Sample & Assay Technologies

2008 október EZ1 DSP DNA Blood Kit Használati utasítás 48 2. verzió Az EZ1 DSP DNA Blood Kit a QIAGEN BioRobot EZ1 DSP-vel vagy az EZ1 Advanced DSP-vel együtt egy olyan rendszer, amely mágneses gyöngy technológiát használ genomi DNS izolálásra és tisztításra humán eredetű teljes vérmintából diagnosztikai eljárásokban való felhasználáshoz. In vitro diagnosztikai felhasználásra 62124 1050259HU QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D-40724 Hilden R2 1050259HU Sample & Assay Technologies

QIAGEN Sample and Assay Technologies A QIAGEN vezető gyártója különböző innovatív minta és analízis technológiának, mely lehetővé teszi bármilyen biológiai mintából azok összetevőinek izolálását és detektálását. A fejlett technológiát tartalmazó, kitűnő minőségű termékek és szolgáltatások biztosítják a sikert a mintától az eredményig. A QIAGEN etalon a következő technológiákban: DNS, RNS és fehérjék tisztítása Nukleinsav és fehérje assay-k microrns kutatás és RNSi Minta és analízis technikák automatizálása Küldetésünk, hogy lehetővé tegyük a felhasználóink számára kiemelkedő sikerek és áttörő eredmények elérését. További információért kérjük, látogassa meg a www.qiagen.com honlapot.

Tartalomjegyzék Kit összetevõk 4 Jelölések 4 Tárolás 5 A felhasználás célja 6 A felhasználás korlátai 6 Termék és elégedettségi garancia 6 Technikai segítségnyújtás 7 Biztonsági információk 7 Minőségbiztosítás 9 Bevezetés 10 Elv és módszer 10 Az EZ1 DSP DNA Blood rendszer teljesítményjellemzői 10 Eszközök és Reagensek, amelyeket a felhasználónak kell biztosítania 25 Fontos megjegyzések 26 A vérminták tárolása 26 Csapadék a reagens kazettában (RCB) 26 Az EZ1 munkaállomásokkal történő munka 26 Protokoll: Genomiális DNS tisztítása teljes vérmintából 33 Hibakeresési útmutató 35 A Függelék: Kijelzett üzenetek 37 B Függelék: A DNS tárolása, mennyiségének és tisztaságának meghatározása 45 C Függelék: Minta adatlap a BioRobot EZ1 DSP használatához 47 D Függelék: Példa egy EZ1 Advanced Riport file-ra 48 Referenciák 49 Rendelési információk 50 EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008 3

Kit összetevõk EZ1 DSP DNA Blood Kit (48) Katalógusszám 62124 Tesztek száma 48 RCB Reagent Cartridge, Blood 350 µl * (Reagens kazetta) 48 DTH DFT ST ET Disposable Tip Holders (Eldobható pipettahegy tartó) Disposable Filter-Tips (Eldobható pipettahegyek) Sample Tubes (2 ml) (Minta csövek) Elution Tubes (1.5 ml) (Elúciós csövek) 50 50 50 50 Q-Card 1 Handbook (Kézikönyv) 1 * Tarósítószerként nátrium-azidot tartalmaz. Guanidin sókat tartalmaz. Nem kompatibilis fehérítőszereket tartalmazó fertőtlenítőkkel. További információért lásd a 7. oldalt. A Q-Card-on található vonalkóddal kódolt információ szükséges a reagens adatkövetéshez az EZ1 Advanced munkaállomással történő használathoz. Jelölések Összesen 48 minta kezeléséhez szükséges reagenst tartalmaz Felhasználásra. által Orvosi eszköz in vitro diagnosztikához Katalógusszám Tétel szám Anyag szám Összetevők 4 EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008

Szám Térfogat Hőmérséklet határértékek Jogos gyártó Fontos figyelmeztetés Csak..-tal/val való használatra Tartalmaz Guanidin-izotiocianát Guanidin-hidroklorid Etanol Az áru beérkezése után nyissuk ki a dobozt; a reagens kazettákat (RCB) tároljuk 2-8 C-on A doboz felnyitásakor ez az oldal legyen lefele Tárolás 2-8 C-on hűtve tároljuk a reagens kazettát (RCB). A reagens kazettában lévő (RCB) mágneses szemcsék aktívak maradnak, amennyiben ezen a hőmérsékleten történik a tárolás. Ne fagyasszuk le a reagens tartókat (RCB). Amennyiben 2-8 C-on tároljuk a reagens kazettákat (RCB), akkor azok a cimkén és a dobozon feltüntetett lejárati ideig stabilak maradnak. A hűtőből való kivétel után a reagens kazetta egyszer tárolható 15-25 C-on, de ekkor 4 héten vagy a lejárati határidőn belül fel kell használni, amelyik előbb elkövetkezik. A lejárati idő a cimkén, a Q-kártyán illetve a kit dobozán található meg. A reagens kazettában található pufferek (RCB) (1. lyuk) tárolás során kicsapódhatnak. Felhasználás előtt ellenőrizzük és oldjuk vissza a csapadékot, a Csapadék a reagens kazettában (RCB) című fejezetben elírtak szerint (26. oldal). EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008 5

A felhasználás célja Az EZ1 DSP DNA Blood Kit a QIAGEN BioRobot EZ1 DSP vagy EZ1 Advanced géppel kombinációban olyan rendszer, amely mágneses gyöngy technológiát használ genomi DNS izolálására és tisztítására humán teljes vérmintából diagnosztikai célú felhasználásra. Friss és fagyasztott teljes vér használható kiindulási mintaként, amelyet az általános vérgyűjtő rendszerekkel vettek le és EDTÁ-val, citráttal vagy heparinnal kezeltek. A terméket csak képzett felhasználók használhatják, technikusok, orvosok, akik a molekuláris biológiai technikákban járatosak. Bármilyen a mintafeldolgozással kapcsolatos diagnosztikai eredmény a további alkalmazások eredményeivel egyetemben, csak az egyéb klinikai és laboratóriumi eredmények figyelembevételével történhet. A felhasználás korlátai A rendszer nem alkalmas szöveti vagy széklet minták kezeléséhez. A kit nem alkalmas továbbá bakteriális, gomba eredetű vagy parazita nukleinsavak valamint RNS izolálására és tisztítására. A rendszer működését nem tesztelték genomi DNS izolálására és tisztítására buffy coat-ból, tenyésztett és izolált sejtekből, kenetből, száraz vérfoltokból vagy sejtmentes testfolyadékokból, mint pl. agy-gerincvelői folyadék (CSF), plazma, szérum vagy vizelet. Az EZ1 DSP DNA Blood rendszer teljesítményét DNS izolálással határozták meg egészséges egyénekből származó vérből (3,8 x 10 6 1,0 x 10 7 leukocita/ml). A felhasználó felelős azért, hogy megfelelő EZ1 DSP DNA Blood működési feltételeket állapítson meg a további DNS alapú alkalmazásokhoz. A diagnosztikai eredményt negatívan befolyásoló körülmények minimalizálása érdekében, megfelelő kontrollok használata ajánlott a további alkalmazások során. További validáláshoz az International Conference on harmonization of Technical Requirements (IHC) megjelent: ICH Q2A: Validation of analytical methods: Definitions and terminology and ICH Q2B: Validation of analytical methods: Methodology által meghatározott vezérfonal használata javasolt. A termék használata során a lehető legnagyobb figyelemmel járjunk el. Javasoljuk minden QIAGEN terméket használó részére az NIH rekombináns DNS kísérletekhez kifejlesztett vezérfonalához való ragaszkodást, vagy bármilyen vonatkozó szabvány betartását. Termék és elégedettségi garancia A QIAGEN garantálja az összes termék működését úgy, ahogyan az a termék leírásában szerepel. A vásárló feladata meghatározni, hogy a termék egy bizonyos alkalmazásra megfelelő-e. Bármelyik termék nem megfelelő működése esetén kivéve, ha nem a kézikönyvben leírtaknak megfelelő módon használták azt a QIAGEN ellenszolgáltatás nélkül kicseréli vagy a vásárlási árat visszatéríti. A QIAGEN fenntartja a jogát arra, hogy lecserélje, 6 EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008

megváltoztassa vagy módosítsa bármelyik termékét annak érdekében, hogy azok minősége javuljon (akár kit működés, akár készülék tervezés). Ha egy QIAGEN termék nem felel meg az igényeknek egyszerűen hívja a helyi technikai segítségnyújtó helyet vagy forgalmazót (Biomarker Kft.). A termék árát döntésétől függően jóváírjuk számláján vagy kicseréljük a terméket. Más feltételek vonatkoznak a QIAGEN tudományos műszereire, szervíz termékeire és azokra a reagensekre, amelyeket szárazjégen szállítanak. További információért kérjük, érdeklődjön a helyi QIAGEN képviseletnél (Biomarker Kft.). A QIAGEN kondíciós lista másolata elérhető külön kérésre illetve szerepel számláink hátoldalán. Amennyiben a termék specifikációkkal és minőséggel kapcsolatos kérdései merülnek fel, hívja a QIAGEN technikai segítségnyújtás számát vagy a helyi forgalmazót (Biomarker Kft., valamint a kézikönyv hátoldala és a www.qiagen.com honlap). Technikai segítségnyújtás A QIAGEN-nél büszkék vagyunk az általunk nyújtott technikai segítségnyújtás elérhetőségére és minőségére. A technikai segítségnyújtási osztályokon a mintakezelési és analízis technikákban kiterjedt gyakorlati és elméleti ismeretekkel rendelkező tapasztalt tudósok állnak rendelkezésre. Ha bármilyen kérdése merülne fel, az EZ1 DSP DNA Blood Kit-tel kapcsolatos probléma esetén vagy a QIAGEN termékekkel kapcsolatban lenne általános kérdése, észrevétele kérjük, vegye fel a kapcsolatot velünk. A QIAGEN felhasználók köre a legfőbb információs forrás termékeink fejlett szintű vagy speciális felhasználására. Ez az információ segítség más tudósok számára is éppúgy, mint a QIAGEN kutatói részére. Ezért mindenképp bátorítjuk felhasználóinkat arra, hogy bármilyen a termék felhasználásával, teljesítményével kapcsolatos tapasztalatát illetve termékeink új alkalmazásokra és technikákra való használatát, javaslataikat osszák meg velünk, azokat köszönettel fogadjuk. Technikai segítségnyújtáshoz kérjük keresse a QIAGEN technikai támogatási központot a www.qiagen.com/support oldalon vagy hívja a QIAGEN egyik technikai szerviz osztályát vagy a helyi forgalmazót (Biomarker Kft., lásd a hátoldalt vagy a www.qiagen.com honlapot). Biztonsági információk Amennyiben kémiai anyagokkal dolgoznak, mindig viseljenek megfelelő védőköpenyt, egyszerhasználatos védőkesztyűt és védőszemüveget. További információért kérjük, tanulmányozza a megfelelő biztonsági adatlapot (MSDS). Ezek online elérhetők kényelmes és tömör PDF formátumban a www.qiagen.com/support/msds.aspx oldalról, ahol minden QIAGEN Kit és kit összetevő biztonsági lapját (MSDS) letöltheti. FIGYELMEZTETÉS: NE ADJUNK fehérítőszert vagy savas oldatokat közvetlenül a mintakezelés után maradt hulladékhoz. EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008 7

A reagens kazettában (RCB) lévő pufferek guanidin-hidrokloridot/guanidinizotiocianátot tartalmaznak, amelyek veszélyes és nagymértékben reaktív elegyet képezhetnek a fehérítőszerekkel. Ha olyan folyadékot öntünk ki, amely ezeket a puffereket is tartalmazza, akkor a kiömlés helyét alkalmas laboratóriumi detergenssel és vízzel tisztítsuk fel. Ha fertőző ágenst tartalmazó folyadék kerül az EZ1 munkaállomásra, akkor fertőtlenítsük a készüléket az EZ1 készülékhez kapott kézikönyvben található fertőtlenítőszerek egyikével. A törött vagy szivárgó reagens kazettát (RCB) a helyi biztonsági előírásnak megfelelően kell kezelni és hulladékként eltávolítani. Ne használjunk sérült reagens kazettát (RCB) vagy más kit összetevőt, mert ezek használata rossz és megbízhatatlan eredményhez vezethet. A QIAGEN nem ellenőrizte az EZ1 DSP DNA Blood eljárás használatakor hulladékként keletkező folyadékokat a maradék fertőző ágens tekintetében. A visszamaradt hulladékban lévő fertőző anyag jelenléte nagyon valószínűtlen, azonban az ilyen folyadékokat, mindig fertőző folyadékként kezeljük és a helyi eljárási szabályok szerint kezeljük és távolítsuk el. A következő veszélyességi és biztonsági jelzések vonatkoznak az EZ1 DSP DNA Blood Kit összetevőire: 8 EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008

Reagens kazetta, Vér (RCB) F, Xn Etanolt, guanidin-hidrokloridot és guanidin-izotiocianátot tartalmaz: erősen gyúlékony, ártalmas és irritáló. Veszélyességi és biztonsági jelzők*: R11-20/21/22-32-36/38, S13-26-36/37/39-46 24 órás elsősegély információ Sürgősségi orvosi információ Angolul, Franciául és Németül napi 24 órában érhető el a következő helyről: Mérgezési Információs Központ, Mainz, Németország T: +49-6131-19240 Minőségbiztosítás A QIAGEN ISO-minősített minőségellenőrzési rendszerének megfelelően az EZ1 DSP DNA Blood Kit minden egyes gyártási tételét leellenőrzik, hogy az megfelel-e az előírt paramétereknek, ezzel biztosítják a kit egyenletes és kifogástalan minőségét. R11: Nagyon gyúlékony; R20/21/22: Ártalmas belélegzéssel, bőrre kerülve és lenyelve; R32: savakkal érintkezve nagyon erősen mérgező gázok keletkeznek; R36/38: szemre és bőrre irritáló hatású; S13: Tartsuk távol élelmiszertől, italtól és állati takarmányoktól; S26: Szembe jutás esetén azonnal bő vízzel öblítsük a szemet, majd forduljunk orvoshoz; S36/37/39: Viseljünk megfelelő védőköpenyt, védőszemüveget és arc/szemvédő szemüveget/maszkot; S46: ha lenyeltük azonnal forduljunk orvoshoz és mutassuk meg a doboz feliratát vagy a címkéjét az orvosnak. EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008 9

Bevezetés Az EZ1 DSP DNA Blood Kit genomi DNS izolálására alkalmas teljes vérből. A mágneses gyöngy technológia jó minőségű DNS-t szolgáltat, amely a további alkalmazásokra alkalmas, mint pl. amplifikáció vagy más enzimes reakció. Az EZ1 Advanced vagy BioRobot EZ1 DSP a mintakezelés összes lépését végrehajtja, egyszerre maximum 6 mintán. A minta kiindulási térfogata 350 µl, a DNS leoldás 200 µl elúciós pufferben történik. Elv és módszer A mágneses gyöngy technológia kombinálja a hatékony szilika bázisú DNS tisztítást és a gyors és kényelmes mágneses elválasztást (lásd a folyamatábrát a következő oldalon). A lizátumból a DNS-t egy lépésben lehet izolálni, úgy, hogy a DNS kaotróp sók hatására a gyöngyök felszínén lévő szilika mátrixhoz köt. A részecskéket a lizátumtól mágnessel lehet szétválasztani. A DNS-t ezután hatékonyan lehet mosni és leoldani az elúciós pufferrel. Az EZ1 DSP DNA Blood rendszer teljesítményjellemzői Rendszer robosztusság Különböző primer vérvételi csöveket és antikoagulánst lehet felhasználni az EZ1 DSP DNA Blood Kit-hez való vérminta gyűjtésére. Az 1. táblázat (12. oldal) áttekintést ad a mintagyűjtő csövekről, amelyeket a rendszer kiértékeléséhez használtak. Azért ezeket a csöveket választották, hogy a piacon található antikoagulánsok és vérmintavételi csövek használhatóságát vizsgálják. Más gyártótól származó csövek is használhatók. A vérmintákból kinyerhető átlagos relatív kitermelést az 1. ábra (13. oldal) mutatja, különböző primer csövekkel. 10 EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008

Az EZ1 EZ1 DNA DNS Procedure procedúra Teljes vér, vértermékek vagy emésztett szövet Whole blood, blood products, or digested tissue Lysis Lízis Magnetic Mágneses particles részecskék kerülnek a mintába added to samples A DNA DNS binds köt a mágneses részecskékhez to magnetic particles Magnet Magnetic Mágneses elválasztás separation Mosás Wash Magnet Magnetic Mágneses elválasztás separation Leoldás Elute Pure, Tiszta, high-quality jó minőségű DNA DNS EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008 11

1. táblázat. Az EZ1 DSP DNA Blood rendszerrel vizsgált vérmintavételi csövek Cső Rövidítés Gyártó Katalógus szám* Névleges kapacitás (ml) BD Vacutainer 9NC BD 9NC Becton Dickinson 366007 9 BD Vacutainer K3E BD K3E Becton Dickinson 368457 10 BD Vacutainer K2E BD K2E Becton Dickinson 367864 6 Monovette EDTA EDTA Sarstedt 21.066.001 9 Monovette LH LH Sarstedt 21.065.001 9 Monovette CDPA1 CPDA1 Sarstedt 11.610.001 8,5 Vacuette K3E K3E Greiner Bio-One Vacuette 9NC V 9NC Greiner Bio-One 455036 9 454382 9 * A katalógusszámok változhatnak; kérjük ellenőrizze a gyártónál vagy a forgalmazónál. 12 EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008

Átlagos, relatív DNS kinyerés (%) Gyűjtő cső 1. ábra A rendszer robosztussága különböző mintavételi csövek és antikoagulánsok használatával. Teljes vér 6 egészséges donorból levéve 8 különböző csővel, három ismétlésben donoronként és csövenként. A csöveket az 1. táblázatban soroltuk fel (12. oldal). 350 µl kiindulási anyagból (teljes vér) az EZ1 DSP DNA Blood rendszerrel történt az izolálás 200 µl-ben. Az elméleti DNS kinyerést minden egyes donor és cső esetén a fehérvérsejtszám alapján határoztuk meg. Az oszlopok az átlagos DNS kinyerést mutatják (az elméleti kinyeréshez viszonyítva) standard deviációt is megjelenítve. EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008 13

Minták fagyasztása és visszaolvasztása Friss vagy fagyasztott humán teljes vérmintákat lehet használni (lásd Vérminták tárolása, 26. oldal). A fagyasztás és felolvasztás hatását a vérmintából történő DNS hozamra az EZ1 DSP DNA Blood rendszerrel határozták meg (2. ábra). Átlagos relatív DNS kinyerés (%) 2. ábra A fagyasztás-felolvasztási ciklus hatása a DNS hozamra. Teljes vért gyűjtöttek 3 egészséges donorból a fent jelölt csövekbe, mindegyiket 6 ismétlésben. A felhasznált csöveket a 1. táblázatban soroltuk fel. Genomi DNS-t tisztítottak 350 µl mintából az EZ1 DSP DNA Blood módszerrel. Az átlagos relatív DNS kinyerést (Friss) kiszámolták minden donorra és csőre. A vért tartalmazó csöveket háromszori fagyasztási és felolvasztási ciklusnak tették ki. Genomi DNS-t izoláltak minden egyes fagyasztási/olvasztási ciklus (1 ciklus 3 ciklus) után az EZ1 DSP DNA Blood rendszerrel és ezekből a relatív DNS kinyerést kiszámolták. Fagyasztott (és felolvasztott) vérmintákhoz javasolt az EDTA használata anti-koagulánsként. A tisztítás DNS hozama Egészséges egyedekből származó 350 µl vérmintából genomi DNS-t izoláltak. Az EZ1 DSP DNA Blood módszerrel kinyert DNS mennyisége függ az egyes mintákban lévő fehérvérsejtek számától, ezért a kinyerés donorról-donorra változhat (3. ábra). 14 EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008

A Átlagos relatív hozam (%) Donor Relatív Abszolút Átlagos abszolút hozam (µg) B Átlagos DNS hozam (µg) Fehérvérsejtek száma (x 10 3 sejt/µl) 3. ábra Átlagos abszolút és relatív DNS hozam különböző donorokból. 27 donorból gyűjtöttek teljes vért 3 ismétlésben. Minden egyes minta 350 µl-éből genomi DNS-t izoláltak az EZ1 DSP DNA Blood rendszerrel. A Az elméleti DNS kinyerést fehérvérsejt számolással határozták meg. Abszolút (Abszolút) és relatív (Relatív) (a kiszámolt elméleti hozamhoz viszonyítva) DNS hozam középérték látható minden donorra. B Az abszolút hozam középértéke látható minden egyes donorra a fehérvérsejtek számához viszonyítva. Tiszta genomi DNS elúció A genomi DNS leoldása 200 µl kis sótartalmú eluáló pufferben történik. A leoldott DNS közvetlenül alkalmas az izolálást követő in vitro diagnosztikai elemzésekhez, mint pl. a CE-IvD jelöléssel ellátott artus PCR Kitek. Harminc véletlenszerűen kiválasztott vér donortól mintát gyűjtöttek és azokból az EZ1 DSP DNA Blood rendszerrel DNS-t tisztítottak. Az artus MTHFR LC PCR Kit, az artus DPD LC PCR Kit és az artus TPMT LC PCR kit használatával klinikailag releváns genetikai variánsokat kerestek a metiléntetrahidrofolát (MTHFR) a dihidro-pirimidin (DPD) és a tiopurin-smetiltranszferáz (TPMT) génben. A mintákat LightCycler készüléken vizsgálták. Az adatok a 2. és 3. táblázatban (a 16. és 18. oldaltól) találhatók. Az olvadáspont analízist és a variánsok százalékos eloszlását az MTHFR génre a 4. és 5. ábra (18. és 19. oldal) mutatja (példaként). EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008 15

2. táblázat. Az MTHFR gén 667. és 1298. nukleotid pozíciójában található polimorfizmusok az artus MTHFR LC PCR kittel kimutatva Minta száma 677. nukleotid 1298. nukleotid Genotípus 1 heterozigóta var homozigóta wt wt677/var677 wt1298/wt1298 2 homozigóta wt homozigóta wt 3 homozigóta wt heterozigóta var 4 homozigóta var homozigóta wt 5 homozigóta wt heterozigóta var 6 homozigóta wt heterozigóta var wt677/wt677 wt1298/wt1298 wt677/wt677 wt1298/var1298 var677/var677 wt1298/wt1298 wt677/wt677 wt1298/var1298 wt677/wt677 wt1298/var1298 7 heterozigóta var homozigóta wt wt677/var677 wt1298/wt1298 8 homozigóta wt homozigóta wt 9 homozigóta wt heterozigóta var 10 heterozigóta var heterozigóta var 11 homozigóta wt heterozigóta var 12 homozigóta wt homozigóta wt 13 homozigóta wt homozigóta wt wt677/wt677 wt1298/wt1298 wt677/wt677 wt1298/var1298 wt677/var677 wt1298/var1298 wt677/wt677 wt1298/var1298 wt677/wt677 wt1298/wt1298 wt677/wt677 wt1298/wt1298 var: Módosult allél az MTHFR jelzett pozíciójában. wt: Vadtípusú allél az MTHFR jelzett pozíciójában 16 EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008

2. táblázat Folytatás Minta száma 677. nukleotid 1298. nukleotid Genotípus 14 heterozigóta var homozigóta wt wt677/var677 wt1298/wt1298 15 heterozigóta var homozigóta wt 16 homozigóta wt heterozigóta var wt677/var677 wt1298/wt1298 wt677/wt677 wt1298/var1298 17 homozigóta var homozigóta wt var677/var677 wt1298/wt1298 18 heterozigóta var homozigóta wt wt677/var677 wt1298/wt1298 19 homozigóta wt heterozigóta var 20 homozigóta wt heterozigóta var 21 homozigóta wt homozigóta var 22 heterozigóta var homozigóta wt 23 heterozigóta var heterozigóta var 24 heterozigóta var homozigóta wt 25 homozigóta wt heterozigóta var 26 homozigóta wt homozigóta var 27 homozigóta wt heterozigóta var wt677/wt677 wt1298/var1298 wt677/wt677 wt1298/var1298 wt677/wt677 var1298/var1298 wt677/var677 wt1298/wt1298 wt677/var677 wt1298/var1298 wt677/var677 wt1298/wt1298 wt677/wt677 wt1298/var1298 wt677/wt677 var1298/var1298 wt677/wt677 wt1298/var1298 var: Módosult allél az MTHFR jelzett pozíciójában. wt: Vadtípusú allél az MTHFR jelzett pozíciójában EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008 17

2. táblázat Folytatás Minta száma 677. nukleotid 1298. nukleotid Genotípus 28 heterozigóta var heterozigóta var wt677/var677 wt1298/var1298 29 heterozigóta var homozigóta wt 30 homozigóta var homozigóta wt wt677/var677 wt1298/wt1298 var677/var677 wt1298/wt1298 var: Módosult allél az MTHFR jelzett pozíciójában. wt: Vadtípusú allél az MTHFR jelzett pozíciójában A B 4. ábra Az amplifikációs termékek olvadáspont analízise az MTHFR gén 677. és 1298. nukleotidjánál. A DNS tisztítása 30 donor teljes vérmintájából történt az EZ1 DSP DNA Blood rendszerrel. Az eluátumokat a CE-IvD jelöléssel ellátott artus MTHFR LC PCR kittel olvadáspont vizsgálatnak vetették alá a LightCycler készüléken. A Analízis a 677. nuleotidnál. B Analízis az 1298. nukleotidnál. 18 EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008

35 30 Megoszlás (%) Proportion (%) 25 20 15 10 5 0 wt677/var677 wt1298/wt1298 wt677/wt677 wt1298/var1298 var677/var677 wt1298/wt1298 wt677/wt677 wt1298/wt1298 wt677/var677 wt1298/var1298 wt677/wt677 var1298/var1298 5. ábra. Az MTHFR génben azonosított genotípusok százalékos megoszlása. A 2. táblázat és 4. ábra adatait foglalja össze grafikusan. 3. táblázat. A DPD és TPMT génekben detektált polimorfizmusok az artus DPD LC PCR Kit-tel és az artus TPMT LC PCR Kit-tel detektálva Mintaszám DPD genotípus TPMT genotípus 1 DPYD*1/*1 TPMT*1/*1 2 DPYD*1/*1 TPMT*1/*1 3 DPYD*1/*1 TPMT*1/*1 4 DPYD*1/*1 TPMT*1/*1 5 DPYD*1/*1 TPMT*1/*1 6 DPYD*1/*1 TPMT*1/*3A vagy TPMT*3C/*3B 7 DPYD*1/*1 TPMT*1/*1 8 DPYD*1/*1 TPMT*1/*3A vagy TPMT*3C/*3B 9 DPYD*1/*1 TPMT*1/*1 10 DPYD*1/*1 TPMT*1/*3A vagy TPMT*3C/*3B A táblázat a következő oldalon folytatódik. EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008 19

3. táblázat Folytatás Mintaszám DPD genotípus TPMT genotípus 11 DPYD*1/*1 TPMT*1/*1 12 DPYD*1/*1 TPMT*1/*1 13 DPYD*1/*2A TPMT*1/*1 14 DPYD*1/*1 TPMT*1/*1 15 DPYD*1/*1 TPMT*1/*1 16 DPYD*1/*1 TPMT*1/*1 17 DPYD*1/*1 TPMT*1/*3A vagy TPMT*3C/*3B 18 DPYD*1/*1 TPMT*1/*1 19 DPYD*1/*1 TPMT*1/*1 20 DPYD*1/*1 TPMT*1/*1 21 DPYD*1/*1 TPMT*1/*1 22 DPYD*1/*1 TPMT*1/*1 23 DPYD*1/*1 TPMT*1/*1 24 DPYD*1/*1 TPMT*1/*1 25 DPYD*1/*1 TPMT*1/*1 26 DPYD*1/*1 TPMT*1/*1 27 DPYD*1/*1 TPMT*1/*1 28 DPYD*1/*1 TPMT*1/*1 29 DPYD*1/*1 TPMT*1/*1 30 DPYD*1/*1 TPMT*1/*1 20 EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008

Gátlási teszt A növekvő mennyiségű eluátum hatását vizsgálták a PCR hatékonyságára (6. ábra). 10 µl luátum 5 µl luátum 2 µl luátum 6. ábra az eluátum térfogatának hatása a PCR reakció teljesítményére. Egy egészséges donor vérét BD K2E csövekbe vették le, majd a mintákat összeöntötték. 24 db 350 µl-es mintából genomi DNS-t izoláltak 4 különböző futtatásban (run 1 run 4), 6 ismétlésben az EZ1 DSP DNA Blood rendszerrel. A jelölt mennyiségű eluátumot használták fel 50 µl-es PCR reakcióban, amelyben a primer egy 1100 bp egykópiás humán gén fragmensre specifikus. +: Pozitív kontroll. -: Negatív kontroll. M: Kisméretű DNS molekulatömeg marker. EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008 21

Precíziós vizsgálat A DNS kinyerését vizsgálták 350 µl humán vérminta felhasználásával az EZ1 DSP DNA Blood Kit rendszerrel a különböző futtatások során. A futások közötti különbségeket (pontosság és ismételhetőség) a DNS hozamok standard deviációjaként tüntették fel (7. ábra). DNS hozam (µg) Run 1 Run 2 Run 3 Run 4 DNA Blood Protokoll a BioRobot EZ1 DSP-n 7. ábra Futáson belüli és futások közötti pontosság az EZ1 DSP DNA Blood rendszerrel. Egy egészséges donor vérét BD K2E csövekbe vették le, majd a mintákat összeöntötték. 24 db 350 µl-es mintából genomi DNS-t izoláltak 4 különböző futtatásban (run 1 run 4), 6 ismétlésben az EZ1 DSP DNA Blood rendszerrel. A teljes DNS hozam középértékei és a standard deviáció látható minden futásra. Az egy futáson belüli pontosság 4,85% (1-es futtatás, Run 1), 6,10% (2-es futtatás, Run 2), 7,48% (3-as futtatás, Run 3), 6,59% (4-es futtatás, Run 4), az össz pontosság 6,33%. Eluátum stabilitás A genomi DNS stabilitása az EZ1 eluátumokban. 10 hétig stabil 5 C-on tárolva, akár 24 hónapig is stabil -20 C-on vagy -80 C-on tárolva. Minta kereszt-kontamináció kizárása Annak kiértékelésére, hogy az EZ1 DSP DNA Blood rendszerben (az izolálás során és az izolálások között) milyen veszélye lehet a minta keresztkontaminációnak 12 futtatást végeztek. A minta keresztfertőzés detektálásához a 12 futtatásból 8-at 3 vérmintával és 3 vízmintával végeztek (váltakozó pozíciókkal) a 4. táblázat szerint. Minden 3. futtatás csak vízzel történt. 22 EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008

4. táblázat Kereszt-kontamináció kísérleti elrendezés Pozíció Futtatás 1 2 3 4 5 6 1 B W B W B W 2 W B W B W B 3 W W W W W W 4 B W B W B W 5 W B W B W B 6 W W W W W W 7 B W B W B W 8 W B W B W B 9 W W W W W W 10 B W B W B W 11 W B W B W B 12 W W W W W W B: Vér. W: Víz. Minden vérminta pozitív volt a PCR reakcióban (8A ábra, 24. oldal). Minden vízminta negatív volt a vegyes futtatásokban és a csak vizes futtatásokban is (8B ábra, 24. oldal). Ezek a kísérletek demonstrálják, hogy az EZ1 DSP DNA Blood módszer a fenti körülmények között nem okoz minta kereszt-fertőzést. EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008 23

A B 8. ábra Az EZ1 DSP DNA Blood módszer közbeni és az egyes futtatások közötti minta keresztkontamináció kizárása. Egy egészséges donor vérét levették, a mintákat összeöntötték. 12 db 350 µl-es mintából genomi DNS-t izoláltak (12 futtatás, run 1 run 12) az EZ1 DSP DNA Blood rendszerrel a 4. táblázat szerinti felállásban. Az izolált mintából PCR segítségével egy 1 kb-os egykópiás génre specifikus fragmenst mutattak ki. A pozitív és negatív mintákat egymástól elkülönítve használták az izolálás utáni PCR reakció összeállítása és végrehajtása alatti kereszt-kontamináció megelőzésére. A Minden vérminta pozitív a PCR-ben. B Minden negatív minta PCR-rel is negatív volt, 35 ciklus után nem volt detektálható fragmens. +: Pozitív PCR kontroll. -: Negatív PCR kontroll. M: Kis molekulatömegű DNS létra. 24 EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008

Eszközök és Reagensek, amelyeket a felhasználónak kell biztosítania Amennyiben kémiai anyagokkal dolgoznak mindig viseljenek megfelelő laboratóriumi védőköpenyt, egyszer használatos védőkesztyűt és védőszemüveget. További információért tanulmányozza a megfelelő biztonsági adatlapot (MSDS), amelyet a gyártótól vagy forgalmazótól szerezhet be. Minden protokollhoz Pipetták* és steril, RNáz-mentes pipettahegyek Lágy törlőpapír Víz 70% etanol Opcionális: rázó-inkubáló* (ha a reagens kazetták /RCB/ kicsapódott anyagot tartalmaznak a csövek alján) Opcionális: mikrocentrifuga* (ha a mágneses részecskéket el kell távolítani az eluátumból) Az EZ1 Advanced felhasználóknak EZ1 Advanced munkaállomás * (kat. szám 9001411) EZ1 Advanced DSP DNA Blood Card (kat. szám 9018305) Minta követéshez az alábbiak közül az egyik szükséges: PC (monitorral) az EZ1 Advanced Communicator szoftverrel felszerelve (kat. szám 9017759) EZ1 Advanced Communicator szoftver az EZ1 Advanced géppel együtt szállítva (kat. szám 9018464) saját PC-vel való használatra Nyomtató (kat. szám 9018464) és nyomtató kiegészítők (kat. szám 9018465) BioRobot EZ1 felhasználóknak BioRobot EZ1 DSP munkaállomás* (kat. szám 9001360) EZ1 DSP DNA Blood Card (kat. szám 9017713) * Biztosítsuk, hogy a készülékeket rendszeresen ellenőrzik, karbantartják és kalibrálják a gyártó utasításai alapján. EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008 25

Fontos megjegyzések A vérminták tárolása EDTA-val, ACD-vel vagy heparinnal * kezelt teljes vérminták használhatók, friss illetve fagyasztott formában. A fagyasztott mintákat enyhe rázás mellett szobahőn (15-25 C) kell felolvasztani, mielőtt a feldolgozást elkezdjük. Az izolált DNS hozama és minősége a vérminták tárolásától függ. Frissebb vérrel jobb eredményeket kaphatunk. Rövid idejű tárolás esetén (10 napig) EDTA-t, mint antikoagulánst tartalmazó csövekbe gyűjtsük a vért és 2-8 C-on tároljuk. Azonban az olyan alkalmazások esetében, amelyek maximális fragmens hosszt igényelnek, mint pl. Southern blotting, a 2-8 C-on való tárolást csak 3 napig ajánljuk, mivel ezt meghaladóan kismértékű degradáció léphet fel. Hosszú távú tárolás esetén a vért standard antikoagulánst (leginkább EDTA, ha nagy molekulasúlyú DNS-re van szükségünk) tartalmazó tubusokba gyűjtsük és -70 C-on tároljuk. Ne használjon olyan vért, amelyben koaguláció jelei látszanak. Csapadék a reagens kazettában (RCB) A reagens kazetta (RCB) 1. tubusában (az a tubus, amelyik a legközelebb helyezkedik el az EZ1 Advanced vagy a BioRobot EZ1 DSP elülső oldalához, amikor a reagens kazetta (RCB) be van töltve) töltött pufferben csapadék keletkezhet. Amennyiben szükséges, 30-40 C-on történő finom rázogatással oldja fel a csapadékot. Az EZ1 munkaállomásokkal történő munka Az EZ1 Advanced és BioRobot EZ1 munkaállomások legfőbb jellemzői: Futásonkénti 1-6 mintából történő kitűnő minőségű nukleinsav tisztítás Kis helyigényű, hogy spóroljon a laboratóriumi férőhellyel Az előre programozott EZ1 DSP Kártyák tartalmazzák a felhasználásra kész protokollokat a nukleinsav tisztításhoz Előre töltött és lezárt reagens kazetták a könnyű, biztonságos és gyors EZ1 munkaelőkészítéshez A nukleinsav tisztítás teljes automatizálása a reagens kazetták nyitásától a nukleinsavak eluálásáig, kézi centrifugálási lépések nélkül Az EZ1 Advanced további jellemzői: * Amikor vegyszerekkel dolgozik, mindig viseljen megfelelő laborköpenyt, eldobható kesztyűt és védőszemüveget. További információért tekintse meg a biztonsági adatlapokat (MSDS), amelyek a forgalmazónál rendelkezésre állnak. 26 EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008

Vonalkód olvasás és minta nyomkövetés Kit adat követés a kithez tartozó Q-Card segítségével UV lámpa a futásonkénti esetleges mintaátvitel kiküszöbölésére, valamint a munkafelület dekontaminálására Az UV dekontamináció segít lecsökkenteni az esetleges patogén szennyeződéseket az EZ Advanced munkafelületekről. Az inaktiválás hatékonyságát mindegyik specifikus élőlényre meg kell határozni és függ pl. a mintatípustól és a rétegvastagságtól. A QIAGEN nem tudja garantálni a specifikus patogének teljes megsemmisítését. EZ1 DSP DNA Blood Kártya vagy EZ1 Advanced DSP DNA Blood Kártya Az EZ1 DSP DNA Blood protokoll az EZ1 Advanced DSP DNA Blood Kártyán és az EZ1 DSP DNA Blood Kártyán van tárolva (integrált áramkört tartalmazó kártya). A felhasználó egyszerűen behelyezi az EZ1 Advanced DSP Kártyát az EZ1 Advanced gépbe vagy az EZ1 DSP Kártyát a BioRobot EZ1 DSP gépbe és a munkaállomás készen is áll a protokoll futtatására (9. és 10. ábra). 9. ábra. A protokoll beállítás könnyedsége EZ1 Advanced DSP Kártyával. A protokollt tartalmazó EZ1 Kártya behelyezése az EZ1 Advanced gépbe. A munkaállomást csak az EZ1 DSP Kártya behelyezése után kapcsoljuk be. Győződjön meg róla, hogy az EZ1 DSP Kártya teljesen be lett tolva a gépbe. Ellenkező esetben fontos gépadatok veszhetnek el, ami memóriahibához vezethet. Az EZ1 Advanced DSP Kártya ill. az EZ1 Kártya nem cserélhető ki, amíg a gép bekapcsolt állapotban van. EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008 27

10. ábra. Az Advanced Kártya teljesen betolva az EZ1 Kártya nyílásba. Reagens kazetták (RCB) Az egy mintából származó nukleinsavak izolálásához szükséges reagenseket egyetlen reagens kazetta (RCB) (11. ábra, 32. oldal) tartalmazza. A kazetta minden egyes tubusa sajátos reagenst tartalmaz, mint pl. mágneses gyöngyök, lízis puffer, mosó puffer vagy elúciós puffer (AVE). Mivel minden tubus csak a szükséges reagens mennyiséget tartalmazza, kiküszöböli az esetleges felesleges reagens maradványok keletkezését az izolálás végére. 28 EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008

A B 11. ábra. A munkaállomás beállításának könnyedsége a reagens kazettákkal (RCB). A Egy lezárt és előre töltött reagens kazetta (RCB). A reagens kazetta (RCB) típusától függően a tubusok töltöttségi szintje változik. B A reagens kazetták (RCB) behelyezése a kazettatartóba. A kazettatartón nyíl formájában egy jelzés található, amely a reagens kazetták (RCB) behelyezésének irányát mutatja. EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008 29

Munkaasztal Az EZ1 Advanced vagy a BioRobot EZ1 DSP munkaasztala az a hely, ahová a felhasználó a mintákat és az EZ1 DSP DNA Blood Kit komponenseit helyezi (12. ábra, 31. oldal). A munkaasztal beállításának részletei az EZ1 Advanced vákuum fluoreszcens kijelzőjén (VFD) ill. a BioRobot EZ1 DSP folyadékkristályos kijelzőjén (LCD) kerülnek feltüntetésre, amikor a felhasználó megkezdi a munkaasztal beállítását. A gép kijelzője a protokoll állapotát is jelzi az automatizált izolálási folyamat alatt. 30 EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008

12. ábra. Az EZ1 Advanced ill. a BioRobot EZ1 DSP munkaasztala 1. Az Elúciós tubusok (ET) (1,5 ml) az első sorba kerülnek. 2. Az eldobható pipettahegy-tartók (DTH), amelyek az eldobható filteres pipettahegyeket (DFT) tartalmazzák, a második sorba kerülnek. 3. Az EZ1 DSP DNA Blood protokoll esetében a harmadik sor üresen marad. 4. A Mintatubusok (ST) (2 ml) a negyedik sorba kerülnek. 5. Reagens kazetták (RCB) a kazettatartóban. 6. Az EZ1 DSP DNA Blood protokoll esetében a fűtőblokk üresen marad. EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008 31

Az EZ1 Advanced ill. a BioRobot EZ1 DSP DNA Blood működtetésének folyamata Helyezze be az EZ1 Advanced DSP DNA Blood Kártyát vagy az EZ1 DSP DNA Blood Kártyát az EZ1 Kártyanyílásába Kapcsolja be az EZ1 Advanced vagy a BioRobot EZ1 DSP gépet Kövesse a kijelző üzenetét a mintakövetéshez* Kövesse a kijelző üzenetét a munkaasztal beállításához Indítsa el a protokollt Gyűjtse össze az izolált DNS-t UV dekontamináció* *Csak az EZ1 Advanced esetében 32 EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008

Protokoll: Genomiális DNS tisztítása teljes vérmintából A kezdés előtti fontos pontok Amennyiben először használja az EZ1 DSP DNA Blood Kitet, olvassa el a fontos megjegyzések részt a 25. oldalon A reagens kazetták (RCB) guanidin sókat tartalmaznak, ezért nem kompatibilisek fehérítőt (hypo) tartalmazó fertőtlenítő szerekkel. Használatukkor tegyen megfelelő óvintézkedéseket és használjon védőkesztyűt. A biztonsági információkért nézze meg a 7. oldalt. A protokoll minden egyes lépését szobahőmérsékleten végezze (15-25 C). Az összekészítés alatt gyorsan dolgozzon. Miután a kitet kézhez kapta, ellenőrizze, hogy az összetevők nem sérültek-e. Ha a reagens kazetták (RCB) vagy a kit egyéb összetevői sérültek, keresse meg a QIAGEN technikai szervízét vagy a helyi forgalmazót. Folyadék kiömlés esetén nézze meg a biztonsági információk részt (7. oldal). Ne használjon sérült reagens kazettákat (RCB) vagy egyéb kit összetevőket, ugyanis ezek alacsony kit hatékonysághoz vezethetnek. A folyamat néhány lépésénél 2 választás lehetséges. Válassza a (kéket) ha az EZ1 Advanced gépet használja; válassza a (pirosat) ha a BioRobot EZ1 DSP-t használja. A kezdés előtti teendők A reagens kazettákban (RCB) lévő lízis pufferben a tárolás során csapadék képződhet. Amennyiben szükséges, 30-40 C-on történő melegítéssel oldja fel, majd tegye szobahőmérsékletre. Folyamat 1. Ekvilibrálja az akár 6 db teljes vérmintát szobahőmérsékletre. Győződjön meg róla, hogy a lefagyasztott minták teljesen felolvadtak és elegendő ideig ekvilibráltuk őket szobahőmérsékleten. Amennyiben a mintákat 2-8 C-on tároltuk, ugyanúgy szobahőmérsékletre ekvilibráljuk azokat is. Az optimális kinyerés és DNS tisztaság érdekében mindegyik minta hőmérsékletének 15-25 C-nak kell lennie, mielőtt a folyamatot elkezdjük. 2. Helyezze be az EZ1 Advanced DSP DNA Blood Kártyát az EZ1 Advanced gép EZ1 Advanced kártyanyílásába vagy az EZ1 DSP DNA Blood Kártyát a BioRobot EZ1 DSP gép EZ1 kártyanyílásába. 3. Kapcsolja be az EZ1 munkaállomást. A be-/kikapcsoló gomb a gép hátulján található 4. Nyomja meg a START -ot, hogy elkezdje a munkaasztal beállítását az EZ1 DSP DNA Blood protokollhoz. EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008 33

5. Nyissa fel a munkaállomás ajtaját. 6. Fordítsa fel-le az 1-6 reagens kazettát (RCB) háromszor, hogy a mágneses részecskéket összekeverje. Azután kocogtassa meg a reagens kazettákat (RCB), hogy a reagensek összegyűljenek a tubusok aljába. 7. Kövesse a kijelzőn olvasható utasításokat a munkaasztal beállításához, a protokoll kiválasztásához és a mintakövetéshez. Miután becsúsztatta a reagens kazettát (RCB) a kazettatartóba, nyomja le a kazettát, amíg be nem pattan a helyére. Ha 6 reagens kazettánál (RCB) kevesebbet használ, bármilyen sorrendben behelyezheti őket. Ebben az esetben a többi laboreszköz behelyezésénél is kövesse a kazetták sorrendjét. Amennyiben használja a mintakövetési opciót, győződjön meg róla, hogy a minta-azonosító is a minták sorrendjét követi a munkaasztalon, hogy elkerülje a minták összekeveredését. 8. Csukja be a munkaállomás ajtaját. 9. Nyomja meg a START-ot a protokoll kezdéséhez. 10. Amikor a protokoll befejeződött, a kijelzőn a Protocol finished felirat jelenik meg. Nyomja meg az ENT gombott, hogy riport file-t készítsen. Az EZ1 Advanced akár 10 riport file-t is tud tárolni. Ezeket közvetlenül ki lehet nyomtatni egy hozzákapcsolt nyomtatóval, vagy továbbítani egy számítógépre. 11. Nyissa fel a munkaállomás ajtaját. 12. Gyűjtse össze az izolált DNS-t tartalmazó elúciós csöveket az első sorból. Dobja ki az elhasznált laboreszközöket.* 13. Opcionális: Kövesse a kijelző utasításait a munkaasztal felületének UV dekontaminálásához. 14. Végezze el az EZ1 munkaállomáshoz csomagolt kézikönyvben szereplő időszakos karbantartási lépéseket. Az időszakos karbantartás minden protokoll futtatás után kötelező. Magában foglalja a lyukasztó egység és a munkaasztal felületek megtisztítását. A lyukasztó egység hegyes. Dupla védőkesztyű használatát javasoljuk. 15. Még egy protokoll futtatásához nyomja meg a START -ot, végezze el a protokoll 1. és 2. lépéseit és folytassa az 5. lépéssel. Egyéb esetben kétszer nyomja meg STOP -ot, hogy a kijelző nyitóképéhez visszatérjen, csukja be a munkaállomás ajtaját és kapcsolja ki az EZ1 munkaállomást. A 3. és 4. lépések elvégzése nem szükséges, ha másik protokollt futtatna. Ugorja át ezeket. * A minta hulladék guanidin sókat tartalmaz, ezért az nem kompatibilis a fehérítőszerekkel. Lásd a 8. oldalt a biztonsági információkért. 34 EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008

Hibakeresési útmutató Ez a hibakeresési útmutató az esetlegesen felmerülő problémák megoldásában segíthet. További információért, nézze meg gyakran feltett kérdések lapot a technikai segítség központunk honlapján: www.qiagen.com/faq/faqlist.aspx. A QIAGEN technikai szervíz kutatói szívesen segítenek a kérdései megválaszolásában, akár ebben a kézikönyvben található információkkal vagy protokollokkal, akár a minta és analízis technológiákkal kapcsolatban (további információért nézze meg a hátoldalt vagy keresse fel a www.qiagen.com oldalt). Észrevételek és javaslatok Általános működtetés Hibaüzenet a berendezés kijelzőjén Alacsony DNS kinyerés a) a mágneses részecskék nem teljesen feloldottak b) nem elégséges reagens felszívása c) a fagyasztott vérminták a kiolvasztás után nem megfelelően lettek összekeverve d) A reagens kazetta (RCB) tubusainak aljában kicsapódás látható Hivatkozzon az EZ1 berendezéshez szállított kezelési útmutatóra. Győződjön meg róla, hogy a mágneses részecskéket felszuszpendálta, mielőtt a reagens kazettákat (RCB) a kazettatartóba csúsztatta. Miután fel-le fordította a reagens kazettákat (RCB) hogy felszuszpendálja a mágneses részecskéket, győződjön meg róla, hogy megkocogtatta a reagens kazettákat (RCB), hogy a reagenseket a tubusok aljába gyűjtse Olvassza fel a fagyasztott vérmintákat egy inkubátorban * vagy vízfürdőbe* 30-40 C-on finom rázogatással, hogy az alapos összekeverést biztosítsa Helyezze a reagens kazettákat (RCB) rázóinkubátorba és akár 2 órán keresztül inkubálja finom rázás mellett 30-40 C-on. Amennyiben a kicsapódás nem oldódott fel, ne használja a reagens kazettákat (RCB). * Biztosítsa, hogy a készülékek szabályos időközönként ellenőrizve, karbantartva és kalibrálva legyanek a gyártó utasításai szerint. EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008 35

A DNS nem megfelelően használható az izolálást követő enzimatikus reakciókban a) Nem elégséges DNS-t használ az alkalmazáshoz Mérje meg a DNS mennyiségét spektrofotométeres vizsgálattal 260 nm-en (tekintse meg a DNS mennyiségi meghatározása részt a 45. oldalon). b) Túl nagy mennyiségű DNS felhasználása az alkalmazáshoz A túlzott mennyiségű DNS gátolhatja az enzimatikus reakció működését. Mérje le az izolált DNS mennyiségét spektrofotométeres vizsgálattal 260 nm-en (tekintse meg a DNS mennyiségi meghatározása részt a 45. oldalon). Alacsony A 260 /A 280 arány az izolált nukleinsavaknál A 320 nm-nél mért abszorbancia érték nem lett kivonva a 260 és 280 nm-nél mért abszorbancia értékből Az eluátumban található mágneses részecskék miatt mérje le az eluátumot a 320 nm-nél is és ezt vonja ki a 260 és 280 nm-en kapott értékekből 36 EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008

A Függelék: Kijelzett üzenetek Az üzenetek, amelyeket a gép ad a munkaasztal összeállítás (7. lépés), a protokoll futtatása alatt és a futtatás után az 5. táblázatban foglaltuk össze az EZ1 Advanced és a 6. táblázatban az BioRobot EZ1 DSP készülékhez. Az üzenetek száma a táblázatban megfelel a készülék szoftvere által adott üzenet számának. Az általános hibaüzeneteket az EZ1 Advanced vagy a BioRobot EZ1 DSP készülékkel adott kézikönyvben találhatjuk meg. 5. táblázat Az EZ1 Advanced DNA Blood procedúra üzenetei Üzenet száma Üzenet típusa EZ1 Advanced üzenet szövege Nincs Útmutatás Date/Time START: Run 1: UV 2: Man 3: Test 4: Setup Key: START, 1, 2, 3, 4 1 Útmutatás EZ1 Advanced DSP DNA Blood Version 1.0 Magyar megfelelő Dátum/Idő START: futtatás 1: UV 2: Man 3: Teszt 4: Beállítás Bill.: START, 1, 2, 3, 4 2 Adatkövetés Scan/enter user ID Vonalkód olvasóval vagy kézzel vigyük be a felhasználó azonosítót 3 Adatkövetés Scan/enter Q-Card bar code 4 Útmutatás Wrong kit! Please load EZ1 DSP DNA Blood ENT: back 5 Útmutatás Kit expired ENT: Use new kit ESC: Stop protocol 6 Adatkövetés Use Q-Card data with sample no. 1 to Enter 1 to 6 Vonalkód olvasóval vagy kézzel vigyük be a Q-Card vonalkódját Rossz kit! Töltse be az EZ1 DSP DNA Blood kitet ENT: Vissza Kit lejárt ENT: Használjon új kitet ESC: Stop protokoll Használja a Q-Card adatokat az 1 mintától a. mintáig Vigye be 1-6 EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008 37

Üzenet száma Üzenet típusa EZ1 Advanced üzenet szövege 7 Útmutatás Do you want to process more samples with another kit lot ENT: Yes, ESC: No 8 Adatkövetés Do you want to add sample ID? ENT: Yes ESC: No 9 Adatkövetés Scan/enter sample ID sample no. [x] 10 Adatkövetés ID1: ID2: ID3: Next=ENT 11 Adatkövetés ID1: ID2: ID3: Next=ENT, ID1-3=Up 12 Adatkövetés Do you want to add assay information? ENT: Yes, ESC: No 13 Adatkövetés Scan/enter assay ID sample no. [x] 14 Adatkövetés Do you want to add notes? ENT: Yes ESC: No 15 Adatkövetés Scan/enter notes sample no. [x] Magyar megfelelő További mintákat is akar kezelni másik tételszámú kittel? ENT: Igen, ESC: Nem Akar hozzátenni minta azonosítót? ENT: Igen ESC: Nem Vonalkóddal vagy kézzel vigye be a minta azonosítót az [x.] mintára4 Azonosító 1: 2: 3: ENT=Következő Azonosító 1: 2: 3: ENT:Következő, UP/FEL=Azonosító 1-3 Hozzá akar adni vizsgálati info-t? ENT: Igen, ESC: Nem Vonalkóddal vagy kézzel vigye be a [x.] mintához a vizsgálat azonosítót Hozzáad megjegyzést? ENT: Igen ESC: Nem Vonalkóddal vagy kézzel vigye be a [x.] mintához a megjegyzést 38 EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008

Üzenet száma Üzenet típusa EZ1 Advanced üzenet szövege 16 Útmutatás The protocol use Sample Volume: 350μl Elution Volume: 200μl Next=Any 17 Útmutatás Load cartridges at same positions as samples Next=Any, Prev=Esc 18 Útmutatás Load elution tubes (ET) (1.5ml) into first row Next=Any, Prev=Esc 19 Útmutatás Load tip holders (DTH) and tips (DFT) into second row Next=Any, Prev=Esc 20 Útmutatás Leave third row empty Next=Any, Prev=Esc 21 Útmutatás Load 2.0 ml tubes (ST) with sample in fourth row Next=Any, Prev=Esc 22 Útmutatás Loading finished. Close door and press START Prev=Esc Magyar megfelelő A protokollban: Minta térf.: 350μl Elúció térf.: 200μl Bármely gomb=tovább Tegyük be a reagens kazettákat a mintáknak megfelelően Bármely gomb=tovább, ESC=Előző Tegyük be az elúciós csöveket (ET) (1,5 ml) az első sorba. Bármely gomb=tovább, ESC=Előző Tegyük be a hegy tartókat (DTH) és hegyeket (DFT) a második sorba Bármely gomb=tovább, ESC=Előző Hagyjuk a 3. sort üresen Bármely gomb=tovább, ESC=Előző Tegyünk 2,0ml-es csövet (ST) a mintákkal a 4. sorba Bármely gomb=tovább, ESC=Előző Betöltés vége. Csukja be az ajtót és nyomja meg a START gombot. ESC=Előző (lépés) EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008 39

Üzenet száma Üzenet típusa EZ1 Advanced üzenet szövege Magyar megfelelő 23 Útmutatás Please close door! Kérem csukja be az ajtót! 24 Státusz Protocol started Protokoll elkezdve 25 Státusz Piercing Foil [x] of 23 min left 26 Státusz Collecting Elution Buffer [x] of 23 min left 27 Státusz Deliver at Heat Block [x] of 23 min left 28 Státusz Collecting Magnetic Beads [x] of 23 min left 29 Státusz Resuspension of Magnetic Beads [x] of 23 min left 30 Státusz Adding Lysis Buffer [x] of 23 min left 31 Státusz Mixing Lysate [x] of 23 min left 32 Státusz Adding Magnetic Beads [x] of 23 min left 33 Státusz DNA binding to Magnetic Beads Magnetic separation [x] of 23 min left 34 Státusz Wash 1 Magnetic separation [x] of 23 min left 35 Státusz Wash 2 Magnetic separation [x] of 23 min left 36 Státusz Wash 3 Magnetic separation [x] of 23 min left Fólia lyukasztás, [x] perc maradt a 23-ból. Elúciós puffer felszívása, [x] perc maradt a 23-ból. A fűtőblokkba szállítás [x] perc maradt a 23-ból. Mágnesgyöngyök felszívása, [x] perc maradt a 23-ból. Mágnesgyöngyök felszuszpendálása [x] perc maradt a 23-ból. Lízis puffer hozzáadása [x] perc maradt a 23-ból. Lizátum keverése [x] perc maradt a 23-ból. Mágnesgyöngyök hozzáadása [x] perc maradt a 23-ból. DNS kötés a mégnesgyöngyhöz, mágneses elválasztás [x] perc maradt a 23- ból. 1. mosás, mágneses elválasztás, [x] perc maradt a 23-ból. 2. mosás, mágneses elválasztás, [x] perc maradt a 23-ból. 3. mosás, mágneses elválasztás, [x] perc maradt a 23-ból. 40 EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008

Üzenet száma Üzenet típusa EZ1 Advanced üzenet szövege 37 Státusz Wash 4 Magnetic separation [x] of 23 min left 38 Státusz Rinse [x] of 23 min left 39 Státusz Checking Temperature Set: Cur: 40 Státusz Elution [x] of 23 min left Magyar megfelelő 4. mosás, mágneses elválasztás, [x] perc maradt a 23-ból. Öblítés, [x] perc maradt a 23-ból. Hőmérséklet ellenőrzés: Set: beállított Cur:aktuális Elúció, [x] perc maradt a 23-ból. 41 Útmutatás Protocol finished Protokoll befejezve 42 Útmutatás Transfer Report file, attempt no. 43 Útmutatás Report file sent Next=ENT 44 Útmutatás Report file could not be sent Resend=ENT 45 Útmutatás Perform UV run? ENT: Yes ESC: No 46 Útmutatás UV DECONTAMINATION Set time min Key:0-9, ENT 47 Útmutatás UV lamp expires soon UV runs left ENT= continue 48 Útmutatás UV lamp is expired ENT=continue ESC=abort Jelentés file átvitel kísérlet (x). Jelentés file átküldve ENT=Következő Jelentés file átküldése sikertelen ENT=Újraküldés UV tisztítás? ENT: Igen ESC: Nem UV FERTŐTLENÍTÉS Beállítás percben: 0-9-ig majd ENT UV lámpa hamarosan lejár Maradék UV futtatás ENT=Folytatás UV lámpa lejárt ENT=Folytatás ESC=Leállít EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008 41

Üzenet száma Üzenet típusa EZ1 Advanced üzenet szövege 49 Útmutatás UV DECONTAMINATION Time must be between 20-60 min Key:ESC 50 Útmutatás UV DECONTAMINATION Total Time: min Time left: min 51 Útmutatás Decontamination UV lamp cooling Please stand by 52 Útmutatás Perform regular maintenance before next run! ESC=Main menu Magyar megfelelő UV FERTŐTLENÍTÉS Az idő 20-60 perc között lehet. Tovább: ESC UV FERTŐTLENÍTÉS Beállított idő: perc Idő maradt: perc Fertőtlenítő UV lámpa hűtés folyamatban. Kérjük várjon! Végezze el a szokásos karbantartást a következő futtatás előtt. ESC=Főmenü 6. táblázat A BioRobot EZ1 DSP DNA Blood procedúra üzenetei Üzenet száma Üzenet típusa EZ1 Advanced üzenet szövege Nincs Útmutatás Choose button: START: Protocols 1 : Tools 2 : Tests 1 Útmutatás EZ1 DSP DNA Blood Version 1.0.0 2 Útmutatás The protocol uses Sample Volume: [SampleVolume]ul Elution Volume: [ElutionVolume]ul Next=Any Magyar megfelelő Válasszon gombot START: Protokollok 1: Eszközök 2:Tesztek A protokoll a következő térfogatokat használja: Minta térfogat: [Minta térf.] μl Elúciós térfogat: [Elúciós térf.] μl Bármely gomb=következő 42 EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008

Üzenet száma Üzenet típusa EZ1 Advanced üzenet szövege 3 Útmutatás Load sufficient cartridges (RCB) for samples Next=Any, Prev=ESC 4 Útmutatás Load elution tubes (ET) (1.5ml) into first row Next=Any, Prev=ESC 5 Útmutatás Load tip holders (DTH) and tips (DFT) into second row Next=Any, Prev=ESC 6 Útmutatás Leave third row Empty Next=Any, Prev=ESC 7 Útmutatás Load 2.0ml tubes (ST) with sample in fourth row Next=Any, Prev=ESC 8 Útmutatás Start protocol Press START Prev=ESC Magyar megfelelő Tegyünk be a mintának megfelelő mennyiségű kazettát (RCB) Bármely=Következő, ESC=Előző Tegyük be az elúciós csöveket (ET) (1,5 ml). Bármely=Következő, ESC=Előző Tegyük be a hegy tartókat (DTH) és hegyeket (DFT) a második sorba Bármely gomb=tovább, ESC=Előző Hagyjuk a 3. sort üresen Bármely gomb=tovább, ESC=Előző Tegyünk 2,0ml (ST) a mintákkal a 4. sorba Bármely gomb=tovább, ESC=Előző Indítsa el a protokollt a START gomb megnyomásával. ESC=Előző (lépés) 9 Státusz Protocol started Protokoll elkezdve 10 Státusz Piercing Foil Fólia lyukasztás 11 Státusz Collecting Elution Buffer Elúciós puffer felszívása. 12 Státusz Deliver at Heat Block A fűtőblokkba. 13 Státusz Collecting Magnetic Beads Mágnesgyöngyök felszívása. EZ1 DSP DNA Blood Kit Kézikönyv 10/2008 43