidek tervezése Foszfoszerin-csoport serkenti a mineralizációt (csontszövet előállításánál) RGD motívumok segítik az adhéziót (integrinkötőhelyek biztosítása) Ciszteinek a molekulák közötti keresztkötések létrejöttét teszik lehetővé GGG összekötő-motívumok a feji és farki rész között növelik a molekuláris szerkezet rugalmasságát
Magasszintű technikák Automatikus gyártási technológiák TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Rapid prototyping : adott szerkezetű tárgy automatizált előállítása additív technológia felhasználásával Gyors technológia, mely azonos minőségű, szerkezetű, mintázatú scaffold -ot eredményez Drága módszer, számítógép vezérelt készüléket igényel
Magasszintű technikák Fused deposition modeling (FDM) TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Robotikusan vezérelt készülék Polimer vagy más anyagból készült szálat tesz le a lerakófejen keresztül több rétegben Szilárd felületre vagy Vonalkázva : ekkor a később eltávolításra kerülő részekhez más anyagot használnak
Magasszintű technikák Selective laser sintering (SLS) TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 A kicsivel az olvadáspontja alatt tartott, por vagy granulátum formájú scaffold anyagból egy réteget terítenek le (előreprogramozott minta szerint) A számítógép-vezérelt lézersugár felmelegíti az anyagot, amely ennek hatására összeáll (összeolvad anélkül, hogy megolvadna) Újabb réteget fektetnek le és olvasztanak össze A tárgy 3D szerkezete így rétegenként épül fel
Selective laser sintering (SLS) 1 Scaffold anyagot mozgató rendszer 2 3 Szkenner Lézer Scaffold réteg Éppen készülő tárgy Roller Dugattyú Dugattyú Dugattyú 4 5 6 7
Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és tissue engineering 10. Előadás BIOKOMPATIBILITÁS
Biokompatibilitás - Definíció Az anyag azon képessége, hogy a befogadó szervezetben az alkalmazásának megfelelő választ vált ki. A biokompatibilitás a TE termékek előállításához használt scaffoldok vagy mátrixok azon képessége, hogy olyan szubsztrátként viselkednek, amely támogatja a megfelelő sejtműködést, vagyis megkönnyíti a molekuláris és mechanikai jelátviteli rendszerek működését az optimális szövetregeneráció érdekében, DE sem az adott sejtekben, sem pedig lokálisan vagy szisztémásan nem idéz elő nem kívánt válaszreakciót.
Biokompatibilitás - Jelenlegi nézetek Régi koncepció: olyan bioanyagok használata, melyek nem lépnek interakcióba a befogadó szervezet ( host ) szöveteivel A bioanyag-tervezés új célkitűzései: A bioanyagok aktív módon interakcióba lépnek a host szöveteivel Pozitív élettani választ váltanak ki Támogatják a sejtek növekedését és differenciálódását
Bioanyagok biokompatibilitása A természetből származó anyagok természetüknél fogva biokompatibilisek (pl.: kollagén, fibrin, hyaluronsav) A xenogén bioanyagokat a biokompatibilitás eléréséhez módosítani kell (pl.: borjúkollagén humán felhasználása előtt az immunogén szekvenciákat el kell távolítani emésztéssel) Már rekombináns humán kollagén is kapható Más xenogén anyagok (pl.: növényi eredetű poliszacharidok) biokompatibilitását tesztelni kell Szintetikus anyagoknál szintén ellenőrizni kell azok biokompatibilitását
Biokompatibilitás - Terminológia Biodegradálhatóság: in vivo makromolekuláris degradáció; a lebomlási termékek nem eliminálódnak a szervezetből Bioabszorbeálhatóság: a makromolekuláris komponensek az anyagcsere megváltozása nélkül jutnak be a szervezetbe Biológiai felszívódóképesség: a makromolekuláris alkotóelemek lebomlása és metabolizálódása, a molelulatömeg csökkenése, a végtermék kiválasztása
Biokompatibilitás tesztelése A vér/anyag vagy szövet/anyag határfelületnek a lehető legkisebbnek kell lennie Álljon ellen a biodegenerációnak Fontos, hogy a bioanyag természetes anyagként viselkedjen vér és szövet jelenlétében. A beültethetőséget kizárja, ha az anyag: Vérrögképződést indít el (Trombózisveszély) Károsítja vagy szenzitizálja a vér sejtes elemeit Megváltoztatja vérplazma fehérjéit (köztük enzimeket) nem kívánt reakciókat előidézve Káros immunreakciót indít el Rákot okoz Teratogén Toxikus vagy allergiás választ vált ki Elektrolitvesztést okoz Sterilizálás hatással van rá
Inkompatibilitás miatt fellépő komplikációk TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 A beültetett anyag elleni immunreakció Krónikus gyulladás Hegszövet képződés Fokozott véralvadás (érgraft inkompatibilitás) Graft elégtelenség Kilökődés
Normál sebgyógyulás A sebgyógyulás több fázisra osztható, az egyes szakaszokra a bennük szerepet játszó sejtpopulációk illetve sejtfunkciók egyaránt jellemzőek: 1. Véralvadás 2. Gyulladás 3. Sejtek inváziója és szöveti újraképződés
Idegentest reakció I. Az implantátum jelenléte megváltoztatja a gyógyulási folyamatot, ez az un. idegentest reakció (Foreign Body Reaction, FBR), részei: Fehérje adszorpció Makrofágok Sokmagvú idegentest óriássejtek Fibroblasztok Érképződés Az implantátum folyamatos jelenléte egy végső készenléti állapot eléréséhez vezethet (resolution). Az implantátum sorsa ezután a következő 3 folyamat egyike lehet: Reszorpció Integráció Enkapszuláció (fibrózis)
Idegentest reakció II. Az abszorbeált plazmafehérjék granulocita és makrofág választ indítanak el A frusztrált fagocitózis a makrofágok aktivációjához és óriássejtek képződéséhez vezet Ér Endotél Monociták Sejt-vándorlás Makrofágok Idegentest típusú óriássejtek Fibroblasztokat és kollagént tartalmazó réteg Makrofágokat tartalmazó réteg Bioanyag Bioanyag
Állandó implantátumok: Hosszú távú fizikai integritás és mechanikai teljesítmény Szervműködés hosszú távú helyettesítése Műbillentyűk, ízületek, stb. TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Bioanyagok Ideiglenes implantátumok: A szöveti regeneráció és gyógyulás átmeneti segítése Csont graftok, biológiailag felszívódó sebészeti varratok
Biológiailag inert anyagok Poli-tetrafluor-etilén (PTFE, Teflon ): A szervezet számára inert Rendkívül alacsony súrlódási együttható (0,05-0,10 a polírozott acélhoz képest) Biológiailag inert, az élő szövetekkel nem lép interakcióba Ízületi protézisek valamint műbillentyűk felszínének borítására használják
Szilikon származékok A szilikonok olyan polimerek, amelyek a biokompatibilis polimerek által általánosan tartalmazott C, H, N, O elemek mellett Si-t is tartalmaznak A szilikonok gyógyászati osztályozása: nem beültethető, rövid- illetve hosszútávra beültethető szilikonok Katéterek, csövek, mellimplantátumok, óvszerek előállításához
Biokompatibilis fémek Titánium ötvözetek ízületi protézisekhez és fogpótlásokhoz Kitűnő mechanikai sajátságok Nem toxikusak, és nem lökődnek ki Egyedülálló osseointegrációs képesség A beültetést megelőzően alkalmazott hidroxiapatit borítás elősegíti az osseointegrációt
Hidroxiapatit kerámiák A hidroxiapatit (HA) természetes állapotban a csontokban és a fogakban megtalálható HA kristályokat gyakran más polimerekkel kombinálják a scaffold előállítás során Mikrokristályos HA táplálékkiegészítőként is kapható a csontritkulás megelőzésére Jobb, mint a CaCO 3 az oszteoporózis megelőzésében
Poli-a-hidroxi-savak: bioabszorbeálható polimerek TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Leggyakrabban használt bioanyagok Fő felhasználási terület: felszívódó varratok, gyógyszerhordozó scaffold -ok, ortopédiai protézisek Poliészter láncok Egyszerű hidrolízissel történő biodegradáció A keletkező a-hidroxi-savak különböző anyagcsereutakon át eliminálódnak (pl.: citromsav ciklus) vagy módosítás nélkül a vizelettel távoznak
Poli-a-hidroxi-savak biodegradációja I. (CH 2 ) n CO(CH 2 ) n C H 2 O HO(CH 2 ) n CO + (CH 2 )COH O O O O Poliészter Hidroxi-terminális Karboxi-terminális Leggyakrabban használt poli-a-hidroxi-savak: Poli-tejsav (PLA) Poli-glikolsav (PGA) Poli-kaprolakton (PCL) Degradációs termékeik a citrátkörbe lépnek be
Poli-a-hidroxi-savak biodegradációja II. PHB Észteráz b-hidroxi-butirát Szerin Glicin Glikolsav H 2 O PGA PDS Piruvát Tejsav H 2 O PLA CO 2 H 2 O Vizelet Acetoacetát Acetil-KoA Citromsav PGA = poli-(glikolsav) PLA = poli-(tejsav) PDS = poli-(d-dioxán) PHB = poli-(hidoroxi-butirát) Citrátkör CO 2 H 2 O Oxidatív foszforiláció ATP
Poli-a-hidroxi-savak felhasználása Típus Polimer Jelenlegi felhasználás Poliészter Poliészter Poliészter Politejsavak Poli-(L-tejsav), [PLLA] Poli-(D, L-tejsav), [PDLLA] Tejsav-glikolsav kopolimer, [PLGA] Poli-(ε-kaprolakton), [PCL] Felszívódó varratok Csontprotézisek Csont-, máj- és idegszövet konstrukció számára scaffold -ként Gyógyszerhordozóként (többféle) Szabályozott hatóanyag-leadási rendszerként (fehérjék és kismolekulájú gyógyszerek) TE scaffold Gyógyszerhordozóként (többféle) Génátvitel Lassú szabályozott hatóanyagleadási rendszerként gyógyszerhordozóként (pl.: > 1 év)
Poli-(Glikolsav), (PGA) PGA merev, erősen kristályos anyag Kizárólag erősen apoláros szerves oldószerekben oldódik Főként felszívódó varratokban használják (Dexon ) SCPL technikával scaffold előállítás Tömeg-degradáció Természetes lebomlási termék (glikolsav)
Poli-(tejsav), PLA és PGA kopolimerek D, L izoformák és racémek keverékei Leggyakrabbab az L izoformát használják együtt PGA-val: PLGA kopolimer PLGA egyike azon kevés polimernek, amelyet humán felhasználásra fejlesztettek ki PGA és PLLA kopolimerjei széles körben felhasználhatóak A degradáció sebessége illetve típusa a kopolimer összetételétől függ
Politejsavak biodegradációja Általános lépés az észterkötések random hidrolízise A degradáció típusa és sebessége az összetételtől függ A lebomlási termékek nem toxikusak, nem váltanak ki gyulladást Nagyméretű ortopédprotézisek esetén azok savas degradációja toxikus termékeket eredményezhet Kisebb darabok törhetnek le az implantátumról, melyek gyulladást okozhatnak
Poli-(kaprolakton), (PCL) Szemikristályos polimer Nagyon lassú degradáció (a tiszta PCL 3 év alatt bomlik le, más kapronokkal alkotott kopolimerjei könnyebben degradálódnak) Hosszabb távú gyógyszerhordozásra használják A PCL-t biokompatibilis, nem toxikus anyagként tartják számon
Polimer erózió A víz beszivárog az anyagba, a polimer amorf fázisának kémiai kötéseit hasítja, így a hosszú polimerláncokat rövid vízoldékony darabokra bontja. Ennek következtében a molekulatömeg csökken, a fizikai tulajdonságok viszont nem változnak, hiszen a kristályos fázisok összetartják a polimert. A víz átjárja az anyagot, és a fragmensek metabolizálódását és tömegerózióját indítja el. A polimer felületi eróziójáról akkor beszélünk, ha a polimer gyorsabban alakul át vízoldékony anyagokká, mint ahogy a víz beszivárog a konstrukcióba.
Bioanyagok degradációjának típusai Felületi erózió Tömegerózió Degradáció Idő
Degradáció I. Biológiailag lebomló hidrogélek: a vízoldékony polimerláncok közötti kémiai keresztkötések hasítása Felületi erózió a jellemző A tömegveszteség lineáris a degradáció során
Degradáció II. A polimerlánc hasítása vízoldékony monomereket eredményez CH 3 CH 3 H 2 O (CH C O CH C O ) x (CH 2 C O CH 2 C O) y O O O O CH 3 HO CH C OH + OH CH 2 C OH O O Krebbs ciklus CO 2 + H 2 O
Degradáció III. Polimer hidrofóbicitás: a hidrofóbicitás növekedése nagyobb stabilitást eredményez Bulky szubsztitúciós csoportok (pl.: metil-csoport PLA esetén) növeli a degradációs időt (PGA<PLA) Üvegesedés: Az üvegesedési hőmérséklet (Tg) felett a rugalmassá váló polimerek láncai mozgékonyabbak, így a víz számára könnyebben hozzáférhetőek Kristályos szerkezet csökkenti, az amorf struktúra növeli a degradáció időtartamát