A Tks5 állványfehérje szerepe az EGF jelpályában Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei Fekete Anna Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar, Biológia Doktori Iskola Doktori iskola vezetője: Dr. Erdei Anna Szerkezeti Biokémia Doktori Program Programvezető: Dr. Nyitray László Témavezető: Dr. Buday László Magyar Tudományos Akadémia, Természettudományi Kutatóközpont, Enzimológiai Intézet Budapest 2015
1. Bevezetés A sejtek közötti és a sejteken belüli jelátviteli folyamatok régóta és széles körben kutatott területe a biológiai tudományoknak. E terület fontossága könnyen belátható, hisz a bonyolult folyamatok megértésével akár számos betegség gyógyíthatósága is elérhető közelségbe kerül. Jelátvitelen általánosan azt a folyamatot értjük, amikor az extracelluláris/külső térből érkező stimulus - ami lehet valamilyen hormon vagy növekedési faktor, vagy egyéb - a sejt egyik receptorát aktiválja és a sejt végül valamilyen módon választ fejt ki; génexpresszióváltozás vagy metabolikus változás esetleg aktin sejtváz átrendeződés történik. A sejten belüli, aktivált receptortól történő jeltovábbítás fontos résztvevői az állványfehérjék. Szerepük a jelátviteli enzimek, receptorok megkötésében, együtttartásában van. Ezek a komplexek a jelátviteli folyamatok funkcionális egységei. Ebbe a csoportba tartozik a Tks fehérjecsalád is, melynek két tagja ismert; a Tks4 és Tks5 fehérje. Az Src tirozin kináz szubsztrátjaiként azonosított fehérjék elsősorban az aktin váz átrendeződésében, podoszómák, invadopódiumok képzésében játszanak szerepet. E nagyméretű, multidomén fehérjék több fehérje-interakciós SH3 domént, valamint egy N-terminális, lipid-kötő PX domént hordoznak. A nyugvó sejtekben diffúz citoplazmatikus elhelyezkedést mutató Tks fehérjék aktív Src hatására foszforilálódnak és a plazmamemránhoz transzlokálódva, egyes aktin-kötő és aktin polimerizációt elindító fehérjék megkötésén keresztül részt vesznek a sejtek mozgásához/migrációjához szükséges képződmények, a podoszómák kialakításában. Ennek pontos mechanizmusa még nem ismert, mint ahogy az sem, hogy milyen működésbeli különbség van a Tks4 és Tks5 között. Az EGFR számos jelátviteli útvonalon keresztül szabályozhatja az aktin sejtváz átrendeződését, mint például a foszfolipáz Cγ1 aktiváción vagy Rho GTPázokon keresztül. Mivel Src tirozin kináz általi szabályozást is kimutattak már, felmerült a lehetőség, hogy a Tks fehérjék az EGF útvonalon keresztül szabályozzák az aktin vázat. Laborunkban a Tks4- ről már kimutatták, hogy képes az aktin sejtváz Src-n és EGFR-on keresztüli szabályozására. Disszertációmban pedig bemutatom azokat az eredményeket, melyek a Tks5-öt is az EGF jelátviteli út tagjaként azonosítják. A Tks4 génjében bekövetkezett mutációk egy igen ritka, autoszomális recesszív öröklődésű betegség kialakulásához vezethetnek, melyet Frank-ter Haar szindrómának neveznek. A legtöbb esetben a mutáció a fehérje teljes hiányát okozza, azonban az egyik
érintett család esetében egy pontmutációt írtak le, melynek következtében a fehérje PX doménjében a 43. arginin helyett triptofán épült be. E betegek tünetei azonosak voltak a fehérje teljes hiánya esetén tapasztaltakkal. Doktori dolgozatomban kitérek azon eredményeinkre, melyek a Tks4 R43W mutáns fehérje ún. aggresszómákba való sejten belüli izolációját bizonyítják, mely magyarázatul szolgálhat a fentebb említett jelenségre. 2. Célkitűzések A Tks5 podoszómaképzésben betöltött szerepét már több közleményben leírták, ám növekedési faktor indukálta sejtmozgásban még nem vizsgálták szerepét. Laboratóriumunkban már hosszú ideje foglalkozunk az EGF jelpályával és az EGF általi aktin citoszkeleton szabályozással. A rokon Tks4 fehérjéről pedig már sikerült kimutatnunk, hogy része az EGF-jelpályának, és szerepet játszik az EGF-függő aktin citoszkeleton átrendezésben. Ezért vizsgálatainkat kiterjesztettük a Tks5 fehérjére is. Első körben az alábbi kérdések megválaszolását tűztük ki célul: 1. Foszforilálódik-e a Tks5 EGF hatására? 2. Milyen kinázon keresztül történik a foszforiláció? 3. Szükséges-e a fehérje PX doménje és az azon keresztüli membránkapcsolat a foszforilációhoz? 4. EGF hatására hol helyezkedik el sejten belül a fehérje? Történik-e transzlokáció? A rokon Tks4 fehérjéből létrehozott PX domén-mutáns előzetes kísérleteink alapján rendellenes sejten belüli lokalizációt mutat. Ennek további vizsgálatához célunk az alábbi kérdések megválaszolása volt: 5. A Tks4 R43W mutáns hová lokalizálódik a sejten belül? 6. A kialakult fehérje-aggregátum aggresszómának tekinthető-e?
3. Módszerek Plazmidok és konstrukciók; Irányított mutagenezis A pcdna3.1/v5-his-topo vektorba klónozott humán V5-Tks5 és V5-Tks4 konstrukciókat Geiszt Miklós laboratóriumából kaptuk. Ebből QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies) segítségével állítottuk elő az R42A és R43W mutánsokat, a gyári leírásnak megfelelően. Sejtvonalak fenntartása és tranziens transzfekciója A COS7 és A431 sejtvonalakat 10% magzati borjúszérumot (FBS), hozzáadott glutamint (2 mm) és antibiotikumot (100 egység/ml penicillin, 100μg/ml sztreptomicin) tartalmazó Dulbecco s modified Eagle s médiumban (DMEM) tartottuk fönt 37 C-os termosztátban, 5% CO2 tartalmú levegőben. Az egyes plazmidok tranziens transzfekcióját COS7 sejtekbe Lipofectamine reagenssel (Life Technologies) végeztük. Sejtek kezelése inhibitorokkal és EGF-stimuláció Az EGF-kezelést megelőzően a sejteket szérummentes közegben tartottuk egy éjszakán át. A sejtek stimulációjához 50 ng/ml EGF-et használtunk, mellyel 10 percig inkubáltuk a sejteket 37 C-on. Amennyiben az Src-t vagy a PI3-kinázt gátolni akartuk, ezt az EGF-kezelést megelőzően, inhibitor hozzáadásával értük el. Az Src tirozin kináz gátlásához PP1 inhibitort használtunk 10 µm végkoncentrációban, illetve 10 µm PP2-t, vagy 5 µm Src kinase inhibitor I-t. Mindhárom esetben egy órán keresztül kezeltük a sejteket. A PI3 kinázt 20 µm LY294002 vagy 5 µm BKM120 nevű gátlószer egy órán keresztüli alkalmazásával gátoltuk. Immunprecipitáció és Western Blot A különböző kezeléseken átesett COS7, illetve az A431 sejteket jéghideg foszfát pufferrel mostuk (PBS), majd Triton X-100-at, valamint proteáz- és foszfatázgátlókat tartalmazó pufferben tártuk fel. Az immunprecipitációt transzfektált sejtek esetén agarózhoz konjugált anti-v5 ellenanyaggal végeztük, míg az endogén fehérjét A431 sejtekből Protein-A Sepharose gyöngyökhöz kötött Tks5-ellenanyaggal fogtuk ki. A mintákat SDS tartalmú poliakrilamid-gélen választottuk el, amit azután nitrocellulóz membránra blottoltunk át. Az
előhívást torma-peroxidázhoz kapcsolt másodlagos ellenanyaggal, a detektálást ECLreagenssel és fényérzékeny filmmel végeztük. Immunfluoreszcens festés A COS7 sejteket kis sűrűségben, üveg fedőlemezeken növesztettük. Másnap a sejteket a megfelelő konstrukciókkal transzfektáltuk, majd rákövetkező nap a különböző kezeléseket és PBS-es mosást követően paraformaldehiddel fixáltuk. Ezt követően a Tks5 megjelölésére szolgáló anti-v5 elsődleges majd fluoreszcensen jelölt másodlagos ellenanyaggal inkubáltuk a sejteket. Az F-aktint TRITC-falloidinnel, a sejtmagokat DAPI-val tettük láthatóvá. A rokon Tks4 fehérje PX domén-mutáns változatának (Tks4 R43W ) sejten belüli lokalizációjának vizsgálata a fent leírtakhoz hasonlóan történt. A Tks4 megjelölésére szintén az anti-v5 elsődleges-, valamint az Alexa Fluor 488 vagy 546 fluoreszcens másodlagos ellenanyagokat használtuk. Az értekezésben bemutatott képeket Zeiss LSM 710 típusú konfokális mikroszkóppal készítettük.
4. Eredmények 1. Kimutattuk, hogy a Tks5 fehérje tirozinon foszforilálódik EGF-kezelés hatására. Mind COS7 sejtekben, overexpresszált fehérje esetén, mind A431 sejtekben, endogén fehérje esetén sikerült kimutatni a foszforilációt. A sejteket egy éjszakán át szérummentes körülmények között tartottuk, majd 10 percig EGF-el kezeltük. Ezt követően a Tks5-öt (COS7 sejtekből V5 ellenanyaggal, A431 sejtekből Tks5 ellenanyaggal) immunprecipitáltuk és anti-foszfotirozin Western blot-tal vizsgáltuk a fehérje foszforilációját. 2. Bizonyítottuk, hogy a Tks5 fehérje foszforilációja az EGF-kezelés 5. perce után eléri a maximumát és ez az intenzitás változatlanul fennmarad a két órás intervallumon belül. Irodalmi adatokból ismert, hogy a PDGF hatására bekövetkező Tks5 foszforiláció kinetikája nagyon lassú. A maximális intenzitást csak két órával a stimulust követően éri el. Ezzel szemben kísérleteinkkel igazoltuk, hogy az EGF-kezelést követő fehérjefoszforiláció időbeni lefutása a jelátviteli folyamatok általános menetét követi. Kísérleteink során V5-Tks5-el transzfektáltunk COS7 sejteket és a szérummentes körülmények között töltött éjszakát követően EGF-el kezeltük őket 5, 10, 30, 60 és 120 perces időtartamokig. A V5-Tks5-öt immunprecipitáltuk és anti-foszfotirozin Western blot-tal vizsgáltuk a fehérje foszforilációját. 3. Kimutattuk, hogy a Tks5-öt EGF-stimulus hatására az Src nem-receptor tirozin kináz foszforilálja, viszont kölcsönhatás a kináz és szubsztrátja között a Tks4-el ellentétben immunprecipitációval nem kimutatható. A Tks5 az Src tirozin kináz jól ismert szubsztrátja; az irodalmi adatokból pedig az is ismert, hogy az EGF jelpálya működése során az Src kináz család tagjai aktiválódnak. Ezért feltételeztük, hogy a Tks5 fehérje EGF hatására bekövetkező foszforilációja is Src-n keresztül történik. Ennek vizsgálatára V5-Tks5-el transzfektált COS7 sejteket, valamint A431 sejteket EGF kezelés előtt különböző Srcgátlószerekkel egy órán át inkubáltunk. Sikerült kimutatnuk, hogy COS7 sejtekben három különböző inhibitor (PP1, PP2, Src Inhibitor I) alkalmazása mellett, illetve A431 sejtekben PP1 hatására a Tks5 foszforiláció gátlódott.
Tekintve, hogy a rokon Tks4 esetében sikerült kimutatni, hogy a fehérje az Src-vel össze is kapcsolódik EGF-kezelés hatására, vizsgáltuk azt is, hogy a Tks5-el szintén kialakul-e kapcsolat. Ehhez a V5-Tks5-öt immunprecipitáltuk EGF-el kezelt COS7 sejtekből és anti-src Western blottot végeztünk. Az Src tirozin kináz nem volt kimutatható az EGF-el kezelt mintában. 4. Igazoltuk, hogy a Tks5 fehérje PX doménje EGF-el kezelt sejtekben főként a PI3-kináz lipidtermékeihez kötődik; ezek hiányában a fehérje csökkent foszforilációt mutat. Irodalmi adatokból ismert, hogy a PX domén kötőpartnerei közül a 3-as pozícióban foszforilált foszfatidil-inozitol lipideket részesíti előnyben, melyek a PI3- kináz lipidtermékei. Mivel a PI3-kinázról köztudott, hogy működését az EGFR is aktiválni képes, felmerült a lehetőség, hogy a PI3-kináz aktivitása szükséges a Tks5 foszforilációjához. Ennek vizsgálatára V5-Tks5-el transzfektált COS7 sejteket, valamint A431 sejteket EGF kezelés előtt különböző PI3-kináz-inhibitorokkal (LY294002, BKM120) előkezeltünk, és azt tapasztaltuk, hogy a PI3-kináz gátlása csökkentette illetve megszüntette a Tks5 EGF hatására bekövetkező foszforilációját. 5. Bizonyítottuk, hogy a PX domén már egy konzervált argininjének az elmutálása (R42A) is a Tks5 fehérje lipidkötő képességének elvesztéséhez, ezáltal a foszforiláció elmaradásához vezet. A fehérje PX doménjének 42-es pozícióban lévő, lipid-kötésben fontos, konzervált argininjét alaninra cseréltük, majd e mutáns Tks5-öt COS7 sejtekben fejeztettük ki. EGF-kezelés utáni immunprecipitációval és Western blottal kimutattuk, hogy a vad típusú fehérjével ellentétben a PX domén mutáns Tks5 EGF hatására nem foszforilálódik. Ez az eredmény megerősíti a PI3-kináz gátlásánál tapasztaltakat, mely szerint a Tks5 fehérje foszforilációjához szükséges a PX-domén által közvetített, foszfatidil-lipideken keresztüli membránhoz kapcsolódás. 6. Kimutattuk, hogy a Tks5 fehérje EGF-kezelés hatására a plazmamembránhoz, az aktintartalmú sejtszéli fodrokba transzlokálódik. A PI3-kináz gátlása a transzlokációt csak részben gátolja, míg a PX domén mutáns fehérje membrántranszlokációja EGF hatására elmarad.
A Tks5 fehérje sejten belüli lokalizációjának vizsgálatához vad típusú és PX domén mutáns (R42A) fehérjéket COS7 sejtekben kifejeztettünk. EGF-el illetve PI3- kináz gátlószerrel (LY294002) történt kezeléseket követően immunfluoreszcens festéssel és konfokális mikroszkóppal tettük láthatóvá a sejteket. Azt tapasztaltuk, hogy EGF-kezelés hatására az addig citoplazmatikus fehérje a plazmamembránhoz, az aktinban gazdag sejtszéli fodrozódásokba transzlokálódott. A membránhoz toborzódást a PI3-kináz inhibitor alkalmazása csak részben akadályozta, míg a PX doménen belül létrehozott inaktiváló pontmutáció (R42A) hatására a Tks5 teljesen elvesztette azt a képességét, hogy EGF-kezelés hatására a membránhoz transzlokálódjon. 7. Bizonyítottuk, hogy a rokon Tks4 fehérje Frank-ter Haar szindrómás betegekben is kimutatott PX domén-mutáns változata (R43W) a sejtmag melletti aggresszómákban lokalizálódik, mivel a Tks4 R43W mutáns az aggresszóma-marker HDAC6-al kolokalizációt mutat, aggregátumát pedig vimentin-ketrec veszi körbe. A különböző Tks4-konstrukciók sejten belüli lokalizációjának vizsgálatához V5 címkével ellátott vad típusú és R43W mutáns Tks4-el, valamint üres V5- plazmiddal transzfektáltunk COS7 sejteket. Immunfluoreszcens festés és konfokális mikroszkópia segítségével kimutattuk, hogy a vad típusú Tks4 a sejtekben normál, diffúz citoplazmatikus eloszlást mutat, míg az R43W mutáns Tks4 aggregátumot képez a sejtmag mellett. Irodalmi adatokból ismert, hogy eukarióta sejtekben a rosszul feltekeredett fehérjék, miután telítik a proteoszóma rendszert, aggresszómának nevezett képletekbe gyűlnek. A poliubikvitinálódott fehérjeaggregátumok hisztondeacetiláz 6 (HDAC6) segítségével a mikrotubulus hálózaton keresztül a mikrotubulus organizáló centrumhoz (MTOC) szállítódnak, ahol vimentin-ketrec burkolja be őket. A vad típusú és R43W mutáns Tks4-el transzfektált COS7 sejtekben immunfluoreszcens festéssel, konfokális mikroszkóppal vizsgáltuk a HDAC6 és vimentin sejten belüli lokalizációját. Kimutattuk, hogy a Tks4 R43W aggregátumával a HDAC6 kolokalizációt mutat, a vimentin filamentumok pedig burokként veszik körbe az aggregátumot.
5. Következtetések Doktori értekezésemben bemutatott eredményeink igazolják, hogy a Tks5 állványfehérje hasonlóan a rokon Tks4 fehérjéhez tagja az EGF-jelpályának és részt vesz az EGF indukálta aktin citoszkeleton átrendeződésben. Kimutattuk, hogy a fehérje EGF-kezelés hatására tirozinon foszforilálódik. A foszforiláció kinetikáját vizsgálva a jelátviteli folyamatok általános sémáját tapasztaltuk, ugyanis a foszforiláció szintje már 5 perccel az EGF kezelést követően elérte a maximumát és ez az intenzitás nagyrészt változatlanul fennmaradt két órán keresztül. Ez azért is érdekes, mivel irodalmi adatokból ismert, hogy a Tks5 PDGF hatására is foszforilálódik, ám e folyamat időbeni lefolyása jóval lassabb, a foszforiláció maximális intenzitását csak két órával a stimulust követően éri el. Bizonyítottuk, hogy a Tks5-öt EGF-stimulus hatására is az Src nem-receptor tirozin kináz foszforilálja. Egyúttal feltártuk, hogy a nagyfokú hasonlóság mellett számos különbség adódik a Tks5 és a Tks4 szabályozásában, mely a két fehérje eltérő funkciójára is utalhat. A PX domén Tks5 működésében betöltött szerepét több kísérlettel is igazoltuk. Eredményeink alapján úgy tűnik, hogy a Tks5 Src-általi foszforilációjához szükséges, hogy azt megelőzően a hármas helyen foszforilált inozitol lipidek megjelenjenek a membránban, és ezekhez a fehérje PX doménjén keresztül kikötődjön. Vagyis a membránhoz kapcsolódás megelőzi a foszforilációt. Ez az eredményünk ellent mond azon irodalmi adatoknak, mely szerint az Src általi foszforiláció a fehérje inaktív szerkezetének kinyílásának előfeltétele. Egyúttal egy újabb, eddig még ismeretlen szabályozási lépés lehetőségét is felveti. Kimutattuk, hogy a Tks5 fehérje EGF-kezelés hatására a plazmamembránhoz, az aktintartalmú sejtszéli fodrokba (angolul: membrane ruffles) transzlokálódik. Igazoltuk, hogy a Tks5 lipidkötésének elrontása (akár a PX domén elmutálásával, akár a lipidtermékek képződésének gátlásával) a fehérje membránfodrokba történő transzlokációját megszüntette. Eredményeink rávilágítanak, hogy a Tks5 (és Tks4) fehérjék egyéb (a podoszómáktól és invadopódiumoktól különböző) aktin-átrendeződéssel járó szerkezetek (pl. membránfodrok) kialakításában is részt vehetnek. Bizonyítottuk, hogy a rokon Tks4 fehérje PX doménjében lévő 43-as arginin triptofánra való mutációja a fehérje hibás tekeredéséhez és ún. aggreszómákba való izolációjához vezet. Valószínűleg ezzel magyarázható az a megfigyelés, miszerint ez a mutáció a fehérje teljes hiánya esetén megfigyeltekkel azonos tüneteket okoz a Frank-ter Haar szindrómás betegekben.
6. Saját publikációk jegyzéke 6.1. Az értekezés témájához kapcsolódó közlemények 1. Bogel G, Gujdár A, Geiszt M, Lányi Á, Fekete A, Sipeki S, Downward J, Buday L. Frank-ter Haar syndrome protein Tks4 regulates epidermal growth factor-dependent cell migration. J Biol Chem. 2012 Sep 7;287(37):31321-9 2. Fekete A, Bogel G, Pesti S, Péterfi Z, Geiszt M, Buday L.: EGF regulates tyrosine phosphorylation and membrane-translocation of the scaffold protein Tks5. J Mol Signal. 2013 Aug 7;8(1):8. 3. Ádám Cs, Fekete A, Bőgel G, Németh Zs, Tőkési N, Ovádi J, Liliom K, Pesti Sz, Geiszt M, Buday L. Accumulation of the PX domain mutant Frank-ter Haar syndrome protein Tks4 in aggresomes. Cell Commun Signal. 2015 (megjelenés alatt) 6.2. Egyéb közlemények 1. Kun E, Mendeleyev J, Kirsten E, Hakam A, Kun AM, Fekete A, Bauer PI, Dunai Z, Mihalik R. Regulation of malignant phenotype and bioenergetics by a π-electron donor-inducible mitochondrial MgATPase. Int J Mol Med. 2011 Feb; 27(2):181-6. 2. Fekete A, Kenesi E, Hunyadi-Gulyas E, Durgo H, Berko B, Dunai ZA, Bauer PI. The guanine-quadruplex structure in the human c-myc gene's promoter is converted into B-DNA form by the human poly(adp-ribose)polymerase-1. PLoS One. 2012;7(8):e42690. 3. Pesti S, Balázs A, Udupa R, Szabó B, Fekete A, Bőgel G, Buday L. Complex formation of EphB1/Nck/Caskin1 leads to tyrosine phosphorylation and structural changes of the Caskin1 SH3 domain. Cell Commun Signal. 2012 Nov 27;10(1):36.