FIXÁLÁSI TECHNIKÁK A PATOLÓGÁBAN dr. Péter Ilona Országos Onkológiai Intézet Sebészi és Molekuláris Daganatpatológiai Centrum és a Frank Diagnosztika Dako Szimpóziuma 2010. december 3. Budapest
Bevezetés Fixálási technika Fixálási eljárások a rutin hisztotechnikai gyakorlatban Kezdetektől Napjainkig Fixálási technika a differenciáldiagnosztikai gyakorlatban Immunhisztokémiai/Immuncytokémiai Molekuláris patológiai felhasználásra is Fixálási eljárások a mindennapi használatban Előnyök Hátrányok
Virchow s initial studies of Cellular Pathologie (1863), and the rational system of histologic classification of normal and neoplastic tissues that ultimately derived from those studies, were only possible because of concurrent advances in practical techniques. Thus in the mid-19th century, following the pioneer studies of Marcello Malpighi and Anton van Leeuwenhoek, more efficient microscopes were available, and morbid histology was being taught in medical schools. This reflected not only gradual acceptance of the method, but also the development of two indispensable aids to modern histopathologic diagnosis: The microtome and the methods of practical histologic staining. These developments not only made it possible for Virchow to perform his studies, but also facilitated the translation of his ideas into diagnostic practice. Willis RA, Pathology of tumours. Butterworths, London, 1948.
Rögzítőszerek, rögzítőkeverékek Formalin: a formaldehid 40%-os vizes oldata, a leggyakrabban használt rögzítőszerünk. Általában 10%-os koncentrációjú formalint használunk (4-szeres hígítás), de használatos a 4%-os formalin is (10-szeres hígítás). Célszerű a formalint neutralizálni. A neutralizálásra nátriumkarbonátot vagy nátrium-hidrogénkarbonátot használunk. A formalin a fehérjék számos oldalláncával, funkciós csoportjaival lép reakcióba. Hosszantartó formalin fixálás után az anyagban un. formalin pigment (barnás - zöldes) keletkezik. Glutáraldehid: a formalinnal szemben dialdehid. Sokkal erélyesebben fixál, mint a formalin, tehát a fixálási idő is lényegesen csökken. Paraformaldehid: a formaldehid polimerje. Hidroxi - adipaldehid: ugyancsak dialdehid általában 12,5%-os, pufferolt oldatát használják. Alkohol: erélyes vízelvonószer, a fehérjéket kicsapja, denaturálja, de immunológiai vizsgálatok szerint számos fehérje megtartja immuntulajdonságait alkohol kezelés után is. Erélyes jó fixálószer, hátránya azonban, hogy a vízelvonás miatt zsugorítja az anyagot. Aceton: az alkoholhoz hasonló vízelvonó és fehérje denaturáló szer. Ozmium-tetroxid: elsősorban elektronmikroszkópos technikában használják fixálószerként. Króm - sók: erős affinitásuk van a fehérjék -COOH és -OH csoportjához. Önmagában nem, más fixálókkal együtt szokták használni. Higany - sók: a krómsókhoz hasonlóan a fehérjék -COOH és -OH csoportjaihoz kötődik, de ezen kívül rendkívüli affinitásuk van az -SH csoportokhoz. Önmagukban nem használják fixálásra. Számos ún. fixálókeveréket is ismerünk: Zenker - fixáló, Carnoy - oldat, Cajal- fixáló, Susa -fixáló, Helly, Bouin, Orth. Ezek közül mindig azt kell kiválasztani, amely az alkalmazandó, további vizsgálati eljárást legkevésbé befolyásolja.
Formaldehid / Methanol A formaldehidet 1867-ben fedezte fel Wilhelm von Hofman és Alexander Butlerov. 1892-ben izolálták először. Friedrich Von Stradovitz megalkotta a kémiai kötések elméletét. A metanol a metilalkohol oxidációjával előállított termék. A természetben a formaldehid ritkán található meg eredeti formájában, mert rövid a felezési ideje a levegőben. Fényben toxikus hatóanyaggá alakul. Vízben nagyon bomlékony, könnyen szétválik szállítás közben is.
Formaldehid Szinoninák: formalin, hangyasavaldehid, formolhidrát, metanal, metilaldehid Formaldehydum solutum, Formaldehyd, Formol) Szerkezete: CH 2 O Neve az acidum formicicum (hangyasav) és az aldehid szavak összevonásából származik Tiszta, vízmentes állapotában színtelen, szúrós, átható szagú (a levegőnél csak kissé nehezebb) gáz. Vízben rendkívül könnyen oldódik. 1 liter víz szobahőmérsékleten több, mint 400 liter gáz állapotú formaldehidet képes feloldani. Az oldat legnagyobb töménysége 55 % a kereskedelmi közönséges oldat 30-40 %-os vizes oldat. A tiszta és az oldott formaldehid számos polimerizációs és Addíciós reakcióra hajlamos, mivel a szénnek oxigénnel alkotott kettőskötése a következőképpen bomolhat fel: R és R1 bármilyen gyököt jelenthet A formaldehid többek között a következő polimerizációs terméket képezheti: Trioximetilén (trioxán) (CH 2 O)3 (Römpp féle Vegyészeti Lexikon, 1960. Budapest). H I C-OR I R1
Formaldehid hatása a szövetekre A kereskedelmi forgalomban kb. 40 %-os formaldehid oldatot lehet beszerezni. Rutin hisztopatológiai felhasználásához 1:9 1:3 arányú hígítását használják, 4-10 %-os formaldehid formalin, amit kiegészítenek isoosmolaritás elérése céljából pufferolják ph 7,0 re. A formalin fixáló kapacitása főleg a proteinekkel történő reakcióba lépésnek pontosabban a reaktív hidrogén résznek tulajdonítható. Metilező kötések alakulnak ki a bázikus aminosavak között, mint például a lizin és arginin. Továbbá a diszulfid kötődések redukálódnak szulfhidril csoportokra, amelyek viszont részt vesznek a metil kötéssel keresztkötések kialakításában. A fehérjék sekunder és tertier szerkezetében következnek be változások. Az epitópok maszkírozódhatnak.
Fixálási módszerek A paraffinba ágyazást megelőző számos fixálási protokoll ismert: Rutin körülmények között a széles választékból a formalinban történő fixálás a legelterjedtebb. Fixálószer Fixálási idő ( óra ) Hőmérséklet (ºC) 2-10% formaldehid 0,05 M foszfát pufferrel ph 7,2 12-18 21 Bouin (pikrinsav, ecetsav) 4-8 21 Zenker (kálium dikromát, higany klorid, nátrium szulfát, ecetsav) 4-8 21 B5 (higany klorid, formaldehid, nátrium acetát) 4-8 21 Etilalkohol és ecetsav (1 % vol) 12-18 4 Európában a legtöbb patológiai intézetben a 10 %-os formalint használják standard fixáló szerként, kiváló szövetekbe történő penetrációs tulajdonsága miatt.
Tissue preparation for immunocytochemistry Williams JH, 1997. There is no standard tissue preparation schedule for the optimal demonstration of all antigens. Factors involved in all aspects of tissue preparation can affects immunoreactivity, so it is important that precise details of the preparation schedule are given when reporting immunocytochemical studies, rather than using the general term: routinely fixed and processed. J Clin Pathol 1997; 50:422-428.
Ismert, jelenleg is használt fixálási protokollok 1. Fixáló szerek: 10 % neutralizált pufferolt formalin; 10 % formalin csapvízzel hígítva; 10 % formalin, NaCl-dal kiegészítve; 10 % neutrális pufferolt formalin-nacl-dal kiegészítve; 10 % formalin ecetsavval kiegészítve; 10 % formalin cinkkel kiegészítve; Carson féle fixáló; Bouin féle fixáló; B5
Ismert, jelenleg is használt fixálási protokollok 2. Fixálások időtartama <5, 5, 12, 24, 36 és 48 óra 3. Fixáló oldat hőmérséklete: 18ºC, 27ºC és 37ºC 4. A 10 %-os formalin ph értéke: ph 3,0 ph 5,0 ph 7,0 ph 9,0 és ph 11,0. 5. Fixálás előtti késlekedési időtartam: 0, 1, 2, 4 és 8 óra 6. A formalin és a sebészi preparátum térfogat-aránya: 1:1, 1:20 7. A formalinhoz adott melitalkohol %-os aránya: 0-, 0,25-, 0,5-, 1,5-, 2- és 5 %
A fixálási protokoll kivitelezéséhez varációk: A fixálási procedúra időtartama Csökkentett (gyorsított) Hosszabb (nyújtott), mint általában. Hőmérséklet a fixálási eljárás során: Környezettel egyező vagy 45ºC Vacuum használata a fixálási periódusban végig. Blokkok száma és a szövet pozíciója a tartó dobozban az eljárás alatt. Xylol minősége: a Xylol tisztító reagensek ismételt felhasználása,?!
A MINTA FIXÁLÁSA, A SZÖVETTANI TECHNIKA STANDARDIZÁLÁSA 1. Formalin (aldehyd) fixálás A formalin vizes oldatban főleg metilén-glicol {CH 2 (ON) 2 } formában és ennek oligomerjeiben van jelen, szabad HCHO nagyon kevés. A CH 2 (ON) 2 gyorsan, 4 óra alatt penetrál a szövetekbe, még 4 C-on is. A formaldehyd bekötődése a szövetekbe lassú, 8-12 órát igényel, a metilénglicol bomlása előzi meg és a szövetekben metilén-hidakat képezve fixál. Rövid mikrohullámú besugárzás jelentősen gyorsítja a fixálást. Szövetblokk fixálása: PBS-ben oldott 8%-os neutrális formalinban 8-12 óra. 2. Vízelvonó szerekkel (alkohol) történő fixálás Alkalmas molekuláris patológiai célokra 3. Molekuláris patológiai vizsgálatot nehezítő / kizáró eljárások Nem-neutrális formalinban történő fixálás Core biopsia fixálása < 1 óra Műtéti szövetminta fixálása < 6 óra, > 24 óra A fixálás alapvetően befolyásolja a MP vizsgálatok eredményét
Tissue preparation for immunocytochemistry Williams JH, 1997. Vizsgált antitestek Eredet Munkahígítás Előkezelés L26 CD20 Dako A/S 1:1000 NT UCHL1 CD45RO Dako 1:100 NT CD3 Dako 1:200 E/ Tripszin Vimentin 3B4 Dako 1:1000 E/ Tripszin Kappa lánc Dako 1:500 E/ Tripszin J Clin Pathol 1997; 50:422-428.
Tissue preparation for immunocytochemistry Williams JH, 1997. Vizsgált antitestek Eredet Munkahígítás Előkezelés MIB1 Dako A/S 1:1000 + MW PC10 Dako 1: 800 E/tripszin ID5 Dako 1:500 + MW bcl-2 Dako 1:150 + MW α1sma Dako 1:2000 + MW CEA Dako 1:400 E/Tripszin Vimentin (V9) Dako 1:2000 + MW Desmin Dako 1:500 NT J Clin Pathol 1997; 50:422-428.
Tissue preparation for immunocytochemistry Williams JH, 1997. Az immunfestés eredménye a formalinnal végzett különböző hosszúságú fixálási idők függvényében Antitest <5 h 5 h 12 h 24 h 36 h 48 h L26 +++ +++ +++ +++ +++ +++ UCHL1 +++ +++ +++ ++ ++ + CD3 ++ ++ +++ +++ +++ +++ Vimentin + +++ +++ +++ ++ + Kappa - ++ +++ +++ +++ +++ J Clin Pathol 1997; 50:422-428.
Average percentage of cells stained per case in stored vs. fresh sections among positives for A. ER (n = 65) B. PR (n = 67) C. HER2 (n = 67) Immunohistochemistry for PR. A. A core from the freshly cut and immunostained section. B. The same tissue core from a section that had been cut 6 months previously and was stained at the same time as the core in A. Fergenbaum J H et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2004;13:667-672
Dako PATHOLOGY FLEX Ready-to-Use Atlas of Stains - 3rd Edition Difterential diagnosis is aided by the results from a panel of antibodies. 2008
Automatizálható munkafolyamatok Szövetelőkészítés Paraffinblokkba ágyazás Metszés Metszet festés Metszet fedés Speciális festés Immunhisztokémia Szöveti microarray készítése Hajas Lászlóné MPT 2010
Szövet előkészítés Előnyök Hátrányok Zárt rendszer Számítógép vezérelt Állandó térfogat, időtartam és hőmérséklet Kapacitás 306 blokk/nap Reagensek keverése, szövetminták rotálása Hajas Lászlóné MPT 2010 Meghibásodás Aktuális program valamely lépésénél a gép leáll károsodott szövetek Befagy a paraffin idővesztés Esetleges magas javítási költség Érzékenység
Szöveti multiblokk készítő A szöveti microarray (TMA) készítő automata segítségével egy hagyományos metszeten akár több száz különböző szövetblokkból származó azonos nagyságú mikrominta helyezhető el. - pontosan meghatározhatjuk a kiszúrás helyét - új antitestek gazdaságosan és gyorsan tesztelhetők - genetikai molekuláris vizsgálatok Hajas Lászlóné MPT 2010
Immunhisztokémia Kiváló minőséget biztosító automata - standardizált automatizált reakciók - szabadon szerkeszthető protokollok - kapacitás 30 tárgylemez - immunhisztokémia - In situ hibridizácio FIHS SISH The Total Test Approach to Standardization of Immunohistochemistry Clive R. Taylor, MD, DPhil Arch Pathol Lab Med 124: 945-951. 2000 Hajas Lászlóné MPT 2010
A módszer standardizálása: Kontrollok (belső és külső kontrollok) kialakítása Hibaforrások felkutatása